close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY17435

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2013.08.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
BY 17435 C1 2013.08.30
(54)
BY (11) 17435
(13) C1
(19)
C 12N 1/20
C 12R 1/19
(2006.01)
(2006.01)
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕКТИВНЫХ АНТИГЕНОВ
ESCHERICHIA COLI, ВЫБРАННЫХ ИЗ
ESCHERICHIA COLI КМИЭВ-98, ESCHERICHIA COLI КМИЭВ-39А
И ESCHERICHIA COLI КМИЭВ-38
(21) Номер заявки: a 20101341
(22) 2010.09.16
(43) 2012.04.30
(71) Заявитель: Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное
предприятие "Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского" (BY)
(72) Авторы: Гусев Анатолий Алексеевич; Ломако Юрий Васильевич;
Опарина Ирина Владимировна; Амосова Любовь Александровна (BY)
(73) Патентообладатель: Республиканское
научно-исследовательское дочернее
унитарное предприятие "Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского" (BY)
(56) БЕДОЕВА З.М. Тест-системы для
иммунологического мониторинга и
прогнозирования острых кишечных
инфекций животных и усовершенствование средств профилактики:
Автореф. дис.. - М., 2006. - С. 7-9,
16-18, 36-38.
BY 10886 C1, 2008.
BY 10978 C1, 2008.
RU 2070819 C1, 1996.
ЗАЙЦЕВ В.В. и др. Ученые записки
учреждения образования "Витебская
ордена "Знак Почета" государственная
академия ветеринарной медицины".
Т.40, ч.1. - Витебск, 2004. - С. 211-212.
ЛОМАКО Ю.В. Специфическая профилактика колибактериоза телят на
основе адгезивных антигенов возбудителя: Автореф. дис. - Минск, 2003. С. 3-15.
МЕДВЕДЕВ А.П. и др. Ученые записки
учреждения образования "Витебская
ордена "Знак Почета" государственная
академия ветеринарной медицины".
Т.43, ч. 1. - Витебск, 2007. - С. 154-157.
ЗАЙЦЕВ В.В. и др. Ученые записки
учреждения образования "Витебская
ордена "Знак Почета" государственная
академия ветеринарной медицины".
Т.43, ч. 2. - Витебск, 2007. - С. 38-41.
(57)
Способ получения протективных антигенов Escherichia coli, выбранных из Escherichia
coli КМИЭВ-98, Escherichia coli КМИЭВ-39А и Escherichia coli КМИЭВ-38, заключающийся в том, что клетки Escherichia coli культивируют на мясопептонном агаре, ресуспензируют в физиологическом растворе, содержащем 0,1-0,3 % солянокислого гидроксиламина, до получения концентрации 20-25 млрд. клеток в 1 мл, полученную суспензию
инкубируют в течение 24-48 ч при температуре 25-28 °С, прогревают в течение 20-30 мин
при 60-65 °С, охлаждают при 4 °С в течение 4-6 ч, центрифугируют при 5000-10000g в течение 20-30 мин и отбирают надосадок, содержащий протективные антигены.
BY 17435 C1 2013.08.30
Изобретение относится к области бактериологии и может быть использовано в биотехнологии для приготовления моно- и ассоциированных вакцин для профилактики колибактериоза, а также для приготовления эритроцитарных диагностикумов для регистрации
и прогнозирования эпизоотического процесса.
Так, известен способ получения антигенов из бактериальных клеток энтеробактерий,
заключающийся в раздельном культивировании штаммов энтеробактерий на синтетической питательной среде (10-12 ч), экстрагировании антигенов штаммов энтеробактерий
(концентрация клеток 48-50×109 микр. кл./мл) раствором солянокислого гидроксиламина
(0,05 мг на 109 микробных клеток), и термической обработке при 56 °C в течение 48 ч с
дальнейшим центрифугированием и использованием надосадка в качестве антигенов [1].
Недостатком указанного способа является использование высокой концентрации бактериальных клеток (48-50 млрд./мл), что уменьшает выход получаемых антигенов.
Задачей предлагаемого способа является получение высокоиммуногенных, нетоксичных антигенов кишечной палочки для конструирования вакцин против колибактериоза и
ассоциированных желудочно-кишечных инфекций, а также для приготовления эритроцитарных диагностикумов для регистрации и прогнозирования эпизоотического процесса, а
также повышение выхода протективных антигенов.
Поставленная задача достигается тем, что способ получения протективных антигенов
Escherichia coli, выбранных из Escherichia coli КМИЭВ-98, Escherichia coli КМИЭВ-39А,
Escherichia coli КМИЭВ-38, заключается в том, что клетки Escherichia coli культивируют
на мясопептонном агаре, ресуспензируют в физиологическом растворе, содержащем 0,10,3 % солянокислого гидроксиламина, до получения концентрации 20-25 млрд. клеток в
1 мл, полученную суспензию инкубируют в течение 24-48 ч при температуре 25-28 °С,
прогревают в течение 20-30 мин при 60-65 °С, охлаждают при 4 °С в течение 4-6 ч, центрифугируют при 5000-10000g в течение 20-30 мин и отбирают надосадок, содержащий
протективные антигены.
Таким образом, предлагаемый способ использования солянокислого гидроксиламина
является щадящим. При обработке солянокислым гидроксиламином, клетки частично сохраняют свою структуру, поэтому продукты их распада не загрязняют получаемый препарат. Прогревание при 60-65 °С обеспечивает больший выход веществ полисахаридной
природы, отвечающих за специфичность О-антигенов. Последующее центрифугирование
и использование в качестве источника антигенов надосадка позволяет освободиться от
остатков микробных клеток, что снижает реактогенность препарата. А также использование штаммов, выделенных в Республике Беларусь, позволяет получить протективные антигены с высокими иммуногенными свойствами.
В предлагаемом способе в качестве продуцента антигенов используют штаммы бактерий Escherichia coli КМИЭВ-98 - штамм-антиген, Escherichia coli КМИЭВ-39А - штаммантиген, Escherichia coli КМИЭВ-38 - штамм-антиген.
Штамм бактерий Escherichia coli КМИЭВ-98 - штамм-антиген обладает следующими
свойствами.
Таксономическая принадлежность. Escherichia coli относится к 5-й группе факультативно-анаэробных грамотрицательных палочек, подгруппе 1 - семейство Enterobactericeae,
роду Escherichia, виду Escherichia coli.
Морфологические признаки. В мазках, приготовленных из бульонных и агаровых
культур, при окраске по Грамму имеет вид тонких коротких (0,2-0,7 × 2-4 мкм) грамотрицательных палочек.
Культуральные признаки. Факультативный анаэроб. Растет в МПБ, в бульоне на основе перевара Хоттингера с интенсивным помутнением среды и образованием на дне пробирки осадка, легко разбивающегося при встряхивании. Культура на плотных
питательных средах формирует круглые, блестящие, выпуклые колонии с приподнятым,
более оптически плотным центром. На среде Эндо бактерии образуют колонии красного
2
BY 17435 C1 2013.08.30
цвета с металлическим блеском, размером от 0,2 до 0,5 см, с более интенсивно окрашенным центром, подвижны.
Биохимические признаки. В биохимическом отношении на средах, содержащих углеводы и многоатомные спирты, штамм ферментирует глюкозу, лактозу, манит, сорбит,
арабинозу, мальтозу, ксилозу, манозу, дульцит с образованием кислоты и газа, продуцирует индол, не образует сероводород, не разжижает желатину, не утилизирует цитраты,
дает отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра.
Антигенные признаки. Имеет в своем составе адгезивный антиген F41, О-антиген, не
типируемый коммерческим набором О-колисывороток, содержит жгутиковый антиген.
Патогенность, иммуногенность. Штамм Escherichia coli КМИЭВ-98 - штамм-антиген
патогенен. LD50 составляет 670 млн. микробных клеток при внутрибрюшинном заражении. Иммуногенность штамма Escherichia coli КМИЭВ-98 составляет 100 %, антигенность
в PA 13,8 ± 0,14 log2.
Условия хранения. Штамм Escherichia coli КМИЭВ-98 - штамм-антиген хранится при
температуре +2…+4 °С после лиофильного высушивания в ампулах в течение 2-3 лет, а
также в течение 3-6 месяцев на 0,3 % ПЖА под слоем стерильного вазелинового масла.
Пример 1.
Культивирование штамма Escherichia coli КМИЭВ-98 - штамма-антигена в биореакторе.
Штамм бактерий Escherichia coli КМИЭВ-98 - штамм-антиген выращивают в течение
8-10 ч (не более 12 ч) при температуре 37 °С; скорости вращения мешалки в начале культивирования - 70, а в конце - 300 об/мин; подаче стерильного воздуха в процессе всего периода культивации - 0,1 л/л среды. Через каждый час культивирования отбирают пробы
микробной суспензии, определяют уровень накопления бактериальной массы (по оптическим стандартам мутности) и устанавливают pH среды. Понижение pH в растущей культуре до 7 и ниже регулируют подщелачиванием путем добавления 10 %-ного раствора
NaOH до pH 7,6-7,8. Через 2, 4, 6 ч от начала засева среду трижды обогащают раствором
глюкозы из расчета 0,3 % сухого вещества глюкозы на 1 л среды.
Заявленный штамм бактерий Escherichia coli КМИЭВ-98 - штамм-антиген выделен в
животноводческом хозяйстве Республики Беларусь и поэтому является специфичным для
крупного рогатого скота в пределах республики, его включение в вакцину против колибактериоза позволяет усилить ее специфичность и повысить эффективность профилактики данного заболевания.
Штамм бактерий Escherichia coli КМИЭВ-39А - штамм-антиген обладает следующими
свойствами.
Морфологические признаки. Неподвижные короткие (0,2-0,7 × 2-4 мкм) грамотрицательные палочки.
Культуральные признаки. Факультативный анаэроб. Растет в МПБ, в бульоне на основе перевара Хоттингера с интенсивным помутнением среды и образованием на дне пробирки осадка, легко разбивающегося при встряхивании. На плотных питательных средах
формирует круглые, блестящие, выпуклые колонии с приподнятым, более оптически
плотным центром. На среде Эндо образует колонии красного цвета с металлическим блеском, размером от 0,2 до 0,5, с более интенсивно окрашенным цветом.
Биохимические свойства. Ферментирует глюкозу, лактозу, манит, сорбит, арабинозу,
мальтозу, ксилозу, манозу, дульцит с образованием кислоты и газа, продуцирует индол, не
образует сероводород, не разжижает желатину, не утилизирует цитраты, дает отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра.
Антигенные свойства. Имеет в своем составе антиген Att25, O-антигены, не типируемые коммерческим набором O-сывороток, H-антиген.
Патогенность. Патогенен для белых мышей, LD50 составляет 840 млн. микробных клеток при внутрибрюшинном заражении.
3
BY 17435 C1 2013.08.30
Условия хранения. Штамм хранится в защитной среде в лиофилизированном состоянии при влажности не более 3 %, от - 2 до - 10 °С [2].
Штамм бактерий Escherichia coli КМИЭВ-38 - штамм-антиген обладает следующими
свойствами.
Морфологические признаки. Короткие (0,2-0,7 × 2-4 мкм), слабоподвижные, грамотрицательные палочки, спор и капсул не образуют.
Культуральные признаки. Факультативный анаэроб. Растет в МПБ, в бульоне на основе перевара Хоттингера - с интенсивным помутнением среды и образованием на дне пробирки осадка, легко разбивающегося при встряхивании, на плотных питательных средах
формирует круглые, блестящие, выпуклые колонии с приподнятым, более оптически
плотным центром. На среде Эндо образует колонии красного цвета с металлическим блеском, размером от 0,2 до 0,5 см, с более интенсивно окрашенным центром, на среде Минка
колонии растут в S- и R-формах. При S-формах наблюдаются ровные края, колонии выпуклые, с точкой уплотнения в центре.
Биохимические свойства. Ферментирует глюкозу, лактозу, манит, сорбит, арабинозу,
мальтозу, ксилозу, манозу, дульцит с образованием кислоты и газа, продуцирует индол, не
образует сероводород, не разжижает желатину, не утилизирует цитраты, дает отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра.
Антигенные свойства. Имеет в своем составе антиген К99, O-антигены, не типируемые коммерческим набором O-сывороток, H-антиген.
Патогенность. Патогенен для белых мышей, LD50 составляет 840 млн. микробных клеток при внутрибрюшинном заражении.
Ростовые свойства. При культивировании в МПБ Хоттингера в течение 24 ч накопление бактериальной массы составляет 47-50 млрд./см3.
Условия хранения. Штамм хранится в защитной среде в лиофилизированном состоянии при влажности не более 3 %, от - 2 до - 10 °С [3].
Для инактивации протективных антигенов кишечной палочки используют формалин.
Формалин - 37 %-ный раствор формальдегида, широко применяется для инактивации различных видов микроорганизмов. Его инактивирующее действие возможно благодаря высокой реакционной способности в отношении аминокислот и белков, нуклеотидов и
нуклеиновых кислот [4].
Пример 2.
Получение протективных антигенов Escherichia coli, выбранных из Escherichia coli
КМИЭВ-98, Escherichia coli КМИЭВ-39А, Escherichia coli КМИЭВ-38.
Бактериальные клетки штаммов Escherichia coli КМИЭВ-98 - штамма-антигена, Escherichia coli КМИЭВ-39А - штамма-антигена, Escherichia coli КМИЭВ-38 - штамма-антигена
раздельно культивируют на МПА в течение 24-48 ч при температуре 36-38 °С, ресуспензируют бактериальные клетки раствором 0,1-0,3 % солянокислого гидроксиламина, приготовленном на физиологическом растворе, до получения концентрации 20-25 млрд./мл, затем из
бактериальных клеток экстрагируют поверхностные антигены в течение 24-48 ч при температуре 25-28 °С, после подвергают их термической обработке 20-30 мин при 60-65 °С и
охлаждают при 4 °С в течение 4-6 ч, центрифугируют полученную суспензию при 500010000 g в течение 20-30 мин, получают осадок и надосадок, и в качестве источника протективных антигенов используют надосадок, инактивируют экстрагированные протективные антигены штаммов 0,4-0,5 % формалином при 37-56 °С в течение 24-96 ч.
Пример 3.
Определение безвредности протективных антигенов Escherichia coli, выбранных из
Escherichia coli КМИЭВ-98, Escherichia coli КМИЭВ-39А, Escherichia coli КМИЭВ-38.
Полученный образец инъецируют 5-10 белым мышам массой 14-16 г внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл. За животными ведут наблюдение в течение 10 дней, учитывая их клиническое состояние.
4
BY 17435 C1 2013.08.30
Пример 4.
Определение иммуногенной и антигенной активности полученных протективных антигенов Escherichia coli, выбранных из Escherichia coli КМИЭВ-98, Escherichia coli КМИЭВ-39А, Escherichia coli КМИЭВ-38.
Образец однократно инъецируют белым мышам массой 14-16 г в дозе 0,3 см3 подкожно, на 12-14-й день мышей заражают внутрибрюшинно живой культурой гомологичных
штаммов в дозе 2ЛД50, наблюдают за состоянием животных в течение 3 суток, затем выживших животных подвергают декапитации для получения сыворотки крови и смотрят
титр антител в РА.
Пример 5.
Условия хранения протективных антигенов Escherichia coli, выбранных из Escherichia
coli КМИЭВ-98, Escherichia coli КМИЭВ-39А, Escherichia coli КМИЭВ-38.
Протективные антигены кишечной палочки хранят в плотно закрытых стерильных
флаконах при температуре 4 °С в защищенном от света месте.
Источники информации:
1. Бедоева З.М. Тест-системы для иммунологического мониторинга и прогнозирования острых кишечных инфекций животных и усовершенствование средств специфической
профилактики: Автореф. дис.…докт. биол. наук. - М., 2006. - 51 с.
2. Патент BY 10886, МПК С 12N 1/20, 2007.
3. Патент BY 10978, МПК С 12N 1/20, 2006.
4. Костина, Т.Н. К вопросу о механизмах химической инактивации // ЖМЭИ. - 1981. № 8. - С. 25-30.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
5
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
93 Кб
Теги
by17435, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа