close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY18207

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2014.06.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 18207
(13) C1
(19)
A 01H 4/00
(2006.01)
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЫ АДОНИСА
ВЕСЕННЕГО ADONIS VERNALIS L.
(21) Номер заявки: a 20101464
(22) 2010.10.11
(43) 2012.06.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Центральный ботанический сад
Национальной
академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Кутас Елена Николаевна;
Малахова Ирина Николаевна; Горецкая Анастасия Антоновна; Кухарева Лидия Васильевна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Центральный
ботанический сад Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) KZ 10714 A, 2001.
UA 14450 U, 2006.
RU 2152150 C1, 2000.
MURASHIGE T. et al. Physiologia
plantarum. - 1962. - V. 15. - Р. 473-479.
BY 18207 C1 2014.06.30
(57)
Способ получения каллусной культуры адониса весеннего Adonis vernalis L., заключающийся в том, что подготавливают эксплант адониса весеннего путем отбора почки
возобновления с растения адониса весеннего, промывки его проточной водой и слабым
раствором марганцевокислого калия, стерилизации в 0,1 %-ном растворе азотнокислого
серебра в течение 5-8 мин и разрезания на пластины толщиной 2 мм, подготовленные пластины экспланта в стерильных условиях культивируют до образования каллуса на питательной среде с рН 6,0 следующего состава, мг/л среды:
BY 18207 C1 2014.06.30
KNO3
1900
NH4NO3
1650
KH2PO4
170
MgSO4 x 7H2O
370
CaCl2 x 4H2O
440
Na2MoO4 x 2H2O
0,25
CuSO4 x 5H2O
0,025
H3BO3
6,2
MnSO4 x 5H2O
24,1
ZnSO4 x 7H2O
8,6
KJ
0,83
CoCl2 x 6H2O
0,025
FeSO4 x 7H2O
557
Na2 ЭДТА
745
мезоинозит
100
глицин
2
тиамин-HCl
1
пиридоксин-HCl
1
никотиновая кислота
1
азотнокислое серебро
10
сахароза
30 000
нафтилуксусная кислота
2
бензиламинопурин
1,5
2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота
1
агар
9 000,
образовавшийся каллус культивируют в стерильных условиях до получения каллусной культуры на питательной среде с рН 6,0 следующего состава, мг/л среды:
KNO3
1900
NH4NO3
1650
KH2PO4
170
MgSO4 x 7H2O
370
CaCl2 x 4H2O
440
Na2MoO4 x 2H2O
0,25
CuSO4 x 5H2O
0,025
H3BO3
6,2
MnSO4 x 5H2O
24,1
ZnSO4 x 7H2O
8,6
KJ
0,83
CoCl2 x 6H2O
0,025
FeSO4 x 7H2O
557
Na2 ЭДТА
745
мезоинозит
100
глицин
2
тиамин-HCl
1
пиридоксин-HCl
1
никотиновая кислота
1
азотнокислое серебро
10
сахароза
30 000
нафтилуксусная кислота
3
бензиламинопурин
1,5
тидиазурон
0,2
агар
9 000,
2
BY 18207 C1 2014.06.30
при этом культивирование пластин экспланта и каллуса адониса весеннего осуществляют
при флуоресцентном освещении 4000 лк с фотопериодом 16 ч при температуре 24 °С и
влажности воздуха 70 %.
Изобретение относится к сфере морфогенеза (каллусообразования) у растений. Область применения: биотехнология, медицина, фармацевтическая промышленность.
Известно, что Adonis vernalis L. (горицвет весенний) является ценным лекарственным
растением. Заготовка травы горицвета весеннего привела к истощению растительных ресурсов этого вида [3]. Альтернативным источником сырья для фармацевтической промышленности может служить каллусная культура горицвета весеннего, содержащая
биологически активные соединения.
Каллус - это новообразование из паренхимных недифференцированных клеток на раневых поверхностях растения. Возникает в виде валика или аморфной массы в местах
надрезов, трещин на концах черенков в культуре клеток и тканей. Особенно энергично
каллус образуется тогда, когда в раневой зоне есть камбий. Каллусная ткань способствует
зарастанию ран, срастанию прививок, образованию корней при вегетативном размножении растений.
Известен способ получения каллусной ткани аконита из этого же семейства лютиковых, которая была получена из зрелых зародышей [1]. Предварительно замоченные семена
стерилизовали в течение 1 мин 70 %-м этанолом и 15 мин 0,1 %-м диацидом, затем промывали автоклавированной дистиллированной водой. Стерилизованные семена переносили на питательную среду Мурасиге и Скуга [2], не содержавшую фитогормонов.
Тронувшиеся в рост зародыши затем пересаживали на среду Мурасиге и Скуга, дополненную ИУК (2 мг/л), кинетином (2 мг/л) и 2,4-Д (6 мг/л). Каллус культивировали в темноте
на среде того же состава при температуре 22-24 °С. Пересадку осуществляли каждые 21
сутки.
Однако, что касается получения каллусной культуры горицвета весеннего, все попытки ее осуществления заканчивались неудачей. В научной и технической литературе не
удалось найти описание подобного способа получения каллусной культуры адониса весеннего.
Решение проблемы сводится к разработке способа получения каллусной культуры горицвета весеннего. Стремление исследователей получить каллусную культуру горицвета
весеннего не имели успеха [4].
Поставленная задача решается тем, что предложен способ получения каллусной культуры адониса весеннего (Adonis vernalis L.) в условиях in vitro. Способ включает подготовку оборудования, приготовление питательной среды и ее автоклавирование,
подготовку растительного материала (эксплантов), стерилизацию почек возобновления
адониса весеннего, посадку эксплантов адониса на питательную среду, культивирование
почек возобновления адониса весеннего (эксплантов), пересадку и культивирование каллуса. Способ получения каллусной культуры адониса весеннего (Adonis vernalis) включает
приготовление питательной среды, используя маточные растворы макро- и микросолей,
хелата железа, витамины по Уайту, мезоинозит, глицин, ИУК, кинетин, поливинилпирролидон, сахарозу, агар, этанол, азотнокислое серебро при pH среды 6,0.
В результате экспериментальных исследований морфогенеза адониса весеннего разработаны различные модификации питательных сред, обеспечивающие получение каллусной культуры адониса весеннего в условиях in vitro. Схема получения каллуса адониса
весеннего представлена на фигуре.
Для осуществления способа получения каллусной культуры адониса весеннего требуется определенный набор посуды, инструментов, сырья и реактивов.
3
BY 18207 C1 2014.06.30
1. Используемое оборудование:
1.1 ламинар-бокс;
1.2 автоклав;
1.3 весы лабораторные;
1.4 дистиллятор;
1.5 бидистиллятор;
1.6 pH-метр;
1.7 стеклянные цилиндры градуированные V 25, 50 мл;
1.8 стеклянные стаканы градуированные с носиком V 50, 1000 мл;
1.9 водяная баня;
1.10 пипет-дозаторы на 200 мкл;
1.11 пипет-дозаторы на 1000 мкл;
1.12 конические колбы объемом 100 мл;
1.13 стерильные скальпели;
1.14 стерильные пинцеты;
1.15 стерильные стеклянные чашки Петри диаметром 9 см;
1.16 стеклянные палочки;
1.17 спиртовка;
1.18 алюминиевая фольга.
2. Используемое сырье и реактивы:
2.1 почки возобновления адониса весеннего;
2.2 вода дистиллированная;
2.3 вода бидистиллированная;
2.4 маточный раствор макросолей (табл. 1);
2.5 маточный раствор микросолей (табл. 2);
2.6 маточный раствор хелата железа (табл. 3);
2.7 модифицированная среда для индукции каллуса (табл. 4);
2.8 модифицированная среда для наращивания каллусной массы (табл. 5);
2.9 этанол;
2.10 азотнокислое серебро.
Таблица 1
Маточный раствор макросолей
№ пп.
1
2
3
4
5
Компонент среды
KNO3
NH4NO3
KH2PO4
MgSO4 × 7H2O
или MgSO4
безводный
CaCl2 × 4H2O
или CaCl2
безводный
Содержание в 1 л пита- Содержание в 1 л бидистиллительной среды, мг
рованной воды, г
1900
1650
170
370
180
38
33
3,4
7,4
3,6
440
332,5
8,8
6,65
4
BY 18207 C1 2014.06.30
Таблица 2
Маточный раствор микросолей
№ пп.
1
2
3
4
Компонент среды
Na2MoO4 × 2H2O
CuSO4 × 5H2O
H3BO3
MnSO4 × 5H2O
или MnSO4 × 4H2O
ZnSO4 × 7H2O
KJ
CoCl2 × 6 H2O
5
6
7
Содержание в 1 л питательной среды, мг
0,25
0,025
6,2
24,1
22,3
8,6
0,83
0,025
Содержание в 100 мл бидистиллированной воды, мг
25
2,5
620
2410
2230
860
83
2,5
Таблица 3
Маточный раствор хелата железа
№ пп.
1
2
Компонент среды
FeSO4 × 7H2O
Na2 ЭДТА
Количество вещества
мг на 100 мл бидистиллята
557
745
Таблица 4
Модифицированная среда для индукции каллуса адониса весеннего
Компоненты среды
Макросоли (маточный раствор)
Микросоли (маточный раствор)
Хелат железа (маточный раствор)
Витамины по Уайту
Мезоинозит
Глицин
НУК
БАП
2,4-D
AgNO3
Сахароза
Агар
pH
Концентрация компонентов среды (мл/л, мг/л)
50
1
5
1
100 мг
2 мг
2 мг
1,5 мг
1 мг
10 мг
30 000 мг
9 000 мг
6
Таблица 5
Модифицированная среда для наращивания каллусной массы адониса весеннего
Компоненты среды
Макросоли (маточный раствор)
Микросоли (маточный раствор)
Хелат железа (маточный раствор)
Витамины по Уайту
Мезоинозит
Концентрация компонентов среды (мл/л, мг/л)
50
1
5
1
100 мг
5
BY 18207 C1 2014.06.30
Компоненты среды
Продолжение таблицы 5
Концентрация среды компонентов (мл/л, мг/л)
2 мг
3 мг
0,2 мг
10 мг
30 000 мг
9 000 мг
6
Глицин
НУК
TDZ (тидиазурон)
AgNO3
Сахароза
Агар
pH
3. Ход технологического процесса.
3.1. Подготовка посуды и инструментов.
Колбы, чашки Петри, мерные цилиндры, стаканы мыли с использованием стирального
порошка, споласкивали 12 раз проточной водой и 2 раза - дистиллированой. Сухую, чистую посуду использовали для приготовления маточных растворов и питательной среды.
Инструменты (пинцеты, скальпели) заворачивали в термостойкую бумагу и стерилизовали
сухим жаром при температуре 180 °С на протяжении 2 ч. Стерильные инструменты помещали в ламинар-бокс.
3.2. Приготовление питательной среды и ее автоклавирование.
В соответствии с прописью питательной среды, составленной нами ранее (табл. 4)
взвесили, растворили и прилили все необходимые компоненты в мерный стакан объемом
1 л, довели pH среды до 6, разлили содержимое в пробирки (по 15 мл в каждую), закрыли
фольгой и автоклавировали при давлении 0,75 атмосфер в течение 25 мин. Застывшую
среду поместили в ламинар-бокс.
3.3. Подготовка растительного материала (эксплантов).
Визуально выбирали растение адониса весеннего без видимых повреждений и отмечали его этикеткой. Летом в июле отбирали почки возобновления адониса весеннего. Предварительно их промывали в проточной воде, затем в слабом растворе марганцевокислого
калия.
3.4. Стерилизация почек возобновления адониса весеннего.
Почки стерилизовали в 0,1 %-ном растворе азотнокислого серебра в течение 8 мин
(крупные), 5-6 мин (мелкие) (с предварительным погружением в 70º этанол на 5 с), с последующей трехкратной промывкой в стерильной дистиллированной воде в течение 5, 10
и 15 мин соответственно.
3.5. Посадка эксплантов адониса весеннего на питательную среду.
Стерильные почки возобновления разрезали острым скальпелем на пластинки толщиной 2 мм и помещали в пробирки одинакового объема по 15 мл питательной среды в каждой (состав питательной среды - табл. 4). Перед посадкой и окончанием посадки
эксплантов горлышко каждой пробирки и фольгу обжигали над пламенем спиртовки. Эту
же процедуру выполняли с инструментами.
3.6. Культивирование эксплантов адониса весеннего.
Культивировали экспланты, высаженные на питательную среду, под флюоресцентным
освещением с фотопериодом 16 ч, освещенностью 4000 лк при температуре 24 °С и влажности воздуха 70 %. По истечению 2 месяцев на эксплантах образовался каллус.
3.7. Пересадка и культивирование каллуса.
Каллус, образовавшийся на эксплантах, помещали в колбы одинакового объема по
20 мл питательной среды в каждой (состав питательной среды - табл. 5). Колбы с каллусом помещали на стеллажи под флюоресцентное освещение с фотопериодом 16 ч, освещенностью 4000 лк при температуре 24 °С и влажности воздуха 70 % для наращивания
каллусной массы.
6
BY 18207 C1 2014.06.30
4. Подготовка к работе.
Подготовка персонала, оборудования к работе, уборка помещения осуществлялись в
строгом соответствии с производственными инструкциями, разработанными и согласованными в установленном порядке.
5. Нормы расхода сырья и материалов.
Нормы расхода сырья и вспомогательных материалов при получении каллусной культуры адониса весеннего приведены в табл. 6.
Таблица 6
№
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
Наименование материалов, сырья
Почки возобновления адониса весеннего,
шт.
KNO3, мг
NH4NO3, мг
MgSO4 × 7H2O, мг/ MgSO4 безводный
CaCl2 × 4H2O, мг/ CaCl2, мг
KH2PO4, мг
MnSO4 × 5H2O, мг/ MnSO4 × 4 H2O, мг
ZnSO4 × 7H2O, мг
H3BO3, мг
KJ
CuSO4 × 5H2O, мг
Na2MoO4 × 2H2O, мг
CoCl2 × 6 H2O, мг
FeSO4 × 7H2O, мг
Na2ЭДТА, мг
Мезоинозит, мг
Тиамин - HCl, мг
Пиридоксин - HCl, мг
Никотиновая к-та, мг
Поливинилпирролидон, мг
Сахароза, мг
Глицин, мг
НУК, мг
БАП, мг
TDZ (тидиазурон)
2,4-D
Агар, мг
Этанол, мл
Азотнокислое серебро, мг
Расход на одну посадку
10
1900
1650
370/180
440/332,5
170
24,10/22,30
8,6
6,2
0,83
0,025
0,25
0,025
55,7
74,5
100
1,00
1,00
1,00
10 000
30 000
2
2/3
1,5
0,2
1
9000
250
100
Источники информации:
1. Лукичева И.А., Мигранова И.Г. Каллусная ткань, полученная из зрелых зародышей
Aconitum septentrionale Koelle - перспективный источник алкалоида лаппаконитин //
Вестник Башкирского университета. - 2001. - № 2 (II). - С. 94-95.
2. Murashige T., Skoog F. // Phisiol. Plant. - 1962. - Bd. 15. - No. 13. - P. 473-497.
7
BY 18207 C1 2014.06.30
3. Парень М.И. Адонис весенний (Adonis vernalis L.) в Украине (еколого-ценотичнi
особенности и охрана): Дис… канд. биол. наук: 03.00.05 / Национальный ботанический
сад им. М.М. Гришка НАН Украины. - К., 2002. - С. 3-5.
4. Орлова И.Г., Атаманченко М.П. Биотехнологические методы в интродукции и сохранении биологического разнообразия растений. Materialy IV Mezinarodni vedeckopraktika conference "VEDA: TEORIA A PRAXE-2008". - Praha, Publishing Hause "Education
and Science" s.r.o., 2008. - С. 3-7.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
8
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
2
Размер файла
153 Кб
Теги
by18207, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа