close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY17436

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2013.08.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 12N 1/20
C 12R 1/42
(2006.01)
(2006.01)
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНОВ САЛЬМОНЕЛЛ,
ВЫБРАННЫХ ИЗ SALMONELLA DUBLIN КМИЭВ-В115,
SALMONELLA TYPHIMURIUM КМИЭВ-В128 ИЛИ SALMONELLA
CHOLERAESUIS КМИЭВ-В131
(21) Номер заявки: a 20101335
(22) 2010.09.16
(43) 2012.04.30
(71) Заявитель: Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие "Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского" (BY)
(72) Авторы: Амосова Любовь Александровна; Гусев Анатолий Алексеевич; Ломако Юрий Васильевич;
Опарина Ирина Владимировна (BY)
BY 17436 C1 2013.08.30
BY (11) 17436
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Республиканское
научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие "Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского" (BY)
(56) RU 2166329 С2, 2001.
UA 12590 U, 2006.
RU 2162340 C1, 2001.
МАКСИМОВИЧ В.В. и др. Ученые
записки учреждения образования "Витебская ордена "Знак Почета" государственная академия ветеринарной медицины". - Витебск, 2004. - Т. 40. Ч. 1. С. 245-246.
МЕДВЕДЕВ А.П. и др. Ветеринарная
наука - производству // Научные труды. - 2009. - Вып. 40. - Т. 2. - С. 30-36.
(57)
Способ получения антигенов сальмонелл, выбранных из Salmonella dublin КМИЭВВ115, Salmonella typhimurium КМИЭВ-В128 или Salmonella choleraesuis КМИЭВ-В131,
заключающийся в том, что клетки сальмонелл культивируют на мясопептонном бульоне
Хоттингера, осаждают центрифугированием, ресуспензируют в 0,05-0,2 %-ном растворе
солянокислого гидроксиламина до получения концентрации 8-10 млрд. клеток в 1 мл, полученную суспензию инкубируют при 30-38 °С в течение 24-48 ч, прогревают на водяной
бане при 60-65 °С в течение 20 мин, охлаждают при 2-4 °С в течение 6-8 ч, центрифугируют 18-20 мин при 10000-12000g, после чего отбирают содержащий антигены надосадок.
Изобретение относится к области бактериологии и может быть использовано в биотехнологии для приготовления моно- и ассоциированных вакцин для профилактики кишечных инфекций животных и эритроцитарных диагностикумов для регистрации
противосальмонеллезных агглютининов.
В ветеринарной бактериологии и биотехнологии применяют ряд штаммов сальмонелл
для производства вакцин и приготовления эритроцитарных диагностикумов, которые различаются по серовариантной принадлежности. В Республике Беларусь от сельскохозяйственных животных наиболее часто выделяют сероварианты сальмонелл Salmonella
dublin, Salmonella typhimurium и Salmonella choleraesuis.
BY 17436 C1 2013.08.30
Так, известен способ извлечения антигенов из бактериальных клеток энтеробактерий,
разработанный Буавеном. Сущность способа заключается в обработке бактериальных клеток 0,25N раствором трихлоруксусной кислоты [1].
Так, известен способ получения антигенов бактерий, заключающийся в том, что микробную массу обрабатывают смесью фенол/вода при температуре 3-5 либо 65 °С [2].
Преимуществом данных способов является высокая степень очистки получаемого антигенного препарата, недостатком - неполное извлечение антигена из микробной клетки и
снижение его иммуногенности в результате повреждения при извлечении.
Также известен способ извлечения антигенов бактерий путем триптического растворения клеток. Сущность способа заключается в том, что микробные клетки бактерий кишечной группы обрабатываются 0,025 %-ным раствором трипсина в течение 60 ч при
37 °С [3].
Преимущество данного способа заключается в том, что он обеспечивает высокий выход антигена, однако существенным недостатком является загрязнение препарата продуктами распада микробной клетки, кроме того, обязательная последующая очистка
препарата приводит к потере антигенов.
Так, известен способ получения антигенов, основанный на воздействии на микробные
клетки разницы температур. Сущность способа заключается в многократном резком замораживании и оттаивании бактериальных клеток [4].
Преимуществом данного способа является то, что получаемые препараты малотоксичны.
Недостаток состоит в том, что антигены малоиммуногенны и содержат много балластных веществ.
Так, известен способ получения поверхностных адгезивных антигенов на основе
штамма Escherichia coli, включающий культивирование бактериальных клеток штамма на
мясопептонном бульоне Хоттингера, осаждение клеток посредством центрифугирования
при 6000 об/мин в течение 20 мин, ресуспензирование осадка бактериальных клеток в
фосфатно-мочевинном буфере до получения суспензии с концентрацией 100 млрд/мл,
прогревание суспензии при температуре 60-65 °С в течение 20 мин для экстрагирования
адгезивных антигенов, центрифугирование полученной суспензии при 10000 об/мин в течение 30 мин [5].
Недостатком указанного способа является применение большого количества мочевины, что затруднило бы получение антигенов в промышленных условиях, а также использование высокой концентрации бактериальных клеток (100 млрд/мл), что уменьшает
выход получаемых антигенов.
Задачей предлагаемого способа является получение высокоиммуногенных, нетоксичных поверхностных антигенов сальмонелл из специфичных для Республики Беларусь
штаммов-антигенов для конструирования вакцин против сальмонеллеза и ассоциированных вакцин против кишечных инфекций, а также для приготовления эритроцитарных диагностикумов для контроля напряженности противосальмонеллезного иммунитета.
Поставленная задача реализуется тем, что способ получения антигенов сальмонелл,
выбранных из Salmonella dublin КМИЭВ-В115, Salmonella typhimurium КМИЭВ В128,
Salmonella choleraesuis КМИЭВ В131, заключается в том, что клетки сальмонелл культивируют на мясопептонном бульоне Хоттингера, осаждают центрифугированием, ресуспензируют в 0,05-0,2 %-ном растворе солянокислого гидроксиламина до получения
концентрации 8-10 млрд. клеток в 1 мл, полученную суспензию инкубируют при 30-38 °С
в течение 24-48 ч, прогревают на водяной бане при 60-65 °С в течение 20 мин, охлаждают
при 2-4 °С в течение 6-8 ч, центрифугируют 18-20 мин при 10000-12000g, после чего отбирают содержащий антигены надосадок.
Поставленная задача достигается за счет того, что предлагаемый способ использования солянокислого гидроксиламина является щадящим, так как при обработке клетки ча2
BY 17436 C1 2013.08.30
стично сохраняют свою структуру, поэтому продукты их распада не загрязняют получаемый препарат. Прогревание при 60-65 °С и последующее охлаждение обеспечивает больший выход веществ полисахаридной природы, отвечающих за специфичность
O-антигенов. Дальнейшее центрифугирование и использование в качестве источника антигенов деканта, т.е. надосадка, позволяет освободиться от остатков микробных клеток,
что снижает реактогенность антигенов.
Пример 1. Получение антигенов сальмонелл, выбранных из Salmonella dublin
КМИЭВ-В115, Salmonella typhimurium КМИЭВ-В128, Salmonella choleraesuis КМИЭВ-В131.
Бактериальные клетки каждого штамма-антигена сальмонелл культивируют на мясопептонном бульоне Хоттингера, после культивирования центрифугируют полученные
культуры штаммов при 6000 об/мин в течение 20 мин для отделения бактериальных клеток от питательной среды. Осадок бактериальных клеток ресуспензируют (разбавляют)
0,05-0,2 %-ным раствором солянокислого гидроксиламина до получения суспензии клеток
с концентрацией 8-10 млрд/мл. Экстракцию поверхностных антигенов осуществляют за
счет инкубирования полученной суспензии 24-48 ч при 30-38 °С в термостате, после чего
подвергают термической обработке 20 мин при 60-65 °С на водяной бане и охлаждают
при 2-4 °С в течение 6-8 ч. Для осаждения бактериальных клеток суспензию центрифугируют 18-20 мин при 10000-12000g, в результате получают осадок бактериальных клеток и
надосадок, содержащий поверхностные антигены.
Пример 2. Определение безвредности антигенов сальмонелл, выбранных из Salmonella dublin КМИЭВ-В115, Salmonella typhimurium КМИЭВ-В128, Salmonella choleraesuis
КМИЭВ-В131.
Полученный образец поверхностных антигенов инъецируют 5-10 белым мышам массой 14-16 г внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл. За животными ведут наблюдение в течение
10 дней, учитывая их клиническое состояние. Животные должны оставаться клинически
здоровыми.
Пример 3. Определение иммуногенности и антигенной активности антигенов сальмонелл, выбранных из Salmonella dublin КМИЭВ-В115, Salmonella typhimurium КМИЭВВ128, Salmonella choleraesuis КМИЭВ-В131.
Образец каждого поверхностного антигена сальмонелл однократно инъецируют белым мышам массой 14-16 г подкожно в дозе 0,4-0,44 мг/мл белка или 5,6-6,0 мкг/мл полисахаридов. На 12-й день по 5 голов из группы декапитируют для получения сыворотки
крови и определения титра антител в реакции агглютинации. Остальных животных, разделенных на группы, заражают 4 ЛД50 (Salmonella dublin, Salmonella typhimurium и Salmonella choleraesuis) гомологичных штаммов, ведут наблюдение в течение 10 дней.
Антигенную активность оценивали по титру специфических антител в реакции агглютинации, иммуногенность - согласно выживаемости белых мышей после заражения соответствующими штаммами (таблица).
Антигенная активность и иммуногенность антигенов сальмонелл, выбранных из
Salmonella dublin КМИЭВ-В115, Salmonella typhimurium КМИЭВ-В128,
Salmonella choleraesuis КМИЭВ-В131
Антиген
Антигенная активность, log2 Выживаемость, %
Salmonella dublin
Salmonella typhimurium
Salmonella choleraesuis
6
7
7
100,0
100,0
20,0
Полученные протективные антигены сальмонелл обладают антигенной активностью и
иммуногенностью.
3
BY 17436 C1 2013.08.30
Источники информации:
1. Петросян Е.А. Комплексные антигены тифо-паратифозной группы бактерий. - М.:
Медгиз, 1961. - С. 10-12.
2. Петросян Е.А. Комплексные антигены тифо-паратифозной группы бактерий. -М.:
Медгиз, 1961. - С. 17-19.
3. Петросян Е.А. Комплексные антигены тифо-паратифозной группы бактерий. - М.:
Медгиз, 1961. - С. 25-26.
4. Петросян Е.А. Комплексные антигены тифо-паратифозной группы бактерий. - М.:
Медгиз, 1961. - С. 32-33.
5. Пирожков М.К. Биологические препараты для специфической профилактики и терапии эшерихиоза животных: Автореф. дис. … докт. вет. наук. ФГУ ВГНКИ. - М., 2002. 26 с.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
86 Кб
Теги
by17436, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа