close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY17291

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2013.06.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
G 01N 33/574
(2006.01)
СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ
ГАСТРОИНТЕСТИНАЛЬНОЙ СТРОМАЛЬНОЙ ОПУХОЛИ,
ОПУХОЛИ ГЛАДКОМЫШЕЧНОГО ИЛИ НЕЙРОГЕННОГО
ПРОИСХОЖДЕНИЯ У БОЛЬНОГО С МЕЗЕНХИМАЛЬНОЙ
ОПУХОЛЬЮ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА, МАЛОГО
ТАЗА ИЛИ ЗАБРЮШИННОГО ПРОСТРАНСТВА
(21) Номер заявки: a 20100222
(22) 2010.02.17
(43) 2011.10.30
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Республиканский научно-практический центр онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н.Александрова" (BY)
(72) Авторы: Смолякова Раиса Михайловна; Рябцева Светлана Николаевна; Рогов Юрий Иванович (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное учреждение "Республиканский
научно-практический центр онкологии и медицинской радиологии
им. Н.Н.Александрова" (BY)
BY 17291 C1 2013.06.30
BY (11) 17291
(13) C1
(19)
(56) RU 2245551 C1, 2005.
UA 23956 U, 2007.
Гастроинтестинальные стромальные опухоли (диагностика, лечение). Практические рекомендации. - М., 2008. - С. 7-19.
РЯБЦЕВА С.Н. Актуальные проблемы
медицины. Сборник научных статей
Республиканской научно-практической
конференции "Актуальные проблемы
медицины" и 17-й итоговой научной
сессии Гомельского государственного
медицинского университета. - Гомель,
2008. - Т. 3. - Вып. 8. - С. 154-156.
РЯБЦЕВА С.Н. и др. Медицина. 2008. - № 4. - С. 26-31.
ДУБОВА Е.А. и др. Медицинская визуализация. - 2007. - № 1. - С. 25-31.
(57)
Способ дифференциальной диагностики гастроинтестинальной стромальной опухоли,
опухоли гладкомышечного или нейрогенного происхождения у больного с мезенхимальной опухолью желудочно-кишечного тракта, малого таза или забрюшинного пространства, отличающийся тем, что в удаленной опухоли оценивают иммуногистохимическим
методом экспрессию CD117, CD34, SMA, Des и S100 и диагностируют гастроинтестинальную стромальную опухоль при наличии экспрессии CD117 и CD34, опухоль гладко
BY 17291 C1 2013.06.30
мышечного происхождения при отсутствии экспрессии CD117 и наличии экспрессии
SMA и Des или опухоль нейрогенного происхождения при отсутствии экспрессии CD117
и наличии экспрессии S100.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано
для дифференциальной диагностики гастроинтестинальных стромальных опухолей, опухолей гладкомышечного или нейрогенного происхождения у больного мезенхимальной
опухолью желудочно-кишечного тракта, малого таза (вне связи с маткой) и забрюшинного
пространства путем оценки иммуногистохимического фенотипа опухолевой ткани.
Морфологическая диагностика мягкотканных опухолей основывается на комплексной
оценке клинико-анатомических данных, специфических морфологических признаков, иммуногистохимического фенотипа, ультраструктурных и генетических особенностей [1].
При наличии выраженного морфологического сходства на светооптическом уровне следующим этапом дифференциальной диагностики мягкотканных опухолей является анализ
иммуногистохимического фенотипа опухолевой ткани.
Установлено, что в опухолях и метастазах сохраняется экспрессия тканеспецифических антигенов, т.е. антигенов дифференцировки, положительная реакция на которые выявляется не только в клетках новообразований с определенным гистогенезом, но и в
клетках неопухолевой ткани аналогичного происхождения. Оценка экспрессии тканеспецифических маркеров позволяет судить о тканевом происхождении исследуемой опухоли.
При этом наиболее важным считается наличие положительной реакции, а не отрицательной.
Для новообразований нейрогенного происхождения характерна экспрессия иммуногистохимического маркера S100 (низкомолекулярный кальций-связывающий белок) в опухолевых клетках, так как экспрессию данного маркера отмечают в доброкачественных и
злокачественных неврилеммомах, нейрофибромах, и она выявлена в шванновских клетках
оболочек периферических нервов [2, 2, 4].
Для опухолей гладкомышечного происхождения диагностически значимой считается
сочетанная экспрессия иммуногистохимических маркеров цитоплазматического актина
клеток гладкомышечной дифференцировки (SMA) и белка промежуточных филаментов
цитоскелета клеток мышечного происхождения (Des).
Гастроинтестинальные стромальные опухоли (ГИСО) - специфическая группа преимущественно веретеновидно-клеточных, мезенхимальных новообразований с неуточненным гистогенезом. Следовательно, и специфических маркеров тканевой дифференцировки для ГИСО также не выявлено. В клетках ГИСО в 90-100 % случаев наблюдается
экспрессия иммуногистохимического маркера тирозинкиназного трансмембранного рецептора стволовых и тучных клеток, маркера фактора роста стволовых клеток (CD117). В
ткани ГИСО в 50-80 % выявлена позитивная реакция опухолевых клеток на CD34 (маркер
трансмембранного белка стволовых клеток, незрелых клеток лимфогематопоэза, эндотелиальных клеток капилляров и фибробластов). В клетках гастроинтестинальных стромальных опухолей возможна экспрессия и таких маркеров, как SMA (30-40 %), Des (510 %) и S100 (5 %) [5, 6, 7].
При оценке результатов иммуногистохимического исследования неоплазий следует
учитывать, что в новообразованиях мезенхимального происхождения опухолевые клетки
не всегда сохраняют иммунофенотип, характерный для нормального клеточного аналога
[1]. Согласно мировым данным, в клетках нейрофибром и злокачественных шванном отмечена очаговая экспрессия CD34 [3], а в клетках лейомиом и лейомиосарком наблюдают
очаговую экспрессию CD34 и S100 [8]. Однако описанные данные не учитываются при
проведении дифференциальной диагностики гастроинтестинальных стромальных опухолей, гладкомышечных и нейрогенных новообразований, что вызывает определенные
трудности в определении гистогенеза опухоли в каждом конкретном случае.
2
BY 17291 C1 2013.06.30
В настоящее время российскими авторами предложена модель-таблица иммуногистохимической дифференциальной диагностики гастроинтестинальных стромальных опухолей,
основанная на оценке иммунофенотипа опухолевой ткани с использованием более 15 тканеспецифических маркеров [9]. Данный способ принят нами за прототип.
Недостатками прототипа являются:
1. В данной модели-таблице представлен иммуногистохимический профиль новообразований разной дифференцировки (включая гладкомышечные и нейрогенные опухоли) без
сопоставления с иммунофенотипом ГИСО.
2. Несмотря на широкий спектр используемых иммуногистохимических маркеров,
представлен только "типичный" иммунофенотип гладкомышечных и нейрогенных новообразований без учета возможной экспрессии CD34 в клетках данных опухолей.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа дифференциальной
диагностики гастроинтестинальных стромальных опухолей, опухолей гладкомышечного
или нейрогенного происхождения у больного мезенхимальным новообразованием иммуногистохимическим методом с использованием тканеспецифических антител (CD117,
CD34, SMA, S100, Des).
Поставленная цель достигается тем, что проводят иммуногистохимическим методом
определение экспрессии тканеспецифических антигенов (CD117, CD34, SMA, S100 и Des)
в ткани удаленной опухоли у данной категории больных. На основании комплексной
оценки как положительной, так и отрицательной иммуногистохимической реакции делают
вывод о тканевой дифференцировке исследуемой опухоли и относят больного с мезенхимальным новообразованием к одной из трех групп в целях выработки патогенетически
обоснованной тактики лечения, имеющим:
гастроинтестинальную стромальную опухоль;
гладкомышечную опухоль;
нейрогенную опухоль.
Способ осуществляется следующим образом.
Описание технологии использования иммуногистохимического метода определения
экспрессии CD117 (клон A4502, разведение 1:200, DAKO, Дания), CD34 (клон QBEnd-10,
разведение 1:100, DAKO, Дания), SMA (клон 1A4, разведение 1:200, DAKO, Дания), S100
(поликлональное антитело, разведение 1:3000, DAKO, Дания), Des (клон D33, разведение
1:200, DAKO, Дания):
I этап. Фрагменты опухолевой ткани размерами 1 × 1 × 0,2 см фиксируют в формалине
и заключают в парафин по стандартной технологии, затем парафиновые срезы толщиной
3-5 мкм депарафинизируют в ксилоле и регидратируют в батарее спиртов.
II этап. Для восстановления структуры белка, которая изменяется в ходе фиксации и
заливки в парафин, срезы прогревают на водяной бане при t = 98 °С с использованием демаскировочного буфера (pH = 6,0; S1699) в течение 30 мин. После демаскировки емкости
со срезами выдерживают при комнатной температуре 20 мин, обрабатывают дистиллированной водой и 3 %-ной перекисью водорода.
III этап. Инкубацию с первичными антителами проводят при комнатной температуре в
течение 30 мин. После двукратной промывки в фосфатном буфере (pH = 7,2) на срез наносят визуализирующую систему EnVision+ (DAKO, Дания) на 30 мин при комнатной температуре. После повторной промывки в фосфатном буфере наносят раствор диаминобензидина (ДАБ). Далее срезы докрашивают гематоксилином и заключают в бальзам.
Оценку результатов окрашивания осуществляют с применением светового микроскопа (увеличение ×20, ×40). Оценивают процент окрашенных клеток без учета интенсивности пероксидазной метки (в области с максимальной экспрессией).
В исследовании применяют следующие критерии оценки маркеров:
экспрессию CD117, CD34, SMA и Des в опухолевых клетках оценивают как положительную при цитоплазматическом окрашивании более 25 % опухолевых клеток и считают
отрицательной, если процент окрашенных клеток составляет менее 25 %;
3
BY 17291 C1 2013.06.30
экспрессию S100 оценивают как положительную при наличии сочетанного окрашивания цитоплазмы и ядра в более чем 25 % опухолевых клетках и отрицательной - при ядерноцитоплазматическом окрашивании менее 25 % клеток или при только цитоплазматическом окрашивании опухолевых клеток.
Пересмотр гистологических препаратов и оценку иммуногистохимического окрашивания производят одним патологоанатомом.
Статистическую обработку полученных данных осуществляют с использованием программы Statistica 6,0. Для сравнения уровней экспрессии маркеров тканеспецифических
антигенов в изучаемых группах (1 - пациенты с гастроинтестинальными стромальными
опухолями, 2 - пациенты с гладкомышечными и 3 - пациенты с нейрогенными новообразованиями) применяют непараметрический метод - критерий Манна-Уитни (U, p < 0,05).
Среди пациентов с гастроинтестинальными стромальными опухолями (n = 52) в 50
(96,2 %) исследуемых ГИСО выявлена очаговая или диффузная положительная реакция на
CD117, в 2 (3,8 %) случаях (при локализации опухоли в области малого таза и при поражении желудка) отмечена отрицательная реакция на маркер стволовых клеток. Положительная реакция на CD34 определена в ткани 38 (73,1 %) гастроинтестинальных стромальных опухолей. Экспрессия гладкомышечного актина (SMA) установлена в 19 (36,5 %)
случаях, белка S100 - в 2 (3,8 %), десмина (Des) - в 7 (13,5 %).
В группе пациентов с опухолями гладкомышечного происхождения (n = 18) во всех
(18/100 %) исследованных образцах ткани опухоли выявлена отрицательная реакция на
CD117. Наряду с диффузной положительной экспрессией гладкомышечного актина
(17/94,4 %) и десмина (16/88,9 %) в исследованных опухолях выявлена очаговая положительная реакция на CD34 (2/11,1 %) и S100 (3/16,7 %).
Во всех (8/100 %) исследованных образцах ткани опухоли нейрогенной дифференцировки выявлена диффузная цитоплазматическая положительная реакция на S100 и отрицательная на CD117, SMA и Des. Экспрессия CD34 обнаружена в 1 (12,5 %) случае.
При проведении сравнительного анализа иммуногистохимического профиля гладкомышечных и гастроинтестинальных стромальных опухолей диагностировано отсутствие
экспрессии маркера стволовых клеток (CD117) в опухолевых клетках лейомиом и лейомиосарком, отмечена более высокая частота экспрессии маркеров мышечной дифференцировки и более низкая экспрессия эндотелиального маркера в клетках гладкомышечных
новообразований (таблица). Для иммуногистохимического профиля нейрогенных новообразований характерно отсутствие экспрессии маркера стволовых клеток (CD117), маркеров
гладкомышечной и мышечной дифференцировки, низкая экспрессия эндотелиального
маркера, но высокая экспрессия белка S100.
Иммуногистохимическая характеристика гастроинтестинальных стромальных
опухолей, новообразований гладкомышечной или нейрогенной дифференцировки
Нозологическая
форма
ГИСО
Гладкомышечные опухоли
Нейрогенные опухоли
CD117
+
–
–
Иммуногистохимические маркеры
CD34
SMA
Des
+
+/–
+/–/+
+
+
–/+
–
–
S100
–/+
–/+
+
Наиболее значимыми иммуногистохимическими маркерами для проведения дифференциальной диагностики между гастроинтестинальными стромальными опухолями, новообразованиями гладкомышечной или нейрогенной дифференцировки являются: CD117
(rg = –1,0, p = 0,0000), CD34 (rg = –0,87, p = 0,0000) и S100 (rg = 0,91, p = 0,0000), а также
SMA (rg = 0,29, p = 0,0286) и Des (rg = 0,56, p = 0,0000). При проведении дифференциальной диагностики для гастроинтестинальных стромальных опухолей следует, в первую
очередь, оценивать экспрессию CD117 и CD34, для гладкомышечных новообразований SMA и Des, для нейрогенных - наличие экспрессии S100.
4
BY 17291 C1 2013.06.30
Нами выявлены диагностически значимые иммуногистохимические маркеры для каждой группы пациентов и получены статистически значимые различия в экспрессии тканеспецифических антител в 1 и 2 группах, а также в 1 и 3 группах больных.
Основные отличительные признаки предлагаемого изобретения:
1. Согласно предложенному способу проводят совокупную оценку экспрессии иммуногистохимических маркеров тканеспецифических антител, по данным которой судят о
гистогенезе исследуемой опухоли (фигура).
2. Данный способ учитывает наиболее распространенные варианты сочетанной экспрессии иммуногистохимических маркеров в клетках исследуемых новообразований, что
позволяет повысить эффективность диагностики в каждом конкретном случае.
3. Экспрессия CD117 (U, p = 0,000000) и CD34 (U, p = 0,000097) в клетках гастроинтестинальных стромальных опухолей достоверно выше по отношению к больным с гладкомышечными новообразованиями.
4. В клетках гладкомышечных опухолей преобладает экспрессия SMA (U,
p = 0,000271) и Des (U, p = 0,000002) по сравнению с гастроинтестинальными стромальными опухолями.
5. При сравнительном анализе экспрессии маркеров тканеспецифических антител у
пациентов с нейрогенными и гастроинтестинальными стромальными опухолями установлено статистически значимое преобладание экспрессии S100 (U, p = 0,000014) в клетках
нейрогенных новообразований и достоверное преобладание экспрессии CD117 (U,
p = 0,000014) и CD34 (U, p = 0,006144) в клетках гастроинтестинальных стромальных опухолей.
Способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
Больной К.Н.В., 1929 г.р., поступил в абдоминальное отделение 23.09.2008 г. (амбулаторная карта № 7185/2008). При обследовании больного установлен диагноз: мезенхимальная опухоль верхней трети тела желудка. 06.10.2008 г. выполнена секторальная
резекция желудка с опухолью, спленэктомия. Гистологическое заключение № 140995510/08 - мезенхимальная опухоль желудка. При иммунногистохимической оценке экспрессии тканеспецифических маркеров с использованием антител к CD117, CD34, SMA,
Des и S100 выявлена положительная экспрессия CD117 (+), CD34 (+) и SMA (+) в опухолевых клетках, но отрицательная реакция на Des (–) и S100 (–). Данная опухоль - гастроинтестинальная стромальная опухоль.
Пример 2.
Больная Р.М.И., 1941 г.р., поступила в торакальное отделение 24.07.2008 г. (амбулаторная карта № 96126/2007). При обследовании больной установлен диагноз: лейомиома
средней трети пищевода. 30.07.2008 г. выполнена правосторонняя торакотомия, удаление
опухоли пищевода. Гистологическое заключение № 116869-872/08 - лейомиома пищевода.
При иммуногистохимической оценке экспрессии тканеспецифических маркеров с использованием антител к CD117, CD34, SMA, Des и S100 диагностирована положительная экспрессия SMA (+) и Des (+) в опухолевых клетках и отрицательная реакция на CD117 (–),
CD34 (–) и S100 (–). Данная опухоль - лейомиома пищевода.
Пример 3.
Больная В.В.П., 1952 г.р., поступила в абдоминальное отделение 01.08.2008 г. (амбулаторная карта № 5217/2008). При обследовании больной был установлен диагноз: неэпителиальная опухоль тела желудка. 05.08.2008 г. выполнена атипичная резекция тела
желудка, резекция большого сальника. Гистологическое заключение № 201866-67/08 пролиферирующая веретеновидно-клеточная опухоль желудка. При иммуногистохимической оценке экспрессии тканеспецифических маркеров с использованием антител к
CD117, CD34, SMA, Des и S100 детектирована положительная экспрессия S100 (+) в опухолевых клетках и отрицательная реакция на CD117 (–), CD34 (–), SMA (–) и Des (–). Данная опухоль - неврилеммома желудка.
5
BY 17291 C1 2013.06.30
Таким образом, предложенный способ дифференциальной диагностики гастроинтестинальной стромальной опухоли, опухоли гладкомышечного или нейрогенного происхождения включает анализ экспрессии иммуногистохимических маркеров тканеспецифических антигенов в удаленной опухоли с целью повышения точности дифференциальной
диагностики указанных неоплазий, при этом оценивают наличие позитивной и отрицательной экспрессии CD117, CD34, SMA, Des и S100. Опухоль оценивают как гастроинтестинальную стромальную опухоль при наличии экспрессии CD117 (диагностическая
эффективность - 98,1 %) и CD34 (диагностическая эффективность - 83 %), как гладкомышечную - при наличии позитивной экспрессии SMA (диагностическая эффективность 81,7 %), Des (диагностическая эффективность - 89 %) и отрицательной реакции на CD117.
К нейрогенному новообразованию относят опухоль, клетки которой экспрессируют S100
(диагностическая эффективность - 96,5 %), но имеют отрицательную реакцию на CD117.
Изобретение является промышленно применимым, так как может быть использовано в
здравоохранении для повышения точности дифференциальной диагностики гастроинтестинальной стромальной опухоли, опухоли гладкомышечного или нейрогенного происхождения с целью выбора патогенетически обоснованной адъювантной полихимиотерапии в послеоперационном периоде. Данный способ может быть рекомендован для
использования в специализированных онкологических учреждениях, патологоанатомических бюро.
Источники информации:
1. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей / Под ред.
С.В.Петрова, Н.Т.Райхлина. - Казань: РИЦ "Титул", 2004. - С. 45-52, 189-228.
2. Greenson J.K. Gastrointestinal stromal tumors and other mesenchymal lesions of the gut //
Mod. Pathol. - 2003. - Vol. 16. - No. 4. - P. 366-375.
3. Parfitt J.R. et al. Gastrointestinal stromal tumors: a contemporary review // Pathology Research and Practice 202. - 2006. - P. 837-847.
4. Miettinen M., Lasota J. Gastrointestinal stromal tumors: review on morphology, molecular
pathology, prognosis and differential diagnosis // Arch. Pathol. Lab. Med. - 2006. - Vol. 130. P. 1466-1478.
5. Miettinen M., Lasota J. Gastrointestinal stromal tumors (GISTs): definition, occurrence,
pathology, differential diagnosis and molecular genetics //Pol. J. Pathol. - 2003. - Vol. 54. - No. 1. P. 3-24.
6. Miettinen M. et al. Immunohistochemical spectrum of GISTs at different sites and differential
diagnosis with a reference to CD 117 (KIT) // Mod. Pathol. - 2000. - Vol. 13. - No. 10. - P. 1134-1142.
7. By Boudewijn E.C. et al. Soft tissue leiomyosarcomas and malignant gastrointestinal
stromal tumors: differences in clinical outcome and expression of multidrug resistance proteins //
Journal of Clinical Oncology. - 2000. - Vol. 18. - No. 18. - P. 3211-3220.
8. Graadt van Roggen J.F., van Velthuysen M.L.F., Hogendoom P.C.W. The histopathological differential diagnosis of gastrointestinal stromal tumours // J. Clin. Pathol. - 2001. - Vol. 54. P. 96-102.
9. Гастроинтестинальные стромальные опухоли (диагностика, лечение): практические
рекомендации / Под ред. И.В.Поддубной. - М., 2008. - С. 7-19 (прототип).
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
118 Кб
Теги
by17291, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа