close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY17743

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2013.12.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
G 01N 30/02
(2006.01)
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ N-АЦЕТИЛ-L-КАРНИТИНА
(21) Номер заявки: a 20101184
(22) 2010.08.03
(43) 2012.04.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной
академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Кравченко Елена Валериевна; Петров Петр Тимофеевич;
Дубовик Борис Валентинович; Романовский Дмитрий Иосифович;
Курман Петр Владимирович; Шабуня Полина Станиславовна; Фатыхова Светлана Анатольевна (BY)
BY 17743 C1 2013.12.30
BY (11) 17743
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) KWON O.-S. et al. Arch. Pharm. Res. 2004. - V. 27. - No. 6. - P. 676-681.
LONGO A. et al. Journal of Chromatography B. - 1996. - V. 686. - Is. 2. P. 129-139.
VERNEZ L. et al. Journal of Chromatography A. - 2003. - V. 984. - Is. 2. P. 203-213.
KAGAWA M. et al. Journal of Chromatography A. - 1999. - V. 857. - Is. 1-2. P. 127-135.
LI K. et al. Clinica Chimica Acta. - 2007. V. 378. - Is. 1-2. - P. 159-163.
HIRCHE F. et al. Journal of Chromatography B. - 2009. - V. 877. - Is. 22. P. 2158-2162.
JP 2005-221425 A.
(57)
1. Способ определения N-ацетил-L-карнитина в фармацевтических субстанциях, готовых лекарственных формах, биологически активных добавках к пище или полупродуктах
фармацевтического производства, при котором пробу исследуемого образца растворяют в
воде, фильтруют через мембранный фильтр и полученный раствор анализируют методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе, оснащенном колонкой
с сорбентом C18 и спектрофотометрическим детектором, при температуре 25-30 °С и длине
волны 210 ± 20 нм с использованием в качестве подвижной фазы смеси 1-5 мМ раствора
додецилсульфата натрия в воде или аналогичного анионного ПАВ с pH 2,5 ± 1 и ацетонитрила при следующем изменении состава подвижной фазы: линейный градиент от 25 до
40 % ацетонитрила в течение 5 мин и изократический режим при 40 % ацетонитрила в течение следующих 10 мин.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что проводят количественное определение Nацетил-L-карнитина в фармацевтических субстанциях с использованием стандартного образца.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что проводят количественное определение Nацетил-L-карнитина в одно- или многокомпонентных готовых лекарственных формах для
энтерального и парентерального применения с использованием стандартного образца.
BY 17743 C1 2013.12.30
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что проводят количественное определение Nацетил-L-карнитина в одно- или многокомпонентных биологически активных добавках к
пище с использованием стандартного образца.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что проводят количественное определение Nацетил-L-карнитина в полупродуктах фармацевтического производства с использованием
стандартного образца.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что проводят качественное определение Nацетил-L-карнитина в фармацевтических субстанциях, готовых лекарственных формах
или биологически активных добавках к пище.
Изобретение относится к области фармацевтической химии, фармацевтической и пищевой промышленности. Предложен способ количественного определения N-ацетил-Lкарнитина в фармацевтических субстанциях, в готовых лекарственных формах и биологически активных добавках к пище, включающих N-ацетил-L-карнитин, а также в полупродуктах, получаемых на различных стадиях фармацевтического производства. Заявляемый
метод может применяться и для качественного анализа субстанций и фармпродуктов, содержащих указанное вещество.
N-ацетил-L-карнитин широко используется в производстве готовых лекарственных
средств (например, "Карницетин" фирмы ООО "ПИК-ФАРМА", Москва, Россия) [1] и
биологически активных добавок к пище (например, Acetyl L-Carnitine фирмы "Twinlab",
Hauppauge, New York) [2]. Для производства качественных, эффективных и безопасных
для потребителя фармпродуктов необходимо проведение качественного анализа и оценка
количественного содержания вышеназванного активного соединения в субстанции (для
исключения приобретения и использования некачественного сырья), в полупродуктах (для
промежуточного контроля качества продукции) и в финишных фармпродуктах.
В настоящее время для количественного анализа N-ацетил-L-карнитина широко используются ВЭЖХ методы с применением флуоресцентного детектора [3, 4]. Эти методы
заключаются в предварительной дериватизации N-ацетил-L-карнитина с помощью различных веществ, например 1-аминоантрацена и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорида (EDC), с последующим разделением полученных продуктов на
обратно-фазовой колонке и регистрацией с помощью флуоресцентного детектора. Однако
необходимо отметить, что применение этого метода удлиняет время анализа за счет трудоемкой пробоподготовки с использованием ряда дорогостоящих реактивов (например,
EDC и 9-(диазометил)антрацен (ADAM)).
Существуют методы анализа N-ацетил-L-карнитина и других ацил-карнитинов методом
ВЭЖХ с различными видами масс-детекторов [5, 6]. Хотя эти методы отличаются высокой чувствительностью и точностью, но для них также характерна сложная пробоподготовка, требуется использование дорогостоящего масс-спектрометрического оборудования
и наличие квалифицированных специалистов с опытом работы на подобном оборудовании, что зачастую недоступно для лабораторий фармацевтических предприятий.
Также описаны методы определения концентрации N-ацетил-L-карнитина с помощью
ферментного анализа [7] и радиоферментного анализа [8], требующие, в свою очередь,
работы с термолабильными ферментами и радиоактивными метками, работа с которыми
требует соблюдения ряда правил техники безопасности, таких как отдельное помещение,
специально обученный персонал, утилизация радиоактивных отходов.
Описан метод анализа чистоты L-карнитина-L-тартрата методом ВЭЖХ - прототип
заявляемого метода [9]. Для анализа карнитина в данном методе используется высокоэффективная жидкостная обратнофазовая хроматография со спектрофотометрическим детектором и присутствием в подвижной фазе 10-6M додецилсульфата натрия. При этом в
качестве внешнего стандарта используется смесь L-карнитина гидрохлорида и N-ацетил2
BY 17743 C1 2013.12.30
L-карнитина [9]. Данный метод используется для определения количественного содержания
L-карнитина в L-карнитин-L-тартрате; его применение с целью качественного и количественного анализа N-ацетил-L-карнитина, в т.ч. в фармацевтической и пищевой промышленности, предложено не было [9].
Задачей настоящего изобретения является направленная разработка способа качественного и количественного определения N-ацетил-L-карнитина в фармацевтических субстанциях, в готовых лекарственных формах и биологически активных добавках к пище с
или без вспомогательных веществ, а также в полупродуктах, получаемых на различных
стадиях фармацевтического производства. При этом предпочтительно использование широко
применяемого в фармацевтической промышленности, высокочувствительного и надежного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим
детектором.
Способ определения N-ацетил-L-карнитина включает отбор пробы, растворение образца субстанции, ГЛФ или БАД в среде растворения, фильтрацию полученного раствора
через мембранный фильтр, качественное и/или количественное определение N-ацетил-L-карнитина методом ВЭЖХ с детекцией при длине волны 210 ± 20 нм. В качестве растворителя
испытуемого образца используют предпочтительно дистиллированную (деионизованную)
воду, но возможно использование низкомолярных фосфатных или иных буферных растворов
с pH от 2 до 7. В качестве стандартного образца используют N-ацетил-L-карнитин (кат.
№ 00985 Fluka, A6706 Sigma или аналогичного качества). Используются стандартные условия хроматографирования, хорошо известные специалистам. Наиболее предпочтительны
следующие условия хроматографирования: колонка, заполненная силикагелем октадецилсилильным (C-18) для хроматографии (например, Agilent Zorbax SB-18 4,6 × 250 mm,
3,5 µm или аналогичная); температура колонки от + 25 до + 30 °С. Используется линейноступенчатый градиент из двух подвижных фаз, одна из которых представляет собой водный раствор анионного ПАВ с pH 2,5 ± 1, вторая - органическая, предпочтительно ацетонитрил. В качестве ПАВ предпочтительно использовать додецилсульфат натрия в
концентрации от 1 до 5 мМ либо иной близкий по свойствам анионный ПАВ, применяемый в ВЭЖХ (например, децилсульфат натрия). Регистрация сигнала спектрофотометрического детектора ведется при длине волны 210 ± 20 нм.
Метод является удобным, характеризуется высокой степенью безопасности, позволяет
удешевить анализ субстанции, ГЛФ, БАД на основе N-ацетил-L-карнитина, а также полупродуктов, использующихся при их производстве.
Пример 1.
Качественный и количественный анализ N-ацетил-L-карнитина в субстанции фирмы
A And Z Trading Company [10]. Испытание проводят методом жидкостной хроматографии
согласно ГФ РБ т.1, п. 2.2.29 [11].
Раствор сравнения стандарта N-ацетил-L-карнитина и испытуемый раствор субстанции N-ацетил-L-карнитина готовят в концентрации 1,6 мг/мл путем растворения навесок
соответствующих веществ в деионизованной воде. Аликвоты растворов перед хроматографированием фильтруют через мембранный фильтр с размером пор не менее 0,45 мкм.
В качестве подвижных фаз используют 5 мМ раствор додецилсульфата натрия в воде, pH
2,5 (pH доводится фосфорной кислотой) и 100 % ацетонитрил. Анализ проводят на хроматографе Agilent 1200 при следующих условиях: колонка C-18 размером 250 × 4,6 мм,
3,5 мкм; температура колонки + 25 °С; скорость подвижной фазы - 1,0 мл/мин; детектирование при длине волны 210 нм; изменение состава подвижной фазы - линейный градиент
от 25 % до 40 % ацетонитрила в течение 5 мин и изократический режим при 40 % ацетонитрила в течение следующих 10 мин; объем вводимой пробы - 20 мкл.
Применение заявляемого метода позволяет определить присутствие N-ацетил-Lкарнитина в субстанции (пик на хроматограмме испытуемого раствора, совпадающий по
времени удерживания с пиком на хроматограмме стандарта). Найденное количество N3
BY 17743 C1 2013.12.30
ацетил-L-карнитина в субстанции заявляемым методом - 98,17 ± 0,26 %, методом ВЭЖХМС - 98,23 ± 0,18 %, по данным аналитического листа производителя [10] - не менее 98 %
(таблица).
Пример 2.
Качественный и количественный анализ N-ацетил-L-карнитина в фармацевтической
композиции для энтерального применения (раствор для приема внутрь), содержащей
600 мг N-ацетил-L-карнитина, фруктоза - 100 мг, растворитель (вода очищенная) - до 15 мл.
Испытание проводят методом жидкостной хроматографии согласно ГФ РБ т.1,
п. 2.2.29 [11].
Условия хроматографирования, используемые буферный раствор и раствор сравнения
соответствуют описанным в примере 1. Испытуемый раствор готовят следующим образом: 2 мл раствора фармацевтической композиции для энтерального применения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 30 мл деионизованной воды,
тщательно перемешивают и доводят водой до метки. Аликвоту фильтруют через мембранный фильтр с размером пор не более 0,45 мкм.
Заявляемый метод позволяет подтвердить присутствие N-ацетил-L-карнитина в композиции для энтерального применения (пик на хроматограмме испытуемого раствора, совпадающий по времени удерживания с пиком на хроматограмме стандарта). Результаты
количественного определения приведены в таблице. Образец фармкомпозиции по вышеуказанной прописи содержит 40 мг N-ацетил-L-карнитина в 1 мл. Заявленным методом
было найдено 39,8 + 0,41 мг (правильность определения 99,5 %), методом ВЭЖХ-МС 40,23 ± 0,39 мг (правильность определения 100,6 %). Таким образом, правильность определения заявляемым методом количества N-ацетил-L-карнитина в композиции для энтерального применения находится в пределах 98-102 %, что не уступает критериям
приемлемости известных методов определения, но позволяет анализировать N-ацетил-Lкарнитин в фармацевтичекой композиции более удобным и дешевым способом.
Пример 3.
Качественный и количественный анализ N-ацетил-L-карнитина в фармацевтической
композиции для энтерального применения (капсулы), содержащей 200 мг N-ацетил-Lкарнитина и вспомогательные вещества: лактоза - 48 мг, кальция стеарат - 2 мг.
Испытание проводится методом жидкостной хроматографии согласно ГФ РБ т.1,
п. 2.2.29 [11].
Условия хроматографирования, используемые буферный раствор и раствор сравнения
соответствуют описанным в примере 1. Испытуемый раствор готовят следующим образом: 100 мг содержимого капсул помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 30 мл деионизованной воды, тщательно перемешивают, встряхивают на
механическом встряхивателе в течение 30 мин. Доводят водой до метки. Полученному
раствору дают отстояться. Аликвоту надосадочной жидкости фильтруют через мембранный фильтр с размером пор не более 0,45 мкм.
Заявляемый метод позволяет подтвердить присутствие N-ацетил-L-карнитина в фармацевтической композиции (капсулы) для энтерального применения (пик на хроматограмме
испытуемого раствора, совпадающий по времени удерживания с пиком на хроматограмме
стандарта). Результаты количественного определения приведены в таблице. Образец
фармкомпозиции по вышеуказанной прописи содержит 200 мг N-ацетил-L-карнитина в
капсуле. Заявленным методом было найдено 198,7 ± 1,52 мг (правильность определения
99,3 %), методом ВЭЖХ-МС - 199,0 ± 1,45 мг (правильность определения 99,5 %). Таким
образом, правильность определения заявляемым методом количества N-ацетил-Lкарнитина в фармацевтической композиции (капсулы) для энтерального применения находится в пределах 98-102 %, что не уступает критериям приемлемости известных методов определения, но позволяет анализировать N-ацетил-L-карнитин более удобным и
дешевым способом.
4
BY 17743 C1 2013.12.30
Результаты количественного определения N-ацетил-L-карнитина
в образцах заявленным методом и методом ВЭЖХ-МС
Анализируемый
образец
Количество
Количество N-ацетил- Количество N-ацетилN-ацетил-L-кар- L-карнитина, опреде- L-карнитина опреденитина, присутст- ленное заявляемым
ленное методом
вующее в образце
методом ВЭЖХ
ВЭЖХ-MC
Субстанция N-ацетилL-карнитина
Фармацевтическая
композиции для энтерального применения
(раствор для приема
внутрь)
Фармацевтическая
композиция для энтерального применения
(капсулы)
98 %
98,17 ± 0,26 %
98,23 ± 0,18 %
40 мг/мл
39,8 ± 0,41 мг/мл
40,23 ± 0,39 мг/мл
200 мг
198,7 ± 1,52 мг
199,0 ± 1,45 мг
Заявляемый метод обеспечивает избирательность, линейность, прецизионность (повторяемость и воспроизводимость) и правильность. Понятно, что в примерах описано
применение заявляемого метода для анализа наиболее применяемых на практике вариантов
фармацевтических композиций - ГЛФ и БАД (капсулы, раствор для орального применения) и наиболее доступные вспомогательные вещества. Однако заявляемый метод определения
N-ацетил-L-карнитина может быть использован и для анализа других фармацевтических
композиций с другими вспомогательными веществами (не ограничиваясь приведенными
примерами), которые разрешены к применению и описаны в фармакопеях (например, в
таблетках, капсулах, порошках для приготовления растворов для приема внутрь, назальных спреях).
Заявляемый метод может использоваться также и в других отраслях промышленности,
помимо фармацевтической и пищевой промышленности, например в химическом производстве (при получении N-ацетил-L-карнитина из карнитина методом ацетилирования) [12].
Источники информации:
1. Интернет-портал ООО "ПИК-ФАРМА" [Электронный ресурс]. - М., 2006. Режим
доступа: http://www.pikfarma.ru/products/Carnisetin.html. - Дата доступа: 24.07.2010.
2. Twinlab Corporation [Electronic resource] / - Hauppauge, New York, 2009. - Mode of access: http://www.twinlab.com/product/acetyl-l-carnitine - Date of access: 25.07.2010.
3. Cao Y. et al. Comparison of pharmacokinetics of L-Carnitine, Acetyl_L- carnitine and
Propionyl-L-carnitine after single oral administration of L-carnitine in healthy volunteers // Clin.
Invest Med. - 2009. - Vol 32. - No. 1. - P. 13-19.
4. Oh-Seung Kwon, Youn Bok Chung. HPLC determination and pharmacokinetics of endogenous acetyl-L-carnitine (ALC) in human volunteers orally administered a single dose of
ALC // Arch Pharm Res. - 2004. - Vol 27. - No. 6. - P. 676-681.
5. Paul E. Minkler et al. Quantification of carnitine and acylcarnitines in biological matrices
by HPLC electrospray ionization-mass spectrometry // Clinical Chemistry. - 2008.- Vol. 54. Nо. 9. - P. 1451-1462.
6. Maeda Y. et al. Simultaneous quantification of acylcarnitine isomers containing dicarboxylic acylcarnitines in human serum and urine bi HPLC/ESI tandem mass spectrometry // Rapid
Commun Mass Spectrom. - 2007. - Vol. 21. - No. 5. - P. 799-806.
5
BY 17743 C1 2013.12.30
7. Takahashi M. et al. Carnitine determination by an enzymatic cycling method with carnitine dehydrogenase // Clinical Chemistry. - 1994. - Vol. 40. - P. 817-821.
8. Hoppel C.L. et al. Separation of acylcarnitines from biological samples using highperformance liquid chromatography // Anal Biochem. - 1986. - Vol. 156. - No. 1.- P. 111-117.
9. Determination of Carnitine Tartrate Purity. Analytical Test Report. [Electronic resource]/Mode
of access: http://forum.bodvbuilding.com/attachment.php?attachmentid = 256504&d. - Date of
access: 25.07.2010.
10. A & Z Food Additives Co.,Ltd. [Electronic resource] / - HangZhou, ZheJiang, China,
2008 - 2009. - Mode of access: http://www.chinaadditives.com/N-Acetyд- L-Carnitine-Hcl.htm Date of access: 25.07.2010.
11. Государственная Фармакопея Республики Беларусь (1 издание) // Ред. Годовальников Г.В. - Молодечно, 2009.
12. Dubroeucq M.C. et al. Psychopharmacological agents // In: U1lmann's Encyclopedia of
Industrial Chemistry. - Wiley-VCH Publishers. - 2003. - Vol. 30. - P. 397-442.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
107 Кб
Теги
by17743, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа