close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY18422

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2014.08.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
G 01N 33/577
(2006.01)
СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ В БИОЛОГИЧЕСКОМ ОБРАЗЦЕ
ПРОТЕАЗОУСТОЙЧИВОЙ ФОРМЫ ПРИОННОГО БЕЛКА PrPd
С МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССОЙ 27-30 кДа
ПРИ ТРАНСМИССИВНОЙ ГУБКООБРАЗНОЙ
ЭНЦЕФАЛОПАТИИ ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЖИВОТНОГО
(21) Номер заявки: a 20110013
(22) 2011.01.04
(43) 2012.08.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт химии
новых материалов Национальной
академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Жавнерко Геннадий Константинович; Капитулец Сергей Петрович; Парибок Ирина Вячеславовна; Капитулец Наталья Николаевна;
Полещук Николай Николаевич;
Агабеков Владимир Енокович (BY)
BY 18422 C1 2014.08.30
BY (11) 18422
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт химии
новых материалов Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) US 2004/0115752 A1.
EP 1229331 A1, 2002.
DE 10351543 A1, 2005.
JP 2009052933 A, 2009.
RU 2313790 C2, 2007.
RU 2052193 C1, 1996.
SERBAN D. et al. Neurology. - 1990. V.40. - No. 1. - P. 110-117.
VARSHNEY M. et al. Talanta. - 2009. V.80. - No. 2. - P.593-599.
LOURENCO P.C. et al. J. Gen. Virol.,
2006. - V.87. - Pt 10. - P.3119-3124.
(57)
Способ обнаружения в биологическом образце протеазоустойчивой формы прионного
белка PrPd с молекулярной массой 27-30 кДа при трансмиссивной губкообразной энцефалопатии человека или животного, заключающийся в том, что готовят иммуночип, для чего
на поверхность гидрофильного кремния методом микроконтактной печати наносят полосы
бычьего сывороточного альбумина, затем между ними иммобилизуют антиприонные моноклональные антитела к разным эпитопам PrPd и их комбинации, биологический образец
обрабатывают протеиназой К, наслаивают на иммуночип и инкубируют при комнатной
температуре, промывают иммуночип дистиллированной водой, высушивают, сканируют
его поверхность методом атомно-силовой микроскопии и при выявлении на иммуночипе
полос с иммунным комплексом антитело-PrPd и/или комбинация антител-PrPd, высота которых увеличена, устанавливают наличие протеазоустойчивой формы прионного белка
PrPd с молекулярной массой 27-30 кДа.
Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано для обнаружения в анализируемых образцах инфекционной формы протеазоустойчивого прионного белка (PrPd, disease - болезнь) при трансмиссивных губкообразных энцефалопатиях
человека и животных.
BY 18422 C1 2014.08.30
В настоящее время общепризнано, что патологическая форма прионного белка (PrPd,
молекулярная масса 33-35 кДа) является основным компонентом инфекционного агента,
который вызывает у человека и животных медленно-прогрессирующие фатальные нейродегенеративные заболевания, объединенные в группу трансмиссивных губкообразных энцефалопатии (ТГЭ), или прионные болезни. У людей заболевания прионной природы
представлены болезнью Крейцфельдта-Якоба (БКЯ) и ее "новым вариантом" (вБКЯ), куру,
синдромом Герстманна-Стрейсслера-Шейнкера, фатальной семейной бессонницей и
амиотрофическим лейкоспонгиозом (АЛ). Животные поражаются скрепи (овцы, козы),
трансмиссивной губкообразной энцефалопатией (крупный рогатый скот) и рядом других
достаточно редких, но всегда фатальных нейроинфекций (норки, олени, лоси, кошачьи и
др.). В Республике Беларусь встречаются 3 прионных болезни: БКЯ и АЛ - у человека и
скрепи - у животных [1, 2].
Эти заболевания отличаются длительным инкубационным периодом (15-30 лет), отсутствием воспалительной реакции в центральной нервной системе (ЦНС) и антител в сыворотке крови к возбудителю, неуклонным прогрессированием с неизбежным летальным
исходом. Существуют определенные трудности в индикации возбудителя в органах и тканях
организма у заболевшего. Несмотря на интенсивные исследования, лабораторная диагностика данных заболеваний затруднена и проводится только постмортально. Прижизненная
лабораторная диагностика не разработана, что затрудняет проведение своевременных и
адекватных лечебно-профилактических мероприятий. Так, известны случаи инфицирования
БКЯ при переливании крови и лечении препаратами гормонов, полученными от больных
доноров, заболевание которых не было диагностировано своевременно, при проведении
медицинских манипуляций: имплантации инфицированных электродов в мозг здорового
человека, заражение хирурга от больного БКЯ во время проведения операции и др. [1-3].
Инфекционный PrPd отличается от нормальной клеточной формы приемного белка
(PrPС, М.м. 33-35 кДа), в норме кодируемого геномом у всех млекопитающих, относительной протеазоустойчивостыо [4, 5] и инфекционностью т.е. способностью передаваться и
вызывать заболевание [6, 7]. Установлено, что PrPd образуется при посттрансляционной
модификации PrPC. Конформационное превращение последнего является центральным
событием в патогенезе прионных болезней. Третичная структура PrPd характеризуется высоким содержанием β-структур, тогда как PrPC содержит преимущественно α-спирали [5, 6].
Однако вторичная и третичная структуры PrPd и механизмы, лежащие в основе конверсии
PrPC в PrPd окончательно не изучены.
Известен лабораторный способ обнаружения PrPd путем заражения животных с последующим клинико-морфологическим обследованием после развития признаков заболевания через 2,5-6 месяца [8]. Однако этот метод обладает низкой чувствительностью,
трудоемок и выполняется в течение длительного времени.
Известен способ заражения культур нейронов лабораторных животных материалом,
содержащим аномальную протеазоустойчивую форму прионного белка (PrPd), с последующим обнаружением белковых антигенов в клетках [9]. Его существенным недостатком является малая чувствительность в случаях низкой концентрации возбудителя в
исследуемом материале, трудности при культивировании нервных клеток, длительность
получения ответа (2-3 недели), вероятность получения артефактов.
Известен способ обнаружения возбудителя АЛ с использованием культуры клеток
Нер-2. Инфекционный прионсодержащий материал освобождают от классических возбудителей бактериальных и вирусных заболеваний прогреванием в водяной бане при 80-100 °С в
течение 15-20 мин с последующим удалением клеточного дебриса и вносят на монослой
клеток Нер-2. Присутствие аномальной протеазоустойчивой формы прионного белка (PrPd)
устанавливают через 2-3 суток по увеличению митотической активности в 2-5 раз [10].
2
BY 18422 C1 2014.08.30
Из литературных источников [11-17] известен ряд иных способов выделения, концентрирования и детектирования PrPd, основой которых является специфическое связывание
патогенной формы прионного белка различными агентами.
Описан метод детектирования агрегированной формы прионного белка in vitro и in
vivo [11]. Металлорганические лиганды избирательно взаимодействуют с агрегированной
формой прионного белка, содержащейся в биологических жидкостях или тканях, в результате образуется меченая агрегированная форма прионного белка, которую детектируют методом однофотонной эмиссионной компьютерной томографии.
Описан метод, реагенты и оборудование для быстрого и чувствительного анализа биомолекулярных взаимодействий и, в частности, агрегации пептидов, в том числе ассоциированной с проявлением нейродегенеративных заболеваний [12]. Присутствие прионной
инфекции (prion disease) в пробе может быть доказано электрохимически. Золотые коллоидные частицы, модифицированные самоорганизованными монослоями питрилотриуксусной кислогы/Ni и октаметилферроцена, добавляли в раствор, содержащий His-меченый
PrP белок в растворимой форме таким образом, чтобы по меньшей мере часть His-меченого PrP белка связалась с коллоидными частицами. В смесь добавляли также магнитные
частицы с привитым PrP или антителами против него. Далее добавляли пробу с подозрением на содержание инфекционного PrPd. Инфекционный PrPd при его наличии в пробе
вызывал конверсию нормального клеточного PrPc (cell - клетка) как связанного с коллоидными частицами, так и свободного в растворе, и, как следствие, массовую агрегацию.
Массовая агрегация приводила к инкорпорации магнитных и коллоидных частиц в эти агрегаты, которые притягивались к электроду за счет магнитных взаимодействий и вызывали
электрический сигнал. Измерения проводили с использованием стандартных электрохимических методов, таких как переменнотоковая вольтамперометрия.
Описан метод детектирования патогенных прионных белков, обусловливающих наличие прионных заболеваний, с использованием конъюгированных полиэлектролитов (ПЭ)
[13]. Конъюгированный полиэлектролит вводится в образец и взаимодействует с патогенным прионным белком, при этом происходит изменение свойств указанного полиэлектролита. Наблюдаемое изменение свойств используется как аналитический сигнал,
указывающий на присутствие инфекционного прионного агента. Метод включает следующие стадии: приведение образца в контакт с хотя бы одним конъюгированным ПЭ,
облучение электромагнитным излучением, измерение поглощения или испускания на одной или более длинах волн, сравнение измеренного значения с известными значениями
для конъюгатов ПЭ с различными патогенными приемными агентами.
Описан метод детектирования PrPSc в биологических образцах, основанный на использовании пептидных реагентов, избирательно взаимодействующих с PrPSc-формой прионного белка [14]. В частности, описан тест ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) диагностический in vitro тест, основанный на методе иммуноферментного анализа (ИФА).
Метод включает следующие стадии: подготовка первой твердой подложки с одним из
пептидов, указанных в последовательности; контакт первой твердой подложки с образцом
в условиях, позволяющих патогенному прионному белку при его наличии в пробе связаться с
пептидным реагентом с образованием первого комплекса; удаление несвязанного остатка;
диссоциация первого комплекса с высвобождением патогенного прионного белка и его
денатурация; отделение денатурировавшего патогенного прионного белка от первой твердой подложки; контакт денатурировавшего патогенного прионного белка со второй подложкой, содержащей антиприонные антитела первого типа, в условиях, позволяющих
диссоциированному прионному белку связаться с антиприонными антителами первого
типа; детектирование связавшегося белка на второй твердой подложке с помощью антиприонных антител второго типа.
Описан метод высокоспецифичного экспресс-анализа патогенной формы прионного
белка, обусловливающей возникновение нейродегенеративных заболеваний [15]. Для уда3
BY 18422 C1 2014.08.30
ления нормального клеточного прионного белка из биологической пробы используется
протеиназа К, поэтому в дальнейшем для качественного и количественного анализа патогенной формы прионного белка может использоваться иммунохроматографический анализ.
Метод включает следующие стадии: гомогенизация биологической пробы в буферном
растворе и удаление непатогенной формы приемного белка; использование двух типов
антител к патогенной форме прионного белка (первый тип антител иммобилизуется на
мембране, а меченые антитела второго типа образуют с патогенной формой прионного
белка комплекс, который мигрирует к иммобилизованным антителам, вследствие чего регистрируется аналитический сигнал); интерпретация аналитического сигнала (качественный и количественный анализ содержания патогенной формы прионного белка в образце).
Описаны прионсвязывающие материалы и методы их использования для детектирования и удаления прионного белка из пробы [16]. Указанные материалы способны связывать
одну или более форм прионного белка, включая клеточный прионный белок (PrPc), инфекционный прионный белок (PrPsc), рекомбинантный прионный белок (PrPr) и протеиназарезистивный прионный белок (PrPres). Они представляют собой полимерные материалы,
такие как хроматографические сорбенты и смолы, или неорганические вещества, такие как
оксид алюминия, которые обладают специфичностью и аффинностью к прионным белкам.
Идентификация прионсвязывающих материалов в гомогенате головного мозга хомяков
проводилась двумя методами. Во-первых, количество приона, связанного с материалом,
определяли по накоплению частиц связывающего материала в исследуемом образце. Второй метод заключался в использовании SDS-электрофореза и иммунного блоттинга.
Описана методика селективного связывания инфекционных агрегированных форм
прионного белка в присутствии нормальной формы белка полиионным связывающим
агентом - анионным (сульфат декстрана или пентосан) или катионным (полидиаллилдиметиламмония хлорид) - в условиях, обеспечивающих селективное связывание в присутствии N-лауроилсаркозина при среднещелочных pH. Результат может быть идентифицирован с помощью иммунодетектирования [17].
Наиболее близким по своей технической сущности является метод тестирования образцов, содержащих прионный белок, на возможное присутствие PrP.sup.Sc формы, согласно
которому образец смешивается с протеазой для расщепления протеазочувствительных
белков или белковых фрагментов, далее проводится тестирование образца на содержание
фрагмента PrP27-30, устойчивого к действию фермента. При этом заключение о наличии
PrP.sup.Sc в образце делается на основании положительной детекции PrP27-30 [18]. Как
правило, для детектирования используют иммунологический "сэнвич"-тест. Принцип его
заключается в использовании двух типов антител к каждому антигену, причем эти антитела должны быть специфичны к различным эпитопам антигена. Обычно антитела первого
типа иммобилизованы на твердой подложке и служат для связывания антигена, а антитела
второго типа имеют специфическую метку и служат для детектирования.
Цель изобретения - разработка метода и увеличение точности обнаружения аномальной протеазоустойчивой формы прионного белка (PrPd), коррелята инфекционности при
всех трансмиссивных губкообразных энцефалопатиях человека и животных.
Цель достигается тем, что аномальная протеазоустойчивая форма прионного белка
(PrPd) с молекулярной массой приблизительно 27-30 кДа (PrP27-30), полученная после
протеолитической обработки анализируемой пробы протеиназой К, примененной в концентрации, деградирующей все клеточные белки, концентрируется на заданных участках
поверхности кремния, активированных специфическими антиприонными моноклональными антителами, с последующей визуализацией, результатов анализа методом атомносиловой микроскопии (АСМ), что позволяет доказать наличие патогенного прионного
белка в биологической пробе.
Способ может быть использован для развития методов прижизненной диагностики
приемных инфекций у человека. Способ является новым, т.к. такой совокупности признаков нигде не описано.
4
BY 18422 C1 2014.08.30
Обнаружение PrPd, включающее направленное концентрирование самого белка или
его фрагментов на заданных участках локально активированной поверхности с последующей оценкой результата методом атомно-силовой микроскопии, в литературе не найдено. Никто никогда не определял PrPd таким образом.
Для локальной активации поверхности гидрофильного кремния используется метод
микроконтактной печати, который позволяет создать на поверхности регулярно чередующиеся полосы двух различных белков, один из которых (например, бычий сывороточный
альбумин - БСА) блокирует адсорбцию любых белков из биологической пробы и служит
контролем сравнения, а второй (например, антиприонные моноклональные антитела МАТ) иммобилизуется в промежутки между полосами БСА методом адсорбции из раствора и промотирует специфическое связывание компонента PrP27-30 патогенного прионного белка за счет специфического взаимодействия типа "антиген-антитело". В качестве
МАТ используют коммерческие антиприонные моноклональные антитела 3F4 и 6H4,
имеющие сродство ко всем видам прионных белков человека и млекопитающих, а также
6A5, 7F7, 2C8 и 9C12, производства Института вирусологии РАМН, РФ, или их комбинации. При наличии PrP27-30 в анализируемой пробе высота белковых полос изменяется
относительного контрольных полос БСА в сторону повышения, а результат количественно регистрируется при сканировании поверхности с использованием атомно-силовой микроскопии.
Использование при анализе нескольких антиприонных МАТ позволяет существенно
увеличить чувствительность и специфичность способа.
Предварительные этапы.
Прежде чем проводить исследование, заранее готовят образец активированной подложки кремния ("иммуночип").
1. Подготовка подложек.
Кремниевые подложки, представляющие собой монокристаллы кремния ориентации (100) размером 1 см × 1 см × 1 мм, гидрофилизируют при нагревании в смеси
H2O:H2O2:NH4OH (в отношении 5:1:1) в течение 10-15 мин при температуре 61-12 °С с последующей тщательной промывкой бидистиллированной водой и сушкой в токе азота. На
гидрофильную поверхность кремния методом микроконтактной печати [19] наносят полосы БСА.
Для микроконтактной печати в качестве "мастера" используют калибровочную решетку для атомно-силового микроскопа TGZ3 (высота "ступенек" 540 ± 2 нм, шаг 3 мкм).
Для получения микроштампа форполимер и катализатор смешивают в массовом соотношении 10:1, деаэрируют смесь с помощью водоструйного насоса в течение 15-20 мин,
после чего наносят тонким слоем (~0,5 мм) на поверхность "мастера". Далее проводят термополимеризацию при температуре 100° ± 5 °С в течение 20 мин. После охлаждения до
комнатной температуры микроштамп отделяют от "мастера".
Белок из водного раствора с концентрацией 1 мг/мл адсорбируют на поверхность
штампа в течение 15 мин. Затем отмывают поверхность микроштампа от избытка адсорбата и высушивают в токе азота.
При получении полос БСА модифицированный микроштамп приводят в соприкосновение с поверхностью гидрофильного кремния на 60 с. Полученный образец высушивают
при комнатной температуре и хранят до использования. Контроль иммобилизации БСА на
поверхность гидрофильного кремния осуществляют методом атомно-силовой микроскопии (фиг. 1).
В описанном формате метод микроконтактной печати обеспечивает формирование
однородных полос белка БСА на поверхности гидрофильного кремния. Причем эти полосы четко отличаются от немодифицированных участков подложки, служащих поверхностью сравнения. Перепад высот у БСА при микроконтактной печати составляет 1,6 ± 0,2
нм. БСА блокирует неспецифическую адсорбцию других белков на модифицированную
5
BY 18422 C1 2014.08.30
поверхность, что обеспечивает в последующем эффективную иммобилизацию антиприонных моноклональных антител в промежутки между полосами БСА.
2. Подготовка анализируемой пробы из биологических образцов.
Из патологического материала (аутоптаты головного мозга (у человека - область левой
или правой половины ствола головного мозга (brainstem); у крупного рогатого скота продолговатый мозг (область obex), у лабораторных животных (мыши, хомяки) - правая
или левая половины мозга), лимфоузлы, биоптаты органов: миндалины, селезенка, печень,
почки и др.) скальпелем вырезают кусочки весом от 0,45 до 0,70 г.
Образцы органов, ранее заключенные в парафиновые блоки для гистологических исследований, депарафинизуруют нагреванием до 80 °С.
Точный вес образца определяют на электронных весах ВЭ-15И (Акц. общ. "Масса",
С.-Петербург, Россия). Кусочки органов помещают в контейнер для гомогенизации Prypcon,
добавляют десять объемов рабочего раствора для гомогенизации (фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ), pH 7,4, содержащий 0,5 % нонидет Р-40 и 1 % дезоксихолат натрия) и
гомогенизируют в гомогенизаторе PrioGENIZER™ (Швейцария) при 20000 ± 1000 об/мин
в течение 45,0 ± 5,0 с. Готовят 10 % суспензию. Допускается гомогенизировать биологические ткани в стерильной фарфоровой ступке с использованием фарфорового пестика.
Полученную суспензию (разведение 10-1) переносят в пробирку и центрифугируют при
6000 об/мин в течение 15 мин. Для анализа используют надосадочную жидкость.
Кровь от больного собирают в отдельную коническую пробирку, дефибринизируют
покачиванием с использованием стеклянных бус (диаметр 2 мм), пока кровь не свернется.
Дефибринизированную кровь разбавляют ФСБ, pH 7,4 в соотношении 1:1 и наслаивают в
пробирку объемом 15 мл на 3 мл 9 % градиента плотности метризоат-фиколл. Центрифугируют при 1500 об/мин при комнатной температуре. Эритроциты и гранулоциты оседают
на дно пробирки, а на градиенте раздела фаз находятся мононуклеарные клетки (мононуклеары перефирической крови - МПК). Слой мононуклеаров собирают и переносят в чистую центрифужную пробирку. Разбавляют 4-х кратным избытком ФСБ (pH 7,4)
перемешивают и центрифугируют при 300 об/мин в течение 10 мин при 4 °С. Осадок
МПК ресуспендируют в 1 мл раствора для гомогенизации (ФСБ, pH 7,4, 0,5 % нонидет Р40, 1 % дезоксихолат натрия).
Биологические жидкости организма (спинномозговая жидкость - СМЖ, слюна, моча и
др.) от больного с подозрением на БКЯ и АЛ собирают в полипропиленовые пробирки и
центрифугируют при 12000 об/мин в течение 1 ч при комнатной температуре, надосадочную жидкость отбрасывают. Осадок ресуспендируют в рабочем растворе для гомогенизации
(ФСБ, pH 7,4, 0,5 % нонидет Р-40, 1 % дезоксихолат натрия) в объеме, равном 1/10 части от
первоначального объема пробы до центрифугирования (концентрирование образца в 10 раз).
Аликвоты полученных гомогенатов биологических образцов (по 100 мкл) отбирают в
промаркированные микропробирки типа "Эпендорф". Затем в микропробирки добавляют
протеиназу К (Р5568, Sigma, США) до конечной концентрации 100 мкг/мл и обрабатывают в микропланшетном инкубаторе при 47± 1 °С в течение 1 ч. Реакцию останавливают
добавлением 10 мкл раствора 1 мМ фенилметилсульфонилфлюорида (Р7626, Sigma, США).
До исследования пробы хранят при - 20 °С.
3. Подготовка рабочей концентрации антиприонных моноклональных антител.
В качестве антиприонных антител используют коммерческие анти-PrP моноклональные антитела (MAT) 3F4 (Р1115, Sigma) или 6H4 (Prionics AG, Швейцария) в рабочих разведениях 1:5000, имеющих высокую специфичность к PrPd человека и всех видов
животных. Хорошие результаты были отмечены при использовании МАТ к PrPd - 6A5,
7F7, 2C8 и 9C12 (пр-во Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН РФ, Москва).
Они получены к рекомбинантному белку скрепи PrPSc (120-240 а.о.) методом, гибридом
путем иммунизации мышей рек-PrP, культивированием спленоцитов из селезенки с миеломными клетками SP2/0-Ap14 с последующим выделением и очисткой специфических
IgG. Активность МАТ колебалась в пределах 1:3000-1:5000.
6
BY 18422 C1 2014.08.30
Антиприонные МАТ разводят буфером TBST (0,05 М трис-HCl, pH 7,4, 0,138 M NaCl,
0,0027 M KCl, 0,05 % твин-20) до рабочих концентраций.
Использование комбинации известных антиприонных МАТ к различным аминокислотным остаткам полипептидной цепи PrPd (антигенные эпитопы) в соотношении 1:1 существенно повышает чувствительность и специфичность способа.
4. Приготовление "иммуночипа".
На локально-активированные кремниевые поверхности с иммобилизованными полосами БСА наносят по 50 мкл антиприонных МАТ в рабочих концентрациях (см. п. 3) и
обрабатывают 15 мин при комнатной температуре. Затем подложки тщательно промывают дистиллированной водой (20 раз по 50 мкл) и высушивают на воздухе (20 мин).
Контроль иммобилизации МАТ на полосы гидрофильного кремния осуществляют методом АСМ.
При анализе АСМ-изображений, полученных после иммобилизации МАТ на поверхность гидрофильного кремния, установлено, что уровень полос иммобилизованных МАТ
был лишь незначительно ниже уровня полос БСА (≤ 0,1 нм).
Для работы используются "иммуночипы", поверхность которых по данным АСМ является практически ровной, без четко наблюдаемого перепада высот.
Основные этапы:
1. Из анализируемой пробы (10-1 разведение биологического образца от исходного)
готовят серийные десятикратные разведения в ФСБ, pH 7,4: 10-2, 10-3, 10-4.
2. На четыре подготовленные кремниевые подложки ("иммуночипы") с регулярно чередующимися полосами иммобилизованных БСА и МАТ (одного вида или в комбинации)
наслаивают по 50 мкл десятикратных разведений анализируемой пробы после ферментативного переваривания протеиназой К (100 мкг/мл, 37 °С, 1 ч). После инкубации в течение
30 мин при комнатной температуре подложки тщательно промывают дистиллированной
водой и высушивают на воздухе, как описано выше (см. п. 4 раздела "Предварительные
этапы").
3. Обнаружение аномальной протеазоустойчивой формы приемного белка (PrPd) проводят методом АСМ путем сканирования поверхности "иммуночипов".
Изображения поверхности "иммуночипов" получают на воздухе с помощью микроскопа Nanoscope IIID (Veeco, США), оборудованного "D-сканером" в контактном режиме.
Используются контактные 100- и 200-мкм кантилеверы "Nanoprobe" из Si3N4 с константой
упругости 0,12 и 0,36 Н/м. Сила воздействия иглы на образец в контактном режиме составляет 1-5 нН. Частотой строчной развертки при получении изображения варьируют от
1 до 5 Гц.
Присутствие протеазоустойчивой формы прионного белка (PrPd) в анализируемой
пробе устанавливают по обнаружению узких полос белковых комплексов, превышающих
уровень полос БСА в среднем на 1,6 ± 0,2 нм (фиг. 2).
Таким образом, высота комплекса "MAT-PrPd" составляет в среднем 3,2 ± 0,4 нм.
Частота выявляемых пиков и их плотность на полосах с иммобилизованными антиприонными МАТ должны увеличиваться пропорционально снижению кратности разведения анализируемой пробы.
Пример 1.
Обнаружение PrPd в ткани ЦНС больного Д с патоморфологическим диагнозом АЛ.
1. Из мозга (кора больших полушарий) через 3 ч после смерти выделяют кусочек ткани (0,3 г), помещают в фарфоровую ступку, гомогенизируют, добавляя 2,7 мл фосфатносолевой буферного раствора (ФСБ), pH 7,4, содержащего 0,5 % нонидет Р-40 и 1 % дезоксихолат натрия. Полученную суспензию (разведение 10-1), переносят в пробирку и центрифугируют при 6000 об/мин в течение 15 мин.
2. 100 мкл надосадочной жидкости отбирают в маркированную микропробирку типа
"Эпендорф", добавляют протеиназу К (P5568, Sigma, США) до конечной концентрации
7
BY 18422 C1 2014.08.30
100 мкг/мл и обрабатывают в микропланшетном инкубаторе при 47°± 1 °С в течение 1 ч.
Реакцию останавливают добавле нием 10 мкл раствора для остановки переваривания
(1 мМ фенилметилсульфонил флюорида, P7626, Sigma, США). До исследования пробы
хранят при - 20 °С.
3. Готовят десятикратные разведения анализируемой пробы, начиная с разведения 10-1
до 10-4. Для этого в три микропробирки типа "Эпендорф" до бавляют по 90 мкл ФСБ, pH
7,4. Затем из микропробирки с анализируемой пробой микропитеткой отбирают 10 мкл и
переносят в первую микропробирку (разведение 10-2). Осторожно перемешивают пипетированием. Последовательные разведения получают аналогичным способом. Все разведения готовят отдельными наконечниками.
4. На поверхности 4-х "иммуночипов", активированных иммобилизованными антиприонными MAT 3F4, микропипеткой и одним наконечником наносят по 50 мкл каждого
разведения анализируемой пробы, начиная с большего разведения.
5. "Иммуночипы" с нанесенным материалом помещают во влажную камеру и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре.
6. После инкубации "иммуночипы" тщательно промывают дистиллированной водой (5
раз по 200 мкл) и высушивают на воздухе.
7. Поводят сканирование поверхности "иммуночипов", начиная с анализа препарата с
наивысшим разведением анализируемой пробы.
8. На АСМ-изображениях выявляют узкие, равномерно чередующиеся полосы белкового материала высотой 1,6 ± 0,2 им, ограниченные широкими полосами-сравнения БСА
(контроль). Взаимодействия БСА с PrPd не выявлено. Количество прионных комплексов
на полосах МАТ увеличивалось при уменьшении кратности разведения анализируемого
материала и увеличении времени инкубации.
Разница между средним показателем высоты белковых агрегатов с учетом средней
ошибки в опытных полосах (MAT + PrPd) и контрольных (БСА) статистически значима
(1,6 ± 0,2 нм), т.е. отмечено специфическое взаимодействие "антиген-антитело".
Заключение: в ткани ЦНС больного Д содержится аномальная протеазоустойчивая
форма прионного белка (PrPd). Посмертная верификация заболевания - амиотрофический
лейкоспонгиоз.
Пример 2.
Обнаружение PrPd в ткани ЦНС больного ДВ с клиническим диагнозом БКЯ.
Проведено взятие ткани головного мозга объемом 0,5 см из области центральной извилины коры больших полушарий. Получение гомогената мозга и процедуры приготовления и обработки анализируемой пробы проводили, как описано в примере 1.
Сканирование поверхностей 4-х "иммуночипов", активированных иммобилизованными
антиприонными MAT 9C12, показало наличие выраженных белковых пиков (иммунные
комплексы MAT + PrPd). Взаимодействия БСА с PrPd не отмечено (белковые пики отсутствовали). Отмечено десятикратное увеличение количества специфических иммунных
комплексов ("антиген + антитело") на полосах МАТ при снижении кратности разведения.
Заключение: внесение гомогенатов мозга больного ДВ в активированные "иммуночипы" ведет к образованию специфических иммунных комплексов между антиприонными
МАТ и патологическим белком PrPd, содержащимся в ткани ЦНС больного ДВ. В ЦНС
больного ДВ содержится инфекционный агент БКЯ.
Пример 3.
Выявление PrPd в органах и тканях сирийского хомяка с экспериментально воспроизведенным заболеванием скрепи.
Сирийского хомяка под легким эфирным наркозом заражали интрацеребрально в правую гемисферу большого мозга путем введения 10 %-ной суспензии инфицированного
образца, содержащей возбудитель скрепи (инфекционный титр возбудителя 4,8 lg ЛД50).
Через 1,5 месяца после заражения у животного появлялись клинические признаки заболе8
BY 18422 C1 2014.08.30
вания, проявляющиеся в выпадении шерсти, атрофии мышц, развитии парезов и параличей конечностей и туловища. В терминальной стадии заболевания органы и ткани больного животного (головной мозг, селезенка, печень, ночки, кровь) были взяты для проведения
вирусологических исследований. Выявление PrPd методом атомно-силовой микроскопии в
органах и тканях проводили как описано в примере 1. Диагностическую эффективность
выявления PrPd в биологических образцах определяли в серии экспериментов с использованием "иммуночипов", приготовленных на основе иммобилизации на поверхность активированного гидрофильного кремния МАТ одного вида (3F4, 6H4, 6A5, 7F7, 2C8 и 9C12)
и их комбинаций (3F4 + 6A5, 3F4 + 9C12, 6H4 + 7F7, 6H4 + 9C12, 3F4 + 6A5 + 2C8,
3F4 + 2C8 + 9C12).
Анализ АСМ-изображений поверхностей "иммуночипов" с иммобилизованными антиприонными МАТ к различным эпитопам прионного белка (моновидовые и в комбинации)
при исследовании органов и тканей больного животного показал наличие выраженных
белковых пиков (иммунные комплексы МАТ + PrPd) в образцах головного мозга, селезенки, печении, почек и лимфоцитах периферической крови (табл. 1 и 2). При этом количество иммупокомплексов МАТ с PrPd и высота белковых пиков варьировали в зависимости
от анализируемого образца. Количество белковых пиков было наибольшим при исследовании проб из головного мозга при всех исследованных разведениях. Высота пиков в этих
образцах также была максимальной при использовании комбинации МАТ, иммобилизованных на поверхность "иммуночипов". Иммунокомплексы МАТ с PrPd выявлены во всех
проанализированных биологических образцах больного животного. Различия в высотах
полос иммунокомплексов МАТ с PrPd образцах органов и тканей статистически недостоверны (р>0.05). Отмечено десятикратное увеличение количества специфических иммунных
комплексов ("антиген + антитело") на полосах МАТ при снижении кратности разведения.
При этом образование комплексов БСА + PrPd не отмечено (белковые пики на полосах
сравнения БСА отсутствовали).
Заключение: АСМ-анализ с использованием "иммуночипов" с иммобилизованными
антиприонными МАТ доказывает наличие аномальной протеазоустойчивой формы прионного белка (PrPd) в биологических органах и тканях хомяка с экспериментальной инфекцией скрепи.
Таблица 1
Обнаружение иммунных комплексов "МАТ + PrPd" в различных органах и тканях
сирийского хомяка с экспериментальной инфекцией скрепи методом АСМ
Моноклональное
антитело
3F4
6H4
6A5
7F7
2C8
9C12
3F4+6A5
3F4+9C12
6H4+7F7
6H4+9C12
3F4+6A5+2C8
3F4+2C8+9C12
Головной мозг
10-4
10-4
10-4
10-4
10-4
10-4
10-4
10-4
10-4
10-4
10-4
10-4
Разведение анализируемой пробы*
Селезенка
Печень
Почки
-3
-1
10
10
10-1
10-2
10-1
10-1
10-1
10-1
10-1
-1
-1
10
10
10-1
10-2
10-1
10-1
-4
-1
10
10
10-1
10-3
10-3
10-1
-4
-3
10
10
10-2
10-3
10-2
10-1
10-4
10-2
10-2
-4
-4
10
10
10-2
10-4
10-4
10-3
МПК
10-1
10-1
10-1
10-1
10-1
10-1
10-2
10-2
10-2
10-2
10-3
10-3
* Последнее разведение, при котором отмечается статистически достоверное выявление иммунных комплексов "MAT + PrPd".
9
BY 18422 C1 2014.08.30
Таблица 2
Высота иммунных комплексов "MAT + PrP " в различных органах и тканях
сирийского хомяка с экспериментальной инфекцией скрепи методом АСМ
d
Моноклональное
антитело
3F4
6H4
6A5
7F7
2C8
9C12
3F4+6A5
3F4+9C12
6H4+7F7
6H4+9C12
3F4+6A5+2C8
3F4+2C8+9C12
Высота иммунных комплексов "MAT + PrPd"
относительно полос-сравнения БСА, в нм
Головной мозг Селезенка
Печень
Почки
1,9±0,2
1,8±0,2
1,5±0,1
1,6±0,1
1,7±0,2
1,6±0,1
1,5±0,2
1,7±0,2
1,5±0,1
1,3±0,1
1,4±0,2
1,4±0,2
1,5±0,1
1,2±0,1
1,5±0,1
1,6±0,2
1,3±0,2
1,6±0,2
1,6±0,2
1,3±0,2
1,8±0,2
1,7±0,2
1,7±0,2
1,8±0,1
1,9±0,4
1,8±0,3
1,7±0,3
1,9±0,2
2,1±0,3
1,9±0,2
1,8±0,4
2,0±0,2
1,7±0,2
1,5±0,2
1,7±0,2
1,8±0,2
2,0±0,4
1,6±0,3
1,8±0,3
1,9±0,2
2,4±0,5
1,9±0,2
2,1±0,4
1,9±0,4
2,8±0,3
2,1±0,3
2,2±0,2
2,4±0,5
МПК
1,7±0,2
1,7±0,1
1,5±0,1
1,3±0,2
1,6±0,2
1,7±0,2
1,6±0,3
1,8±0,2
1,7±0,3
1,8±0,2
2,1±0,2
2,2±0,4
Пример 4.
Определение персистенции инфекционного агента АЛ в монослойных культурах клеток, полученных из мозга больного Д, умершего от АЛ.
Для этого кусочки ткани мозга (объемом 10-15 мм3), выделенные от больного Д спустя 3 ч после смерти, сразу же переносили в чашку Петри и измельчали до 0,5-1 мм3 в присутствии ростовой среды. Ростовая среда содержала 30 % (объем/объем) сыворотки плодов
коров и 70 % (объем/объем) 5 %-ного раствора гемогидролизата с 0,2 М L-глутамина (из
расчета 1 мл на 100 мл среды) и гентамицином (25 мкг/мл). Полученную взвесь клеток
пропускали через нейлоновое сито, первоначально с размером пор 150 мкм, а затем 75 мкм. Первичный монослой клеток, содержащих до 80 % астроцитов, получали при инкубировании результирующей взвеси в течение 7 дней во флаконах (площадь дна 22 см2)
при 37 °С в атмосфере с содержанием 5 % CO2.
После образования сплошного монослоя культуральную среду удаляли, клетки обрабатывали смесью 0,1 % трипсина и 0,02 % версена (1:5), снимали добавлением новой порции ростовой среды и рассевали. Клеточную взвесь из астроцитов (концентрация не менее
7 × 104 кл/мл) культивировали в пенициллиновых флаконах со стеклышками в течение
14 дней. Субпассирование культур осуществляли в течение 10 пассажей (140 дней).
При проведении пересевов из взвеси посевного материала отбирали 3 мл и клетки осаждали центрифугированием при 2000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость
отбрасывали, а осадок лизировали добавлением 2,7 мл фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБ), pH 7,4, содержащего 0,5 % нонидет P-40 и 1 % дезоксихолат натрия в течение 30 мин при 37 °С при постоянном перемешивании. Дальнейшие процедуры приготовления и обработки аназируемой пробы проводили, как описано в примере 1.
Присутствие протеазоустойчивой формы прионного белка (PrPd) в лизатах клеток верифицировали на всех пассажных уровнях по обнаружению узких полос белковых комплексов, превышающих уровень полос-сравнения БСА в среднем на 1,3-2,5 нм.
Заключение: в первичных монослойных культурах клеток мозга больного Д, умершего
от АЛ, содержащих до 80 % клеток астроцитов, инфекционный агент АЛ персистирует
длительное время на протяжении всего срока наблюдения (10 пассажей, или 140 дней).
10
BY 18422 C1 2014.08.30
Пример 5.
Больной Пв. Патологоанатомический диагноз - болезнь Шильдера.
АСМ-анализ ткани ЦНС больного Пв проводили, как описано в примере 1.
На АСМ-изображениях не выявлено никаких равномерно чередующихся полос белкового материала. Поверхность "иммуночипов" ровная, что свидетельствует об отсутствии
специфического взаимодействия "антиген-антитело".
Заключение: в ЦНС больного Пв инфекционный агент прионной этиологии отсутствует.
Пример 6.
Больной Т. Патологоанатомический диагноз боковой амиотрофических склероз.
АСМ-анализ ткани ЦНС больного Т проводили, как описано в примере 1.
На АСМ-изображениях не выявлено никаких равномерно чередующихся полос белкового материала. Поверхность "иммуночипов" ровная, что свидетельствует об отсутствии
специфического взаимодействия "антиген-антитело".
Заключение: в ЦНС больного Т инфекционный агент прионной этиологии отсутствует.
Таким образом, цель изобретения достигнута. В результате предложенного способа,
благодаря использованию введенных критериев оценки, можно в течение 6-8 ч точно обнаружить аномальную протеазоустойчивую форму прионного белка (PrPd) при трансмиссивных губкообразных энцефалопатиях (прионных заболеваниях человека и животных),
что подтверждает существенность введенных признаков, так как эффект является новым и
не описанным.
Это достигается тем, что в результате ферментативной обработки высокой дозой протеиназы К другие клеточные белки разрушаются, а описанное явление может возникать
только в результате специфического взаимодействия аномальной протеазоустойчивой
формы прионного белка (PrP) с антиприонным моноклональным антителом с образованием иммунного комплекса "антиген-антитело", выявляемого на подложке активированного
гидрофильного кремния методом атомно-силовой микроскопии. Способ нетрудоемок,
легко воспроизводим и может найти широкое применение в лабораторной диагностике
заболеваний прионной этиологии как постмортальной, так и прижизненной.
Кроме того, изобретение может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях, занимающихся изучением этиологии и патогенеза не только прионных болезней,
но и других форм медленных инфекций ЦНС человека и животных, сопровождающихся
нейродегенеративным поражением мозга (в настоящее время их известно более 30 нозоформ) для проведения дифференциальной диагностики и установления истинной причины
заболевания, окажется полезным при проведении поиска эффективных антиприонных химиопрепаратов.
Перечень фигур.
Фиг. 1 - АСМ-изображение пространственных форм, образованных в результате микроконтактной печати бычьего сывороточного альбумина на кремнии.
Фиг. 2-АСМ-изображение пространственных форм "иммуночипа", образованного после обработки микроструктурированной поверхности моноклональными антителами 3F4 и
анализируемой пробой, содержащей аномальную протеа-зоустойчивую форму прионного
белка PrPd.
Источники информации:
1. Wadsworth J.D.F., Collinge J. Update on human prion disease // Biochim Biophys Acta. 2007. - Vol. 1772. - P. 598-609.
2. Prusiner S.B. Prions//Proc Natl Acad Sci USA. - 1998. -Vol. 95. - P. 13363-13383.
3. Saa P., Castilla J., Soto C., Presymptomatic detection of prions in blood, Science. - 2006. Vol. 313. - P. 92-94.
11
BY 18422 C1 2014.08.30
4. Bolton D. C., McKinley M.P., Prusiner S.B. Identification of a protein that purifies with
the scrapie protein // Science. - 1982. - Vol. 218. - P. 1309-1311.
5. Oesch В., Westaway D., Wälchli M., McKinley M. P., Kent S.В.Н., Aebersold R.,
Barry R.A., Tempst P., Teplow D.B., Hood L.E., Prusiner S.B., Weissmann C. A cellular gene
encodes scrapie PrP 27-30 // Cell. - 1985. - Vol. 40. - P. 735-746.
6. Gabizon R., McKinley M.P., Groth D., Prusiner S.B. Immunoaffinity purification and
neutralization of scrapie prion infectivity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1988. - Vol. 85. P. 6617-6621.
7. 4. McKinley M.P., Bolton D.C., Prusiner S.B. A protease-resistant protein is a structural
component of the scrapie prion // Cell. - 1983. - Vol. 35. - P. 57-62.
8. Вотяков В.И., Протас И.И., Коломиец Н.Д., Лысцова Е.Г., Полещук Н.Н., Коломиец А.Г., Милькомонович Э.К., Дубойская Г.П. Клинико-морфологический анализ амиотрофического лейкоспонгиоза человека, воспроизведенного на морских свинках // Журн.
Неврапотол. и психиатр. - 1987. - № 2. - С.222-225.
9. Баринский И.Ф., Шубладзе А.К. Этиология хронических вирусных нейроинфекций. М.: Медицина, 1984. . - С. 166.
10. Коломиец Н.Д., Вотяков В.И., Протас И.И., Коломиец А.Г.? Недзьведь М.К., Лысцова Е.Г., Дубойская Г.П., Лучко В.П. Клинико-морфологическая характеристика и лабораторная диагностика амиотрофического лейкоспонгиоза (методические рекомендации). Минск, 1986.
11. Международный патент WO/1997/041856, МПК A 61K 49/06, A 61K 51/04; C 07B
59/00, C 07F 13/00, 1997.
12. Международный патент WO/2002/001230, МПК G 01N 33/543, G 01N 33/68, 2002.
13. Патент США 20090197343 МПК G 01N 33/50, G 01N 033/50, 2009.
14. Патент США 20090130774, МПК G 01N 33/566, G 01N 033/566, 2009.
15. Патент США 20060205025, МПК G 01N 33/537, G 01N 033/537, 2006.
16. Патент США 20060078892, МПК C 12Q 1/68, C 12Q 001/68, C 12P 21/06, C 12P
021/06, 2006.
17. Патент США 20050221404, МПК G 01N 033/53, G 01N 033/537, G 01N 033/543,
2005.
18. Патент США 20040115752, МПК G 01N 033/53; G 01N 033/537; G 01N 033/543,
2004.
19. Парибок И.В., Жавнерко Г.К., Агабеков В.Е., Змачинская Ю.А., Янцевич А.В.,
Усанов С.А. Локальная модификация поверхности кремния молекулами белков // Журнал
общей химии. - 2007. - Т. 77. - Вып. 3. - С. 395-399.
Фиг. 1
12
BY 18422 C1 2014.08.30
Фиг. 2
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
13
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
371 Кб
Теги
by18422, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа