close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY18208

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2014.06.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 18208
(13) C1
(19)
A 01H 4/00
(2006.01)
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЯ-РЕГЕНЕРАНТА
АДОНИСА ВЕСЕННЕГО ADONIS VERNALIS L.
(21) Номер заявки: a 20101728
(22) 2010.12.01
(43) 2012.08.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Центральный ботанический сад Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Кутас Елена Николаевна;
Огородник Любовь Евгеньевна;
Малахова Ирина Николаевна; Горецкая Анастасия Антоновна; Кухарева Лидия Васильевна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Центральный
ботанический сад Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) BY 1533 C1, 1996.
RU 2303348 C2, 2007.
RU 2273987 C2, 2006.
RU 2027757 C1, 1995.
BY 18208 C1 2014.06.30
(57)
Способ получения растения-регенеранта адониса весеннего Adonis vernalis L., заключающийся в том, что подготавливают эксплант, представляющий собой почку возобновления адониса весеннего, при этом отбирают почку возобновления с растения адониса
весеннего, промывают ее проточной водой и слабым раствором марганцевокислого калия
и стерилизуют в 0,1 %-ном растворе азотнокислого серебра в течение 5-8 мин, после чего
культивируют подготовленный эксплант в стерильных условиях до образования регенеранта на питательной среде с pH 6,0, имеющей следующий состав компонентов,
мг/л:
BY 18208 C1 2014.06.30
KNO3
1900
NH4NO3
1650
KH2PO4
170
MgSO4 x 7H2O
370
CaCl2 x 4H2O
440
Na2MoO4 x 2H2O
0,25
CuSO4 x 5H2O
0,025
H3BO3
6,2
MnSO4 x 5H2O
24,1
ZnSO4 x 7H2O
8,6
KJ
0,83
CoCl2 x 6H2O
0,025
FeSO4 x7H2O
557
Na2 ЭДТА
745
мезоинозит
100
глицин
2
тиамин-HCl
1
пиридоксин-HCl
1
никотиновая кислота
1
кинетин
2,5
сахароза
30 000
индолилуксусная кислота
2,5
поливинилпирролидон
10 000
агар
9 000,
причем культивирование экспланта адониса весеннего осуществляют при флуоресцентном освещении 4000 лк с фотопериодом 16 ч при температуре 24 °С и влажности воздуха
70 %.
Изобретение относится к сфере клонального микроразмножения растений. Область
применения: интродукция, охрана окружающей среды (сохранение биоразнообразия растений), народная медицина.
Известно, что Adonis vernalis L. (горицвет весенний) является ценным лекарственным
растением. Заготовка травы горицвета весеннего привела к истощению растительных ресурсов этого вида. В связи с этим горицвет весенний занесен в Красную книгу и подлежит
охране [1]. Известно, что горицвет весенний в силу своих биологических особенностей
плохо размножается традиционными методами - вегетативным и генеративным. Альтернативным методом традиционному размножению может служить регенерация горицвета
весеннего in vitro. В доступной нам литературе отсутствуют положительные экспериментальные данные получения регенерантов горицвета весеннего в культуре in vitro [2].
Для решения поставленной задачи предложен способ получения регенерантов горицвета весеннего в условиях стерильной культуры (in vitro).
Сущность способа получения регенерантов адониса весеннего (Adonis vernalis L.) в
условиях in vitro заключается в приготовлении модифицированной питательной среды для
выращивания почек возобновления и регенерантов адониса весеннего, выборе растения в
естественных условиях для отбора почек возобновления, предварительной промывке их в
проточной воде, затем в слабом растворе марганцевокислого калия, подготовке растительного материала (эксплантов) путем стерилизации почек возобновления адониса весеннего в 0,1 %-ном растворе азотнокислого серебра с предварительным погружением в
70-градусный этанол с последующей трехкратной промывкой в стерильной дистиллиро2
BY 18208 C1 2014.06.30
ванной воде, посадке стерильных эксплантов (почек возобновления) в колбы одинакового
объема на модифицированную питательную среду для культивирования почек возобновления, высаживании почек возобновления на модифицированную питательную среду для
культивирования регенерантов и культивировании их под флуоресцентным освещением
до образования вегетативных и генеративных побегов.
Для осуществления способа получения регенерантов адониса весеннего требуется
определенный набор оборудования, посуды, инструментов, сырья и реактивов. Используемое оборудование включает: ламинар-бокс, автоклав, весы лабораторные, дистиллятор,
бидистиллятор, pH-метр, стеклянные цилиндры градуированные V 25, 50 мл, стеклянные
стаканы градуированные с носиком V 50 и 1000 мл, водяную баню, пипет-дозаторы на
200 мкл, пипет-дозаторы на 1000 мкл, конические колбы объемом 100 мл, стерильные
скальпели, стерильные пинцеты, стерильные стеклянные чашки Петри диаметром 9 см,
стеклянные палочки, спиртовку, алюминиевую фольгу.
Используемое сырье и реактивы включают: почки возобновления и почки обогащения
адониса весеннего, воду дистиллированную, воду бидистиллированную, маточные растворы макросолей (табл. 1), микросолей (табл. 2) и хелата железа (табл. 3), модифицированную среду для культивирования почек возобновления (табл. 4) и регенерантов (табл. 5)
адониса весеннего, этанол, азотнокислое серебро.
Затем проводят подготовку оборудования, приготовление питательной среды и ее автоклавирование, подготовку растительного материала (эксплантов), стерилизацию почек
возобновления адониса весеннего, посадку эксплантов адониса на модифицированную
питательную среду, культивирование почек возобновления адониса весеннего (эксплантов) на модифицированной питательной среде до получения вегетативных и генеративных
побегов.
Способ получения регенерантов адониса весеннего (Adonis vernalis L.) включает приготовление питательной среды путем использования маточных растворов макро- и микросолей, хелата железа, витаминов по Уайту, мезоинозита, тиамина-HCI, пиридоксина-HCI,
никотиновой кислоты, поливинилпирролидона, глицина, ИУК, кинетина, сахарозы, агара,
этанола, азотнокислого серебра при pH среды 6,0.
Схема получения регенерантов адониса весеннего представлена на фигуре.
В результате экспериментальных исследований по изучению морфогенеза и регенерации адониса весеннего разработаны различные модификации питательных сред, обеспечивающие получение регенерантов адониса весеннего в условиях in vitro.
Приводим разработанные нами составы маточных растворов макросолей, микросолей
и хелата железа, составы модифицированных питательных сред для культивирования почек возобновления и регенерантов.
Таблица 1
Маточный раствор макросолей
№
пп.
1
2
3
4
5
Компонент среды
KNO3
NH4NO3
KH2PO4
MgSO4 × 7H2O
или MgSO4
безводный
CaCl2 × 4H2O
или CaCl2
безводный
Содержание в 1 л питательной среды, мг
Содержание в 1 л бидистиллированной воды, г
1900
1650
170
370
180
38
33
3,4
7,4
3,6
440
332,5
8,8
6,65
3
BY 18208 C1 2014.06.30
Таблица 2
Маточный раствор микросолей
Содержание в 1 л пи- Содержание в 100 мл бидистиллиКомпонент среды
тательной среды, мг
рованной воды, мг
Na2MoO4 × 2 H2O
0,25
25
CuSO4 × 5H2O
0,025
2,5
H3BO3
6,2
620
MnSO4 × 5H2O
24,1
2410
или MnSO4 × 4Н2О
22,3
2230
5
ZnSO4 × 7H2O
8,6
860
6
KJ
0,83
83
7
CoCl2 × 6H2O
0,025
2,5
Таблица 3
Маточный раствор хелата-железа
№ пп.
Компонент среды
Количество вещества
мг на 100 мл бидистиллята
1
FeSO4 x 7H2O
557
2
Na2 ЭДТА
745
Таблица 4
Модифицированная среда для культивирования почек возобновления
адониса весеннего
Компоненты среды
Концентрация компонентов (мл/л) среды
Макросоли (маточный раствор)
50
Микросоли (маточный раствор)
1
Хелат железа (маточный раствор)
5
Витамины по Уайту
1
Мезоинозит
100 мг
Глицин
2 мг
ИУК
2,5 мг
Кинетин
2,5 мг
Поливинилпирролидон
10 000 мг
Сахароза
30 000 мг
Агар
9 000 мг
pH
6
Таблица 5
Модифицированная среда для культивирования регенерантов адониса весеннего
Компоненты среды
Концентрация компонентов (мл/л) среды
Макросоли (маточный раствор)
50
Микросоли (маточный раствор)
1
Хелат железа (маточный раствор)
5
Витамины по Уайту
1
Мезоинозит
100 мг
Глицин
2 мг
ПУК
1 мг
Кинетин
3 мг
Поливинилпирролидон
10 000 мг
Сахароза
30 000 мг
Агар
9 000 мг
pH
6
№
пп.
1
2
3
4
4
BY 18208 C1 2014.06.30
Для осуществления способа получения регенерантов адониса весеннего необходимо
провести тщательную подготовку посуды и инструментов. С этой целью колбы, чашки
Петри, мерные цилиндры, стаканы моют с использованием стирального порошка, ополаскивают 12 раз проточной водой и 2 раза дистиллированной. Сухую чистую посуду используют для приготовления маточных растворов и питательной среды. Инструменты
(пинцеты, скальпели) заворачивают в термостойкую бумагу и стерилизуют сухим жаром
при температуре 180 °С на протяжении 2 ч. Стерильные инструменты помещают в ламинар-бокс.
Приготовление питательной среды и ее автоклавирование производят в соответствии с
прописью модифицированной питательной среды, представленной в табл. 4, взвешивают,
растворяют и приливают все необходимые компоненты в мерный стакан объемом 1 л, доводят pH среды до 6,0, разливают содержимое в колбы, закрывают фольгой и автоклавируют при давлении 0,75 атм. в течение 25 мин. Застывшую среду помещают в ламинарбокс.
Подготовку растительного материала (эксплантов) начинают осенью с выбора растения адониса весеннего. Для этого визуально выбирают растение адониса весеннего без
видимых повреждений и отмечают его этикеткой. Весной в марте-апреле, как только сойдет снежный покров, отбирают почки возобновления адониса весеннего. Предварительно
их промывают в проточной воде, затем в слабом растворе марганцевокислого калия.
Стерилизация почек возобновления адониса весеннего проводят в 0,1 %-ном растворе
азотнокислого серебра в течение 8 мин (крупные), 5-6 мин (мелкие) (с предварительным
погружением в 70-градусный этанол на 5 с), с последующей трехкратной промывкой в
стерильной дистиллированной воде в течение 5, 10 и 15 мин, соответственно. Стерильные
экспланты помещают в колбы одинакового объема по 20 мл модифицированной питательной среды в каждой (состав питательной среды в табл. 4). Перед посадкой и окончанием посадки почек горлышко каждой колбы и фольгу обжигают над пламенем
спиртовки. Эту же процедуру выполняют и с инструментами.
Культивируют почки возобновления, высаженные на модифицированную питательную среду для получения регенерантов, под флуоресцентным освещением с фотопериодом 16 ч, освещенностью 4000 лк при температуре 24 °С и влажности воздуха 70 %. Из
каждой почки образовалось по 2 побега: вегетативный и генеративный.
Нами разработаны нормы расхода сырья и материалов, необходимых для получения
стерильной культуры и регенерантов, которые приводим в табл. 6.
Таблица 6
Нормы расхода сырья и вспомогательных материалов при получении стерильной
культуры и регенерантов адониса весеннего
№ пп.
Наименование материалов, сырья
Расход на одну посадку
1
Почки возобновления адониса весеннего, шт
50
2
KNO3, мг
1900
3
NH4NO3, мг
1650
4
MgSO4 × 7H2O, мг/ MgSO4 безводный
370/180
5
CaCl2 × 4H2O, мг/ CaCl2 мг
440/332,5
6
KH2PO4, мг
170
7
MnSO4 × 5H2O, мг/ MnSO4 × 4H2O, мг
24,10/22,30
8
ZnSO4 × 7H2O, мг
8,6
9
H3BO3, мг
6,2
10
KJ, мг
0,83
11
CuSO4 × 5H2O, мг
0,025
12
Na2MoO4 × 2H2O, мг
0,25
13
CoCl2 × 6H2O, мг
0,025
5
BY 18208 C1 2014.06.30
№ пп.
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
Наименование материалов, сырья
FeSO4 × 7H2O, мг
Na2ЭДТА, мг
Мезоинозит, мг
Тиамин - HCl, мг
Пиридоксин - HCl, мг
Никотиновая к-та, мг
Поливинилпирролидон, мг
Сахароза, мг
Глицин, мг
ИУК, мг
Кинетин, мг
Агар, мг
Этанол, мл
Азотнокислое серебро, мг
Продолжение таблицы 6
Расход на одну посадку
55,7
74,5
100
1,00
1,00
1,00
10 000
30 000
2
2,5/1
2,5/3
9000
250
100
Источники информации:
1. Парень М.И. Адонис весенний (Adonis vernalis L.) в Украине (еколого-ценотичнi
особенности и охрана): Дис. … канд. биол. наук: 03.00.05 / Национальный ботанический
сад им. М.М. Гришка НАН Украины. - К., 2002. - С. 166-185.
2. Мокшин Е.В., Лукатин А.С. Изучение способности Adonis vernalis L. к морфогенезу
в культуре in vitro. В сб.: Междунар. конф. Биология клеток растений in vitro и биотехнология. Звенигород, 8-12 сентября. - М., 2008. - С. 264.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
1
Размер файла
135 Кб
Теги
by18208, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа