close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY17629

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2013.10.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 17629
(13) C1
(19)
G 01N 33/52
(2006.01)
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ
ХИМИОИММУНОТЕРАПИИ БОЛЬНОГО ХРОНИЧЕСКИМ
ЛИМФОЛЕЙКОЗОМ
BY 17629 C1 2013.10.30
(21) Номер заявки: a 20101612
(73) Патентообладатели: Государственное уч(22) 2010.11.11
реждение "Республиканский научно(43) 2012.06.30
практический центр трансфузиологии
(71) Заявители: Государственное учреждеи медицинских биотехнологий"; Учрежние "Республиканский научно-пракдение здравоохранения "9-я городская
тический центр трансфузиологии и
клиническая больница" (BY)
медицинских биотехнологий"; Учре- (56) RAWSTRON A.C. et al. Blood, 2004. V. 103. - No. 6. - P. 2027-2031.
ждение здравоохранения "9-я городВИНОГРАДОВА Ю.Е. и др. Гематолоская клиническая больница" (BY)
гия и трансфузиология. - 2000. - Т. 45. (72) Авторы: Морозова Оксана Михайлов№ 2. - С. 9-12.
на; Цвирко Дмитрий Геннадьевич;
RU 2014607 C1, 1994.
Смольникова Виктория ВладимировSU 1614659 A1, 1995.
на; Маринич Дмитрий Викторович;
Миланович Наталья Феодосьевна;
Усс Анатолий Леонидович; Змачинский Владимир Арнольдович (BY)
(57)
Способ определения эффективности химиоиммунотерапии больного хроническим
лимфолейкозом, отличающийся тем, что до курса химиоиммунотерапии, в течение курса
и на следующий день после его окончания определяют в периферической крови больного
содержание клональных В-лимфоцитов и апоптотических AnV + B-лимфоцитов с использованием шестицветной цитофлуориметрии и делают вывод о том, что химиоиммунотерапия эффективна при снижении содержания клональных В-лимфоцитов и увеличении
содержания апоптотических AnV + B-лимфоцитов на 5 % или более в течение или после
окончания курса химиоиммунотерапии по сравнению с их уровнем до начала курса химиоиммунотерапии.
Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть использовано для оценки эффективности применения различных протоколов химиоиммунотерапии
у больных хроническим лимфолейкозом.
В связи с внедрением в клиническую практику такого высокоэффективного метода
лечения хронического лимфолейкоза как химиоиммунотерапия, а также в связи с необходимостью ее совершенствования, особую актуальность приобрело применение в клинике
высокочувствительных методов оценки противоопухолевого эффекта терапии.
Известен способ оценки эффективности химиотерапии и прогнозирования ее результатов по снижению содержания в крови и костном мозге лейкозных клеток, в том числе
BY 17629 C1 2013.10.30
лимфоцитов при хроническом лимфолейкозе, определяемых с помощью цитоморфологического исследования при выполнении общего анализа крови и подсчета миелограммы [1].
Недостатком известного способа является его низкая чувствительность и недостаточная специфичность, обусловленные невозможностью морфологически различить лейкемические и нормальные лимфоциты и достаточно высоким содержанием лимфоцитов в
крови и костном мозге в норме (до 40 % от всех лейкоцитов периферической крови и до
10 % миелокариоцитов). Это делает невозможным контроль за динамикой популяций
нормальных и лейкемических лимфоцитов на фоне химиотерапии и тем более выявление
остаточных лейкемических лимфоцитов в морфологически нормальных крови и костном
мозге (мониторинг минимальной остаточной болезни), а также прогнозирование длительной безрецидивной и общей выживаемости.
Наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому результату является способ оценки эффективности одного из протоколов химиоиммунотерапии
(монотерапии алемтузумабом), базирующийся на контроле содержания в крови клональных В-лимфоцитов, определяемых с помощью стандартного метода четырехцветной проточной цитофлуориметрии [2].
Недостатком способа является невысокая эффективность из-за невозможности раннего (в первые 3-5 дней) прогнозирования ответа на терапию (ответ оценивают по степени
снижения содержания в крови клональных B-лимфоцитов на второй-четвертой неделях
лечения), а также его недостаточная чувствительность (1 клональный В-лимфоцит на
10000-100000 лейкоцитов). Информативность данного способа продемонстрирована только для одного протокола химиоиммунотерапии хронического лимфолейкоза - монотерапии алемтузумабом.
Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в повышении эффективности способа для возможности ранней оценки результатов лечения,
что необходимо для обоснованного выбора протокола лечения и своевременной его коррекции при отсутствии эффекта.
Применение заявляемого способа позволит добиться максимально полной элиминации лейкозного клона и длительной безрецидивной и общей выживаемости пациентов.
Задача решается за счет того, что в способе определения эффективности химиоиммунотерапии больного хроническим лимфолейкозом до курса химиоиммунотерапии, в течение курса и на следующий день после его окончания определяют в периферической крови
больного содержание клональных В-лимфоцитов и апоптотических AnV+B-лимфоцитов с
использованием шестицветной цитофлуориметрии и делают вывод о том, что химиоиммунотерапия эффективна при снижении содержания клональных В - лимфоцитов и увеличении содержания апоптотических AnV+B-лимфоцитов на 5 % или более в течение или
после окончания курса химиоиммунотерапии по сравнению с их уровнем до начала курса
химиоиммунотерапии.
Сущность изобретения иллюстрируется фигурами, где на фиг. 1 представлена динамика иммунофенотипических параметров у пациента Л.П.Н. по примеру 1, на фиг. 2 тоже у пациента Г.И.И. по примеру 2, на фиг. 3 - динамика относительного содержания
B-лимфоцитов, клональных B-лимфоцитов и AnV+B-лимфоцитов в периферической крови пациентов группы 1 на фоне химиоиммунотерапии, на фиг. 4 - динамика относительного содержания B-лимфоцитов, клональных B-лимфоцитов и AnV+B-лимфоцитов в
периферической крови пациентов группы 2 на фоне химиоиммунотерапии.
Клональные B-лимфоциты определяют с помощью шестицветной проточной цитофлуориметрии. Нормальные B-лимфоциты имеют фенотип CD19+ CD5- CD45+ CD79в+
CD23- CD20+, тогда как клональные B-лимфоциты при хроническом лимфолейкозе CD19+ CD5+ CD45+ CD23+ CD79в- CD20+ или CD20- (в зависимости от первичного иммунофенотипа).
Определение поверхностных маркеров клональных B-лимфоцитов проводят методом
прямого флуоресцентного окрашивания с использованием моноклональных антител
2
BY 17629 C1 2013.10.30
анти-CD 45 APC Су-7, анти-CD20 PerCP, анти-CD19 FITC, анти-CD5 PE Су-7, CD79в
APC, CD23 PE (Becton Dickinson) [4].
Учет проводят на проточном цитофлуориметре FACSCanto в рабочей программе
FACSDiva.
Для определения клональных B-лимфоцитов используют постадийное гейтирование,
выделяя сначала регион B-лимфоцитов (CD45 + CD19+), в котором определялся процент
клональных и нормальных клеток. Для получения достоверных данных загрузку клеток в
регион B-лимфоцитов проводят в количестве от 1000 до 5000, при этом общее количество
загружаемых клеток может достигать от 100000 до 1000000 (в зависимости от процента
B-лимфоцитов в исследуемом образце).
Спонтанную и индуцированную химиоиммунотерапией апоптотическую активность
опухолевых B-лимфоцитов оценивают по экспрессии этими клетками аннексина V (AnV),
определяемого с помощью шестицветной проточной цитофлуориметрии [3]. Для его определения к 100 мкл периферической крови добавляют моноклональные антитела
CD19(PE), CD3(FITC), CD45(PerCP) (Becton Dickinson) согласно прописи фирмы производителя и инкубируют 25 мин при комнатной температуре, затем эритроциты лизируют и
дважды отмывают Binding Buffer (0,01 М HEPES, pH 7,4, 0,14 M NaCl, 2,5 mM CaCl2), инкубируют в 100 мкл Binding Buffer с моноклональными антителами к AnV (APC) 15 мин
при комнатной температуре. По окончании инкубации добавляют 400 мкл Binding Buffer.
Учет проводят из 50000 клеток на проточном цитофлуориметре BD FACSCanto с использованием двух лазеров возбуждения 488 нм и 630 нм в рабочей программе FACSDiva.
Результат проведения протокола химиоиммунотерапии оценивают по повышению относительного содержания в крови AnV+ (апоптотических) B-лимфоцитов в сравнении с
исходным уровнем и снижению относительного содержания B-лимфоцитов, в том числе
клональных, на фоне терапии. До начала проведения протокола химиоиммунотерапии
ежедневно в течение трех первых дней и после окончания протокола методом шестицветной проточной цитофлуориметрии определяют относительное содержание в периферической крови B-лимфоцитов, в том числе клональных и экспрессирующих AnV.
В случае увеличения относительного содержания AnV+ (апоптотических) B-лимфоцитов на 5 % и более в сравнении с исходным (до начала терапии) уровнем и/или снижения
относительного содержания B-лимфоцитов (также в сравнении с исходным уровнем) на
первом курсе лечения проводят второй курс химиоиммунотерапии (с соблюдением требуемых временных интервалов между курсами), определяя описанные выше иммунофенотипические параметры аналогично первому курсу.
В случае сохранения или нарастания относительного содержания AnV+ B-лимфоцитов
и/или дальнейшего снижения относительного содержания В-лимфоцитов, и/или снижения
относительного содержания клональных B-лимфоцитов по результатам исследования на
втором курсе лечения проводят очередные курсы химиоиммунотерапии с контролем иммунофенотипических параметров до достижения полной клинико-гематологической и
иммуно-фенотипической ремиссии.
В случае отсутствия повышения относительного содержания AnV+ B-лимфоцитов и
снижения относительного содержания B-лимфоцитов в течение первого курса терапии
проведение химиоиммунотерапии по данному протоколу прекращают и меняют протокол
лечения.
В случае отсутствия снижения относительного содержания клональных B-лимфоцитов
в течение либо после третьего курса терапии проведение химиоиммунотерапии по данному протоколу прекращают, меняют протокол лечения.
Пример 1.
Пациент Л.П.Н. Диагноз хронического лимфолейкоза, стадия C, был верифицирован
клинически, морфологически, иммунофенотипически. В качестве терапии был выбран
протокол иммунохимиотерапии FluCamp: после эскалации начальной дозы алемтузумаб
3
BY 17629 C1 2013.10.30
вводили по 30 мг подкожно 3 дня подряд, флюдарабин 30 мг/м2 внутривенно 3 дня подряд.
Через 21 день провели второй курс терапии по схеме FluCamp. При повторном курсе терапии эскалацию дозы алемтузумаба не проводили и препарат вводили в полной дозе (30 мг).
У данного пациента отсутствовали повышение относительного содержания AnV+ B-лимфоцитов в крови, а также снижение относительного содержания клональных B-лимфоцитов в течение первого и второго курсов терапии (фиг. 1). Отсутствие положительной
динамики иммунофенотипических параметров соответствовало клинической картине: у
пациента в течение двух курсов химиоиммунотерапии по схеме FluCamp не отмечалось
уменьшения общего количества лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови, не
отмечалось также уменьшения размеров лимфоузлов; уровень лейкоцитов перед первым
курсом терапии - 65,5 × 109/л, лимфоцитов - 64,2 × 109/л, после проведенного лечения
уровень лейкоцитов составлял 67,6 × 109/л, лимфоцитов 65,6 × 109/л, после второго курса
терапии уровень лейкоцитов составлял 70,7 × 109/л, лимфоцитов - 67,9 × 109/л. Проведение
химиоиммунотерапии по данному протоколу прекратили, изменили протокол лечения.
Пример 2.
Пациент Г.И.И. Диагноз хронического лимфолейкоза, стадия B, был верифицирован
клинически, морфологически, иммунофенотипически. Пациенту проводили лечение по
протоколу RFC: ритуксимаб 375 мг/м2 внутривенно (первый курс) и 500 мг/м2 в течение
последующих (2-6) курсов, флюдарабин 20 мг/м2 внутривенно 3 дня, циклофосфамид
150 мг/м2 внутривенно 3 дня, интервал между курсами составлял 28 дней. У данного пациента имело место повышение относительного содержания AnV+ B-лимфоцитов до
34,73 % (с первого курса), а также наблюдалось значительное снижение относительного
содержания В-лимфоцитов в течение всех курсов терапии (фиг. 2). Наличие положительной динамики иммунофенотипических параметров соответствовало клинической картине:
у пациента уже после двух курсов химиоиммунотерапии по схеме RFC нормализовался уровень лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови. Уровень лейкоцитов до лечения 95,8 × 10 %, лимфоцитов - 87,4 × 109/л; после первого курса терапии: лейкоциты 46,5 × 109/л, лимфоциты 42,6 × 109/л; перед вторым курсом терапии: лейкоциты 6,07 × 109/л, лимфоциты 4,89 × 109/л; после проведенного второго курса: лейкоциты 4,27 × 10 %, лимфоциты 2,11 × 10 %. У данного больного после шести курсов химиоиммунотерапии получена полная клинико-гематологическая и иммунофенотипическая ремиссия.
Заявляемым способом оценивали эффективность различных протоколов химиоиммунотерапии у пациентов с хроническим лимфолейкозом. Пациенты получали различные
варианты химиоиммунотерапии: монотерапию алемтузумабом и ритуксимабом, сочетания
указанных препаратов с флюдарабином, циклофосфамидом, лейкладином. Среди пролеченных пациентов выделили две группы в соответствии с клинико-гематологическими и
иммунофенотипическими параметрами их ответа на терапию:
группа 1 - отсутствие клинико-гематологического и иммунофенотипического (отсутствие снижения относительного содержания В-лимфоцитов, в том числе клональных) ответа (6 пациентов, 43 исследования);
группа 2 - полный клинико-гематологический и полный иммунофенотипический (все
B-лимфоциты неклональны) ответ (5 пациентов, 77 исследований).
Результаты представлены в виде динамики усредненных внутри группы параметров,
соответствующих дням исследования и курсам терапии (фиг. 3, 4).
На фиг. 3 (в группе 1) видно отсутствие стимуляции апоптоза B-лимфоцитов и снижения их относительного содержания в крови на первом курсе терапии, а также отсутствие
снижения относительного содержания клональных B-лимфоцитов на протяжении всех четырех курсов терапии. У пациентов данной группы отсутствовала также положительная
клиническая динамика на фоне лечения.
На фиг. 4 (в группе 2) отражены выраженная стимуляция апоптоза B-лимфоцитов и
снижение их относительного содержания в крови на первом курсе терапии, а также сни4
BY 17629 C1 2013.10.30
жение относительного содержания клональных В-лимфоцитов со второго курса (недели)
терапии вплоть до полной их элиминации к началу пятого курса (недели) лечения. У пациентов данной группы достигнуты полная клинико-гематологическая и полная иммунофенотипическая ремиссия.
Источники информации:
1. Cheson B.D. et al. National Cancer Institute - Sponsored Working Group guidelines for
chronic lymphocytic leukemia: revised guidelines for diagnosis and treatment. Blood. - 1996. No. 12. - P. 4990-4997.
2. Rawstron A.C. et al. Early prediction of outcome and response to alemtuzumab therapy in
chronic lymphocytic leukemia. Blood. - 2004. - V. 15. - No. 103(6). - P. 2027-2031.
3. Darzynkiewicz, Z., E. Bedner, and P. Smolewski. Flow cytometry in analysis of cell cycle
and apoprosis. Seminars Hematol. - 2001. - No. 38. - P. 179-193.
Фиг. 1
Фиг. 2
5
BY 17629 C1 2013.10.30
Фиг. 3
Фиг. 4
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
374 Кб
Теги
патент, by17629
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа