close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY17468

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2013.08.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
A 01H 1/02
(2006.01)
СПОСОБ ИНТРОГРЕССИИ ЦЕННЫХ ГЕНОВ ОТ 1 ЕBN ДИКОГО
ДИПЛОИДНОГО ВИДА КАРТОФЕЛЯ В ГЕНОМ КАРТОФЕЛЯ
ВИДА SOLANUM TUBEROSUM
(21) Номер заявки: a 20101930
(22) 2010.12.30
(43) 2012.08.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Ермишин Александр Петрович; Воронкова Елена Васильевна; Полюхович Юлия Владимировна; Маханько Ольга Владимировна
(BY)
BY 17468 C1 2013.08.30
BY (11) 17468
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) BY 11631 C1, 2009.
RU 2158496 C2, 2000.
SU 731934, 1980.
ВИШНЯКОВА М.А. Ботанический журнал. - 1997. - Т. 82. - № 8. - С. 1-11.
(57)
Способ интрогрессии ценных генов от 1 EBN дикого диплоидного вида картофеля в
геном картофеля вида Solanum tuberosum, заключающийся в том, что получают линию
картофеля, представляющую собой линию-посредник, способную скрещиваться с 1 EBN
диким диплоидным видом картофеля, путем скрещивания дикого диплоидного вида Solanum verrucosum с видом Solanum tuberosum при использовании вида Solanum tuberosum в
качестве материнской формы, получения гибридов картофеля поколения F1, получения
путем их самоопыления или сестринского скрещивания гибридов картофеля поколения F2
и отбора среди них гибрида картофеля с привнесенным от вида Solanum verrucosum аллелем гена Sv в гомозиготном состоянии, затем получают промежуточный гибрид 1 EBN ди-
Фиг. 1
BY 17468 C1 2013.08.30
кого диплоидного вида картофеля с линией-посредником, при этом линию-посредник используют в качестве материнской формы, и скрещивают полученный промежуточный гибрид с картофелем вида Solanum tuberosum, при этом картофель вида Solanum tuberosum
используют в качестве опылителя.
Изобретение относится к селекции растений, например картофеля Solanum tuberosum,
и может использоваться в сельском хозяйстве.
В селекции растений, например картофеля Solanum tuberosum, применяют метод отдаленной гибридизации между культурным картофелем и 1 EBN диплоидными дикими видами картофеля, например Solanum bulbocastanum, Solanum pinnatisectum, Solanum
polyadenium, Solanum commersonii и др., с целью интрогрессии в селекционный материал
ценных генов диких видов. 1 EBN диплоидные дикие виды картофеля имеют диплоидный
набор хромосом (2n = 2x = 24), в отличие от культурного картофеля, который является автотетраплоидом (2n = 4x = 48, 4 EBN). Поэтому для вовлечения их в гибридизацию с
культурным картофелем целесообразно использовать дигаплоиды Solanum tuberosum
(2n = 2x = 24, 2 EBN). Однако гибридизация между этими видами и дигаплоидами Solanum tuberosum сильно затруднена из-за жестких межвидовых пре- и постзиготных репродуктивных барьеров.
Известен способ получения гибридов между культурным картофелем Solanum tuberosum и 1 EBN дикими видами картофеля, основанный на проведении промежуточных
скрещиваний ("bridge crosses") для преодоления межвидовых репродуктивных барьеров
[Hermsen, 1994]). Считается, что наряду с двумя несовместимыми видами, например диким видом и культурным картофелем, может быть третий вид картофеля (вид-посредник "bridge species"), который скрещивается с диким видом, а полученные гибриды можно
непосредственно, или после изменения их плоидности, или через гибридизацию с очередным видом-посредником вовлечь в гибридизацию с культурным картофелем, что в итоге
позволяет осуществить интрогрессию ценных генов дикого вида в селекционный материал.
В качестве посредника для вовлечения в скрещивания дикого диплоидного вида картофеля S. bulbocastanum (2x, 1 EBN) с S. tuberosum в этом способе использовали аллотетраплоидный (4x, 2 EBN) вид S. acaule. У полученных триплоидных двухвидовых гибридов AB
(acaule-bulbocastanum) удвоили число хромосом, затем гексаплоиды S. acaule × S. bulbocastanum 6x (AB)2 скрестили с видом-посредником S. phureja (2x, 2 EBN), получив тетраплоидный гибрид 4x (AB)2P, который можно было скрещивать с сортами культурного картофеля
S. tuberosum (4x, 4 EBN). Недостатки способа следующие. Из-за низкой эффективности гибридизации на всех этапах его осуществления требуется проведение большого объема
скрещиваний. Длинная цепочка скрещиваний с посредниками и манипуляции с плоидностью гибридов занимают длительный период времени, удвоение плоидности гибридов связано с использованием сложных методов митотического удвоения хромосом. В результате
эффективность метода оказалась невысокой: было получено 36 четырехвидовых гибридных
растений АВРТ от опыления, в общей сложности 18616 цветков.
Наиболее близким техническим решением является способ получения гибридов между культурным картофелем S. tuberosum и 1 EBN дикими видами картофеля, который основан на получении промежуточных гибридов с участием дикого диплоидного вида S.
verrucosum (2n = 2x = 24, 2 EBN), характерной особенностью которого является отсутствие пестичных S-РНКаз [Jansky, Hamernik, 2009]. Способ включает гибридизацию между образцами дикого диплоидного вида S. verrucosum, которые используют в качестве
материнских форм, и мужски фертильными образцами 1 EBN диких видов картофеля, которые используют в качестве опылителей. Полученные промежуточные гибриды беккроссируют дигаплоидами S. tuberosum или диплоидными межвидовыми гибридами, а затем
дигаплоидами S. tuberosum. Для переноса интрогрессированных от 1 EBN диких видов
2
BY 17468 C1 2013.08.30
картофеля ценных генов в селекционный материал S. tuberosum (2n = 4x = 48) отобранные
в беккроссных поколениях генотипы переводят на тетраплоидный уровень с помощью
митотического или мейотического удвоения хромосом.
Отсутствие пестичных S-РНКаз у S. verrucosum позволяет решить проблему презиготной
несовместимости, имеющей место между многими 1 EBN дикими видами и 2 EBN видами
картофеля: пыльца любого вида картофеля, в том числе 1 EBN диких видов, способна
беспрепятственно расти в пестиках S. verrucosum. Однако образование жизнеспособных
гибридных семян затруднено из-за нарушения развития их эндосперма, обусловленного
различиями EBN родительских видов. Тем не менее, можно предположить, что благодаря
отсутствию презиготных барьеров в скрещиваниях между S. verrucosum (2 EBN) и 1 EBN
видами возможно завязывание небольшого количества семян вопреки правилу совпадения
эффективной плоидности родительских видов.
Этот способ имеет следующие недостатки. Завязываемость жизнеспособных семян
при гибридизации между видом-посредником S. verrucosum и некоторыми 1 EBN дикими
видами картофеля, как правило, очень низкая. Так, с помощью описанного способа не были получены гибриды между S. verrucosum и одним из наиболее ценных для селекции диких видов картофеля S. bulbocastanum. Не удалось получить такие гибриды и Dinu et al.
(2005), несмотря на большой объем скрещиваний и использование специальных приемов
(культура гибридных зародышей in vitro). Полученные гибриды между S. verrucosum и
1 EBN дикими видами картофеля практически не образуют клубни в условиях Беларуси,
что затрудняет их беккроссирование дигаплоидами S. tuberosum. Эти гибриды с трудом
скрещиваются с дигаплоидами S. tuberosum при использовании в качестве материнских
форм из-за действия факторов презиготной несовместимости, полученных от 1 EBN дикого вида (пестичных РНКаз 1 EBN дикого вида). Мужски фертильные межвидовые гибриды не скрещиваются с дигаплоидами S. tuberosum при использовании в качестве
опылителей по причине односторонней несовместимости (для успешной гибридизации
требуются акцепторные формы S. tuberosum). Если их удается беккроссировать дигаплоидами S. tuberosum, используя в качестве материнских форм, получается мужски стерильное потомство, что является результатом взаимодействия цитоплазмы S. verrucosum с
ядерными генами S. tuberosum (ядерно-цитоплазматическая мужская стерильность). Это
не позволяет использовать мейотическое удвоение хромосом для перевода беккроссов на
тетраплоидный уровень (не образуется фертильная нередуцированная пыльца).
Сущность изобретения состоит в решении задачи повышения эффективности гибридизации между посредником и 1 EBN дикими видами картофеля и упрощения процедуры
беккроссирования полученных гибридов дигаплоидами S. tuberosum.
Решение задачи состоит в том, что получают линию картофеля, представляющую собой
линию-посредник, способную скрещиваться с 1 EBN диким диплоидным видом картофеля, путем скрещивания дикого диплоидного вида Solarium verrucosum с видом Solanum
tuberosum при использовании вида Solatium tuberosum в качестве материнской формы, получения гибридов картофеля поколения F1, получения путем их самоопыления или сестринского скрещивания гибридов поколения F2 и отбора среди них гибрида картофеля с
привнесенным от вида Solanum verrucosum аллелем гена Sv в гомозиготном состоянии,
затем получают промежуточный гибрид 1 EBN дикого диплоидного вида картофеля с линией-посредником, при этом линию-посредник используют в качестве материнской формы, и скрещивают полученный промежуточный гибрид с картофелем вида Solanum
tuberosum, при этом картофель вида Solanum tuberosum используют в качестве опылителя.
У картофеля презиготные барьеры ассоциируют с функционированием так называемого S-локуса (локализован на хромосоме I). Результат гибридизации как внутривидовой,
так и межвидовой, определяется взаимодействием продуктов пестичного и пыльцевого
компонентов S-локуса. Продуктами пестичного компонента S-локуса являются S-РНКазы,
которые содержатся в пестиках вне зависимости от факта опыления, могут свободно про3
BY 17468 C1 2013.08.30
никать в цитоплазму пыльцевых трубок и, действуя как ингибитор процесса трансляции,
останавливать их рост. Этот своеобразный барьер могут преодолеть лишь те пыльцевые
трубки, которые содержат определенные продукты, способные дезактивировать соответствующие РНКазы. В качестве кандидатов в продукты пыльцевого компонента S-локуса
рассматривают так называемые SLF-протеины (F-box proteins of S locus), которые могут
узнавать соответствующие S-РНКазы и запускать систему деградации S-РНКаз.
Есть основания полагать, что межвидовая несовместимость у картофеля обусловлена
тем, что процесс взаимодействия пыльцевого и пестичного компонентов S-локуса при гибридизации отдаленных в эволюционном отношении видов нарушен, поскольку дезактивация соответствующих пестичных РНКаз может произойти только с помощью SLFпротеинов того же или близкородственного вида. 1 EBN диплоидные виды картофеля,
многие из которых произрастают в Мексике, - группа наиболее древних с точки зрения
эволюции клубненосных видов Solanum. Поэтому неслучайно, что для многих 1 EBN диплоидных видов картофеля характерна высокая степень выраженности презиготных барьеров несовместимости при гибридизации их с дигаплоидами S. tuberosum. Особенно это
относится к ценному для селекции виду картофеля S. bulbocastanum, при гибридизации
которого с дигаплоидами S. tuberosum имеет место полное ингибирование пыльцы в пестиках вне зависимости от использования разных генотипов компонентов скрещивания
[Маханько, 2008].
Постзиготными считаются барьеры, возникающие после проникновения пыльцевых
трубок в завязь и оплодотворения. Прежде всего, они обусловлены гибелью зародышей
вследствие недоразвития эндосперма и связаны с понятием EBN (балансовое число эндосперма) вида. Каждому виду картофеля предписывается определенный специфический
показатель (его EBN), значение которого определяет поведение этого вида (формирование
эндосперма гибридных семян) при гибридизации с другими видами. Для успешной гибридизации EBN родительских форм должны совпадать, чтобы эндосперм, а следовательно, и
семя развивались нормально. EBN вида может быть не равен его плоидности, оно является мерилом его "эффективной плоидности". Для каждого вида определена его эффективная плоидность, что позволило сгруппировать виды по группам скрещивания - 2x(1 EBN),
2x(2 EBN), 3x(2 EBN), 4x(2 EBN), 4x(4 EBN) и 6x(4 EBN) [Hanneman, 1999].
Благодаря наличию в гомозиготном состоянии S. генов (SvSv), привнесенных от
S. verrucosum, SvSv-линии не образуют пестичных РНКаз. Поэтому они, так же как и S.
verrucosum не имеют презиготных барьеров в скрещиваниях с 1 EBN дикими видами картофеля при использовании их в качестве материнских форм. Соответственно, в таких
скрещиваниях возможно завязывание небольшого количества гибридных семян вопреки
правилу совпадения эффективной плоидности родительских форм. По сравнению с S. verrucosum растения SvSv-линий отличаются культурным типом куста, большей мощностью,
цветут более интенсивно и продолжительно, способны завязывать больше гибридных семян, способны формировать клубни в условиях Беларуси.
Промежуточные гибриды между SvSv-линиями и 1 EBN дикими видами картофеля в
качестве одного из родителей (SvSv-линии) имеют относительно культурную форму. Благодаря этому они лучше приспособлены к климатическим условиям Беларуси (умеренные
широты, длинный летний день), в силу чего обладают более высокой способностью к
клубнеобразованию. Они несут большее количество признаков культурного картофеля и
меньшее количество нежелательных для селекции признаков дикого вида, чем растения
S. verrucosum. Поэтому требуется меньше поколений беккросса дигаплоидами S. tuberosum промежуточных гибридов между 1 EBN дикими видами картофеля и посредником, чтобы усилить культурные признаки и избавиться от нежелательных признаков
дикого вида. Это свойство SvSv-линий может быть усилено в ходе последующей селекции,
включающей их беккроссирование дигаплоидами S. tuberosum в сочетании с отбором гомозигот SvSv. Гибриды между SvSv-линиями и 1 EBN дикими видами картофеля более
4
BY 17468 C1 2013.08.30
мощные, чем гибриды между S. verrucosum и 1 EBN дикими видами картофеля. Они цветут более обильно и в течение более длительного времени, что упрощает процедуру их
беккроссирования дигаплоидами S. tuberosum.
Растения промежуточных гибридов между посредником (SvSv-линией или
S. verrucosum) имеют следующее строение S-локуса: SvSд.в., где Sv - аллель S-гена от Solarium
verrucosum, а Sд.в. - аллель S-гена от 1 EBN дикого вида, использованного в качестве
опылителя. Соответственно, в пестиках таких гибридов будет образовываться S-РНКаза
дикого вида (аллель Sv от S. verrucosum является нефункционирующим). В силу гемизиготности активность пестичной РНКазы у гибридов ниже, чем у родительского дикого вида,
поэтому презиготные барьеры при беккроссировании промежуточных гибридов дигаплоидами S. tuberosum выражены не так сильно, как при гибридизации непосредственно между дигаплоидами S. tuberosum и 1 EBN дикими видами картофеля. В результате возможно
получение семян первого поколения беккросса (BC1) при использовании промежуточных гибридов в качестве материнских форм. Получение последующих поколений беккросса
культурным картофелем значительно упрощается в силу того, что среди ВС1 резко
уменьшается доля генотипов с аллелем Sд.в., то есть образующих S-РНКазы дикого вида.
Промежуточные гибриды и их беккроссное потомство на основе SvSv-линий имеют
цитоплазму S. tuberosum, что обеспечивает их мужскую фертильность. В то же время
практически все гибриды между S. verrucosum и дигаплоидами S. tuberosum мужски стерильны (ядерно-цитоплазматическая мужская стерильность) [Abdalla, Hermsen, 1972].
Мужская фертильность промежуточных гибридов и их беккроссного поколения благодаря
наличию у них цитоплазмы S. tuberosum делает возможным использование мейотического
удвоения хромосом у беккроссов для перевода их на тетраплоидный уровень с помощью
мейотического удвоения хромосом, которое считается более простым и эффективным по
сравнению с митотическим удвоением хромосом.
Присутствие в пестиках промежуточных гибридов S-РНКазы дикого родительского
вида может существенно снизить завязываемость семян при их беккроссировании дигаплоидами S. tuberosum, поскольку S-локус последних не кодирует образование ингибиторов
РНКаз, способных дезактивировать S-РНКазы дикого родительского вида. Возможность
использовать промежуточные гибриды в качестве опылителей позволяет решить проблему презиготной несовместимости с дигаплоидами S. tuberosum, поскольку в пыльце гибридов в силу расщепления по 8-локусу будут пыльцевые зерна, несущие как аллель Sд.в.,
так и Sv. Пыльцевые зерна с аллелем Sv, как известно, кодируют ингибиторы S-РНКаз,
способные дезактивировать S-РНКазы, находящиеся в пестиках дигаплоидов S. tuberosum,
относящихся к акцепторным генотипам по отношению к S. verrucosum (способным опыляться S. verrucosum) [Hermsen et al. 1974]. Однако в распоряжении исследователей не
всегда имеются акцепторные генотипы S. tuberosum. Проблему беккроссирования промежуточных гибридов дигаплоидами S. tuberosum можно легко решить, если опылить пыльцой фертильных промежуточных гибридов материнские формы SvSv-линий. Половина
потомства от таких скрещиваний будет гомозиготами SvSv, которые в силу отсутствия у
них в пестиках S-РНКаз будут гарантированно скрещиваться с дигаплоидами S. tuberosum. Тот же результат достигается при опылении материнских форм S. verrucosum
фертильной пыльцой промежуточных гибридов. Однако в этом случае потомство будет
иметь значительно большую долю генома, полученную от диких видов, в связи с чем потребуется больше беккроссов культурным картофелем по сравнению с вариантом использования SvSv-линий. Кроме того, беккроссное потомство на цитоплазме S. verrucosum
будет мужски стерильным.
Сопоставительный анализ заявляемого решения с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается от известного тем, что используют в качестве посредника вместо образцов S. verrucosum специально созданные SvSv-линии. Это дает возможность повысить по
сравнению с прототипом эффективность гибридизации между посредником и 1 EBN дикими
5
BY 17468 C1 2013.08.30
видами картофеля. Более высокая жизнеспособность, интенсивность цветения и способность
к клубнеобразованию промежуточных гибридов между посредником и 1 EBN дикими видами
картофеля позволяет упростить процедуру и уменьшить продолжительность их беккроссирования дигаплоидами S. tuberosum. Использование SvSv-линий в качестве материнских форм
при опылении их фертильной пыльцой промежуточных гибридов позволяет получать мужски
фертильное потомство, которое легко скрещивается с дигаплоидами S. tuberosum. Это значительно упрощает процедуру беккроссирования промежуточных гибридов дигаплоидами S.
tuberosum и делает возможным использование мейотического удвоения хромосом у беккроссов для перевода их на тетраплоидный уровень.
Фиг. 1 представляет схему создания SvSv-линий.
Фиг. 2 представляет результаты гибридизации между рядом образцов S. verrucosum и
1 EBN дикими видами картофеля.
Фиг. 3 представляет результаты гибридизации между рядом SvSv-линий и 1 EBN дикими видами картофеля, из которой видно, что завязываемость гибридных семян при использовании в качестве материнских форм SvSv-линий выше, чем при использовании S.
verrucosum.
Фиг. 4 представляет результаты оценки всхожести семян, клубнеобразования и фертильности пыльцы у гибридов F1 между S. verrucosum и 1 EBN дикими видами картофеля
и гибридов F1 между SvSv-линиями и 1 EBN дикими видами картофеля. Эти результаты
свидетельствует о более высокой по сравнению с прототипом всхожести семян, способности к клубнеобразованию и массе клубней с растения гибридов F1 между SvSv-линиями и 1
EBN дикими видами картофеля. Среди этих гибридов достоверно меньше стерильных и
низкофертильных генотипов и больше генотипов со средней и высокой функциональной
фертильностью пыльцы.
Фиг. 5 представляет результаты беккроссирования дигаплоидами S. tuberosum гибридов F1 между S. verrucosum и 1 EBN дикими видами картофеля, из которой видно, что гибриды на основе SvSv-линий не уступают гибридам на основе S. verrucosum по
способности скрещиваться в качестве материнских форм с дигаплоидами S. tuberosum.
Предлагаемый способ интрогрессии ценных генов от 1 EBN дикого диплоидного вида
картофеля в геном картофеля вида Solarium tuberosum реализован следующим образом.
Создание SvSv-линий.
В качестве исходного материала использовали 29 образцов самосовместимого дикого
диплоидного вида Solanum verrucosum Schltdl. (2n = 2x = 24), семена которых были получены из Национального генного банка по картофелю США (NRSP-6). Эти образцы использовали в скрещиваниях в качестве опылителей с 13 фертильными вторичными дигаплоидами картофеля Solanum tuberosum L., 28 первичными дигаплоидами сортов Ласунак,
Орбита, Альпинист (Беларусь), Atzimba, Ireri, Nortena (Мексика), Iris (Польша), Granola
(Германия), Agria (Нидерланды) из коллекции лаборатории генетики картофеля Института
генетики и цитологии НАН Беларуси. Гибридизацию между дигаплоидами Solanum tuberosum и образцами Solanum verrucosum проводили следующим образом.
Для проведения гибридизации растения высаживали в грунт оранжереи из культуры in
vitro или путем посева семян в начале мая. Растения высаживали рядами: расстояние между
рядами 70 см, между растениями в ряду 50 см. Режим выращивания растений: температура воздуха 20-25 °С - днем, 15-20 °С - ночью, влажность 70 %, освещение естественное.
Для стимуляции цветения растения, достигшие высоты 35-40 см, подвязывали к кольям,
обнажали от почвы место отхождения корней от стебля. Образующиеся столоны обрывали или оставляли над поверхностью почвы.
Для получения SvSv-линий растения дигаплоидов Solanum tuberosum использовали в
качестве материнских форм. Накануне опыления проводили кастрацию бутонов, начинающих приобретать окраску (нижняя часть бутонов в это время имеет белый цвет, верхняя
часть бутонов - цвет, характерный для цветков опыляемого образца), путем удаления
6
BY 17468 C1 2013.08.30
пыльников с помощью пинцета. Также удаляли в соцветии все раскрытые цветки, полураскрытые и незрелые (зеленые или начинающие приобретать беловатую окраску) бутоны.
Образцы Solanum verrucosum использовали в качестве опылителей. Сбор пыльцы проводили следующим образом: распустившиеся цветы собирали, подсушивали 1 сутки при
комнатной температуре, затем вытряхивали из них пыльцу с помощью электрического
вибратора, например, электробритвы типа Микма 100, 101, Эра и др. Собранную пыльцу
переносили в лунки пластмассовых планшетов, применяемых для иммуноферментного
анализа или пластиковые одноразовые чашки Петри диаметром 5 см. Опыление кастрированных цветков дигаплоидов Solanum tuberosum осуществляли путем погружения рыльца
пестика в пыльцу. Использовали свежесобранную пыльцу или пыльцу, хранившуюся в
морозильной камере при температуре - 10 °С не более 5 дней. На опыленное соцветие вешали этикетку, в которой была указана дата опыления и наименование родительских
форм. Применяли опыление смесью пыльцы или опыление пыльцой отдельных генотипов
Solanum verrucosum (при опылении смесью пыльцы завязываемость семян значительно
выше). Смесь пыльцы готовили непосредственно перед гибридизацией путем объединения и тщательного перемешивания в лунке равных объемов пыльцы разных образцов Solanum verrucosum.
Пыльцевые трубки самосовместимого Solanum verrucosum не способны расти в пестиках
самонесовместимых видов, в том числе дигаплоидов Solanum tuberosum (односторонняя
несовместимость). Тем не менее, обнаружены отдельные, так называемые акцепторные,
генотипы дигаплоидов Solanum tuberosum, которые могут завязывать семена при опылении Solanum verrucosum. Показано, что акцепторность Solanum tuberosum находится под
контролем двух генов: гена акцепторности A и ингибитора акцепторности I (акцепторными являются генотипы A*ii) [Hermsen et al., 1974] (фиг. 1).
В результате проведенной гибридизации между дигаплоидами Solanum tuberosum и
Solanum verrucosum в изученной коллекции были обнаружены 4 акцепторных генотипа:
1) IGC 98/109-5: первичный дигаплоид сорта Nortena (Мексика); 2) гибрид Solanum tuberosum 881-28: [(Yu1.2 × IGC-203/5.7) × Yu1.2] × Yu1.2; 3) гибрид 895-40: [(Yu1.2 × IGC203/5.7) × Yu1.2] × Yul.2; 4) гибрид 885-21: [(Yu1.2 × 203/5.7 -20) × Yu1.2] × A15, где Yu
1.2 - клон от свободного опыления первичного дигаплоида сорта Юбель, IGC-203/5.7 вторичный дигаплоид на основе сорта Полесский розовый), А15 - клон S. chacoense.
Через месяц после опыления на завязавшиеся ягоды надевали марлевые мешочки и
подвязывали их к стеблю материнского растения. Гибридные семена извлекали из созревших ягод с помощью скальпеля или пинцета, подсушивали и хранили в бумажных пакетах при комнатной температуре. Для посева их замачивали на сутки в 0,1 % растворе
гиббереллина и высевали в начале апреля в плошки с торфяной почвой "Двина", смоченной водой. Глубина заделки семян в почву 0,5 см.
Растения гибридов F1 между акцепторными дигаплоидами S. tuberosum и S. verrucosum самоопыляли или проводили сестринские скрещивания (между разными растениями одной и той же гибридной комбинации) для получения гибридов F2. Целью получения
поколения F2 является отбор гибридов, имеющих аллель Sv в гомозиготном состоянии
(SvSv). Для большинства гибридов F1 была характерна высокая функциональная фертильность пыльцы, что обеспечило высокую результативность гибридизации с целью получения F2. Для дигаплоидов S. tuberosum характерна гаметофитная самонесовместимость.
Тем не менее, среди них можно отобрать отдельные мутантные формы, способные к самоопылению. В настоящей работе в качестве материнских форм для получения гибридов
с S. verrucosum использовано потомство самосовместимых дигаплоидов S. tuberosum, которые были отобраны нами ранее. Неслучайно поэтому отдельные гибриды F1 S. tuberosum Ч S. verrucosum оказались способными с высокой эффективностью завязывать
семена при самоопылении. Те гибриды F1, которые были самонесовместимы, несложно
было вовлечь в гибридизацию с сестринским формами: достаточно различие по одному из
7
BY 17468 C1 2013.08.30
S-аллелей родительских форм, чтобы гибридизация была успешной. Семена, полученные
в результате самоопыления гибридов F1, собирали и хранили, как описано выше. Их высевали на следующий год для получения растений F2, среди которых проводили отбор Svгомозигот (SvSv-линий).
Для выделения Sv-гомозигот проводили отбор по данным анализа роста в пестиках гибридов пыльцевых трубок мексиканских видов S. bulbocastanum и S. pinnatisectum, несовместимых с S. tuberosum. Наблюдение за ростом пыльцевых трубок в пестиках
осуществляли по методике, описанной в руководстве Абрамовой с соавторами (1981) с
помощью люминесцентного микроскопа "Люмам И-3". Пестики опыленных цветков (3-5
штук от каждой комбинации скрещивания) собирали через 48 часов после опыления и
фиксировали в ацетоалкоголе (3:1). При приготовлении препаратов растительный материал дважды отмывался от фиксатора в дистиллированной воде, затем выдерживался в течение 20 минут в 10 % спиртовом растворе КОН и окрашивался далее в растворе красителя
анилинового синего (0,1 % раствор анилинового синего в 0,05M K2HPO4, pH12), после чего приготавливались давленые препараты в 50 % водном растворе глицерина. Рост пыльцевых трубок оценивали в баллах: 0 - ингибирование роста пыльцевых трубок
непосредственно под рыльцем пестика, 1 - ингибирование роста пыльцевых трубок в
верхней трети пестика, 2 - ингибирование на уровне середины-нижней трети пестика, 3 завязи достигает 1-5 пыльцевых трубок, 4 - завязи достигает 15-30 пыльцевых трубок, 5 завязи достигает толстый жгут пыльцевых трубок.
В качестве SvSv-линий рассматривали растения, которые имели показатель роста
пыльцевых трубок мексиканских видов, равный пяти баллам. Подобную картину можно
наблюдать при опылении такой пыльцой S. verrucosum, для которого характерно отсутствие пестичных S-РНКаз. Отобранные SvSv-линии непосредственно включали в гибридизацию с 1 EBN дикими видами картофеля, либо получали клубни, из которых на
следующий год выращивали растения SvSv-линий для гибридизации с 1 EBN дикими видами картофеля или дигаплоидами S. tuberosum (для дальнейшего беккроссирования).
Получение промежуточных гибридов между посредником и 1 EBN дикими видами
картофеля.
Для вовлечения в гибридизацию с целью переноса в селекционный материал ценных
генов от 1 EBN диких видов картофеля проводили их гибридизацию разными образцами
S. verrucosum (прототип) и отобранными SvSv-линиями (заявляемое решение). В качестве
материала использовали 12 образцов S. verrucosum и 13 SvSv-линий (F2 S.tuberosum ×
× S. verrucosum) (материнские формы), которые скрещивали с мужски фертильными образцами диплоидных 1 EBN видов картофеля S. pinnatisectum, S. polyadenium, S. bulbocastanum. Семена образцов диких видов были получены из Национального генного банка по
картофелю США (NRSP-6): S. verrucosum: PI 190170, PI 195171, PI 195172, PI 275256, PI
275257, PI 310966, PI 498010, PI 570643, PI 570644, PI 570645, PI 545745, PI 498060; S. pinnatisectum: PI275231-275236, PI537023; S. polyadenium: PI230480, PI275238, PI347770,
PI498036; S. bulbocastanum: PI243505, PI243506, PI243512, PI243513, PI255516, PI275191,
PI275192, PI498011. Выращивание растений и гибридизацию проводили, как описано выше, в 2009 г.
В 2010 г семена полученных гибридов высевали, как описано выше, при этом учитывали всхожесть семян (количество взошедших семян/количество высеянных семян ×
× 100 %). У гибридных растений определяли показатели фертильности: способность к
цветению, образование пыльцы и функциональную фертильность пыльцы. Для определения функциональной фертильности пыльцы (далее ФФП) проводили проращивание пыльцы
in vitro по методике "висячей капли", предложенной N. Pallais et al. (1984). Для проращивания пыльцы готовили среду следующего состава:
8
BY 17468 C1 2013.08.30
сахароза - 200 г/л,
H3BO3 - 100 мг/л,
Ca(NO3)2 × 4H2O - 300 мг/л,
MgSO4 × 7H2O - 200 мг/л,
KNO3 - 100 мг/л,
TWEEN,
pH 5,5.
По 3-5 капель среды (5 мкл каждая) наносились на поверхность влажных камер для
проращивания. Пыльца равномерно распределялась по поверхности капель препаровальной иглой и выдерживалась 2-3 часа при комнатной температуре. После чего производился подсчет проросших пыльцевых зерен. Учитывали по 300 пыльцевых зерен с образца в
нескольких полях зрения микроскопа (увеличение 600Ч). Функциональную фертильность
пыльцы рассчитывали как: ФФП = частота проросших пыльцевых зерен/частота окрашенных пыльцевых зерен Ч 100 %. В группу стерильных и низкофертильных гибридов относили те, которые не цвели, не образовывали пыльцу или имели ФФП ниже 5 %. В группу
среднефертильных относили генотипы, имеющие ФФП от 5 до 10 %, а к высокофертильным относили генотипы с ФФП более 10 %. Скрещивания промежуточных гибридов с дигаплоидами S. tuberosum проводили, как описано выше. Опыление гибридов проводили
смесью пыльцы фертильных дигаплоидов S. tuberosum: 1) 881-10 - клон № 10 комбинации
скрещивания [Yu 1.2 × (Yu1.2 × IGC-203/5.7-20) ]-5 × A15; 2) 882-5 - клон № 5 комбинации скрещивания [Yu 1.2 × (Yu1.2 × IGC-203/5.7-20) ]-5 × А15; 3) 883-6 - клон № 6 комбинации скрещивания (Yu1.2 × IGC-203/5.7-29)-5 × А15; 4) 895-40 - клон № 40 комбинации
скрещивания [Yu 1.2 × (Yu1.2 × IGC-203/5.7-20) ]-5 × Yu1.2, где Yu 1.2 - клон от свободного опыления первичного дигаплоида сорта Юбель, IGC-203/5.7 - клон от самоопыления
вторичного дигаплоида tbr LVD203/5.7 (вторичный дигаплоид на основе сорта Полесский
розовый), A15- S. chacoense. При уборке учитывали у промежуточных гибридов показатели клубнеобразования: способность к клубнеобразованию - количество растений с клубнями/общее количество растений Ч 100 %, а также массу клубней с растения (г).
Источники информации:
1. Hermsen J.G.Th. Introgression of genes from wild species, including molecular and cellular approaches. / In: Potato Genetics (J.E. Bradshaw, G.R. Mackay eds.) - CAB International.
University Press, Cambridge. England, 1994. - P. 515-539.
2. Jansky S.H., Hamernik A.J. 2009. The Use of Solanum Verrucosum as a Bridge Species.
Genetic Resources and Crop Evolution. - No. 56(8). - P. 1107-1116.
3. Маханько О.В. Межвидовая несовместимость в диплоидной селекции картофеля //
Земляробства i ахова раслiн. - 2008. - № 1. - С. 11-14.
4. Hanneman R.E. Jr. The reproductive biology of the potato and its implication for breeding // Potato Research. - 1999. - Vol. 42, extra edition. - P. 283-312.
5. Abdalla M.M., Hermsen J.G.Th. Plasmons and male sterility types in Solanum verrucosum and its interspecific hybrid derivatives// Euphytica. - 1972. - V. 21. - P. 209-220.
6. Hermsen J.G.Th., Olsder J., Hoving E., Jansen P. Acceptance of self-compatible pollen
from Solanum verrucosum in dihaploids from Solanum tuberosum // Fertilization in higher
plants. - 1974. - P. 37-40.
7. Абрамова Л.И., Орлова И.Н., Вишнякова М.А., Константинова Л.Н., Орел Л.И.,
Огородникова В.Ф. Методические указания по цитологической и цитоэмбриологической
технике (для исследования культурных растений). - Ленинград: ВИР, 1981. - 118 с.
8. Pallais N., Fong N., Berrios D. Research on the physiology of potato sexual seed production // Innovative methods for propagating potatoes. CIP Rep. 28th Planning Conf.: Proc. int.
conf. - Lima: CIP, 1984. - P. 149-168.
9
BY 17468 C1 2013.08.30
Фиг. 2
Фиг. 3
10
BY 17468 C1 2013.08.30
Фиг. 4
Фиг. 5
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
11
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
223 Кб
Теги
by17468, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа