close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY18533

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2014.08.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 12N 5/07
A 61F 2/10
(2010.01)
(2006.01)
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРЫ ЭПИДЕРМАЛЬНЫХ
КЕРАТИНОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПОЛИМЕРНОЙ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КОЖНОГО ПОКРОВА ЧЕЛОВЕКА
(21) Номер заявки: a 20101755
(22) 2010.12.03
(43) 2012.08.30
(71) Заявители: Государственное учреждение "Республиканский научнопрактический центр эпидемиологии
и микробиологии"; Учреждение Белорусского государственного университета "Научно-исследовательский институт физико-химических
проблем" (BY)
(72) Авторы: Квачева Зинаида Болеславовна; Бутенко Анна Викторовна;
Юркштович Татьяна Лукинична;
Беляев Сергей Александрович; Корень Сергей Викторович; Антоневич Наталья Георгиевна; Кабанова
Юлиана Анатольевна; Амвросьева
Тамара Васильевна (BY)
BY 18533 C1 2014.08.30
BY (11) 18533
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатели: Государственное
учреждение "Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии"; Учреждение
Белорусского государственного университета "Научно-исследовательский
институт физико-химических проблем" (BY)
(56) Методы культивирования клеток. Санкт-Петербург: Издательство Политехнического университета, 2008. - С.
176-180.
RU 2135191 C1, 1999.
RU 2148970 C1, 2000.
RU 2391399 C2, 2010.
(57)
1. Способ получения культуры эпидермальных кератиноцитов человека, заключающийся в том, что получают кожный лоскут, отделяют эпидермис кожного лоскута от дермы по линии базальной мембраны с использованием диспазы, обрабатывают эпидермис
при 37 °С трехкратно по 20 мин 0,2 %-ным раствором коллагеназы Н, отделяют центрифугированием эпидермальные кератиноциты и 8-10 дней культивируют их до образования
монослоя в среде, содержащей DMEM и F12 в соотношении 3:1, гидрокортизон в концентрации 0,4 мкг/мл, эпидермальный фактор роста в концентрации 10 нг/мл, аденин в концентрации 1,8×10-4 М, инсулин в концентрации 5 мкг/мл, трансферрин в концентрации 5
мкг/мл, 3-йод-тиронин в концентрации 2×10-11 М и форсколин в концентрации 0,1 мкг/мл.
2. Способ получения биополимерной композиции для восстановления кожного покрова человека, отличающийся тем, что монослой эпидермальных кератиноцитов, полученный способом по п. 1, обрабатывают 0,5 %-ным раствором диспазы с получением
суспензии эпидермальных кератиноцитов, доводят концентрацию кератиноцитов в суспензии до 500000 в 1 мл, смешивают с высокозамещенным фосфатом декстрана, стерилизованным гамма-облучением, в соотношении 60 мл суспензии с концентрацией 500000
кератиноцитов в 1 мл и 6 мг высокозамещенного фосфата декстрана и термостатируют 1820 ч при 37 °С, периодически встряхивая.
BY 18533 C1 2014.08.30
Изобретение относится к медицине, а именно к клеточной биотехнологии, и может
применяться в качестве способа культивирования стволовых клеток кожи и клетокпредшественников кератиноцитов и способа восстановления кожного покрова путем переноса иммобилизированных на биодеградируемом субстрате в виде геля или пленки на
поврежденный кожный покров больных.
В организме кожный покров человека постоянно обновляется за счет пролиферации
кератиноцитов и их последовательной дифференцировки по направлению от базальной
мембраны, разграничивающей эпидермис от дермы, к поверхности кожи. Установлено,
что на базальной мембране сосредоточены ниши стволовых клеток. Они дают начало так
называемым транзиторным клеткам (клеткам-предшественникам кератиноцитов), способным интенсивно размножаться и после нескольких делений вступать на путь дифференцировки. Поэтому для наращивания необходимой биомассы кератиноцитов в условиях
культуры необходимо выделение именно этих клеток, а для повышения их метаболического и энергетического уровня необходимы дополнительные экзогенные стимуляторы.
Известны способы выделения и выращивания пластов кератиноцитов кожи в культуре
с использованием разных ферментов разделения клеток и разных ростовых средах [1]. Недостатками известных способов является отсутствие данных о влиянии каждого из используемых ферментов на адгезивные и пролиферативные свойства стволовых клеток
кожи и клеток-предшественников кератиноцитов.
Наиболее близким, выбранным за прототип, является способ культивирования эпидермальных кератиноцитов [2], включающий:
1. Кожный лоскут погружают в раствор диспазы на 14-16 ч для разделения эпидермиса от дермы, для обнажения базального слоя и выделения фрагменты эпителия из данной
области.
2. Выделенные фрагменты эпителия обрабатывают протеолитическим ферментом
0,25 % трипсином и 0,02 % версеном в соотношении 1:1 в течение 5-10 мин при температуре 37 °С.
3. Фильтруют через нейлоновый фильтр в центрифужную пробирку, добавляют 10 %
сыворотки для нейтрализации ферментативной активности трипсина.
4. Центрифугируют в течение 5 мин при 800-1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в
ростовой среде DMEM:F12 в соотношении 3:1 с добавлением 0,4 мкг/мл гидрокортизона,
10-10 М холерного токсина, 10 нг/мл эпидермального фактора роста, аденина 1,8×10-4 М,
инсулина 5 мкг/мл, 5 мкг/мл трансферрина, 2×10-11 лиотиронина.
Посев клеток проводят во флаконы, обработанные коллагеном I типа, и культивируют
в инкубаторе при 37 °С.
Недостатком известного способа является использование трипсина для выделения
эпидермальных клеток из базального слоя. Эффективное действие трипсина ограничено
во времени (5-10 мин). Дальнейший его контакт приводит к повреждению мембран клеток
и поверхностных рецепторов, что влияет на адгезивную способность клеток к субстрату.
Другим недостатком методики является использование в качестве индуктора аденилатциклазной системы клеток (для повышения уровня метаболического и энергетического их
статуса) субъединиц холерного токсина, являющегося потенциально опасным веществом
биологического происхождения.
Задачей изобретения является подбор более щадящих условий ферментативной обработки базального слоя эпидермиса и выделения большего количества стволовых клеток
кожи и клеток-предшественников кератиноцитов, а также поиск состава ростовой среды с
биобезопасным компонентом для индукции аденилатциклазной системы и обеспечения
высокого уровня метаболического и энергетического статуса клеток, обеспечивающее избирательное накопление биомассы кератиноцитов.
Результат достигается в способе получения культуры эпидермальных кератиноцитов
человека, заключающемся в том, что получают кожный лоскут, отделяют эпидермис кож2
BY 18533 C1 2014.08.30
ного лоскута от дермы по линии базальной мембраны с использованием диспазы, обрабатывают эпидермис при 37 °С трехкратно по 20 мин 0,2 %-ным раствором коллагеназы Н,
отделяют центрифугированием эпидермальные кератиноциты и 8-10 дней культивируют
их до образования монослоя в среде, содержащей DMEM и F12 в соотношении 3:1, гидрокортизон в концентрации 0,4 мкг/мл, эпидермальный фактор роста в концентрации 10
нг/мл, аденин в концентрации 1,8×10-4М, инсулин в концентрации 5 мкг/мл, трансферрин
в концентрации 5 мкг/мл, 3-йод-тиронин в концентрации 2×10-11 М и форсколин в концентрации 0,1 мкг/мл.
Способ иллюстрируется следующими примерами.
1 (по способу-прототипу). Для приготовления культуры кератиноцитов используют
образец кожи области бедра (1 см2) (возраст пациента 37 лет). Для разделения эпидермиса
от дермы для обнажения базального слоя и выделения клеточных фрагментов из данной
области применяют фермент диспазу. Выделенный эпителий обрабатывают протеолитическим ферментом - 0,25 %-ным трипсином - 30 мин. Количество собранных из образца
клеток составляло 2,6 млн. клеток, жизнеспособность, оцененная после окраски их трипановым синим, составляла 68 ± 2 %. Далее фильтруют через нейлоновый фильтр в центрифужную пробирку для удаления остатков фрагментов ткани, добавляют 10 % сыворотки
эмбрионов коров для нейтрализации ферментативной активности трипсина. Центрифугируют в течение 5 мин при 800-1000 об/мин. В качестве ростовой среды используют
DMEM:F12 в соотношении 3:1 с добавлением 0,4 мкг/мл гидрокортизона, 10 нг/мл эпидермального фактора роста, 1,8×10-4 М аденина, 5 мкг/мл инсулина, 5 мкг/мл трансферрина, 2 nM 3-йод-тиронина, 0,1 мкг/мл холерного токсина. Далее посев клеток (5 млн клеток
в 10 мл ростовой среды) проводят во флаконы, обработанные бычьим коллагеном I A
(25 см2 посевная площадь). Время достижения сатурации монослоя 9-11 дней.
2 (по предлагаемому способу). Манипуляции, описанные в примере 1, выполняют те
же, но эпителий базальной мембраны (стволовые и транзиторные клетки) обрабатывают
трехкратно по 20 мин 0,2 %-ным раствором коллагеназы H со сбором надосадка клеток
после каждого цикла обработки. Количество собранных клеток из образца 1,0 см3 составляет 3,5 млн клеток, жизнеспособность - 87,5 ± 2, в ростовую среду вносили вместо
0,1 мкг/мл холерного токсина форсколин (0,1 мкг/мл). Время достижения сатурации монослоя 8-10 дней.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет селективно выделить из образца кожи
большее количество пролиферативно-активных кератиноцитов и при их дальнейшем
культивировании накапливается значительно большее количество биомассы клеток за тот
же промежуток времени.
Известен способ восстановления кожного покрова [3], включающий выделение и последующее культивирование кератиноцитов на полимерной пористой подложке с последующей пересадкой их на раневую поверхность. При этом кератиноциты культивируют на
подложке из оптически прозрачного полимера со сквозными порами диаметром D = 0,013,0 мкм и плотностью пор N = (103-109)1/см2 до формирования монослоя кератиноцитов.
Недостатками способа являются трудоемкость процесса изготовления оптически прозрачной пленки - облучение, травление, а также то, что пленка не является биодеградируемым материалом и после переноса на рану и заживления пленку приходится удалять, что
травмоопасно. Кроме того, требуется длительный подготовительный этап ее приготовления. До конца не исследованы ее свойства на биосовместимость и токсичнось.
К настоящему времени разработаны различные способы иммобилизации клеток на
матрицу в виде губки, гелеобразующие покрытия, пленочные и другие для роста и иммобилизации клеток с последующим переносом и трансплантацией. Используются биодеградируемые полимеры, состоящие из различных сочетаний коллагена, гликозаминогликана, хитозана на основе гиалуроновой кислоты, полилаклида, хондроитинсульфата и
др. [4].
3
BY 18533 C1 2014.08.30
Известен способ получения клеточной биополимерной композиции на основе коллагенового или фибринового геля для трансплантации клеток (мезенхимальные, стволовые,
кардиомиоциты, хондроциты и др.) [5, 6].
Недостатками способа являются использование биологического материала для приготовления биополимера и сложность приготовления клеточной композиции.
Задачей изобретения является разработка клеточной биополимерной композиции для
переноса и трансплантации, полимерный компонент которой будет безопасным, биосовместимым с клетками и легко деградируемым в организме человека.
Результат достигается в способе получения биополимерной композиции для восстановления кожного покрова человека. Монослой эпидермальных кератиноцитов, полученный культуральным способом, предлагаемым в данном изобретении, обрабатывают 0,5 %ным раствором диспазы с получением суспензии эпидермальных кератиноцитов, доводят
концентрацию кератиноцитов в суспензии до 500000 в 1 мл, смешивают с высокозамещенным фосфатом декстрана, стерилизованным гамма-облучением, в соотношении 60 мл
суспензии с концентрацией 500000 кератиноцитов в 1 мл и 6 мг высокозамещенного фосфата декстрана и термостатируют 18-20 ч при 37 °С, периодически встряхивая.
В последние десятилетия декстран считается одним из наиболее перспективных полимеров для получения гидрогелей, используемых в качестве носителей биологически активных веществ и лекарств [7]. Но для культивирования клеток он не использовался.
Изобретение иллюстрируется примером.
3. Манипуляции, описанные в примере 2, те же. После достижения плотного монослоя
клетки переводили в суспензию, обработкой монослоя 0,5 %-ным р-ром диспазы. Определяют число жизнеспособных клеток, которое составляет 89 ± 5. Доводят концентрацию
клеток до 500 тыс/мл питательной средой с антибиотиками без сыворотки с добавлением
10 нг/мл эпидермального ростового фактора. Соединяют 60 мл клеточной суспензии с 6
мг сухого высокозамещенного фосфата декстрана (проба заранее стерилизована гаммаоблучением), ставят в термостат при 37 °С, периодически встряхивая, на 18-20 ч. Микроскопируют с использованием инвертированного микроскопа. Наблюдают распределение
живых округлых клеток, расположенных внутри пор. Жизнеспособность клеток составляет 87 ± 3 %. При наблюдении в течение 1-й недели за клетками в геле цитотоксичности не
наблюдается.
Авторам из научно-технической, в том числе патентной, литературы не известна совокупность признаков заявляемого технического решения, что, по мнению авторов, свидетельствует о соответствии заявляемого способа критерию "новизна".
Отличительные признаки заявляемого технического решения обеспечивают достижение нового технического результата - повышение эффективности способа восстановления
кожного покрова за счет снижения риска поврежения стволовых и прогениторных клеток
базального слоя мембраны при их выделении и повышения биобезопасности накопленной
в культуре биомассы функционально-активных эпидермальных кератиноцитов и за счет
индукции аденилатциклазной системы и обеспечения высокого уровня метаболического и
энергетического статуса клеток при использовании вместо потенциально опасного биологического препарата, применение препарата растительного происхождения.
Результат также обеспечивается разработкой технологии получения биополимерных
клеточных композиций со свойствами полимера: биосовместимость, биодеградация, доступность (отечественная разработка), что существенно снизит стоимость клеточного
биопрепарата, а в последующем и затраты на лечение.
Все вышеизложенное соответствует критерию "изобретательский уровень".
Источники информации:
1. Epithelial Cell Culture. Edited by A.J. Shaw. IRL PRESS, 1996. - Р. 9-15.
4
BY 18533 C1 2014.08.30
2. Методы культивирования клеток / Под ред. Г.П. Пинаевой, М.С. Богдановой. СПб.: Изд-во Политехнического ун-та, 2008. - С. 176-180.
3. Патент РФ 2342164, МПК A 61L 27/60, 2008.
4. Воусе S.T., Forsman T.J., English K.B. et al. Skin wound closure in athymice mice with
cultured human cell, biopolymers, and growth factors // Surgery. - No. 110. - 1991. - P. 866-876.
5. Awad H.A., Butler D.L., Harris M.T., Ibrahim R.E., Wu Y., Young R.G. et al. (2000) In
vitro characterization of mesenchymal stem cell-seeded collagen scaffolds for tendon repair: effects of initial seeding density on contraction kinetics. J. Biomed. Mater. Res. - No. 51. - P. 233240.
6. Ameer G.A., Mahmood T.A. and Langer R. (2002) A biodegradable composite scaffold
for cell transplantation. J. Orthop. Res. - No. 20. - P. 16-19.
7. Патент РБ 11838, МПК A 61K 31/4162, A 61K 31/715, 2002.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
5
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
94 Кб
Теги
патент, by18533
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа