close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY18431

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2014.08.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
A 01H 4/00
(2006.01)
СПОСОБ ВВЕДЕНИЯ СОРТОВОЙ ГОЛУБИКИ ВЫСОКОЙ
VACCINIUM CORYMBOSUM L. В КУЛЬТУРУ IN VITRO
(21) Номер заявки: a 20110076
(22) 2011.01.20
(43) 2012.08.30
(71) Заявители: Учреждение образования
"Полесский государственный университет"; Государственное научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Кудряшова Оксана Александровна; Волотович Антон Анатольевич; Герасимович Татьяна Васильевна; Гук Екатерина Сергеевна;
Глеб Елена Павловна; Хрипач Владимир Александрович (BY)
BY 18431 C1 2014.08.30
BY (11) 18431
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатели: Учреждение образования "Полесский государственный
университет"; Государственное научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) BY 1533 C1, 1996.
РЕШЕТНИКОВ В.Н. и др. Плодоводство. - 2007. - Т. 19. - С. 209-215.
(57)
Способ введения сортовой голубики высокой Vaccinium corymbosum L. в культуру in
vitro, заключающийся в том, что подготавливают первичный эксплант, представляющий
собой неодревесневший верхушечный фрагмент стебля длиной 15 мм с почками, промывают его хозяйственным мылом в проточной воде, выдерживают в течение 20 мин в водном растворе, содержащем 2 г/л фунгицида ридомил голд, 2 г/л фунгицида брайтануниверсал, 20 мл/л аскорбиновой кислоты и 3 мл/л Tween 20, промывают стерильной дистиллированной водой, содержащей 20 мг/л аскорбиновой кислоты, стерилизуют в течение
25 мин в растворе, содержащем 7,5 % гипохлорита натрия, 20 мл/л аскорбиновой кислоты
и 3 мл/л Tween 20, промывают стерильной дистиллированной водой, содержащей 20 мг/л
аскорбиновой кислоты, высаживают первичный эксплант на питательную среду с pH
4,8-5,0, содержащую следующие компоненты, мг на 1 л:
аммоний азотнокислый
400,00
калий сернокислый
990,00
магний сернокислый семиводный
370,00
калий фосфорнокислый однозамещенный
170,00
кальций азотнокислый
400,00
кальция хлорид
82,80
марганец сернокислый одноводный
16,90
цинк сернокислый семиводный
8,60
медь сернокислая пятиводная
0,25
борная кислота
6,20
натрий молибденовокислый двухводный
0,25
BY 18431 C1 2014.08.30
железо II сернокислое семиводное
27,80
трилон Б
37,30
тиамина хлорид
1,00
пиридоксина хлорид
0,50
никотиновая кислота
0,50
глицин
2,00
мезоинозитол
100,00
аденина сульфат
80,00
15,00
6-(γ,γ-диметилаллиламино)пурин
индолилуксусная кислота
4,00
24-эпибрассинолид
0,50-0,75
сахароза
30 000,00
агар-агар
8 000,00
вода деионизированная
остальное,
инкубируют в течение 8 недель при освещении 6000 лк, фотопериоде 16 ч день, 8 ч ночь,
температуре 25 °С и относительной влажности воздуха 70 %, затем черенкуют и высаживают на питательную среду.
Изобретение относится к сфере биотехнологии, к области клеточных технологий в
растениеводстве, к направлению клонального микроразмножения растений in vitro.
Области применения изобретения: биотехнология, сельское и лесное хозяйство, пищевая и медицинская промышленность.
Известно, что процесс клонального микроразмножения растений in vitro начинается с
этапа введения растений в культуру in vitro путем изолирования и стерилизации первичного экспланта с последующим его размещением на стерильной, питательной среде для
инициации побегообразования in vitro [1,2].
Согласно прототипу [2] первичные экспланты сортовой голубики высокой Vaccinium
corymbosum L. в виде фрагментов стебля длиной 15 мм с почками промывают 2-3 ч в проточной воде, затем 20-30 мин - в дистиллированной воде и стерилизуют в 0,1 %-ном растворе диацида в течение 11-18 мин с последующей трехкратной отмывкой первичных
эксплантов в дистиллированной воде и высадкой на питательную агаризованную среду,
содержащую аммоний азотнокислый, калий сернокислый, магний сернокислый, калий
фосфорнокислый однозамещенный, кальций азотнокислый, кальция хлорид, марганец
сернокислый, цинк сернокислый, медь сернокислую, борную кислоту, натрий молибденовокислый, железо (II) сернокислое, трилон Б, тиамина хлорид, пиридоксина хлорид, никотиновую кислоту, глицин, мезо-инозитол, аденина сульфат, 6-(γ,γ-диметилаллиламино)пурин, индолилуксусную кислоту.
Недостатками данного способа введения сортовой голубики высокой в культуру in vitro являются:
крайне низкий выход жизнеспособных, стерильных первичных эксплантов, способных
активно регенерировать in vitro с образованием побегов, пригодных для дальнейшего размножения in vitro;
высокий расход дорогостоящих компонентов питательной агаризованной среды вследствие низкого выхода активно регенерирующих in vitro стерильных первичных эксплантов, что приводит к удорожанию размножаемого in vitro посадочного материала сортовой
голубики высокой;
трудоемкость метода из-за необоснованной, чрезмерной временной протяженности
отдельных операций.
2
BY 18431 C1 2014.08.30
Задача изобретения заключается в модификации способа асептического введения сортовой голубики высокой в культуру in vitro с целью сокращения продолжительности работ и существенного повышения выхода активно регенерирующих in vitro стерильных
первичных эксплантов сортовой голубики высокой Vaccinium corymbosum L.
Задача решается тем, что последовательно выполняются следующие действия:
во-первых, вместо операций по подготовке первичных эксплантов в виде фрагментов
стебля с почками к стерилизации, включающих промывание первичных эксплантов на
протяжении 2-3 ч в проточной воде и затем 20-30 мин в дистиллированной воде, предлагается после предварительного отмывания первичных эксплантов мылом хозяйственным
(72 %) в проточной воде выдерживать первичные экспланты, представляющие собой неодревесневший верхушечный фрагмент стебля длиной 15 мм с почками, на протяжении
20 мин в водном растворе, содержащем 2 г/л фунгицида ридомил голд, 2 г/л фунгицида
байтан-универсал, 20 мг/л аскорбиновой кислоты и 3 мл/л Tween 20, с последующим трехкратным отмыванием первичных эксплантов в стерильной дистиллированной воде, содержащей 20 мг/л аскорбиновой кислоты;
во-вторых, вместо стерилизации первичных эксплантов в 0,1 %-ном растворе диацида
в течение 11-18 мин, предлагается стерилизацию первичных эксплантов осуществлять в
7,5 %-ном растворе гипохлорита натрия в присутствии 20 мг/л аскорбиновой кислоты и
3 мл/л Tween 20 на протяжении 25 мин, с последующим трехкратным отмыванием первичных эксплантов в стерильной дистиллированной воде, содержащей 20 мг/л аскорбиновой кислоты;
в-третьих, после стерилизации и отмывки осуществляется высадка первичных эксплантов на питательную среду, содержащую аммоний азотнокислый, калий сернокислый,
магний сернокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, кальций азотнокислый,
кальция хлорид, марганец сернокислый, цинк сернокислый, медь сернокислую, борную
кислоту, натрий молибденовокислый, железо II сернокислое, трилон Б, тиамина хлорид,
пиридоксина хлорид, никотиновую кислоту, глицин, мезо-инозитол, аденин сульфат,
6-(γ,γ-диметилаллиламино)пурин, индолилуксусную кислоту, сахарозу, агар-агар, дополненную 24-эпибрассинолидом, при следующем соотношении компонентов в мг/л:
аммоний азотнокислый
400,00
калий сернокислый
990,00
магний сернокислый семиводный
370,00
калий фосфорнокислый однозамещенный
170,00
кальций азотнокислый
400,00
кальция хлорид
82,80
марганец сернокислый одноводный
16,90
цинк сернокислый семиводный
8,60
медь сернокислая пятиводная
0,25
борная кислота
6,20
натрий молибденовокислый двухводный
0,25
железо (II) сернокислое семиводное
27,80
трилон Б
37,30
тиамина хлорид
1,00
пиридоксина хлорид
0,50
никотиновая кислота
0,50
глицин
2,00
мезоинозитол
100,00
аденина сульфат
80,00
15,00
6-(γ,γ-диметилаллиламино)пурин
индолилуксусная кислота
4,00
24-эпибрассинолид
0,50-0,75
3
BY 18431 C1 2014.08.30
сахароза
30000,00
агар-агар
8000,00
вода деионизированная
остальное.
Кислотность питательной среды (pH) 4,8-5,0.
Модифицированная нами питательная среда при соблюдении остальных представленных выше модификаций способа введения сортовой голубики высокой Vaccinium corymbosum L. в культуру in vitro позволяет увеличить выход активно регенерирующих
стерильных эксплантов на 3,8-65,0 % в зависимости от генотипа (сорта).
Пример 1.
Исследования проводили на базе биотехнологической лаборатории НИЛ клеточных
технологий в растениеводстве УО "Полесский государственный университет".
В качестве первичных эксплантов сортов Патриот, Нортланд, Эрлиблю, Джерси,
Блюкроп голубики высокой Vaccinium corymbosum L. используют неодревесневшие верхушечные фрагменты стебля длиной 15 мм с почками. Первичные экспланты отмывают
мылом хозяйственным (72 %) в проточной воде, выдерживают на протяжении 20 мин в
водном растворе, содержащем 2 г/л фунгицида ридомил голд, 2 г/л фунгицида байтануниверсал, 20 мг/л аскорбиновой кислоты и 3 мл/л Tween 20, отмывают трижды в стерильной дистиллированной воде, содержащей 20 мг/л аскорбиновой кислоты, стерилизуют в 7,5 %-ном растворе гипохлорита натрия в присутствии 20 мг/л аскорбиновой
кислоты и 3 мл/л Tween 20 на протяжении 25 мин, отмывают трижды в стерильной дистиллированной воде, содержащей 20 мг/л аскорбиновой кислоты, и высаживают на модифицированную нами питательную среду, содержащую в мг/л:
аммоний азотнокислый
400,00
калий сернокислый
990,00
магний сернокислый семиводный
370,00
калий фосфорнокислый однозамещенный
170,00
кальций азотнокислый
400,00
кальция хлорид
82,80
марганец сернокислый одноводный
16,90
цинк сернокислый семиводный
8,60
медь сернокислая пятиводная
0,25
борная кислота
6,20
натрий молибденовокислый двухводный
0,25
железо (II) сернокислое семиводное
27,80
трилон Б
37,30
тиамина хлорид
1,00
пиридоксина хлорид
0,50
никотиновая кислота
0,50
глицин
2,00
мезоинозитол
100,00
аденина сульфат
80,00
15,00
6-(γ,γ-диметилаллиламино)пурин
индолилуксусная кислота
4,00
24-эпибрассинолид
0,50
сахароза
30000,00
агар-агар
8000,00
вода деионизированная
остальное.
Кислотность питательной среды (pH) 4,8-5,0.
Пробирки диаметром 22 мм с высаженными первичными эксплантами инкубируют
при температуре 25 °С, фотопериоде 16 ч день, 8 ч ночь, освещении 6000 лк, относительной влажности воздуха 70 %.
4
BY 18431 C1 2014.08.30
Учет общего количества стерильных первичных эксплантов и количества активно регенерирующих стерильных первичных эксплантов проводят еженедельно на протяжении
8 недель, после чего регенерировавшие побеги черенкуют и высаживают в колбы на стандартную питательную среду иного состава для размножения регенерантов in vitro.
Результаты исследований сведены в табл. 1-6.
Таблица 1
Выход стерильных эксплантов in vitro сорта Патриот голубики высокой
через 8 недель после стерилизации, эксперимент 1
Количество
Количество активно
Общее количестерильных
регенерирующих стеВариант опыта
ство первичных
первичных экс- рильных первичных
эксплантов, шт
плантов, %
эксплантов, %
1 (контроль)
111
74,0
9,0
2 (0,50 мг/л эпибрассинолида)
70
92,9
25,7
Примечание:
1 - контрольная питательная среда для инициации побегообразования in vitro;
2 - модифицированная питательная среда для инициации побегообразования in vitro,
содержащая дополнительно 0,50 мг/л 24-эпибрассинолида.
То же для табл. 2-6.
Таблица 2
Выход стерильных эксплантов in vitro сорта Патриот голубики высокой
через 8 недель после стерилизации, эксперимент 2
Общее колиКоличество сте- Количество активно
чество перрильных первич- регенерирующих стеВариант опыта
вичных
ных
рильных первичных
эксплантов,
эксплантов, %
эксплантов, %
шт
1 (контроль)
50
42,0
18,0
2 (0,50 мг/л эпибрассинолида)
62
56,5
25,8
Таблица 3
Выход стерильных эксплантов in vitro сорта Нортланд голубики высокой
через 8 недель после стерилизации
Количество сте- Количество активно
Общее количестрильных пер- регенерирующих стеВариант опыта
во первичных
вичных
рильных первичных
эксплантов, шт
эксплантов, %
эксплантов, %
1 (контроль)
48
68,0
17,0
2 (0,50 мг/л эпибрассинолида)
28
100,0
82,0
Таблица 4
Выход стерильных эксплантов in vitro сорта Джерси голубики высокой
через 8 недель после стерилизации
Вариант опыта
Общее количе- Количество сте- Количество активно
ство первичных рильных пер- регенерирующих стеэксплантов, шт
вичных
рильных первичных
эксплантов, %
эксплантов, %
1 (контроль)
48
87,5
12,5
2 (0,50 мг/л эпибрассинолида)
104
90,4
24,0
5
BY 18431 C1 2014.08.30
Таблица 5
Выход стерильных эксплантов in vitro сорта Эрлиблю голубики высокой
через 8 недель после стерилизации
Количество сте- Количество активно
Общее количерильных пер- регенерирующих стеВариант опыта
ство первичных
вичных
рильных первичных
эксплантов, шт
эксплантов, %
эксплантов, %
1 (контроль)
43
88,4
11,6
2 (0,50 мг/л эпибрассинолида)
67
82,1
17,9
Таблица 6
Выход стерильных эксплантов in vitro сорта Блюкроп голубики высокой через 8 недель после стерилизации
Общее количе- Количество сте- Количество активно
ство первичрильных пер- регенерирующих стеВариант опыта
ных
вичных
рильных первичных
эксплантов, шт эксплантов, %
эксплантов, %
1 (контроль)
88
37,7
22,4
2 (0,50 мг/л эпибрассинолида)
91
64,8
26,2
Пример 2.
Исследования проводили на базе биотехнологической лаборатории НИЛ клеточных
технологий в растениеводстве УО "Полесский государственный университет".
В качестве первичных эксплантов сорта Блюкроп голубики высокой Vaccinium corymbosum L. используют неодревесневшие верхушечные фрагменты стебля длиной 15 мм с
почками. Первичные экспланты отмывают мылом хозяйственным (72 %) в проточной воде, выдерживают на протяжении 20 мин в водном растворе, содержащем 2 г/л фунгицида
ридомил голд, 2 г/л фунгицида байтан-универсал, 20 мг/л аскорбиновой кислоты и 3 мл/л
Tween 20, отмывают трижды в стерильной дистиллированной воде, содержащей 20 мг/л
аскорбиновой кислоты, стерилизуют в 7,5 %-ном растворе гипохлорита натрия в присутствии 20 мг/л аскорбиновой кислоты и 3 мл/л Tween 20 на протяжении 25 мин, отмывают
трижды в стерильной дистиллированной воде, содержащей 20 мг/л аскорбиновой кислоты,
и высаживают на модифицированную нами питательную среду, содержащую в мг/л:
аммоний азотнокислый
400,00
калий сернокислый
990,00
магний сернокислый семиводный
370,00
калий фосфорнокислый однозамещенный
170,00
кальций азотнокислый
400,00
кальция хлорид
82,80
марганец сернокислый одноводный
16,90
цинк сернокислый семиводный
8,60
медь сернокислая пятиводная
0,25
борная кислота
6,20
натрий молибденовокислый двухводный
0,25
железо (II) сернокислое семиводное
27,80
трилон Б
37,30
тиамина хлорид
1,00
пиридоксина хлорид
0,50
никотиновая кислота
0,50
глицин
2,00
мезоинозитол
100,00
аденина сульфат
80,00
6
BY 18431 C1 2014.08.30
15,00
6-(γ,γ-диметилаллиламино)пурин
индолилуксусная кислота
4,00
24-эпибрассинолид
0,75
сахароза
30000,00
агар-агар
8000,00
вода деионизированная
остальное.
Кислотность питательной среды (pH) 4,8-5,0.
Пробирки диаметром 22 мм с высаженными первичными эксплантами инкубируют
при температуре 25 °С, фотопериоде 16 ч день, 8 ч ночь, освещении 6000 лк, относительной влажности воздуха 70 %.
Учет общего количества стерильных первичных эксплантов и количества активно регенерирующих стерильных первичных эксплантов проводят еженедельно на протяжении
8 недель, после чего регенерировавшие побеги черенкуют и высаживают в колбы на стандартную питательную среду иного состава для размножения регенерантов in vitro.
Результаты исследований сведены в табл. 7.
Таблица 7
Выход стерильных эксплантов in vitro сорта Блюкроп голубики высокой
через 8 недель после стерилизации
Количество сте- Количество активно
Общее количерильных перрегенерирующих стеВариант опыта
ство первичных
вичных
рильных первичных
эксплантов, шт
эксплантов, %
эксплантов, %
1 (контроль)
57
33,4
15,8
2 (0,75 мг/л эпибрассинолида)
58
46,6
34,5
Примечание:
1 - контрольная питательная среда для инициации побегообразования in vitro;
2 - модифицированная питательная среда для инициации побегообразования in vitro,
содержащая дополнительно 0,75 мг/л 24-эпибрассинолида.
Источники информации:
1. Решетников В.Н. и др. Некоторые аспекты микроклонального размножения голубики высокой и брусники обыкновенной // Плодоводство. - 2007. - Т. 19. - С. 209-216.
2. Сидорович Е.А., Кутас Е.Н. Клональное микроразмножение новых плодово- ягодных растений. - Минск, 1996. - С. 63 (прототип).
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
7
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
110 Кб
Теги
by18431, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа