close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY17751

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2013.12.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
BY 17751 C1 2013.12.30
(54)
BY (11) 17751
(13) C1
(19)
G 01N 33/577
(2006.01)
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ДЛЯ АЛЛОГЕННОЙ
ТРАНСПЛАНТАЦИИ БОЛЬНОМУ С ПАТОЛОГИЕЙ
КРОВЕТВОРЕНИЯ
(21) Номер заявки: a 20101247
(22) 2010.08.20
(43) 2012.04.30
(71) Заявитель: Государственное учреждение образования "Белорусская
медицинская академия последипломного образования" (BY)
(72) Авторы: Зафранская Марина Михайловна; Усс Анатолий Леонидович; Кривенко Светлана Ивановна;
Нижегородова Дарья Борисовна
(BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение образования "Белорусская медицинская академия последипломного образования" (BY)
(56) Современные методы диагностики,
лечения и профилактики заболеваний: Сб. инструктивно-методических документов. Т.2. Медицинская
генетика. Гематология и трансфузиология. Лабораторное дело.
Вып. 5. - Минск, 2005. - С. 53-61.
РЯБЦЕВА Е.С. и др. Весцi Нацыянальнай акадэмii навук Беларусi. 2006. - № 1. - С. 81-87.
ХУЛУП Г.Я. и др. Состояние и перспективы трансплантологии. Материалы Международной научно-практической конференции. - Минск, 2008. С. 156-161.
ЛЕВИН В.И. и др. Иммунопатология,
аллергология, инфектология. - 2006. № 1. - С. 6-8.
Современные методы диагностики,
лечения и профилактики заболеваний.
Сб. инструктивно-методических документов. T.2. Лабораторная диагностика. Клиническая фармакология и фармация. Гематология и трансфузиология. - Минск, 2001. - С. 274-292.
КОСМАЧЕВА С.М. и др. Достижения
медицинской науки Беларуси. Вып.
XII. - Минск, 2007. - С. 37-39.
(57)
Способ определения возможности использования мезенхимальных стволовых клеток
для аллогенной трансплантации больному с патологией кроветворения, заключающийся в
том, что получают от одного аллогенного донора мезенхимальные стволовые клетки, а от
другого аллогенного донора - мононуклеары периферической крови, окрашивают мононуклеары карбоксифлуоресцеином, культивируют в течение 5 дней в питательной среде,
содержащей фитогемагглютинин, мононуклеары периферической крови в присутствии
мезенхимальных стволовых клеток и без них, регистрируют фитогемагглютинининдуцированную пролиферацию CD3 + T-лимфоцитов в полученных культурах клеток,
используя моноклональные антитела к CD3 рецептору Т-лимфоцитов, определяют коэффициент супрессии пролиферативного ответа мононуклеаров мезенхимальными стволовыми клетками k в процентах по формуле:
П
× 100
k = 100 − Т + МСК
,
ПТ
BY 17751 C1 2013.12.30
где ПТ + МСК - показатель пролиферации CD3 + T-лимфоцитов в культуре мононуклеаров
периферической крови при их культивировании в присутствии мезенхимальных стволовых клеток, %;
ПТ - показатель пролиферации CD3 + T-лимфоцитов в культуре мононуклеаров периферической крови при их культивировании без мезенхимальных стволовых клеток, %;
и устанавливают возможность использования мезенхимальных стволовых клеток для аллогенной трансплантации больному с патологией кроветворения при значении k более 50 %.
Изобретение относится к медицине, к разделам гематологии, трансплантологии, клеточной биологии, онкологии.
Одним из самых частых и тяжелых осложнений стандартного протокола лечения пациентов с патологией кроветворения, основанного на аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, является развитие реакции "трансплантат против хозяина", в
результате которой происходит цитотоксическое поражение организма реципиента. Перспективное направление селективного подавления активности цитотоксических Тлимфоцитов при развитии реакции "трансплантат против хозяина" основано на использовании иммуносупрессивных свойств аллогенных мезенхимальных стволовых клеток донора. Однако проблема применения донорских культур аллогенных мезенхимальных
стволовых клеток заключается в индивидуальном различии их иммуносупрессивного потенциала. В связи с этим для определения возможности трансплантации аллогенных мезенхимальных стволовых клеток донора больному с патологией кроветворения
необходимо предварительно оценить степень иммуносупрессивного потенциала аллогенных мезенхимальных стволовых клеток донора и определить эффективность их использования in vivo. Аналогов не обнаружено.
Задачей заявляемого способа является подбор аллогенных мезенхимальных стволовых
клеток донора in vitro для определения возможности их трансплантацииольному с патологией кроветворения после проведенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток для предупреждения развития реакции "трансплантат против хозяина".
Поставленная задача решается следующим способом. Предложен способ определения
возможности использования мезенхимальных стволовых клеток для аллогенной трансплантации больному с патологией кроветворения, заключающийся в том, что получают от
одного аллогенного донора мезенхиальные стволовые клетки, а от другого аллогенного
донора - мононуклеары периферической крови, окрашивают мононуклеары карбоксифлуоресцеином, культивируют в течение 5 дней в питательной среде, содержащей фитогемагглютинин, мононуклеары периферической крови в присутствии мезенхимальных
стволовых клеток и без них, регистрируют фитогемагглютинин-индуцированную пролиферацию CD + T-лимфоцитов в полученных культурах клеток, используя моноклональные
крови в присутствии мезенхимальных стволовых клеток и без них, регистрируют фитогемагглютинин-индуцированную пролиферацию CD + T-лимфоцитов в полученных культурах клеток, используя моноклональные антитела к CD3 рецептору T-лимфоцитов,
определяют коэффициент супрессии пролиферативного ответа мононуклеаров мезенхимальными стволовыми клетками k в процентах по формуле:
П
× 100
k = 100 − Т + МСК
,
ПТ
где ПТ + МСК - показатель пролиферации CD3 + T-лимфоцитов в культуре мононуклеаров
периферической крови при их культивировании в присутствии мезенхимальных стволовых клеток, %;
ПТ - показатель пролиферации CD3 + T-лимфоцитов в культуре мононуклеаров периферической крови при их культивировании без мезенхимальных стволовых клеток, %;
2
BY 17751 C1 2013.12.30
и устанавливают возможность использования мезенхимальных стволовых клеток для аллогенной трансплантации больному с патологией кроветворения при значении k более 50 %.
Пример 1.
Больной А., 33 года, поступил в отделение трансплантации костного мозга с диагнозом хронический миелолейкоз. Больному А. была выполнена аллогенная трансплантация
гемопоэтических стволовых клеток после предварительно проведенного режима кондиционирования (высокодозной полихимиотерапии) и запланирована трансплантация аллогенных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) донора Б., 27 лет, для предупреждения
развития реакции "трансплантат против хозяина". Для предварительной оценки in vitro
иммуносупрессивного потенциала аллогенных МСК был осуществлен забор жировой ткани у донора Б. методом стандартной липосакции и получены мезенхимальные стволовые
клетки жировой ткани ранних (1-4-го) пассажей, а у донора В., 31 год, был осуществлен
забор периферической венозной крови и получены мононуклеарные клетки периферической крови (МПК).
Аллогенные МСК донора Б. совместно культивировали с МПК донора В., предварительно окрашенными в 1 мл культуральной среды RPMI-1640 внутриклеточным красителем карбоксифлуоресцеином (7 дМ на 1x10 клеток/мл) в течение 5 мин в темноте при
комнатной температуре, в соотношении 1:10 в течение 5 дней в питательной среде (RPMI1640 с 25 мМ HEPES, 2 мМ L-глютамина, 25 мкг/мл гентамицина, 10 % инактивированной
эмбриональной телячьей сыворотки), содержащей 2,5 мкг/мл митогена фитогемагглютинина,
в увлажненной атмосфере с 5 % CO2 при 37 °С. При этом параллельно культивировали МПК
донора В. без добавления аллогенных МСК жировой ткани донора Б. в той же среде.
Регистрацию митоген-индуцированной пролиферации СБЗ + T-лимфоцитов донора В.
в культуре аллогенных МСК и МПК и в культуре МПК осуществляли на 5-й день культивирования методом проточной цитометрии. Для этого клеточные суспензии обеих культур
окрашивали моноклональными антителами, меченные флуоресцентной меткой, к CD3 рецептору T-лимфоцитов в течение 15 мин в темноте с последующей регистрацией пролиферации клеток. Результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1
Пролиферация СБЗ + Т-лимфоцитов донора В. в ответ на фитогемагглютинин
в присутствии аллогенных МСК жировой ткани донора Б. или в их отсутствие
Пролиферация СОЗ + T-клеток в культуре
Пролиферация СОЗ + T-клеток
МПК с добавлением аллогенных МСК жиров культуре МПК, % (ПT)
вой ткани донора Б., % (ПT + мск)
Донор В.
49,6
11,1
Согласно полученным данным был подсчитан коэффициент супрессии пролиферативного ответа k (%) по формуле:
× 100
П
11,1× 100
= 77,6% .
k = 100 − T +МСК
= 100 −
ПT
49,6
Таким образом, коэффициент супрессии пролиферативного ответа k составил более
50 %, что свидетельствует о наличии возможного терапевтического эффекта аллогенных
МСК жировой ткани донора Б. при использовании данных клеточных культур для предупреждения развития реакции "трансплантат против хозяина" у больного с патологией кроветворения после проведенной аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых
клеток. В связи с этим больному А. рекомендовано проведение трансплантации аллогенных МСК, полученных из жировой ткани донора Б., с целью иммунологической супрессии Т-клеточного ответа.
Пример 2.
Больной Г., 33 года, поступил в отделение трансплантации костного мозга с диагнозом
хронический миелолейкоз. Больному Г. была выполнена аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток после предварительно проведенного режима кондицио3
BY 17751 C1 2013.12.30
нирования (высокодозной полихимиотерапии) и запланирована трансплантация аллогенных МСК донора Д., 30 лет, для предупреждения развития реакции "трансплантат против
хозяина". Для предварительной оценки in vitro иммуносупрессивного потенциала аллогенных МСК был осуществлен забор жировой ткани у донора Д. методом стандартной липосакции и получены мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани ранних (1-4-го)
пассажей, а у донора Е., 29 лет, был осуществлен забор периферической венозной крови и
получены мононуклеарные клетки периферической крови (МПК).
Аллогенные МСК донора Д. совместно культивировали с МПК донора Е., предварительно окрашенными в 1 мл культуральной среды RPMI-1640 внутриклеточным красителем карбоксифлуоресцеином (7 цМ на 1x107 клеток/мл) в течение 5 мин в темноте при
комнатной температуре, в соотношении 1:10 в течение 5 дней в питательной среде (RPMI1640 с 25 мМ HEPES, 2 мМ L-глютамина, 25 мкг/мл гентамицина, 10 % инактивированной
эмбриональной телячьей сыворотки), содержащей 2,5 мкг/мл митогена фитогемагглютинина, в увлажненной атмосфере с 5 % > CO2 при 37 °С. При этом параллельно культивировали МПК донора Е. без добавления аллогенных МСК жировой ткани донора Д. в той
же среде.
Регистрацию митоген-индуцированной пролиферации СОЗ + T-лимфоцитов донора Е.
осуществляли на 5-й день культивирования методом проточной цитометрии. Для этого
клеточные суспензии обеих культур окрашивали моноклональными антителами, меченные флуоресцентной меткой, к CD3 рецептору T-лимфоцитов в течение 15 мин в темноте
с последующей регистрацией пролиферации клеток. Результаты представлены в табл. 2.
Таблица 2
Пролиферация СОЗ + T-лимфоцитов донора Е. в ответ на фитогемагглютинин
в присутствии аллогенных МСК жировой ткани донора Д. или в их отсутствие
Пролиферация СОЗ + Tклеток в культуре
МПК, % (ПT)
Пролиферация CD3 + T- icneTOK в культуре МПК
с добавлением аллогенных МСК жировой ткани
донора Д., % (ПT + мск)
Донор Е.
71,5
50,1
Согласно полученным данным был подсчитан коэффициент супрессии пролиферативного ответа k (%) по формуле:
П
50 × 100
× 100
= 29,9% .
k = 100 − T + МСК
= 100 −
ПT
71,5
Таким образом, коэффициент супрессии пролиферативного ответа k составил менее
50 %, что свидетельствует об отсутствии возможного терапевтического эффекта аллогенных МСК жировой ткани донора Д. при использовании данных клеточных культур для
предупреждения развития реакции "трансплантат против хозяина" у больного с патологией кроветворения после проведенной аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. В связи с этим больному Г. не рекомендовано проведение трансплантации
аллогенных МСК, полученных из жировой ткани донора Д., с целью иммунологической
супрессии T-клеточного ответа.
Вывод.
При определении коэффициента супрессии пролиферативного ответа к более 50 % аллогенные МСК жировой ткани донора могут быть использованы для трансплантации
больному с патологией кроветворения после проведенной аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток с целью предупреждения развития реакции "трансплантат против хозяина".
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
96 Кб
Теги
by17751, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа