close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY18141

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2014.04.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
A 61K 31/675
A 61K 31/685
A 61P 31/10
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
ПРОИЗВОДНЫЕ АЛКИЛФОСФОЛИПИДОВ С ПОНИЖЕННОЙ
ЦИТОТОКСИЧНОСТЬЮ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
(21) Номер заявки: a 20080961
(22) 2006.12.19
(31) 60/751,438 (32) 2005.12.19 (33) US
(31) 05027823.3 (32) 2005.12.20 (33) EP
(85) 2008.07.19
(86) PCT/EP2006/069873, 2006.12.19
(87) WO 2007/071658, 2007.06.28
(43) 2009.02.28
(71) Заявитель: ЭТЕРНА ЗЕНТАРИС
ГМБХ (DE)
(72) Авторы: ПЕРРИССО, Даниэль; ПИЕТРАС, Матиас; ЭНГЕЛЬ, Юрген
(DE)
BY 18141 C1 2014.04.30
BY (11) 18141
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: ЭТЕРНА ЗЕНТАРИС ГМБХ (DE)
(56) EP 0108565 A2, 1984.
WO 03/028736 A2.
EP 0579939 A1, 1994.
EP 0507337 A2, 1992.
WO 03/061669 A1.
EP 0534445 A1, 1993.
(57)
1. Применение производного алкилфосфолипидов, выбранного из группы, включающей
соединение 1
O
O P O
N+
O
и
соединение 5
O
O P O
N+
,
O
для получения композиции, направленной против грибков, выбранных из группы, включающей Aspergillus spp., Candida spp. и Cryptococcus spp., вызывающих заболевания и/или
патофизиологические состояния у млекопитающих.
2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что заболевание и/или патофизиологичекое состояние выбрано из группы, включающей аспергиллез, кандидоз, криптококкоз и
микотический кератит.
3. Применение по п. 1 или 2, отличающееся тем, что млекопитающее выбрано из
группы, включающей человека, домашних животных, крупный рогатый скот, мелких домашних животных, корову, овцу, свинью, козу, лошадь, пони, осла, лошака, мула, зайца,
кролика, кошку, собаку, морскую свинку, хомяка, крысу и мышь, предпочтительно человека.
BY 18141 C1 2014.04.30
Настоящее изобретение относится к новым производным алкилфосфолипидов с пониженной цитотоксичностью, пригодным для лечения разнообразных заболеваний и/или
патофизиологических состояний у млекопитающих, предпочтительно у человека, вызванных микроорганизмами, в частности грибками. Такие производные алкилфосфолипидов
могут использоваться как самостоятельные лекарственные средства или в ходе комбинационной терапии и могут также проявлять антинеопластические свойства.
Алкилфосфолипиды (APL) представляют собой класс веществ, о которых уже несколько десятилетий известно, что они обладают такими свойствами и проявляют такую
биологическую активность, которые можно использовать для лечения при различных медицинских показаний.
Исчерпывающий обзор разнообразных эффектов и вариантов применений, например,
алкилфосфохолинов приводится в журнале Drugs of Today, том 34, Suppl. F, 1998.
Дополнительная информация по алкилфосфолипидам, их разнообразным способам
применения и соответствующим показаниям (включая соответствующие стандартные методы лечения) содержится в рассмотренных ниже источниках.
В патенте EP 0 108 565 описаны алкилфосфохолины, о которых утверждается, что они
обладают антинеопластическими свойствами. WO 87/03478 описывает применение алкилфосфолипидов в качестве противоопухолевого лекарственного средства. Впатенте US
5,219,866 рассматриваются октадецил-[2-(N-метилпиперидино)-этил]-фосфаты, полезные
при лечении раков, а также процесс их приготовления. В патентах US 6,172,050, US
6,479,472 и ЕР 0 579 939 описаны специфические производные фосфолипидов и способы
их использования в качестве лекарственных средств, в частности, при лечении опухолей.
US 5,449,798 и US 5,958,906 относятся к фосфолипидным производным, содержащим более тяжелые элементы пятой группы, о которых известно, что они являются антинеопластиками. Патент US 6,093,704 описывает применение антагонистов дофаминовых
рецепторов при паллиативной терапии опухолей, уменьшающее потенциальные побочные
эффекты алкилфосфохолинов, таких как милтефозин. WO 2004/012744 относится к применению алкилфосфохолинов совместно с противоопухолевыми лекарственными средствами.
Патент EP 0 108 565 описывает алкилфосфохолины, которые, помимо прочего, проявляют противогрибковые свойства. Lu с соавторами рассматривают применение природного бисфосфохолина ирбахолина и его синтетических аналогов в качестве противогрибковых агентов [Lu Q. et al. J. Nat. Prod. - 1999. - No. 62(6). - P. 824-828]. Ganendren с
соавторами исследовали соединения, структурно похожие на фосфолипидные субстраты,
и их использование в качестве ингибиторов фосфолипаз из дрожжевого патогена Cryptococcus neoformans [Ganendren R. et al. Antimicrob. Agents Chemother. - 2004. - No. 48(5). P. 1561-1569].
Koufaki M. с соавторами описывают алкил- и алкоксиэтилфосфолипиды и их использование в качестве антинеопластиков для лечения опухолей [Koufaki et al. J. Med. Chem. 1996. - No. 39. - P. 2609-2614]. Konstatinov с соавторами изучают апоптические эффекты
некоторых алкилфосфолипидов [Konstatinov et al. Cancer Chemother. Pharmacol. - 1998. No. 41. - P. 210-216]. Engel et al. обсуждают фармакологическую активность перифозина
как противоопухолевого лекарственного средства [Engel et al. Drugs of the Future. -2000. No. 25(12). - P. 1257-1260]. WO 00/33917 содержит описание агентов, основанных на липосомах, которые могут содержать милтефозин или перифозин и могут использоваться
для лечения опухолей. Патент EP 0 284 395 содержит описание новых производных глицерина и антигипертензивных агентов для снижения давления крови. Andresen с соавторами исследовали биологическое действие синтетизированных противораковых липидов
эфиров, которые специфически высвобождаются фосфолипазой A2 в опухолевой ткани
[Andresen T.L. et al. J. Med. Chem. - 2005. - No. 48. - P. 7305-7314].
Протозойные заболевания остаются общемировой проблемой. Для большинства таких
заболеваний лечение отсутствует.
2
BY 18141 C1 2014.04.30
Авторы Kanetani/Kanaya F. с соавторами описывают синтез, физико-химические и
противомикробные свойства алкилфосфорилхолинов с длинной цепью. Авторы показывают, что изученные соединения практически не демонстрируют протимомикробных
свойств против Escherichia coli и Staphylococcus aureus. Однако два таких соединения показывают противогрибковый эффект против Aspergillus oryzae [Kanetani/Kanaya F. et al.
Nippon Kagaku Zasshi. - 1984. - No. 9. - P. 1452-1458]. Berger с соавторами исследовали
влияние дексадецилфосфохолина на регрессию опухолей и на инфицирование вирусом
клетки [Berger M.R. et al. J. Cancer Res. Clin. Oncol. - 1993. - No. 119. - P. 541-548]. Ng с соавторами изучили корреляцию противогрибковой активности с ингибированием грибковой фосфолипазы при использовании серии бис-четвертичных аммонийных солей [Ng et
al. J. Med. Chem. - 2006. - No. 49. - P. 811-816]. Widmer с соавторами исследовали фунгицидальную активность дексадецилфосфохолина на модели криптококкоза у мышей [Widmer F. et al. Antimicrob. Agents Chemother. - 2006. - No. 50(2). - P. 414-421].
Однако известные в уровне техники производные фосфолипидов и их применение характеризуется свойственными им недостатками. Так, стандартное медикаментозное лечение (APL и другие препараты) бактериальных, грибковых, протозойных и/или вирусных
заболеваний приводит к нескольким побочным эффектам, таким как резистентность целевых микроорганизмов, а также серьезные последствия высокой токсичности применяемых
соединений и длительного характера лечения.
Целью настоящего изобретения является получение новых производных алкилфосфолипидов, которые могут применяться для лечения заболеваний или патофизиологических
состояний у млекопитающих, вызванных микроорганизмами, в особенности грибками.
Цель настоящего изобретения была неожиданным образом достигнута в соответствии
с одним своим аспектом с применением производного алкилфосфолипидов, выбранного
из группы, включающей
соединение 1
O
O P O
N+
O
и
соединение 5
O
,
O P O
N+
O
для получения композиции, направленной против грибков, выбранных из группы, включающей Aspergillus spp., Candida spp. и Cryptococcus spp., вызывающих заболевания и/или
патофизиологические состояния у млекопитающих.
В соответствии с предпочтительным аспектом изобретения заболевание и/или патофизиологичекое состояние выбрано из группы, включающей аспергиллез, кандидоз, криптококкоз и микотический кератит.
Предпочтительно млекопитающее выбрано из группы, включающей человека, домашних животных, крупный рогатый скот, мелких домашних животных, корову, овцу, свинью, козу, лошадь, пони, осла, лошака, мула, зайца, кролика, кошку, собаку, морскую
свинку, хомяка, крысу и мышь, предпочтительно человека.
Термин "грибок" или "грибки" включает всех известных одноклеточных или многоклеточных членов царства грибов, таких как Chytridiomycota, Zygomycota, Glomeromycota,
Ascomycota и/или Basidiomycota, а также, помимо этого, Myxomycota, Oomycota и/или
Hypochytriomycota.
Примерами грибков являются Aspergillus spp., Candida spp., Cryptococcus spp.
3
BY 18141 C1 2014.04.30
Термин "spp." в связи с любым микроорганизмом означает в контексте настоящего
изобретения всех членов данного семейства, включая виды, подвиды и другие.
В целях настоящего изобретения термин "лечение" включает также профилактическое
лечение или облегчение.
В область действия настоящего изобретения входят все стереоизомеры заявленных соединений либо в виде смеси, либо в виде чистых или в значительной степени чистых
форм. Соединения изобретения могут содержать асимметричные центры по любому атому
углерода. Соответственно, они могут существовать в форме своих рацематов, в форме чистых энантиомеров и/или диастереомеров или в форме смеси этих энантиомеров и/или
диастереомеров. Смеси могут содержать любое желательное соотношение стереоизомеров.
Так, например, соединения изобретения, которые содержат один или более центров
хиральности и представляют собой смеси рацематов или диастереомеров, можно фракционировать известными методами на оптически чистые изомеры, то есть энантиомеры или
диастереомеры. Разделение соединений изобретения можно провести на колонке с хиральной или нехиральной фазой или проведя перекристаллизацию из оптически активного
растворителя, либо с использованием оптически активной кислоты или основания, либо
путем дериватизации с оптически активным реагентом, таким как, например, оптически
активный спирт, с последующим элиминированием радикала.
По отношению к двойной связи соединения изобретения могут представлять собой
как чистые E или Z изомеры, так и смеси этих изомеров.
В случаях, когда это возможно, соединения изобретения могут быть в форме таутомеров.
Соединения по изобретению могут также находиться в форме любого желательного
пролекарства, такого как, например, сложные эфиры, карбонаты, карбаматы, мочевины,
амиды или фосфаты; в этом случае биологически активная форма высвобождается в результате метаболизма. Любое соединение, которое может in vivo подвергаться превращению с образованием биоактивного агента (то есть, соединения изобретения), называется
пролекарством, относится к области изобретения и соответствует его цели.
В уровне техники хорошо известны различные пролекарства, они описаны, например,
в работах:
(i) Wermuth C.G. et at., Chapter. - No. 31. - P. 671-696, The Practice of Medicinal Chemistry, Academic Press. - 1996;
(ii) Bundgaard H. Design of Prodrugs, Elsevier. - 1985; и
(iii) Bundgaard H. Chapter. - No. 5. - P. 131-191, A Textbook of Drug Design и Development, Harwood Academic Publishers. - 1991.
Эти работы включены сюда по ссылке.
Известно также, что химические вещества могут в организме превращаться в свои метаболиты, которые могут также проявлять желательную биологическую активность - в некоторых случаях в более выраженной форме.
Любое биологически активное соединение, которое образовалось in vivo путем метаболизма из любого соединения изобретения, представляет собой метаболит, соответствующий области изобретения и его цели.
Если соединения по изобретению содержат достаточно основные группы, например
если это вторичный или третичный амин, то они могут быть сконвертированы в соли действием неорганических и органических кислот. Фармацевтически приемлемые соли соединений настоящего изобретения предпочтительно формируются из соляной, бромоводородной, йодной, серной, фосфорной, метансульфоновой, пара-толуолсульфоновой,
угольной, муравьиной, уксусной, сульфоуксусной, трифторукусуной, щавелевой, малоновой, малеиновой, янтарной, винной, рацемовой, яблочной, эмбоновой, манделовой, фумаровой, молочной, лимонной, таурохолиновой, глутаровой, стеариновой, глутамовой или
аспарагиновой кислот. При этом образутся соли, которые называют, помимо прочего,
гидрохлориды, хлориды, гидробромиды, бромиды, иодиды, сульфаты, фосфаты, метан4
BY 18141 C1 2014.04.30
сульфонаты, тосилаты, карбонаты, бикарбонаты, форматы, ацетаты, сульфоацетаты, трифлаты, оксалаты, малонаты, малеаты, сукцинаты, тартраты, малаты, эмбонаты, манделаты,
фумараты, лактаты, цитраты, глутараты, стеараты, аспартаты и глутаматы. Кроме того,
стехиометрически соли соединений настоящего изобретения могут содержать целое или
нецелое число компонентов.
Если соединения по изобретению содержат достаточно кислые группы, такие как,
например, карбокси, сульфокислую, фосфорокислую или фенольную группу, то они могут
быть сконвертированы в физиологически переносимые соли действием неорганических
или органических оснований. Примеры подходящих неорганических оснований - это аммиак, гидроксид натрия, калия и кальция, а примеры органических оснований включают
этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, этилендиамин, трет-бутиламин, третоктиламин, дегидроабиетиламин, циклогексиламин, дибензилэтилен-диамин и лизин.
Кроме того, стехиометрически соли соединений настоящего изобретения могут содержать
целое или нецелое число компонентов.
Соединения настоящего изобретения могут также находиться в форме своих сольватов и, в особенности, гидратов, которые получают, например, кристаллизацией из растворителя или из водного раствора. Более того, в состав сольватов или гидратов могут
входить одна, две, три или любое количество молекул сольвата или воды.
В соответствии с предпочтительным аспектом соединения по изобретению доступны в
форме своих гидратов, с любым количеством молекул воды, включая целые и нецелые соотношения, такие как 1:0,5; 1:1; 1:1,5; 1:2; 1:2,5; 1:3; 1:3,5; 1:4 и т.д.
Известно, что химические вещества образуют твердые формы, существующие в виде
состояний различной упорядоченности, их называют полиморфными формами или модификациями. Различные модификации полиморфного соединения могут сильно различаться по своим физическим свойствам. Соединения изобретения могут существовать в виде
различных полиморфных форм, и, более того, некоторые модификации могут быть метастабильны. Считается, что все эти полиморфные формы соединений принадлежат к настоящему изобретению.
Соединения по настоящему изобретению характеризуются удивительно благоприятным действием и/или улучшенной эффективностью против разнообразных грибков, а
также при лечении соответствующих заболеваний и/или патофизиологических состояний.
Благодаря своему удивительно сильному действию и/или эффективности, соединения
настоящего изобретения можно вводить в более низких дозах, по сравнению с другими
известными, но менее сильными APL или другими уместными терапевтическими агентами, достигая при этом такого же или даже превосходящего биологического эффекта. Кроме того, такое уменьшение дозы может приводить к меньшим медицинским побочным
эффектам или даже к их исчезновению.
Более того, соединения по настоящему изобретению оказались на удивление менее
цетотоксичными, по сравнению с известными APL или другими пригодными терапевтическими агентами, обеспечивая по меньшей мере такую же или даже превосходящую эффективность. Таким образом, использование соединений по настоящему изобретению для
лечения упомянутых здесь заболеваний и/или патофизиологических состояний даже в несниженной дозе ведет к уменьшению или исчезновению медицинских побочных эффектов.
Кроме того, соединения по настоящему изобретению оказались на удивление менее эмбриотоксичными или даже неэмбриотоксичными, по сравнению с известными APL или другими
пригодными терапевтическими агентами, будучи столь же или даже более сильнодействующими. Эмбриотоксичностью называют способность вещества вызывать повреждения/быть
токсичным для эмбриона, что приводит к нарушениям в его развитии или к его смерти.
Описанные здесь производные алкилфосфолипидов могут вводиться известным способом. Путь введения может быть любым из обеспечивающих эффективный транспорт
активного соединения к свойственному для него или желательному участку действия,
5
BY 18141 C1 2014.04.30
например, пероральный или непероральный, в частности локальный трансдермальный,
легочный, ректальный, интравагинальный, назальный или парентеральный путь введения,
а также имплантация. Пероральное введение предпочтительнее.
Открытые здесь производные алкилфосфолипидов конвертируются в пригодную для
введения форму и смешиваются, если необходимо, с фармакологически приемлемыми носителями или растворителями. Соответствующие наполнители или носители описаны,
например, в Zanowiak P. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. - 2005, Pharmaceutical Dosage Forms. - P. 1-33; Spiegel A.J. et al. Journal of Pharmaceutical Sciences. - 1963. - No.
52. - P. 917-927; Czetsch-Lindenwald H. Pharm. Ind. - 1961. - No. 2. - P. 72-74;Fiedler H.P.
Lexikon der Hilfsstoffe fur Pharmazie, Kosmetik и angrenzende Gebiete. - 2002. - Editio Cantor
Verlag. - P. 65-68.
Для перорального введения в твердой форме могут быть использованы таблетки, капсулы, гелевые капсулы, таблетки в оболочке, гранулы или порошок, а также может быть
использован раствор для приема внутрь. Открытые здесь производные алкилфосфолипидов при пероральном введении могут комбинироваться с известными и обычно используемыми физиологически толерантными наполнителями и носителями, такими как,
например, гуммиарабик, тальк, крахмал, а также сахара, такие как, например, маннит, метилцеллюлоза, лактоза, желатин, поверхностно-активными агентами, стеаратом магния,
циклодекстринами, водными и неводными носителями, разжижителями, диспергирующими агентами, эмульгаторами, масляными веществами, консервантами и специями (например, эфирными маслами). Производные алкилфосфолипидов, открытые здесь, могут
также быть диспергированы в микрочастицах, например, в наночастицах.
Препараты могут также вводиться непероральным путем, например, с помощью внутривенной, подкожной, внутримышечной инъекции стерильного водного или масляного
раствора, суспензии или эмульсии, посредством имплантов, с помощью мазей, кремов или
суппозиториев. При необходимости возможно введение препарата в виде лекарственной
формы с длительным высвобождением. Импланты могут содержать инертные материалы,
например биоразлагаемые полимеры или синтетические силиконы, такие как, например,
силиконовая резина. Внутривагинальное введение возможно, например, путем использования вагинального кольца. Внутриматочное введение возможно, например, с помощью
диафрагмы или других подходящих внутриматочных средств. Дополнительно предусмотрено чрескожное введение, особенно с помощью подходящего для этой цели способа или
известным способом, например, с помощью пластырей.
Дозировка может варьироваться в широком диапазоне в зависимости от типа и/или
тяжести заболевания, а также патофизиологических условий, формы введения, возраста,
пола, веса и чувствительности субъекта к препарату. Квалифицированные специалисты
могут определять фармакологически эффективное количество производных алкилфосфолипидов, как показано здесь, и/или определять дополнительные фармакологически активные вещества. Введение можно производить одной дозой или несколькими дозами.
Дозировка может колебаться в пределах от 0,001 до 100 мг активного ингредиента на
килограмм веса тела. Препарат может содержать по крайней мере одно активное производное алкилфосфолипидов и, если необходимо, еще одно фармакологически активное
вещество.
Описанный здесь синтез производных алкилфосфолипидов является хорошо описанной в уровне технике процедурой, известной квалифицированному специалисту в области
синтеза благодаря его знаниям. В этом контексте явным образом сделана ссылка на приведенную ниже патентную, а также процитированную здесь литературу: EP 0 108 565 A2;
WO 87/03478; US 5,980,915; US 6,254,879; US 6,506,393; US 6,172,050; US 6,479,472; US
5,449,798; US 5,958,906.
Ниже описаны дополнительные аспекты синтеза некоторых специфических головных
или хвостовых групп.
6
BY 18141 C1 2014.04.30
A)
Другие азотсодержащие головные группы синтезированы путем этилирования (табл. 1
и общая процедура 1).
Таблица 1
Соединение
Азотсодержащая головная группа
5
N+
HO
Общая процедура 1:
где R5 представляет собой производное холина, и R6 означает указанный здесь замещенный и/или незамещенный алкильный радикал.
0,5 моль производного холина и 125 мл CH3CN помещают в реакционный сосуд.
0,5 моль этил бромида в 125 мл CH3CN добавляют по каплям, поддерживая температуру
реакционной смеси ниже 10 °С. После перемешивания в течение 30 мин при комнатной
температуре, смесь нагревают до кипения в течение 30 мин и охлаждают до комнатной
температуры. Полученный твердый осадок (бромид) отделяют (если нужно, в инертной
атмосфере), перекристаллизовывают из 125 мл изопропанола и сушат над P2O5 в вакууме.
Выходы варьруются от 40 до 60 %.
В качестве альтернативы также может быть использован этилиодид.
B)
Различные липофильные хвостовые группы, присоединенные к фосфатной группе,
могут использоваться, как показано ниже (табл. 2).
Таблица 2
Соединение
Азотсодержащая головная группа
Насыщенные алкильные цепи: C16, C18.
1,5
Ненасыщенные алкильные цепи: C16, C18.
C)
Производные алкилфосфолипидов 1, 5 синтезированы в соответствии с приведенной
ниже общей процедурой 2, где "тозилат" означает азотсодержащую головную группу и
"спирт" означает липофильную хвостовую группу.
Общая процедура 4:
R3
O
O
"тозилат"
"спирт" + POCl пиридин R1 O P Cl
R2 N+
O
P O
R1
.
3
CHCl3
R1OH
OCl
В реакционный сосуд помещают 0,1 моль POCl3 в 50 мл хлороформа и охлаждают на
ледяной бане. Раствор 0,9 моль "спирта" и 32 мл пиридина в 100 мл CH2Cl2 добавляют по
каплям к раствору POCl3, поддерживая температуру реакционной смеси между 5-12 °С.
После перемешивания в течение 30 мин при комнатной температуре, добавляют 0,12 моль
"тозилата", охлаждают до 10 °С и добавляют по каплям к этому раствору 40 мл пиридина.
Смесь перемешивают в течение 2,5 ч при комнатной температуре. Добавляют 15 мл воды
(T < 20 °С) и продолжают перемешивать еще 30 мин. Смесь промывают 200 мл
H2O:MeOH (1:1 v/v), 200 мл 3 % HCl:MeOH (1:1 v/v) и 200 мл H2O:MeOH (1:1 v/v). Органический слой концентрируют в вакууме (добавляют изопропанол, чтобы уменьшить
вспенивание). Сырой продукт перекристаллизовывают из 200 мл метил этил кетона. Полученный твердый осадок нагревают в 150 мл EtOH, фильтруют, охлаждают в течение 4 ч
до 5-7 °С и снова фильтруют. К фильтрату добавляют 85 г амберлита МВ3 и перемешивают в течение 3 ч при комнатной температуре. После фильтрации прозрачный раствор кон7
BY 18141 C1 2014.04.30
центрируют в вакууме и кристаллизуют из 150 мл метил этил кетона. Если необходимо,
продукт очищают колоночной хроматографией (CH2Cl2/MeOH/NH3 (25 %) 80:25:5). Выходы варьруются от 25 до 50 %.
Содержание всех процитированных ссылок и патентов включено сюда во всей их полноте.
Более подробно изобретение раскрывается на приведенных ниже примерах, которые,
однако, не ограничивают объем настоящего изобретения.
Примеры.
I) Синтез / физико-химическая характеризация некоторых производных алкилфосфолипидов.
Пример 1.
Соединение 1.
1-Бензил-1-метил-пиперидин-4-иловый эфир гексадециловый эфир фосфорной кислоты.
3,1 г (6 %) соединения 1 получили исходя из гексадекан-1-ола и 1-бензил-пиперидин4-ола, следуя общей процедуре 4 после метилирования 1-бензил-пиперидин-4-ола в соответствии с общей процедурой 2.
1
H-NMR (600MHz, CDCl3-d1, 300K):δ = 7,59 (2H, d), 7,47-7,40 (3H, m), 4,78 (2H, broads), 4,55 (1H, broad-s), 3,86-3,77 (4H, m), 3,56 (2H, d), 3,13 (3H, s), 2,27 (2H, d), 2,13 (2H, t),
1,57 (2H, квинтет), 1,31-1,18 (26H, m), 0,88 (3H, t) ppm.
ESI-MS: получено: m/z 510,4 [M + H], рассчитано: 510,7 г/моль.
Пример 5.
Соединение 5.
1,1-диэтил-пиперидин-4-иловый эфир октадециловый эфир фосфорной кислоты.
6,9 г (14 %) соединения 5 получили исходя из октадекан-1-ола и 1-этил-пиперидин-4ола, следуя общей процедуре 4 после алкилирования 1-этил-пиперидин-4-ола в соответствии с общей процедурой 3.
1
H-NMR (600MHz, CDCl3-d1, 300K):δ = 4,50 (1H, широкий-s), 3,81 (2H, q), 3,71 (2H,
m), 3,62 (2H, m), 3,51 (2H, q), 3,46 (2H, q), 2,25-2,09 (4H, m), 1,58 (2H, квинтет), 1,38-1,21
(36H, m), 0,88 (3H, t) ppm.
ESI-MS: получено: m/z 490,6 [M + H]+ / рассчитано: 490,8 г/моль.
II) Определение цитотоксичности на линиях клеток млекопитающих.
Цитотоксичность выбранных соединений по изобретению против различных линий
клеток млекопитающих была определена следующим образом.
В автоматизированном XTT скрининге для определения цитотоксичности были использованы человеческие опухолевые линии клеток KB/HeLa (ATCC CCL17, карцинома
шейки матки человека), PC3 (ATCC CRL1435, карцинома простаты человека) и RKOp21
(аденокарцинома толстой кишки человека; Schmidt et al., Oncogene 2000, 19: 2423-2429).
В автоматизированном XTT скрининге для определения цитотоксичности могут быть
протестированы также и другие клеточные линии FDCP-1 (DSMZ ACC 368, костный мозг
мыши), H9c2 (2-1) (ECACC 88092904, сердце крысы), L8 (ECACC 95102434, скелетная
мышца крысы), C2C12 (ECACC 91031 101, скелетная мышца мыши), CHO (ECACC
85050302, яичники китайского хомячка), NRK-52E (ECACC 87012902, почка крысы),
NRK-49F (ECACC 86101301, почка крысы), MDCK (ECACC 84121903/ATCC CCL-34,
почка собаки породы кокер спаниель), HepG2 (ATCC HB-8065, человеческая гепатоцеллюлярная карцинома), NIH3T3 (ATCC CRL-1658, фибробласты мыши), HaCaT (Deutsches
Krebsforschungszentrum (DKFZ), человеческие кератиноциты), а также первичные культуры клеток, например первичная культура гепатоцитов крысы.
XTT анализ позволяет количественно определить метаболическую активность, которая коррелирует с жизнеспособностью клеток и их числом. Исследуемые соединения (выбранные соединения настоящего изобретения и известные вещества в качестве контроля)
растворили в культуральной среде до концентрации 600 мкМ и затем добавили к опухоле-
8
BY 18141 C1 2014.04.30
вым клеткам в 10 различных концентрациях полулогарифмической шкалы исходя из
100 мкМ в качестве самой высокой концентрации.
Во второй серии экспериментов на клетках PC3, RKOp21 и SKOV-3 (ATCC HTB-77,
человеческая аденокарцинома яичника) тестовые и контрольные соединения сначала растворили в смеси 70 % этанол/30 % H2O с концентрацией маточного раствора 10 мМ и затем разбавили культуральной средой, чтобы получит конечную концентрацию 31,6 мкМ
(PC3 и RKOp21) или 100 мкМ (SKOV-3).
Через 48 ч измеряли метаболическую активность клеток, обработанных исследуемыми
соединениями. Ее определяли по поглощению при 490 нм (рабочая длина волны для красителя XTT). В качестве контроля использовались необработанные клетки (100 % жизнеспособность).
Клетки KB/HeLa и PC3 культивировали в среде RPMI 1640 (Gibco, Cat.No. 42401-018)
с добавлением 10 % инактивированной фетальной сыворотки теленка (FCS, Biochrom AG,
Cat.No. S0115), 2 мМ L-глутамина (Gibco, Cat.No. 25030-24) и 2 % пенициллинастрептомицина (PenStrep, Gibco, Cat.No. 15140-122). Клетки RKOp21 выращивали в среде
DMEM + GlutaMAXTM-I (Gibco, Cat.No. 61965-026) с добавлением 10 % инактивированной фетальной сыворотки теленка (FCS, Biochrom AG, Cat.No. S0115), 2 мМ L - глутамина
(Gibco, Cat.No. 25030-24), 2 % пенициллина-стрептомицина (PenStrep, Gibco, Cat.No.
15140-122) и 1 % 1 M HEPES (Gibco, Cat.No. 15630-056). Все клетки культивировали при
37 °С в атмосфере 5 % CO2 и в увлажненном воздухе.
В первый день эксперимента клетки были пересажены путем трипсинизации в 96луночные плоскодонные планшеты для микротитрования. Количество пересаженных клеток на 1 лунку зависело от типа клеточной линии, как приведено ниже в таблице:
Клеточная линия
Количество/Лунка
Объем/Лунка
KB/HeLa
2500
125 мкл
PC3
6000
125 мкл
RKOp21
6000
125 мкл
SKOV3
3750
125 мкл
Через 24 ч, которые были необходимы, чтобы клетки восстановились (после обработки трипсином) и вошли в фазу роста, исследуемые соединения, растворенные непосредственно перед использованием, добавляли в каждую лунку в объеме 25 мкл.
Клетки инкубировали с препаратом в течение 2 дней. Затем добавили в каждую лунку
50 мкл свежеприготовленного раствора XTT-PMS {2 % 0,386 мг/мл PMS (N-метил дибензопиразинметилсульфат; Sigma, Cat.No. P9625) в PBS + 98 % 1 мг/мл XTT (натриевая соль
2,3-бис(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-5-[(фениламино)кабонил]-2Н-тетразолия;
Serva, Cat.No. 38450) в среде RPMI 1640 без фенолового красного. Чтобы измерить относительное количество живых клеток, клетки инкубировали в течение 3 ч с реагентом XTTPMS при 37 °С, 5 % CO2 и влажной атмосфере, чтобы образовалась соль формазана. Растворимая соль формазана образуется за счет восстановления клетками XTT. Количество
этой соли определяется по поглощению при 490 нм на сканирующем спектрофотометре
Biomek(r)2000 ELISA (планшетный ридер).
III) Определение эмбриотоксичности для линий клеток млекопитающих.
Эмбриотоксичность может быть вызвана нарушениями процесса дифференциации при
развитии эмбриона за счет действия химических соединений. In vitro тест на эмбриональных стволовых клетках (embryonic stem cell test (EST)) дает потенциальную возможность
оценить in vitro способность химических соединений нарушать и влиять на процесс дифференциации.
Так как первым органом, формирующимся в процессе эмбрионального развития, является сердце, для тестирования на эмбриотоксичность были взяты плюропотентные эмбриональные стволовые клетки мыши (D3), которые дифференцировались в кардиомиоциты.
9
BY 18141 C1 2014.04.30
Процесс in vitro дифференциации в сократительные клетки сердца хорошо охарактеризован и стандартизирован. В присутствии mLIF (фактор ингибирований лейкемии
мыши) D3 клетки могут быть зафиксированы в недифференцированном состоянии как
непрерываемая клеточная линия. В отсутствии mLIF клетки будут образовывать эмбриональные тела, которые затем спонтанно дифференцируются в функциональные кардиомиоциты, после чего под обычным микроскопом можно заметить биение.
Определение эмбриотоксичности выбранных соединений изобретения проводилось с
помощью упомянутого выше теста на эмбриональных стволовых клетках (embryonic stem
cell test (EST)). Для оценки эмбриотоксичности исследуемых соединений были взяты две
непрерывающиеся линии клеток мыши: 3T3 фибробласты (ATCC CCL-92; ATCC CRL1658, ATCC CCL-163) и линия эмбриональных стволовых клеток D3 (ATCC CRL-1934).
Ингибирование дифференциации и роста определялось на эмбриональных стволовых
клетках и сравнивалось с ингибированием роста 3T3 фибробластов, которые использовались как образец здоровых клеток. Для определения эмбриотоксичности в тесте EST использовались три критерия: ингибирование роста эмбриональных стволовых клеток и 3T3
фибробластов на 50 % от контроля (IC50 D3, IC50 3T3) с помощью анализа MTT (набор
для определения жизнеспособности клеток MTT (MTT cell viability assay kit, Cat.No.
30006, Biotium Inc., www.biotium.com) и ингибирование дифференциации эмбриональных
стволовых клеток в самопроизвольно сокращающиеся кардиомиоциты на 50 % (ID50).
Эмбриотоксичность выбранных соединений изобретения методом ранжирования относительно прототипа APL.
IV) Определение противогрибковой активности
Противогрибковая активность выбранных соединений изобретения определялась с
помощью теста на противогрибковую восприимчивость следующим образом.
Противогрибковая активность выбранных соединений изобретения против различных
грибков измерялась стандартным методом микроразведений питательной среды в соответствии с требованиями Национального комитета США по клиническим лабораторным
стандартам (US National Committee for Clinical Laboratory standards (NCCLS)) для дрожжей
(NCCLS document M27-A, 1997) и мицелиальных грибков (NCCLS document M38-A, 2002).
Соединения изобретения исследовались in vitro на противогрибковую активность против различных грибковых штаммов, перечисленных в табл. 3.
Таблица 3
ПроисTemp.
Тестируемый штамм Морфология
Среда АТСС
хождение
ATCC
агар на солодовом экстракте
солодовый экстракт 20 г
Aspergillus fumigatus
мицеA
ATCC
глюкоза 20 г
25 °С
ATCC 204305
лиальный
пептон 1 г
довести водой до 1 л
Aspergillus fumigatus
мицеB
выделен
322-384
лиальный
Aspergillus fumigatus
мицеC
выделен
040-200167
лиальный
Candida albicans
питательная среда для
D
дрожжи
ATCC
25 °С
ATCC 10231
дрожжей
Candida albicans
питательная среда для
E
дрожжи
ATCC
35 °С
ATCC 90028
дрожжей
10
BY 18141 C1 2014.04.30
F
G
H
I
J
Продолжение таблицы 3
ПроисTemp.
Тестируемый штамм Морфология
Среда АТСС
хождение
ATCC
Candida albicans TS3
клетки выращивали в агаре,
Ауксо(Shrikantha et al., Jourсодержащем модифициротрофный
nal of Bacteriology
дрожжи
ванную среду Ли (modified
штамм
2000, 182(6):1580Lee's medium), содержащую
ura 3
1591)
0,01 М уридин
Candida parapsilosis
питательная среда для
дрожжи
ATCC
35 °С
ATCC 22019
дрожжей
Cryptococcus neoforпитательная среда для
дрожжи
ATCC
24 °С
mans ATCC 90112
дрожжей
Cryptococcus neoforВыделен
mans H99 (Ganendren
из челоet al., Antimicrobial
веческой
дрожжи
среда RPMI
Agents and Chemoспинноtherapy,
мозговой
2004,48(5):1561-1569)
жидкости
среда на солодовом экстракте
Cryptococcus gattii
солодовый экстракт 30 г
дрожжи
ATCC
26 °С
ATCC 32608
сактоагар (Agar Bacto 15 г)
довести водой до 1л; рН 5,5
Условия культивирования штаммов ATCC взяты с интернет-сайта www.atcc.org.
Маточные растворы соединений изобретения были приготовлены в день измерения.
Концентрация - 1,28 мг/10 мл среды. Затем были выполнены серийные разведения, чтобы
получить для тестирования следующие концентрации: 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5, 0,25
0,125 мкг/мл.
Инокулят с содержанием грибкового штамма 106 CFU/мл был получен в соответствующей среде и перенесен тестовые пробирки для инкубации.
Метод был использован для определения минимальной ингибирующей концентрации
препарата (MIC) для грибковых штаммов. MIC определялась фотометрическим методом
при длине волны 595 нм после 48 ч культивирования при 35 °С при той концентрации, которая показывала более чем 80 % видимое ингибирование роста дрожжей. Для мицелиальных грибов MIC определяли после 48-72 ч культивирования при 35 °С при той
концентрации, которая показывала более чем 50 % видимое ингибирование роста.
Табл. 4 показывает результаты определения противогрибковой активности (значения
MIC в мкг/мл) выбранных соединений изобретения (соединения 1, 5) по сравнению взятым в качестве примера прототипом эрацилфосфохолином (ErPC).
Таблица 4
Чувствительность различных грибковых штаммов (MIC в мкг/мл) к выбранным
производным алкилфосфолипидов
Гриб
A
B
C
D
E
F
1
2
2
4
2
1
1,5
5
6
8
24
2
2
2
11
ErPC
>64
>64
>64
>64
>64
64
BY 18141 C1 2014.04.30
Гриб
G
H
I
J
1
3
1,5
2
1
5
3
1,5
2
0,75
Продолжение таблицы 4
ErPC
64
4
3
1,5
Результат, представленный в табл. 4, показывает высокую противогрибковую активность выбранных соединений изобретения по сравнению с прототипом эрацилфосфохолином (ErPC).
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
12
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
167 Кб
Теги
by18141, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа