close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY17675

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2013.10.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
G 01N 27/26
(2006.01)
СПОСОБ ОТБОРА СЕМЯН РАПСА ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ
(21) Номер заявки: a 20110055
(22) 2011.01.14
(43) 2012.08.30
(71) Заявитель: Государственное научное
учреждение "Институт экспериментальной ботаники имени В.Ф.Купревича Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Домаш Валентина Иосифовна; Пилюк Ядвига Эдвардовна;
Зеленяк Вадим Вадимович; Шарпио
Тамара Петровна; Забрейко Светлана Алексеевна; Безлюдный Виктор Николаевич (BY)
BY 17675 C1 2013.10.30
BY (11) 17675
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт экспериментальной ботаники имени В.Ф.Купревича Национальной академии наук
Беларуси" (BY)
(56) ДЕМЬЯНЧУК Г.Т. Масличные культуры. - 1985. - № 3. - С. 34.
GUO W. et al. Analytical Letters. - 2005. V. 38. - Is. 3. - P. 343-351.
SU 1406481 A1, 1988.
CA 1113279 A1, 1981.
EP 0275123 A2, 1988.
UA 22772 U, 2007.
(57)
Способ отбора семян рапса для селекции, заключающийся в том, что пробу семян измельчают в муку, которую экстрагируют трис-HCl буфером, pH 7,0, содержащим сахарозу
в концентрации 0,25 М, этилендиаминтетрауксусную кислоту в концентрации 2,0 М и аскорбат натрия в концентрации 0,01 М, при соотношении мука и буфер 1:10, в течение 2-2,5 ч
при температуре 20-23 °С, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15-20 мин, полученный экстракт белка подвергают денатурации путем кипячения в течение 2-3 мин в 100 мМ
трис-HCl буфере, pH 6,8, содержащем 2 % додецилсульфата натрия и 5 % β-меркаптоэтанола, центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об/мин, раствор наносят на пластинку,
содержащую 15 %-ный полиакриламидный гель, которую помещают в 0,05 М трисглициновый буфер, pH 8,3, через который пропускают электрический ток силой 10-20 мА
BY 17675 C1 2013.10.30
и напряжением 120 Вт в течение 1,5-2,0 ч, затем пластинку окрашивают 0,15 %-ным раствором кумасси G-250 в 20 %-ном этаноле и 10 %-ной уксусной кислоте, отмывают от
красителя в 20 %-ном этаноле и 10 %-ной уксусной кислоте, анализируют полученный
полипептидный электрофоретический спектр белков семян рапса и при отсутствии полипептида в области 66 кДа делают вывод о пригодности семян для селекции, а при наличии
полипептида в области 66 кДа делают вывод о непригодности семян рапса для селекции.
Изобретение относится к биохимии растений и сельскому хозяйству, а именно к способу отбора семян рапса по содержанию глюкозинолатов для использования в селекции
растений при создании низкоглюкозинолатных сортов рапса.
В семенах рапса присутствуют антипитательные вещества глюкозинолаты, токсическое соединение серы, содержание которых в зависимости от сорта варьируется в пределах 0,5-6,0 %. При определенных условиях глюкозинолаты расщепляются с образованием
ряда соединений, обладающих разными физиологическими свойствами, вплоть до токсических. Например, глюкозинолаты вызывают раздражение слизистой оболочки, обладают
слабой антибиотической активностью, подавляют деятельность щитовидной железы. Их
количество, переходящее в масло, в значительной степени зависит не только от исходного
содержания в семенах, но и от технологии их переработки.
Известен способ отбора семян рапса по содержанию глюкозинолатов, включающий
отбор семян рапса, их измельчение, извлечение из измельченных семян петролейным эфиром масла, обезжиренную муку помещают в кипящую водяную баню на 5 мин, после центрифугирования супернатант хроматографируют на колонке с ДЕАЕ-сефарозой А-25,
которую промывают 0,5 М ацетатом пиридина и используют для газожидкостной хроматографии. Определение содержания глюкозинолатов проводят по площади пиков.
Недостатками данного способа являются длительность и очень сложная подготовка
пробы, требующая большого количества химических реактивов [1].
Известен способ отбора семян рапса, основанный на гидролизе глюкозинолатов концентрированной щелочью с образованием сульфида. Сероводород, выделяющийся при
взаимодействии сульфида с концентрированной соляной кислотой, отгоняют с паром,
улавливают и определяют количество йодометрическим способом. По количеству выделенной с сероводородом серы рассчитывают содержание глюкозинолатов в семенах рапса.
Недостатком данного способа является необходимость работы с использованием вредных и опасных реактивов, например концентрированной соляной кислоты и щелочи [2].
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является способ
отбора пробы для селекции низкоглюкозинолатных семян рапса, ее экстрагирования буфером при pH 7,0 в присутствии аскорбиновой кислоты, центрифугирования раствора, определения глюкозинолатов методом, основанным на полуколичественном (по цветной
шкале) расчете глюкозы, образующейся при ферментативном распаде глюкозинолатов ортотолуидиновым реактивом.
Но данный способ требует вредных реактивов и является приблизительным [3].
Задачей настоящего изобретения является разработка способа, повышение точности и
ускорение отбора семян рапса на присутствие глюкозинолатов для дальнейшего использования семян для селекции.
Способ отбора семян рапса для селекции заключается в том, что пробу семян измельчают
в муку, которую экстрагируют трис-HCl-буфером, pH 7,0, содержащим сахарозу в концентрации 0,25 М, этилендиаминтетрауксусную кислоту в концентрации 2,0 М и аскорбат натрия в
концентрации 0,01 М, при соотношении мука и буфер 1:10, в течение 2-2,5 ч при температуре
20-23 °С, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15-20 мин, полученный экстракт
белка подвергают денатурации путем кипячения в течение 2-3 мин в 100 мМ трис-HCl буфере, pH 6,8, содержащем 2 %-ный раствор додецилсульфата натрия и 5 % β-меркапто2
BY 17675 C1 2013.10.30
этанола, центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об/мин, раствор наносят на пластинку,
содержащую 15 %-ный полиакриламидный гель, которую помещают в 0,05 М трис-глициновый буфер, pH 8,3, через который пропускают электрический ток силой 10-20 мА и напряжением 120 Вт в течение 1,5-2 ч, затем пластинку окрашивают 0,15 %-ным раствором
кумасси G-250 в 20 %-ном этаноле и 10 %-ной уксусной кислоте, отмывают от красителя в
20 %-ном этаноле и 10 %-ной уксусной кислоте, анализируют полученный полипептидный
электрофоретический спектр белков семян рапса и при отсутствии полипептида в области
66 кДа делают вывод о пригодности семян для селекции, а при наличии полипептида в
области 66 кДа делают вывод о непригодности семян рапса для селекции.
Благодаря совокупности заявленных признаков возможно достижение более высокой
эффективности отбора за счет возможности целенаправленного выделения образцов рапса
с генетически обусловленным более низким содержанием глюкозинолатов.
Заявляемый способ поясняется фигурой, где 1 - пластинка, на которой размещен слой
геля 2 и имеется ячейка 3, в которой размещены белки-маркеры 4, имеющие разную молекулярную массу, обозначенную на шкале 5. Пластинка 1 снабжена шкалой 6, на которой
размещены лунки 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14 с обозначением молекулярной массы полипептидов семян рапса с различным содержанием глюкозинолатов.
Пример.
Пробу семян рапса измельчают в муку, экстрагируют трис-HCl буфером, pH 7,0, содержащим сахарозу в концентрации 0,25 М, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА)
в концентрации 2,0 М и аскорбат натрия в концентрации 0,01 М, при соотношении мука и
буфер 1:10, в течение 2-2,5 ч при температуре 20-23 °С, центрифугируют при 5000 об/мин
в течение 15-20 мин и получают прозрачный экстракт белка, который денатурируют путем
кипячения в течение 2-3 мин в 100 мМ трис-HCl буфере, pH 6,8, содержащем 2 %-ный раствор додецилсульфата натрия и 5 %-ный раствор β-меркаптоэтанола. Раствор центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об/мин. Электрофорез белков семян рапса проводят,
например, на приборе S-250 Amercham Bioscience (Англия). Для этого раствор белка 40-50 мкл
(10-15 мкг) вносят в лунки (ячейки) стеклянной пластинки, содержащей 15 %-ный полиакриламидный гель, которую помещают в 0,05 М трис-глициновый буфер, pH 8,3, через
которую пропускают электрический ток силой 10-20 мА и напряжением 120 Вт в течение
1,5-2 ч. Гелевую пластинку окрашивают 0,15 %-ным раствором кумасси G-250 в 20 %-ном
этаноле и 10 %-ной уксусной кислоте. После этого гель отмывают от красителя в 20 %-ном
этаноле и 10 %-ной уксусной кислоте и получают полипептидный электрофоретический
спектр белков семян рапса, различных по содержанию глюкозинолатов, который анализируют и при отсутствии полипептида в области 66 кДа делают вывод о пригодности семян
для селекции, а при наличии полипептида в области 66 кДа судят делают вывод о непригодности семян рапса для селекции.
Так, в лунке 7 - образец, содержащий 10,9 мкМ/г, в лунке 8 - 10,1 мкМ/г, в лунке 9 9,9 мкМ/г, в лунке 10 - 11,8 мкМ/г, в лунке 11 - 13 мкМ /г, в лунке 12 - 7,6 мкМ/г, в лунке 13 14,2 мкМ/г, в лунке 14 - 15,1 мкМ/г глюкозинолатов.
Способ дает возможность использовать небольшое количество семян и проводить анализ сразу 10 образцов.
Использование предложенного способа отбора семян рапса с низким содержанием
глюкозинолатов для селекции обеспечивает ускорение процесса за счет целенаправленного выделения образцов рапса с генетически обусловленным меньшим содержанием глюкозинолатов.
Источники информации:
1. Guo W., Yuan L., Chen P. and J. Guo. Determination of Glucosinolates in Rapeseeds in Liquid
Chromatography - Electrospray Mass Spectrometry // Analytical Letters. - 2005.- No. 38. - P. 343-353.
3
BY 17675 C1 2013.10.30
2. А.с. СССР 1406481, 1988.
3. Демьянчук Г.Т. Метод массового отбора низкогликозинолатных семян // Масличные культуры. - 1985. - № 3. - С. 34 (прототип).
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
327 Кб
Теги
патент, by17675
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа