close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY17599

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2013.10.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 12Q 1/68
(2006.01)
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ
ИНДИВИДУУМА К РАКУ ЛЕГКОГО
(21) Номер заявки: a 20101808
(22) 2010.12.15
(43) 2012.08.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт генетики
и цитологии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Михаленко Елена Петровна; Чакова Наталья Николаевна;
Крупнова Эвелина Вячеславовна;
Чеботарева Наталья Вячеславовна
(BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт генетики и цитологии Национальной
академии наук Беларуси" (BY)
BY 17599 C1 2013.10.30
BY (11) 17599
(13) C1
(19)
(56) RU 2296328 C1, 2007.
RU 2260799 C1, 2005.
НИКИШИНА М.В. Исследование полиморфизма генов ариламин N-ацетилтрансфераз и ассоциации полиморфных вариантов с раком легкого у
европеоидов г. Новосибирска: Автореф. дис. - Новосибирск, 2007. - С. 1-22.
НИКОНОВА Т.А. и др. Материалы
Всероссийской 67-ой итоговой студенческой научной конференции им.
Н.И.Пирогова. - Томск: Сибирский государственный медицинский университет, 2008. - С. 393-394.
RU 2293991 C1, 2007.
(57)
Способ определения предрасположенности индивидуума к раку легкого, отличающийся тем, что выделяют ДНК индивидуума, определяют с применением полимеразной цепной реакции полиморфизм генов GSTT1, CYP1A2 и MDR1 и судят о
наличии предрасположенности индивидуума к раку легкого при выявлении сочетания
генов 734AACYP1A2/GSTT1(делеция)/3435CCMDR1.
Изобретение относится к области молекулярно-генетических исследований в медицине и может быть использовано в онкологии.
В настоящее время рост мультифакторных заболеваний (МФЗ), в том числе и различных онкопатологий, связывают с возрастающим загрязнением окружающей среды чужеродными для организма веществами (ксенобиотиками) и, как следствие, увеличением их
поступления в организм человека. Ксенобиотики, попадая в организм, подвергаются процессам биотрансформации. Процесс биотрансформации обычно подразделяется на три
фазы: активации, нейтрализации и эвакуации. Изменение активности ферментов биотрансформации ксенобиотиков (ФБК), связанное с наличием генетического полиморфизма, приводит к уменьшению или увеличению восприимчивости организма к вредным
воздействиям и, как следствие, к риску развития различных МФЗ, в том числе и рака легкого (РЛ). Согласно концепции, предложенной академиком Л.А.Пирузяном, индивидуальный ответ человека на воздействие факторов окружающей среды определяется
"стартовым состоянием" ферментативных систем биотрансформации ксенобиотиков, раз-
BY 17599 C1 2013.10.30
личающихся по характеру активности в популяциях [1]. Существуют значительные межпопуляционные различия в распределении частот полиморфных аллелей генов ФБК, которые обусловлены географическими условиями, этнической принадлежностью и др.
Поэтому представляется целесообразным поиск ассоциации полиморфных вариантов генов ФБК с возникновением мультифакторной патологии, в частности РЛ, в конкретном
регионе.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению по техническому исполнению из
существующих прогностических методов является определение предрасположенности к
онкологическими заболеваниям с использованием диагностического набора для проведения медико-генетического анализа полиморфизма генов, кодирующих ферменты первой и
второй фаз биотрансформации [2].
Недостатком этого способа является то, что с помощью его можно анализировать
только предрасположенность к онкологическим заболеваниям, а не выявлять предрасположенность к конкретной онкопатологий. Кроме того, этот способ не позволяет провести
анализ работы ферментов трех фаз биотрансформации. Известно, что к развитию опухоли
приводит дисбаланс активации, инактивации и выведения токсичных соединений. Поэтому представляется важным изучение суммарного вклада полиморфных вариантов генов
ферментов I и II фаз биотрансформации ксенобиотиков, а также P-гликопротеина в развитие предрасположенности к РЛ.
Предлагаемый нами способ основан на комплексном подходе, включающем молекулярно-генетический анализ полиморфизма генов, кодирующих соответствующие ферменты трех фаз биотрансформации ксенобиотиков: 1-я фаза - CYP1A2 (C734A); 2-я фаза GSTT1 (делеция); 3-я фаза - MDR1 (C3435T). Данный способ заключается в определении
молекулярных маркеров предрасположенности к РЛ.
Решение этих задач обеспечивается предлагаемой модификацией способа молекулярно-генетической диагностики. После выделения ДНК проводят одну мультиплексную и
две стандартные полимеразные цепные реакции (ПЦР) с использованием четырех пар
праймеров. Далее проводится гидролиз продуктов стандартных полимеразных цепных реакций эндонуклеазами рестрикции и электрофорез продуктов гидролиза в агарозном геле.
Использованные праймеры и эндонуклеазы рестрикции представлены в табл. 1.
Таблица 1
Последовательность праймеров и характеристика аллелей анализируемых генов
Последовательность прай- Размер Нуклео- ЭндоГен
тидная
продукта
нуклеаза
меров 5, ⇒ K ⇒ 3,
замена
F - ggtatatggaaggtatcagc
CYP1A2
385 п.н. C734A
AhaI
R - gggttgagatggagacattc
F - ttccttactggtcctcacatctc
GSTT1
480 п.н. делеция
R - tcaccggatcatggccagca
F - gccctctgctaacaagtcctac
Albumin
350 п.н.
R - gccctaaaaagaaaatcgccaatc
F - ttgatggcaaagaaataaagc
MDR1
207 п.н. C3435T
MboI
R - cttacattaggcagtgactcg
Длины рестриктных фрагментов
262 + 123 (аллель
C) 385 (аллель A)
145 + 62 (аллель C)
207 (аллель T)
Способ состоит из 7 этапов и осуществляется следующим образом.
Этап 1. Выделение ДНК по стандартному протоколу.
Этап 2. Типирование образцов по гену GSTT1 с применением мультиплексной ПЦР. В
качестве внутреннего контроля используется амплификация фрагмента гена альбумина.
Смесь для амплификации объемом 15 мкл включала: 100-200 нг ДНК (2 мкл); 0,15 мкМ
прямого и обратного праймеров GSTT1; 0,09 мкМ прямого и обратного праймеров Albumin;
2
BY 17599 C1 2013.10.30
7,5 мкл Quick-Load Taq 2X Master Mix (ОДО "Праймтех", Минск). Начальное плавление
проводят в течение 5 мин при температуре 95 °С, далее проводят 30 циклов, включающих
плавление при температуре 95 °С в течение 30 с, отжиг при температуре 64 °С в течение 1
мин, синтез при температуре 72 °С в течение 1 мин. Финальный синтез проводят при температуре 72 °С в течение 5 мин.
Этап 3. Проведение стандартной ПЦР для амплификации CYP1A2. Смесь объемом
15 мкл включает: 50-100 нг ДНК (1 мкл); 0,15 мкМ прямого и обратного праймеров;
7,5 мкл Quick-Load Taq 2X Master Mix (ОДО "Праймтех", Минск). Начальное плавление
проводят в течение 12 минт при температуре 94 °С, далее проводят 35 циклов, включающих плавление при температуре 94 °С в течение 30 с, отжиг при температуре 58 °С в течение 30 с, синтез при температуре 12 °С в течение 30 с. Финальный синтез проводят при
температуре 72 °С в течение 1 мин.
Этап 4. Проведение стандартной ПЦР для амплификации MDR1. Смесь объемом
15 мкл включает: 50-100 нг ДНК (1 мкл); 0,15 мкМ прямого и обратного праймеров;
7,5 мкл Quick-Load Taq 2X Master Mix (ОДО "Праймтех", Минск). Начальное плавление
проводят в течение 5 мин при температуре 94 °С, далее проводят 40 циклов, включающих
плавление при температуре 94 °С в течение 30 с, отжиг при температуре 55 °С в течение
30 с, синтез при температуре 72 °С в течение 1 мин. Финальный синтез проводят при температуре 72 °С в течение 7 мин.
Этап 5. Гидролиз амплифицированных фрагментов ДНК эндонуклеазами (табл. 1):
ApaI (генетический полиморфизм C734A CYP1A2); MboI (генетический полиморфизм
C3435T MDR1) согласно протоколу фирмы-производителя.
Этап 6. Фракционирование продуктов амплификации GSTT1 и альбумина - в 1,2 % и
фракционирование продуктов рестрикции эндонуклеазами ApaI, MboI - в 2,5 %-ном агарозном геле с бромистым этидием при напряжении 1 В/см и визуализация в УФ-свете.
Этап 7. Анализ полученных результатов.
Проведено клинико-генетическое изучение группы больных РЛ (118 человек), проходивших лечение в Минском онкологическом диспансере в период с 2003 по 2009 гг. Диагноз РЛ основывался на данных анамнеза и результатах рентгенологического,
эндоскопического и морфологического обследований. В контрольную выборку вошли 309
человек без онкопатологии, постоянно проживающих на территории Беларуси.
Об ассоциации генотипов с предрасположенностью к РЛ судили по величине отношения шансов (OR - odds ratio). OR является мерой ассоциации, количественно определяющей взаимосвязь между фактором риска и развитием определенного признака [3]. Степень
ассоциаций оценивается в значениях показателя соотношения шансов по формуле:
OR = (a × d)/(b × c),
где a - число лиц с наличием маркера, b - с отсутствием маркера среди больных; c и d число лиц соответственно с наличием и отсутствием маркера среди здоровых. OR указан с
95 %-ным доверительным интервалом (95 % CI).
Достоверность определялась по критерию χ2 для таблиц сопряженности 2 × 2 с поправкой Йетса на непрерывность.
В табл. 2 представлены наиболее значимые сочетания полиморфных вариантов генов для
выявления предрасположенности к РЛ. Сочетания генотипов "CYP1A2(734AA)/GSTT1
(делеция)" и "GSTT1(делеция)/MDR1(3435CC)" являются неблагоприятными и повышают
риск развития РЛ у носителей таких комбинаций. Наибольшую рисковую значимость
имеет комбинация "CYP1A2 (734AA)/ GSTT1(делеция)/MDR1(3435CC)".
3
BY 17599 C1 2013.10.30
Таблица 2
Наиболее значимые комбинации полиморфных вариантов генов
ферментов биотрансформации ксенобиотиков в формировании
предрасположенности к раку легкого
Генотип
CYP1A2(734AA)/GSTT1(делеция)
GSTT1(делеция)/MDR1(3435CC)
CYP1A2(734АА)/GSTT1(делеция)/MDR1(3435CC)
OR (95 %CI)
3,26(1,61-6,60)
3,63(1,33-9,96)
11,37(2,25-57,39)
χ2
10,27
5,56
10,42
P
0,001
0,0018
0,001
Использование данного способа дает возможность у людей из группы риска по возникновению рака легкого выявлять молекулярные маркеры предрасположенности, что
обеспечивает своевременность проведения ранних профилактических мероприятий (исключение воздействия табачного дыма и поллютантов, проведение углубленных медицинских осмотров).
Источники информации:
1. Пирузян Л.А., Суханов В.А., Саприн В.А. Прогностический фактор риска развития
патологических процессов, основанный на полиморфизме ферментов метаболизма ксенобиотиков. // Физиология человека. - 2000. - Т. 26. - № 2. - С. 115-123.
2. Патент РФ 2296328, МПК G 01N 33/50; C 12Q 1/68, 2007.
3. Реброва О.Ю. Сравнение групп по качественному бинарному признаку // Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ Statistica /
Под ред. М.Н. Солововой. - М.: Медиа Сфера, 2004. - Гл. 11. - С. 157-185.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
98 Кб
Теги
патент, by17599
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа