close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY18051

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2014.02.28
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 12N 5/0775
(2010.01)
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ
КЛЕТОК ИЗ ЖИРОВОЙ ТКАНИ ЧЕЛОВЕКА
(21) Номер заявки: a 20101863
(22) 2010.12.21
(43) 2012.08.30
(71) Заявители: Государственное учреждение "Республиканский научнопрактический центр трансфузиологии и медицинских биотехнологий"; Учреждение здравоохранения
"9-я городская клиническая больница" (BY)
(72) Авторы: Кривенко Светлана Ивановна; Бузук Евгения Сергеевна;
Дедюля Наталья Ивановна; Селезнева Евгения Алексеевна; Коритко
Алла Александровна; Назарова Екатерина Александровна (BY)
(73) Патентообладатели: Государственное учреждение "Республиканский
научно-практический центр трансфузиологии и медицинских биотехнологий"; Учреждение здравоохранения "9-я городская клиническая
больница" (BY)
BY 18051 C1 2014.02.28
BY (11) 18051
(13) C1
(19)
(56) KERN S. et al. Stem Cells. - 2006. - V.
24. - P. 1294-1301.
BAGLIONI S. et al. The FASEB Journal. 2009. - V. 23. - P. 3494-3505.
BUNNEL B.A. et al. Methods. - 2008. V. 45. - P. 115-120.
ПОВЕЩЕНКО О.В. и др. Бюллетень
СО РАМН. - 2008. - № 5. - С. 90-95.
US 2006/0051865 A1.
US 2010/0015710 A1.
RU 2252252 C1, 2005.
RU 2351649 C1, 2009.
BOQUEST A.C. et al. Methods Mol.
Biol. - 2006. - V. 325. - P. 35-46.
DUBOIS S.G. et al. Methods Mol. Biol. 2008. - V. 449. - P. 69-79.
BAPTISTA L.S. et al. Cytotherapy. 2009. - V. 11. - No. 6. - P. 706-715.
KORN B.S. et al. Ophthal Plast Reconst.
Surg. - 2009. - V. 25. - No. 1. - P. 27-32.
GIMBLE J. et al. Cytotherapy. - 2003. V. 5. - No. 5. - P. 362-369.
(57)
Способ получения мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани человека, при
котором выделяют жировую ткань в виде липоаспирата, липоаспират трижды отмывают
от эритроцитов стерильным фосфатно-солевым буфером путем центрифугирования при
430 g 10 мин, смешивают с фосфатно-солевым буфером, содержащим 0,045-0,06 % фермента коллагеназы I, инкубируют при медленном помешивании 60 мин при 37 °С, после
чего нейтрализуют действие фермента путем добавления среды DMEM-LG с 10 % FBS,
полученные клетки жировой ткани дважды отмывают от фермента средой DMEM-LG, содержащей 10 % FBS, путем центрифугирования сначала при 1200 g 10 мин, а затем при
430 g 10 мин, ресуспендируют в среде DMEM-LG, содержащей 2 mM L-глютамина, 10000 U/мл
пенициллина и 10 мг/мл стрептомицина, высевают в культуральный флакон в концентрации 5000 клеток/см2, выдерживают 24 ч в CO2-инкубаторе при 37 °С, 5 % CO2 и 90 %-ной
влажности, адгезировавшиеся к поверхности флакона мезенхимальные стволовые клетки
отмывают фосфатно-солевым буфером, заполняют флакон средой DMEM-LG, содержащей 2 mM L-глютамина, 10000 U/мл пенициллина и 10 мг/мл стрептомицина, и культивируют в CO2-инкубаторе при 37 °С, 5 % CO2 и 90 %-ной влажности до получения
BY 18051 C1 2014.02.28
первичной культуры мезенхимальных стволовых клеток, причем среду культивирования
меняют через каждые 3-4 дня.
Изобретение относится к области клеточной биологии, в частности к выделению мезенхимальных стволовых клеток (МСК) из жировой ткани человека, и может найти применение в медицине для лечения широкого круга заболеваний.
В течение последних десятилетий активно разрабатываются методы клеточной терапии, в частности трансплантации стволовых клеток с целью замещения в организме поврежденных клеток и тканевых структур и восстановления функций различных органов.
Различные типы стволовых клеток уже находят свое применение в работах по генетике, эмбриологии, в изучении роли факторов роста и цитокинов, фармакологии, токсикологии, трансплантологии.
Плюрипотентность стволовых клеток, их способность к самоподдержанию и миграции, а также к смене программ развития и дифференцировки дает им решающие преимущества по сравнению с дифференцированными клетками для применения в регенеративной медицине.
В связи с этим стволовые клетки являются одними из самых перспективных кандидатов на использование в клинических целях, и наибольшую актуальность приобретают работы по их выделению из различных тканей человека.
В настоящее время выделены различные типы стволовых клеток взрослого организма:
предшественники клеток нервной ткани, гемопоэтические стволовые клетки, которые ответственны за формирование всех типов клеток крови, и мезенхимальные стволовые клетки, которые способны дифференцироваться не только в клетки мезодермального, но
эндодермального и нейроэктодермального происхождения, включая нейроны, гепатоциты
и эндотелиальные клетки.
Мезенхимальные стволовые клетки отличаются относительной простотой культивирования этой популяции стволовых клеток, плюрипотентностью, низкой иммуногенностью, способностью к самоподдержанию, высоким пролиферативным потенциалом. В
связи с этим особое внимание уделяется способам изоляции мезенхимальных стволовых
клеток из тканей взрослого организма, однако универсального метода их получения до
сих пор нет.
Известен способ получения мезенхимальных стволовых клеток с использованием ферментативной обработки жировой ткани 0,075 %-ным раствором коллагеназы IV типа в
среде Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) в течение 1 ч
при 37 °С. Выделенные клетки центрифугировали при 1200 g 10 мин, затем ресуспендировали в среде DMEM/F12, содержащей 10 % Fetal Bovine Serum (FBS), 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки отмывались от эритроцитов и клеточных дебрей
через 24 ч и инкубировались в атмосфере 5 % CO2 при 37 °С и 90 %-ной влажности [1].
Недостатком этого метода является применение фермента, неспецифичного для данного типа ткани, а также более высокая стоимость коллагеназы IV типа по сравнению с
коллагеназой I типа.
Известен способ выделения мезенхимальных стволовых клеток, при котором жировую
ткань подвергают действию раствора для ферментативной обработки (фосфатно-солевой
буфер, содержащий 1 % FBS и 0,1 % коллагеназы I типа), нагретого до 37 °С. Инкубация
осуществлялась на водяной бане при 37 °С в течение 1 ч при постоянном помешивании.
Далее клетки центрифугировали при комнатной температуре 5 мин при 300-500 g. Клеточный осадок был ресуспендирован в среде для стромальных клеток DMEM/F-12 Ham's,
содержащей 10 % FBS, 100 U пенициллина, 100 мкг стрептомицина, 0,25 мкг фунгизона.
Клетки отмывались от эритроцитов и клеточных дебрей через 48 ч и инкубировались в
атмосфере 5 % CO2 при 37 °С и 90 %-ной влажности.
2
BY 18051 C1 2014.02.28
Недостатком этого способа является значительная ферментативная нагрузка на клетки
ввиду использования высокой концентрации фермента, а также одновременное снижение
его активности при добавлении в раствор 1 % FBS и, соответственно, больший расход дорогостоящего фермента [2].
Известен способ выделения мезенхимальных стволовых клеток, заключающийся в получении мононуклеарных клеток методом, в ходе которого измельченную жировую ткань
в течение двух ч подвергали действию среды для ферментативной обработки, состоящей
из культуральной среды DMEM (0,5 г/мл) и 0,1 %-ного раствора коллагеназы IA. Затем
клетки центрифугировали и пропускали через нейлоновый фильтр с размером пор 40 мкм.
Клеточный осадок был ресуспендирован в среде MesenCult, содержащей 10 % MesenCult
stimulatory supplements. Через 24 ч неадгезировавшиеся клетки были удалены, а адгезировавшаяся фракция инкубировалась в атмосфере 5 % CO2 при 37 °С и 90 %-ной влажности [3].
Недостатком этого метода является повреждение клеточных мембран и снижение жизнеспособности выделяемых стволовых клеток из-за использования фермента в высокой
концентрации и длительного времени инкубации.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к заявляемому является способ выделения мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани человека, заключающийся в том, что для изоляции стромально-васкулярной фракции
необработанный липоаспират интенсивно отмывали в фосфатно-солевом буфере и подвергали действию 0,075 % коллагеназы типа I (1:1) в фосфатно-солевом буфере в течение
30-60 мин при 37 °С при аккуратном помешивании, затем активность коллагеназы нейтрализовали культуральной средой Dulbecco's Modified Eagle Medium - low glucose (DMEMLG), содержащей 10 % FBS. Чтобы получить концентрированный клеточный осадок,
клетки центрифугировали 10 мин при 1200 g. Осадок ресуспендировали в культуральной
среде DMEM- LG, содержащей 10 % Mesenchymal stem cell growth supplements (MSC-GS)
и очищали с помощью нейлонового фильтра с размером пор 100 мкм для удаления клеточных остатков. Очищенные клетки повторно центрифугировали при 1200 g 10 мин, затем высевали в культуральные флаконы и инкубировали в атмосфере 5 % CO2 при 37 °С и
90 %-ной влажности. Через 12-18 ч неадгезировавшаяся фракция клеток удалялась с помощью интенсивной отмывки [4].
Недостатком способа является низкая жизнеспособность выделяемых стволовых клеток вследствие высокой ферментной нагрузки на клетки, в результате невысокий выход
конечного продукта и дороговизна способа.
Изобретение решает задачу выделения мезенхимальных стволовых клеток из жировой
ткани человека и позволяет не только снизить ферментную нагрузку на клетки и увеличить выход МСК, но и удешевить процедуру выделения мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани за счет уменьшения расхода дорогостоящего фермента (для
выделения стволовых клеток используются специальные ферментные препараты высокой
степени очистки).
Поставленная задача достигается за счет того, что в способе получения мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани человека выделяют жировую ткань в виде липоаспирата, липоаспират трижды отмывают от эритроцитов стерильным фосфатно-солевым
буфером путем центрифугирования при 430 g 10 мин, смешивают с фосфатно-солевым
буфером, содержащим 0,045-0,06 % фермента коллагеназы I, и инкубируют при медленном помешивании 60 мин при 37 °С, после чего нейтрализуют действие фермента путем
добавления среды DMEM-LG с 10 % FBS, полученные клетки жировой ткани дважды отмывают от фермента средой DMEM-LG, содержащей 10 % FBS, путем центрифугирования сначала при 1200 g 10 мин, а затем при 430 g 10 мин, ресуспендируют в среде DMEMLG, содержащей 2 mM L-глютамина, 10000 U/мл пенициллина и 10 мг/мл стрептомицина,
высевают в культуральный флакон в концентрации 5000 клеток/см2, выдерживают 24 ч в
CO2-инкубаторе при 37 °С, 5 % CO2 и 90 %-ной влажности, адгезировавшиеся к поверхно3
BY 18051 C1 2014.02.28
сти флакона мезенхимальные стволовые клетки отмывают фосфатно-солевым буфером,
заполняют флакон средой DMEM-LG, содержащей 2 mM L-глютамина, 10000 U/мл пенициллина и 10 мг/мл стрептомицина, и культивируют в CO2-инкубаторе при 37 °С, 5 % CO2
и 90 %-ной влажности до получения первичной культуры мезенхимальных стволовых
клеток, причем среду культивирования меняют через каждые 3-4 дня. Способ осуществляют следующим образом.
Образец жировой ткани предварительно промывают фосфатно-солевым буфером
(PBS, phosphate buffered saline) без ионов Ca2+ и Mg2+. Обрабатываемый липоаспират смешивается с равным объемом стерильного PBS и центрифугируется 10 мин при 430 g. Образовавшийся поверх PBS слой липоаспирата собирается в стерильную пробирку. Процедура повторяется трижды для максимального очищения липоаспирата от эритроцитов,
что является необходимым для получения гомогенной популяции мононуклеарных клеток.
Полученная суспензия смешивается с равным объемом 0,045-0,06 %-ного раствора
коллагеназы I типа в PBS и инкубируется в течение 60 мин при температуре 37 °С и легком помешивании. Фермент нейтрализуется добавлением к смеси равного объема среды
DMEM-LG, содержащей 10 % FBS. Полученная при нейтрализации фермента смесь центрифугируется 10 мин при 1200 g, осадок собирается и ресуспендируется в среде DMEMLG, содержащей 10 % FBS. Для очистки суспензия еще раз центрифугируется при более
щадящем для клеток режиме 10 мин при 430 g.
После этого осадок ресуспендируется в культуральной среде DMEM-LG с добавлением L-глютамина в количестве 2 mM и смеси антибиотиков в количестве 10000 U/мл пенициллина и 10 мг/мл стрептомицина и высевается в культуральные флаконы, которые
помещаются на 24 ч в CO2-инкубатор (37 °С, 5 % CO2, 90 %-ная влажность). L-глютамин
является незаменимой аминокислотой, необходимой для обеспечения пролиферативной
активности клеток. Пенициллин и стрептомицин добавляют в культуральную среду, чтобы избежать контаминации при длительном культивировании.
Адгезировавшиеся к поверхности флакона клетки трижды отмываются струей стерильного фосфатно-солевого буфера, после чего флаконы заполняются специализированной средой для культивирования мезенхимальных стволовых клеток. Среда меняется
каждые 3-4 дня. Изобретение иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1.
Обрабатываемый липоаспират объемом 25 мл смешивался с равным объемом стерильного PBS и центрифугировался 10 мин при 430 g. Образовавшийся поверх PBS слой
адипоцитов собирался в стерильную пробирку. Процедура повторялась трижды. В полученную суспензию для ферментативной обработки вводили 4,5 мл 0,25 %-ного раствора
коллагеназы типа I в фосфатно-солевом буфере (20,5 мл) до конечной концентрации
0,045 %, инкубировали 1 ч при 37 °С на шейкере при медленном покачивании. Фермент
нейтрализовали добавлением к смеси равного объема среды DMEM-LG, содержащей 10 %
FBS. Полученная смесь центрифугировалась 10 мин при 1200 g, осадок собирался и ресуспендировался в среде DMEM-LG с 10 % FBS. Суспензия еще раз центрифугировалась
10 мин при 430 g, ресуспендировалась в 5 мл культуральной среды для мезенхимальных
стволовых клеток DMEM-LG с добавлением 50 мкл L-глютамина (2 mM) и 50 мкл смеси
антибиотиков (10000 U/мл пенициллина и 10 мг/мл стрептомицина) и высевалась в культуральный флакон площадью дна 25 см2 в концентрации 5000 клеток/см2, который помещался на 24 ч в CO2-инкубатор (37 °С, 5 % CO2, 90 %-ная влажность). Жизнеспособность
клеток оценивалась по выходу клеток в первичной культуре. Выход клеток в первичной
культуре составил 238×103 на 25 см2 площади.
Пример 2.
Обрабатываемый липоаспират объемом 25 мл смешивался с равным объемом стерильного PBS и центрифугировался 10 мин при 430 g. Образовавшийся поверх PBS слой
адипоцитов собирался в стерильную пробирку. Процедура повторялась трижды. В полу4
BY 18051 C1 2014.02.28
ченную суспензию для ферментативной обработки вводили 6,25 мл 0,25 %-ного раствора
коллагеназы типа I в фосфатно-солевом буфере (18,75 мл) до конечной концентрации
0,06 %, инкубировали 1 ч при 37 °С на шейкере при медленном покачивании. Фермент
нейтрализовали добавлением к смеси равного объема среды DMEM-LG, содержащей 10 %
FBS. Полученная смесь центрифугировалась 10 мин при 1200 g, осадок собирался и ресуспендировался в среде DMEM-LG с 10 % FBS. Суспензия еще раз центрифугировалась
10 мин при 430 g, ресуспендировалась в 5 мл культуральной среды для мезенхимальных
стволовых клеток DMEM-LG с добавлением 50 мкл L-глютамина (2 mM) и 50 мкл смеси
антибиотиков (10000 U/мл пенициллина и 10 мг/мл стрептомицина) и высевалась в культуральный флакон площадью дна 25 см2 в концентрации 5000 клеток/см2, который помещался на 24 ч в CO2-инкубатор (37 °С, 5 % CO2, 90 %-ная влажность). Жизнеспособность
клеток оценивалась по выходу клеток в первичной культуре. Выход клеток в первичной
культуре составил 176×103 на 25 см2 площади.
Пример 3.
В заявляемом способе использован фермент коллагеназа типа I с концентрацией по
прототипу.
Обрабатываемый липоаспират объемом 25 мл смешивался с равным объемом стерильного PBS и центрифугировался 10 мин при 430 g. Образовавшийся поверх PBS слой
адипоцитов собирался в стерильную пробирку. Процедура повторялась трижды. В полученную суспензию для ферментативной обработки вводили 7,6 мл 0,25 %-ного раствора
коллагеназы типа I в фосфатно-солевом буфере (17,4 мл) до конечной концентрации
0,075 %, инкубировали 1 ч при 37 °С на шейкере при медленном покачивании. Фермент
нейтрализовали добавлением к смеси равного объема среды DMEM-LG, содержащей 10 %
FBS. Полученная смесь центрифугировалась 10 мин при 1200 g, осадок собирался и ресуспендировался в среде DMEM-LG с 10 % FBS. Суспензия еще раз центрифугировалась
10 мин при 430 g, ресуспендировалась в 5 мл специализированной культуральной среды
для мезенхимальных стволовых клеток DMEM-LG с добавлением 50 мкл L-глютамина
(2 mM) и 50 мкл смеси антибиотиков (10000 U/мл пенициллина и 10 мг/мл стрептомицина) и
высевалась в культуральный флакон площадью дна 25 см2 в концентрации 5000 клеток/см2,
который помещался на 24 ч в CO2-инкубатор (37 °С, 5 % CO2, 90 %-ная влажность).
Жизнеспособность клеток оценивалась по выходу клеток в первичной культуре. Выход клеток в первичной культуре составил 156×103 на 25 см2 площади.
Выход клеток в первичной культуре в воспроизведенном способе, иллюстрирующем
прототип по одному из параметров (концентрация коллагеназы I типа), составляет
156×103 клеток на 25 см2 площади, в то время как в заявленном способе выход клеток составляет 238×103 клеток с той же площади в течение одинакового периода культивирования при использовании меньшей концентрации фермента.
Таким образом, совокупность существенных признаков в заявляемом способе приводит к повышению жизнеспособности мезенхимальных стволовых клеток, что влияет на
выход конечного продукта, снижает ферментную нагрузку на клетки, улучшает качество
получаемого трансплантата (во многом определяется клеточностью образца) и удешевляет
процедуру выделения МСК из жировой ткани за счет уменьшения расхода дорогостоящего фермента.
Источники информации:
1. Ng L.W.C., Yip S.K., Wong H.K. et al. Adipose-derived stem cells from pregnant women
show higher proliferation rate unrelated to estrogen // Human Reproduction. - 2009. - Vol. 24. No. 5. - P. 1164-1170.
5
BY 18051 C1 2014.02.28
2. Mitchell B.J., Mclntosh К., Zvonic S. et al. Immunophenotype of human adipose-derived
cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell- associated markers // Stem Cells. 2006. - Vol. 24. - No. 2. - P. 376-385.
3. Yanez R., Lamana M.L., Garcia-Castro J. et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem
cells have in vivo immunosuppressive properties applicable for the control of the graft-versushost disease // Stem Cells. - 2006. - Vol. 24. - No. 11. - P. 2582-2591.
4. Kern S., Eichler H., Stoeve J. et al. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from
bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue // Stem Cells. - 2006. - Vol. 24. - P. 12941301.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
99 Кб
Теги
патент, by18051
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа