close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY18470

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2014.08.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
A 61K 39/112 (2006.01)
ВАКЦИНА ИНАКТИВИРОВАННАЯ ЭМУЛЬГИРОВАННАЯ
ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА КРУПНОГО
РОГАТОГО СКОТА И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ
(21) Номер заявки: a 20101334
(22) 2010.09.16
(43) 2012.04.30
(71) Заявитель: Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие "Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского" (BY)
(72) Авторы: Амосова Любовь Александровна; Ломако Юрий Васильевич;
Гусев Анатолий Алексеевич; Опарина Ирина Владимировна (BY)
BY 18470 C1 2014.08.30
BY (11) 18470
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Республиканское
научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие "Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского" (BY)
(56) RU 2154495 С2, 2000.
BY 3203 С1, 1999.
BY 11671 С1, 2009.
RU 2154495 С2, 2000.
ШУСТЕР Б.Ю. и др. Ветеринария. 1994. - № 2. - С. 11-14.
(57)
1. Способ получения вакцины инактивированной эмульгированной для профилактики
сальмонеллеза крупного рогатого скота, заключающийся в том, что получают надосадочные жидкости, содержащие инактивированные поверхностные антигены бактерий Salmonella dublin - штамм КМИЭВ-В115 и Salmonella typhimurium - штамм КМИЭВ-В128, для
чего бактерии раздельно культивируют на агаре Хоттингера при температуре 36-38 °С 1618 ч, смывают с агара раствором 0,1-0,3 %-ного солянокислого гидроксиламина с pH 7,47,6, доводя их концентрации в смывах до 10-15 млрд. клеток/мл, выдерживают 24-48 ч при
температуре 20-25 °С, 20-30 мин при температуре 60-65 °С и 4-6 ч при температуре 4 °С,
центрифугируют при 8000-10000 g 20-30 мин, отбирают надосадочные жидкости, содержащие поверхностные антигены, добавляют формалин до концентрации 0,4-0,5 % и выдерживают 24-96 ч при температуре 37-56 °С, после чего смешивают надосадочные
жидкости, содержащие инактивированные поверхностные антигены, в соотношении 1:1,
добавляют 30-38 мас. % смеси к масляному адъюванту ISA 70 и гомогенизируют 5-7 мин
при 3000-4000 об/мин.
2. Вакцина инактивированная эмульгированная для профилактики сальмонеллеза
крупного рогатого скота, полученная способом по п. 1, которая содержит надосадочные
жидкости с инактивированными поверхностными антигенами бактерий Salmonella dublin штамм КМИЭВ-В115 и Salmonella typhimurium - штамм КМИЭВ-В128 и масляный адъювант ISA 70 при следующем соотношении компонентов, мас. %:
надосадочные жидкости с инактивированными
поверхностными антигенами бактерий:
Salmonella Dublin - штамм КМИЭВ-В115
15,0-19,0
Salmonella typhimurium - штамм КМИЭВ-В128
15,0-19,0
масляный адъювант ISA 70
62,0-70,0.
BY 18470 C1 2014.08.30
Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и может быть использовано в биотехнологии для приготовления вакцины и в ветеринарии для профилактики
сальмонеллеза крупного рогатого скота.
Сальмонеллез крупного рогатого скота, как правило, вызывается серовариантами сальмонеллами Salmonella dublin и Salmonella typhimurium, имеющими различную антигенную
структуру. Поэтому в заявляемой вакцине присутствуют антигены указанных штаммов.
Так, известна живая сальмонеллезная вакцина, содержащая живые аттенуированные
иммуногенные вакцинные штаммы сальмонелл Salmonella typhimurium № 3 и Salmonella
dublin № 6 [1].
Недостатком вакцины является то, что при определенных условиях (ослабление естественной резистентности организма) препарат может спровоцировать вспышку заболевания
либо привести к тому, что привитое животное будет являться носителем сальмонеллеза.
Так, известна вакцина формолквасцовая концентрированная для профилактики сальмонеллеза телят, представляющая собой жидкость желтоватого цвета с серо-белым осадком, содержащая инактивированные штаммы Salmonella dublin № 373 и Salmonella
typhimurium № 371 [2].
Вакцина имеет недостаток, стельным коровам препарат вводят в объеме 10,0 см3 подкожно,
что создает трудности при использовании препарата в промышленном животноводстве.
В ветеринарной микробиологии известна инактивированная эмульсин-вакцина для
профилактики сальмонеллеза телят, включающая штаммы сальмонелл Salmonella dublin
№ 1449 и Salmonella typhimurium № 159, в качестве иммуностимулятора - взвесь клеток
Rodococcus equi № 2, в качестве адъюванта - маслоланолиновую смесь. Инактивация компонентов осуществляется 0,4-0,5 %-ным формалином [3].
Недостатком данной вакцины является то, что антигены штаммов сальмонелл представлены в виде цельной клетки, что повышает ее реактогенность.
Известные способы получения вакцины не позволяют получить заявляемую вакцину
ввиду того, что для ее изготовления используют бактериальные клетки штаммов в высокой
концентрации, что уменьшает выход получаемого продукта, также антигены штаммов
сальмонелл представлены цельной бактериальной клеткой, что повышает реактогенность
препаратов.
Так, известен способ приготовления инактивированной эмульсин-вакцины против
сальмонеллеза телят, заключающийся в использовании штамма-антигена сальмонелл Salmonella dublin № 1449 в объеме 285 мл, штамма-антигена Salmonella typhimurium № 159 95 мл на физиологическом растворе, концентрация клеток штаммов 90 млрд/мл, инактиванта формалина в концентрации 0,4-0,5 %, взвеси клеток Rodococcus equi № 2 в объеме
95 мл на физиологическом растворе, содержащей 200 млрд. микробных клеток в 1 мл,
адьюванта в соотношении 83-87:17:13 [4].
Недостатком указанного способа является то, что при использовании данной концентрации бактериальных клеток (90 млрд./мл), невозможно получить высокий выход продукта, что повышает его стоимость.
Задачей заявляемого изобретения является конструирование и получение высокоиммуногенной и слабореактогенной вакцины инактивированной для профилактики сальмонеллеза крупного рогатого скота, обеспечивающей надежную защиту от указанного
заболевания, а также разработка способа ее получения, повышающего выход продукции.
Поставленная задача достигается тем, что способ получения вакцины инактивированной эмульгированной для профилактики сальмонеллеза крупного рогатого скота заключается
в том, что получают надосадочные жидкости, содержащие инактивированные поверхностные антигены бактерий Salmonella dublin штамм КМИЭВ-В115 и Salmonella typhimurium штамм КМИЭВ-В128, для чего бактерии раздельно культивируют на агаре Хоттингера
при температуре 36-38 °С 16-18 ч, смывают с агара раствором 0,1-0,3 %-ного солянокислого гидроксиламина с pH 7,4-7,6, доводя их концентрации в смывах до 10-15 млрд. клеток/мл, выдерживают 24-48 ч при температуре 20-25 °С, 20-30 мин при температуре
60-65 °С и 4-6 ч при температуре 4 °С, центрифугируют при 8000-1000 g 20-30 мин, отби2
BY 18470 C1 2014.08.30
рают надосадочные жидкости, содержащие поверхностные антигены, добавляют формалин до концентрации 0,4-0,5 % и выдерживают 24-96 ч при температуре 37-56 °С, после
чего смешивают надосадочные жидкости, содержащие инактивированные поверхностные
антигены, в соотношении 1:1, добавляют 30-38 мас. % смеси к масляному адъюванту ISA
70 и гомогенизируют 5-7 мин при 3000-4000 об/мин.
Кроме того, вакцина инактивированная эмульгированная для профилактики сальмонеллеза крупного рогатого скота, полученная вышеописанным способом, содержит надосадочные жидкости с инактивированными поверхностными антигенами бактерий Salmonella
dublin штамм КМИЭВ-В115 и Salmonella typhimurium штамм КМИЭВ-В128 и масляный
адъювант ISA-70 при следующем соотношении компонентов, мас. %:
надосадочные жидкости с инактивированными поверхностными антигенами бактерий:
Salmonella dublin - штамм КМИЭВ-В115
15,0-19,0
Salmonella typhimurium - штамм КМИЭВ-В128
15,0-19,0
масляный адъювант ISA-70
62,0-70,0.
В предлагаемой вакцине в качестве продуцента антигенов используют штамм-антиген
Salmonella dublin КМИЭВ-В115 и штамм-антиген Salmonella typhimurium КМИЭВ-В128.
Таким образом, включение в вакцину поверхностных антигенов штаммов сальмонелл,
взятых в соотношении 1:1, экстрагированных солянокислым гидроксиламином, и отделение бактериальных клеток путем центрифугирования позволяет получить слабореактогенный препарат, обладающий высокими протективными свойствами. Использование
штаммов, выделенных в хозяйствах республики, повышает эффективность вакцины, а
также применение небольших концентраций бактериальных клеток 10-15 млрд./мл позволяет удешевить производство вакцины.
В заявляемой вакцине для инактивакции применяли формалин. Эффект инактивации
основан на высокой реакционной способности в отношении аминокислот и белков, нуклеотидов и нуклеиновых кислот [5].
В качестве адъюванта взят масляный адъювант ISA-70 фирмы "Seppic". Адъювантность обусловлена совместным проявлением нескольких механизмов: предотвращением
быстрого распространения антигена от места инъекции, его дренированием через лимфатические узлы, улучшением связи антигена с макрофагами и их активацией, стимуляцией
и задержкой Т-лимфоцитов в лимфатических узлах [5].
Пример 1.
Приготовление вакцины инактивированной эмульгированной для профилактики сальмонеллеза крупного рогатого скота.
На первом этапе приготовления вакцины получают поверхностные антигены бактерий
Salmonella dublin - штамм КМИЭВ-В115 и Salmonella typhimurium - штамм КМИЭВ-В128.
Бактерии Salmonella dublin штамм КМИЭВ-В115 и Salmonella typhimurium - штамм
КМИЭВ-В128 выращивают на агаре Хоттингера при 36-38 °С 16-18 ч. Бактериальные
клетки штаммов смывают с агара 0,1-0,3 %-ным раствором солянокислого гидроксиламина pH 7,4-7,6, достигая концентрации бактериальных клеток 10-15 млрд./мл. Концентрацию
определяют, используя Densitometr. Полученную суспензию выдерживают 24-48 ч при
20-25 °С для экстрагирования поверхностных антигенов, после подвергают термической
обработке 20-30 мин при температуре 60-65 °С на водяной бане, охлаждают при 4 °С не
менее 4-6 ч и центрифугируют при 8000-10000 g 20-30 мин. В результате получают осадок
бактериальных клеток и надосадок или декант, содержащий поверхностные антигены.
Дополнительную инактивацию деканта проводят формалином в концентрации 0,4-0,5 %
при 37-56 °С 24-96 ч.
Для приготовления вакцины используют надосадочные жидкости, содержащие поверхностные антигены бактерий Salmonella dublin штамм КМИЭВ-В115 и Salmonella
typhimurium - штамм КМИЭВ-В128, инактивированные формалином. Смешивают инактивированные антигены в соотношении 1:1, затем добавляют масляный адъювант ISA-70.
Для получения однородной стабильной эмульсии к масляному адъюванту постепенно добавляют инактивированные антигены при скорости гомогенизации (перемешивания)
3
BY 18470 C1 2014.08.30
3000-4000 об/мин. Гомогенизацию осуществляют в стерильной емкости объемом до 1,0 л,
перемешивание осуществляют в течение 5-7 мин, используя гомогенизатор Braun Turbo 600.
В итоге полученная вышеописанным образом вакцина включает следующее соотношение
компонентов, мас. %:
надосадочные жидкости с инактивированными поверхностными антигенами бактерий:
Salmonella dublin - штамм КМИЭВ-В115
15,0-19,0
Salmonella typhimurium - штамм КМИЭВ-В128
15,0-19,0
масляный адъювант ISA-70
62,0-70,0.
Пример 2.
Контроль стерильности полученной вакцины.
В посевах вакцины на питательные среды должен отсутствовать рост микроорганизмов.
Материалы, инструменты и методы:
мясопептонный бульон (МПБ) ГОСТ 20 730-75;
мясопептонный агар (МПА) по действующему НД;
среда Сабуро, ГФХI. Вып. 2. - С. 193;
среда Китт-Тароцци по НД;
термостат любой марки по НД;
пробирки стеклянные ГОСТ 25336-82Е.
Для проведения испытания на стерильность используют 5 единиц флаконов из выборки до получения объединенной пробы общим объемом 20 см3.
Посевы проводят в объеме 0,2 см3 в 2 пробирки с МПБ, МПА, средами Сабуро и КиттТароцци. Через двое суток из жидких питательных сред проводят пересев в объеме 0,2 см3
на те же среды и в тех же объемах.
Первичные посевы на среде Сабуро выдерживают при температуре 20-22 °С, а на остальных средах - при температуре 36-38 °С в течение 10 суток, вторичные - в течение 8 суток.
Рост микроорганизмов на всех питательных средах должен отсутствовать.
Пример 3.
Контроль безвредности и реактогенности вакцины инактивированной для профилактики сальмонеллеза крупного рогатого скота.
Безвредность вакцины определяли путем подкожного введения в область спины препарата 10 белым мышам массой 18-20 г в дозе 0,3 см3. Наблюдение за животными вели в
течение 10 дней. Все животные остались живы.
Все иммунизированные животные оставались живыми и клинически здоровыми.
Реактогенность вакцины устанавливали путем ее внутримышечного введения 5 клинически здоровым кроликам в дозе 5,0 см3 с внутренней стороны бедра. Наблюдение за
животными вели в течение 10 дней. У кроликов возможно образование олеогранулемы.
Источники информации:
1. Шустер Б.Ю., Малахов Ю.А., Кириллова В.В. Специфическая профилактика сальмонеллеза животных // Ветеринария. - 1994. - № 2. - С. 11-14.
2. Вакцина формолквасцовая концентрированная против сальмонеллеза телят. Каталог
продукции, 2009. - С. 12.
3. Патент RU 2154495, МПК A 61K 39/112, C 12N 1/20, 2000.
4. Патент RU 2154495, МПК A 61K 39/112, C 12N 1/20, 2000.
5. Костина Г.И. К вопросу о химической инактивации микроорганизмов // ЖМЭИ. 1981. - № 8. - С. 25-30.
6. Шемельков Е.В., Федоров Ю.Н., Верховский О.А. Антигенная активность вакцины
против инфекционных болезней свиней при включении в ее состав адьвантов // Сельскохозяйственная биология. - 2008. - № 4. - С. 101-105.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
88 Кб
Теги
by18470, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа