close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY17486

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2013.08.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 12N 1/20
C 12R 1/19
(2006.01)
(2006.01)
ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI КМИЭВ-98 ШТАММ-АНТИГЕН
(21) Номер заявки: a 20101339
(22) 2010.09.16
(43) 2012.04.30
(71) Заявитель: Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие "Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского" (BY)
(72) Авторы: Ломако Юрий Васильевич;
Опарина Ирина Владимировна; Новикова Оксана Николаевна; Красочко Петр Альбинович; Яромчик
Ярослав Петрович (BY)
(73) Патентообладатель: Республиканское
научно-исследовательское дочернее
унитарное предприятие "Институт
экспериментальной ветеринарии
им. С.Н.Вышелесского" (BY)
BY 17486 C1 2013.08.30
BY (11) 17486
(13) C1
(19)
(56) RU 2043771 C1, 1995.
BY 10978 C1, 2008.
BY 10884 C1, 2008.
UA 67040 A, 2004.
UA 65820 A, 2004.
RU 2222592 C2, 2004.
ЛОМАКО Ю.В. Специфическая профилактика колибактериоза телят на основе адгезивных антигенов возбудителя.
Автореф. дис. - Минск, 2003. - С. 3, 15.
ЗАЙЦЕВ В.В. и др. Исследования молодых ученых в решении проблем животноводства. Материалы IV международной научно-практической конференции. Витебск, 2005. - С. 69-70.
МАКСИМОВИЧ В.В. и др. Проблемы
повышения эффективности производства животноводческой продукции. Тезисы докладов международной научнопрактической конференции. - Жодино,
2007. - С. 353-355.
(57)
Штамм бактерий Escherichia coli КМИЭВ-98 - штамм-антиген.
Изобретение относится к области бактериологии и может быть использовано в биотехнологии для приготовления моно- и ассоциированных вакцин, гипериммунных сывороток против колибактериоза.
Колибактериоз сельскохозяйственных животных по количеству неблагополучных
пунктов, количеству заболевших и павших животных занимает первое место среди болезней бактериальной этиологии.
Наряду с соблюдением зоотехнических и ветеринарно-санитарных правил кормления
и содержания новорожденных животных значительным мероприятием профилактики колибактериоза остается специфическая профилактика. Поэтому изыскание новых средств
борьбы с данной болезнью, в том числе и поиск новых, обладающих высокой иммуногенностью и антигенностью штаммов, является актуальным аспектом при разработке биопрепаратов, предназначенных для специфической профилактики.
BY 17486 C1 2013.08.30
В настоящее время известен депонированный адгезивный штамм Escherichia coli F41,
который используют при конструировании вакцины против колибактериоза свиней [1].
Недостатком этого штамма является его достаточно невысокая антигенная активность.
Титр антител в сыворотке крови иммунизированных свиноматок составлял 1:85 ± 0,62 за
14-21 день до опороса, по сравнению с контролем 1:20 ± 0,71, что не позволяет получить
высокие профилактические показатели при применении вакцины, в составе которой присутствует данный штамм, так, профилактическая эффективность этой вакцины составляет
94,4 %, из 54 голов 3 поросят заболели, а в контроле из 53 голов заболели 6 поросят.
За прототип возбудителя болезни колибактериоза телят взят штамм Escherichia coli
ВГНКИ N 398-37/14.
Производственный штамм бактерий Escherichia coli ВГНКИ N 398-37/14 обладает следующими характеристиками.
Назначение. Штамм Escherichia coli ВГНКИ N 398-37/14 применяется с целью производства вакцин и гипериммунных сывороток против колибактериоза.
Происхождение. Штамм Escherichia coli ВГНКИ N 398-37/14 выделен от теленка 3дневного возраста.
Таксономическая принадлежность. Предложенный штамм бактерий Escherichia coli
ВГНКИ N 398-37/14 - возбудитель колибактериоза, отнесен к семейству
Enterobacteriaceae, к роду Escherichia coli.
Культурально-морфологические свойства. Грамотрицательные, подвижные, полиморфные палочки, образуют полупрозрачные "S"-колонии через 13-24 ч роста на плотной
питательной среде при температуре 36-38 °С.
Ферментативная активность. Ферментирует глюкозу, лактозу, мальтозу, рамнозу, сахарозу, маннит, сорбит, не ферментирует инозит, образует индол, не образует сероводород, уреазу, ацетилметилкарбинол в реакции Фогес-Проскауэра.
Серологические свойства. Штамм бактерий Escherichia coli ВГНКИ N 398-37/14 в своем составе имеет типируемый соматический антиген О101 и обладает наличием адгезивного антигена F41; агглютинируется гомологичной О-коли сывороткой до титра 1:3200 и
гетерологичными сыворотками О4-1:400, О9, О15, О138-1:200, О2, О18-1:100, О117,
О142-1:50; сывороткой F41 до титра 1:800; активно продуцирует адгезивный антиген F41
на среде Хоттингера при культивировании в реакторе при температуре 37-38 °С, аэрации
и активном перемешивании.
Антигенная активность. Титр адгезивного антигена F41 в РДП с МкАт или моноспецифической анти-F41 сывороткой (титр 1:64) составляет 1:8-1:16. Антигенную активность
определяют в РА. Титр антител в сыворотке крови кроликов должен быть не ниже 1:1280.
Иммунизация вакциной против колибактериоза животных, в состав которой входил
известный штамм, привела к следующим показателям: сохранность поросят составила соответственно 95,5 % против 87,9 % в группе контроля, которым применяли производственный аналог, телят - 98 % против 92,2 % в группе контроля, заболеваемость поросят 16,2 % против 38,4 %, телят - 11,2 % против 33,3 %.
Сведения о криоконсервации. В лиофилизированном состоянии под вакуумом в герметично запаянных ампулах при температуре (-18)-(-20) °С. Срок хранения 10 лет [2].
Недостатком известного штамма является его сравнительно низкая антигенная активность - титр адгезивного антигена F41 в РДП с моноспецифической антиадгезивной F41 сывороткой (титр 1:64) составляет 1:8-1:16. Титр антител в сыворотке крови кроликов
после иммунизации составляет 1:1280. Данные недостатки привели к достаточно низким
показателям профилактической эффективности по показателям сохранности и заболеваемости телят и поросят [2].
На известных штаммах невозможно получить заявляемый штамм-антиген, так как известные штаммы обладают более низкими показателями антигенной и иммуногенной ак2
BY 17486 C1 2013.08.30
тивности, что отрицательно влияет на профилактические показатели изготавливаемых из
них биопрепаратов против колибактериоза, а также в связи с имеющимися отличиями в
антигеном отношении, которые могут сказаться на эффективности производимых биопрепаратов против колибактериоза, связанных с несовпадением антигенной структуры вакцинных и эпизоотических штаммов.
В связи с этим актуальной остается проблема изыскания штаммов бактерий Escherichia coli для конструирования специфических средств против колибактериоза с высокими
иммуногенными характеристиками.
Задачей настоящего изобретения является получение штамма бактерий Escherichia
coli, обладающего высокими антигенными и иммуногенными свойствами, позволяющего
конструировать биопрепараты против колибактериоза с высокими профилактическими
показателями.
Поставленная задача достигается тем, что выделен штамм бактерий Escherichia coli
КМИЭВ-98 - штамм-антиген путем выделения его из головного мозга павшего теленка
2-дневного возраста, принадлежащего СПК "Ставокский" Пинского района Брестской области, Республика Беларусь.
Характеристика штамма бактерий Escherichia coli КМИЭВ-98 - штамма-антигена.
Таксономическая принадлежность. Escherichia coli относится к 5-й группе факультативно-анаэробных грамотрицательных палочек, подгруппе 1 - семейство Enterobactericeae,
роду Escherichia, виду Escherichia coli.
Морфологические признаки. В мазках, приготовленных из бульонных и агаровых
культур, при окраске по Грамму имеет вид тонких коротких (0,2-0,7 × 2-4 мкм) грамотрицательных палочек.
Культуральные признаки. Факультативный анаэроб. Растет в МПБ, в бульоне на основе
перевара Хоттингера с интенсивным помутнением среды и образованием на дне пробирки
осадка, легко разбивающегося при встряхивании. Культура на плотных питательных средах формирует круглые, блестящие, выпуклые колонии с приподнятым более оптически
плотным центром. На среде Эндо бактерии образует колонии красного цвета с металлическим блеском размером от 0,2 до 0,5 см с более интенсивно окрашенным центром.
Биохимические признаки. В биохимическом отношении на средах, содержащих углеводы и многоатомные спирты, штамм ферментирует глюкозу, лактозу, манит, сорбит,
арабинозу, мальтозу, ксилозу, манозу, дульцит с образованием кислоты и газа, продуцирует индол, не образует сероводород, не разжижает желатину, не утилизирует цитраты,
дает отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра.
Антигенные признаки. Имеет в своем составе адгезивный антиген F41, О-антиген, не
типирусмый коммерческим набором О-колисывороток, содержит жгутиковый антиген.
Патогенность, иммуногенность. Штамм Escherichia coli КМИЭВ-98 - штамм-антитен
патогенен для белых мышей. LD50 составляет 670 млн микробных клеток при внутрибрюшинном заражении. Иммуногенность штамма Escherichia coli КМИЭВ-98 составляет
100 %, антигенность в РА с 13,8 ± 0,14 log2.
Условия хранения. Штамм Escherichia coli КМИЭВ-98 - штамм-антиген хранится при
температуре + 2…+ 4 °С после лиофильного высушивания в ампулах в течение 2-3 лет, а
также в течение 3-6 месяцев на 0,3 % ПЖА под слоем стерильного вазелинового масла.
Таким образом, поставленная задача достигается за счет того, что предлагаемый нами
штамм имеет высокую антигенную активность по сравнению с прототипом. Так, данный
показатель при проведении РА с сывороткой крови кроликов составил 1:4098-1:8192, тогда как в прототипе данный показатель составил 1:1280, титр адгезивного антигена F41в
реакции диффузной преципитации с моноспецифической анти-F41 сывороткой составил
1:32-1:64, тогда как в известном штамме - 1:8-1:16, что позволяет нам достичь поставленной задачи.
3
BY 17486 C1 2013.08.30
Пример 1.
Выделение штамма бактерий Escherichia coli КМИЭВ-98 - штамм-антиген.
Патологический материал, полученный от павших или вынужденно убитых больных
колибактериозом телят, засевают в пробирки с МПБ, на плотную дифференциальнодиагностическую среду Эндо и МПА в чашках Петри. Патологический материал - участок
головного мозга размером 2,5 × 2,5 прижигают, и стерильным концом пастеровской пипетки скарифицируют и растирают шпателем по поверхности среды Эндо, а также на
МПА и вносят в МПБ и инкубируют при температуре 37 °С в течение суток. Параллельно
проводят аналогичные операции при отборе проб с других паренхиматозных органов. При
отборе проб со слизистой тонкого кишечника ее предварительно очищают от содержимого.
На элективной среде Эндо через 24 ч наблюдают образование круглых, средних, иногда
мелких размеров колонии (диаметром 2-4 мм), выпуклые или слегка приподнятые в центре,
с гладкой поверхностью, ровными краями, красного или малинового цвета с наличием металлического блеска. Культивирование штамма бактерий Escherichia coli КМИЭВ-98 штамм-антиген.
Пример 2.
Культивирование штамма бактерий Escherichia coli КМИЭВ-98 - штамм-антиген.
Штамм бактерий Escherichia coli КМИЭВ-98 - штамм-антиген выращивают в течение
8-10 ч (не более 12 ч) при температуре 37 °С; скорости вращения мешалки в начале культивирования - 70, а в конце - 300 об/мин; подаче стерильного воздуха в процессе всего периода культивации - 0,1 л/л среды. Через каждый час культивирования отбирают пробы
микробной суспензии, определяют уровень накопления бактериальной массы (по оптическим стандартам мутности) и устанавливают pH среды. Понижение pH в растущей культуре до 7 и ниже регулируют подщелачиванием путем добавления 10 %-ного раствора
NaOH до pH 7,6-7,8. Через 2, 4, 6 ч от начала засева среду трижды обогащают раствором
глюкозы из расчета 0,3 % сухого вещества глюкозы на 1 л среды.
Пример 3.
Серологическая идентификация штамма Escherichia coli КМИЭВ-98 - штамм-антиген.
Для серологической идентификации штамма Escherichia coli КМИЭВ-98 - штаммантиген применяют РА на стекле с агглютинирующими О-коли и антиадгезизными колисыворотками, вначале с комплексной, а при наличии положительной реакции - с моновалентными сыворотками. Антиген для серологических реакций готовят по следующей методике: испытуемую культуру, выращенную на скошенном МПА или среде Минка при
температуре 37 °С в течение 18-20 ч, смывают 2-5 мл физиологического раствора. Постановка реакции: каплю диагностической сыворотки наносят на стекло, стерильной пипеткой добавляют каплю испытуемой культуры Escherichia coli КМИЭВ-98 - штамм-антиген,
выращенной на скошенном МПА или среде Минка. Культуры, выросшие в чашках Петри,
берут бактериологической петлей и тщательно растирают с сывороткой. Реакцию учитывают визуально при легком покачивании стекла при температуре 18-28 °С.
При появлении мелкозернистого осадка или хлопьев различной величины с полным
или частичным просветлением сыворотки реакция считается положительной.
Контроли антигена:
а) стабильность - антиген + изотонический раствор натрия хлорида. Реакция отрицательная.
б) специфичность - антиген + нормальная (отрицательная) кроличья сыворотка. Реакция отрицательная.
Культура на МПА или среде Минка, давшая положительную реакцию агглютинации с
моновалентной антиадгезивной сывороткой и имеющая типичные для Escherichia coli
морфологические, тинкториальные и культуральные свойства, считается возбудителем
колибактериоза с адгезивным антигеном F41, что является видовым признаком.
4
BY 17486 C1 2013.08.30
Титр адгезивного антигена F41 в РДП с моноспецифической анти-F41 сывороткой
(титр 1:64) составляет 1:32-1:64, что выше полученных результатов в прототипе.
Пример 4.
Определение иммуногенных свойств штамма бактерий Escherichia coli КМИЭВ-98 штамм-антиген.
Штамм Escherichia coli КМИЭВ-98 - штамм-антиген культивируют на агаровой питательной среде, далее смывают стерильным физраствором доводя до концентрации 5 млрд.
микробных клеток в 1 мл. Инактивируют формалином в конечной концентрации 0,4 % и в
качестве адъюванта добавляют 10 %-ные алюмокалиевые квасцы в количестве 10 % к
объему. Далее двукратно, с интервалом 7 дней, иммунизируют белых мышей. Для этого
десяти белым мышам штамм-антиген вводят подкожно в дозе 0,3 мл. Напряженность иммунитета проверяют через 10-14 дней после повторной вакцинации путем внутрибрюшинного заражения 10 вакцинированных и 10 контрольных животных 18-часовой смесью
бульонной культуры штамма бактерий Escherichia coli КМИЭВ-98 - штамм-антиген в тестдозе 0,5 мл. Штамм-антиген считают иммуногенным, если в опытной группе в живых
оставалось не менее 70 % животных, при гибели контрольных 90 % и более животных в
течение 10 суток после заражения.
Пример 5.
Определение антигенной активности штамма бактерий Escherichia coli КМИЭВ-98 штамм-антиген.
Препаратом из штамма Escherichia coli КМИЭВ-98 - штамм-антиген иммунизируют
3-4 кроликов двукратно, с интервалом 10 дней в дозе 5 млрд. м.т./мл в объеме 2,0 см3, с
последующим определением титров специфических антител в РА на полистироловых
планшетах.
Титр антител в сыворотке крови кроликов в РА составлял не ниже 1:2048, что выше
приведенных показателей в прототипе.
Источники информации:
1. Патент RU 2358758, МПК6 A 61K 39/39, 2009.
2. Патент RU 2043771, МПК6 A 61K 39/108, 1995 (прототип).
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
5
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
94 Кб
Теги
by17486, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа