close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY17124

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2013.06.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 17124
(13) C1
(19)
C 12N 1/20
C 12R 1/42
(2006.01)
(2006.01)
ШТАММ БАКТЕРИЙ SALMONЕLLA CHOLERAESUIS КМИЭВ-В131 ШТАММ-АНТИГЕН
(21) Номер заявки: a 20101336
(22) 2010.09.16
(43) 2012.04.30
(71) Заявитель:
Республиканское
научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие
"Институт
экспериментальной
ветеринарии
им. С.Н.Вышелесского" (BY)
(72) Авторы: Амосова Любовь Александровна; Ломако Юрий Васильевич; Гусев Анатолий Алексеевич;
Опарина Ирина Владимировна
(BY)
(73) Патентообладатель:
Республиканское
научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие "Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского" (BY)
(56) КИРИЛЛОВА В.В. Селекционированные
штаммы сальмонелл для изготовления
инактивированных вакцин против сальмонеллеза животных: Автореф. дисс. М., 1988. - С.13-14, 20-21.
KZ 20803 А4, 2009.
RU 2255763 С2, 2005.
RU 1577116 С, 1995.
Промышленная технология производства
противобактерийных препаратов. - М.:
ИКЦ "Академкнига", 2006. - С. 209-211.
BY 17124 C1 2013.06.30
(57)
Штамм бактерий Salmonella choleraesuis КМИЭВ-В131 - штамм-антиген.
Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и может быть использовано в биотехнологии для приготовления вакцин, диагностических препаратов, а также
получения гипериммунных сывороток и в ветеринарии для профилактики сальмонеллеза
животных.
В ветеринарной микробиологии и биотехнологии применяют ряд штаммов-антигенов
сальмонелл.
Так, известен аттенуированный производственный штамм сальмонелл Sal. choleraesuis
№ 9, который представляет собой супрессорный ревертант, полученный из стрептомицинзависимого мутанта. Данный штамм обладает следующими признаками:
Культуральные свойства и морфология. Подвижные грамотрицательные палочки без
спор, капсул и перитрий. На МПБ образует колонии в S-форме (гладкие, прозрачные, бесцветные, гомогенные, с ровными краями), в МПБ вызывает равномерное помутнение через 12-14 ч роста, без пленки, пристеночного кольца и осадка.
Ферментативные свойства. Ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу,
мальтозу, маннит, ксилозу, арабинозу, дульцит, сорбит; не ферментирует сахарозу, лактозу, рамнозу, не образует индол, образует сероводород.
Серологические свойства. Агглютинируется сальмонеллезными O- и H-сыворотками.
Патогенность. Вызывает гибель не более 2 из 10 белых мышей массой 16-18 г при
подкожном введении 10 млн. м. т. [1].
BY 17124 C1 2013.06.30
Недостаток штамма сальмонелл Sal. choleraesuis № 9 заключается в том, что он используется для производства живых вакцин и при ослаблении резистентности животных
может спровоцировать вспышку заболевания либо стать причиной сальмонеллоносительства; а также вакцина на его основе может обладать иммуносупрессивным действием и
усиливать состояние иммунодефицита [2].
Так, известен эпизоотический штамм сальмонелл Sal. choleraesuis 7. Данный штамм
обладает культурально-морфологическими признаками, типичными для бактерий рода
Salmonella. Антигенная структура штамма Sal. choleraesuis 7 по O-антигену представлена
антигенами 6, 7, по H-антигену - антигеном с [3].
Недостатком штамма является то, что в его антигенной структуре отсутствуют
H-антигены 1, 5, что может быть причиной недостаточной специфичности профилактических и диагностических препаратов на его основе.
Так, известен производственный штамм сальмонелл Sal. choleraesuis 370, использованный нами как прототип.
Штамм обладает следующими свойствами.
Культурально-морфологические признаки. Грамотрицательные палочки с закругленными концами, длиной 1,0-6,0 мкм, шириной 0,4-0,6 мкм, подвижные. Хорошо растет на
обычных питательных средах, на бульоне образует осадок, равномерное помутнение среды, пленку и пристеночное кольцо. На ПЖА растет по всему столбику среды.
Физико-биологические свойства. Аэроб, способный расти в микроаэробных условиях.
Оптимум pH 7,2 при температуре 37 °С.
Ферментативные свойства. Не расщепляет мочевину, индол не образует, выделяет сероводород, глюкозу, маннит, ксилозу, сорбит, арабинозу, дульцит, имеет ферменты лизиндекарбоксилазу и орнитиндекарбоксилазу.
Серологические свойства. Агглютинируется сальмонелезными сыворотками - O 6, 7;
Н с, 1, 5.
Патогенность. Патогенен для белых мышей, ЛД50 составляет 12,0 ± 3,2 микробных
клеток при внутрибрюшинном заражении.
Иммуногенность. ЕД50 для морских свинок составляет 0,34 · 106 ± 0,12 микробных клеток.
Ростовые свойства. При культивировании в МПБ Хоттингера в течение 24 ч накопление бактериальной массы составляет 45 млрд/см3 [4].
Недостатком штамма является то, что он не выделен в Республике Беларусь и поэтому
формирует менее специфичный иммунный ответ, что может быть причиной меньшей эффективности вакцины на его основе, а также обладает более низкими ростовыми свойствами по сравнению с заявляемым штаммом-антигеном и обладает более низкой
иммуногенностью для морских свинок.
Задачей предлагаемого изобретения является получение штамма-антигена Sal. choleraesuis, выделенного в одном из хозяйств Беларуси, характеризующегося полноценной антигенной структурой и обладающего высокой способностью к накоплению бактериальной
массы на МПБ Хоттингера.
Поставленная задача реализуется тем, что штамм бактерий Sal. choleraesuis КМИЭВВ131 - штамм-антиген выделен в Республике Беларусь, содержит полноценный набор O- и
H-антигенов, характеризуется хорошей способностью к накоплению бактериальной массы, обладает высокой иммуногенностью.
Заявленный штамм бактерий Sal. choleraesuis КМИЭВ-В131 обладает следующими
признаками.
Таксономическая принадлежность. Предложенный штамм бактерий Sal. choleraesuis
КМИЭВ-В131 - штамм-антиген отнесен к семейству Enterobacteriaceae, роду Salmonella,
виду Salmonella choleraesuis.
Культурально-морфологические признаки. Грамотрицательные палочки с закругленными концами, длиной 1,0-6,0 мкм, шириной 0,4-0,6 мкм, подвижные. Хорошо растет на
2
BY 17124 C1 2013.06.30
обычных питательных средах, на бульоне образует осадок, равномерное помутнение среды, пленку и пристеночное кольцо. На ПЖА растет по всему столбику среды.
Физико-биологические свойства. Аэроб, способный расти в микроаэробных условиях.
Оптимум pH 7,2 при температуре 37 °С.
Ферментативные свойства. Не расщепляет мочевину, индол не образует, выделяет сероводород, глюкозу, маннит, ксилозу, сорбит, арабинозу, дульцит, имеет ферменты лизиндекарбоксилазу и орнитиндекарбоксилазу.
Антигенные свойства. Агглютинируется сальмонелезными сыворотками - O 6, 7, H с, 1, 5.
Патогенность. Патогенен для белых мышей, ЛД50 составляет 28,0 микробных клеток
при внутрибрюшинном заражении.
Ростовые свойства. При культивировании в МПБ Хоттингера в течение 24 ч накопление бактериальной массы составляет 47-50 млрд/см3.
Условия хранения. Штамм хранится в защитной среде в лиофилизированном состоянии при влажности не более 3 %, от минус 2 °С до минус 10 °С.
Штамм депонирован и хранится в музее культур микроорганизмов РУП "Институт
экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского".
Заявленный штамм бактерий Sal. choleraesuis КМИЭВ-В131 - штамм-антиген выделен в
Республике Беларусь, содержит полноценный набор O- и H-антигенов, что характеризует его
большую специфичность, в частности, для республики, концентрация микробных клеток за
18 ч культивирования на МПБ Хоттингера составляет 47-50 млрд/см3, что позволяет увеличить выход микробной массы и удешевить производство иммунологических препаратов на
его основе, ЕД50 для морских свинок составляет 0,16 · 106 ± 0,11 микробных клеток, что обеспечивает более высокую иммуногенность вакцин на основе заявляемого штамма-антигена.
Пример 1.
Выделение штамма сальмонелл Sal. choleraesuis КМИЭВ-В131 - штамма-антигена.
Штамм выделяли из печени вынужденно убитого поросенка. Для этого прижигали место отбора пробы шпателем, затем прокалывали прижженную область пастеровской пипеткой, отбирали биопробу, переносили содержимое в пробирку с 5,0 мл МПБ.
Культивирование осуществляли в термостате при 37 °С в течение 24 ч.
Пример 2.
Изучение культуральных свойств штамма сальмонелл Sal. choleraesuis КМИЭВ-В131 штамма-антигена.
Для изучения культуральных свойств производили посев из МПБ на питательные среды МПА, агар Эндо и висмут-сульфит-агар. Чашки с МПА и агаром Эндо выдерживали в
термостате при 37 °С в течение 24 ч, с висмут-сульфит-агаром - в течение 48 ч.
Пример 3.
Изучение биохимических свойств штамма сальмонелл Sal. choleraesuis КМИЭВ-В131 штамма-антигена.
Биохимические свойства штамма сальмонелл Sal. choleraesuis КМИЭВ-В131 - штамма-антигена идентифицировали методом биохимических тестов с использованием набора
ЭНТЕРОтест 24.
1. Подготовка культуры.
Из чистой 24-часовой культуры приготовили суспензию в физиологическом растворе,
тщательно гомогенизировали суспензию; мутность суспензии соответствовала 1 степени
по шкале мутности McFarland; параллельно выполнили посев суспензии культуры на
МПА для проверки чистоты культуры, ее ростовых свойств, инкубировали в течение 24 ч
при 37 °С.
2. Подготовка стриппированной пластинки.
Подготовили рамку; отрезали с трех сторон предохранительную пленку; удалили адгезивную пленку с индивидуального стрипа и вставили его в подготовленную рамку, прикрыли крышкой.
3
BY 17124 C1 2013.06.30
3. Инокуляция приготовленной бактериальной суспензии в лунки с тестами.
Суспензию бактерий тщательно встряхнули; инокулировали по 0,1 мл суспензии во
все лунки в соответствующих рядах пластинки; после инокуляции добавили в лунки H, G,
F, E, D и C первого ряда (тесты IND, H2S, LYS, ORN, URE, ARG) по 2 капли парафинового масла.
4. Инкубация.
После инокуляции закрыли пластинку крышкой; вложили пластинку в полиэтиленовый пакетик, конец которого загнули, чтобы инокулят не высыхал при инкубации; инкубировали инокулированную пластику в течение 24 ч при 37 °С.
5. Учет результатов.
Проверили рост и чистоту культуры на контрольной чашке. Добавили реактивы в следующие лунки:
1-й ряд, лунка H (тест IND) - 2 капли реактива для теста ИНДОЛ;
3-й ряд, лунка H (тест VPT) - по одной капле реактива ВПТ I и ВПТ II;
Пластинку инкубировали в течение 30 мин при температуре 35-37 °С; после 30-минутной инкубации добавили во 2-й ряд, лунка H (тест PHE), 1 каплю реактива для теста
ФЕНИЛАЛАНИН.
Учитывали результаты всех реакций ЭНТЕРОтест24 по таблице "Интерпретация реакций". Исследование подтвердило.
Пример 4.
Изучение патогенности штамма сальмонелл Sal. choleraesuis КМИЭВ-В131 - штаммаантигена на белых мышах.
Изучение патогенности штамма проводили на 10 белых мышах массой 16-18 г, которым внутрибрюшинно инъецировали 300 млн. суспензии культуры на физиологическом
растворе. Учет гибели животных вели в течение 10 дней.
Пример 5.
Изучение иммуногенности штамма сальмонелл Sal choleraesuis КМИЭВ-В131 - штамма-антигена на морских свинках.
При постановке эксперимента по определению ИмД50 сформировано 5 групп морских
свинок массой 200-300 г, по 4 головы в каждой. Животных иммунизировали подкожно в
объеме 1,0 см3 инактивированной формалином культурой штамма сальмонелл Sal. choleraesuis КМИЭВ-В131 - штамма-антигена в дозах 109, 108,107, 106, 105 микробных тел. На
12-й день животные заражены 4 ЛД50 штамма сальмонелл Sal. choleraesuis КМИЭВ-В131 штамма-антигена. Учет гибели животных вели 10 дней. ИмД50 рассчитывали по методу
Кербера в модификации Ашмарина.
Источники литературы:
1. Рубан Е.А., Мельник Н.В., Непоклонов Е.А. Промышленная технология производства противобактерийных препаратов. - М.: ИКЦ "Академкнига", 2006. - С. 209-210.
2. Максимович В.В. Сальмонеллез свиней. - Минск: Ураджай, 1994. - С. 90.
3. Виговська Л.М. Удосконалення системи культивування, зберiгання та параметрiв
контролювання виробничих штамiв (Pasteurella, Salmonella, Listeria): Автореф. дис. …
канд. вет. наук. - Харкiв, 2008. - 24 с.
4. Кириллова В.В. Селекционные штаммы сальмонелл для изготовления инактивированных вакцин против сальмонеллеза животных: Автореф. дис. … канд. вет. наук - М.,
1988. - 21 с. (прототип).
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
86 Кб
Теги
by17124, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа