close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY18720

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2014.12.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
G 01N 33/50
(2006.01)
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕГО, БЕЛКОВОСВЯЗАННОГО И
СВОБОДНОГО ЙОДА В ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЕ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ЖИВОТНОГО
(21) Номер заявки: a 20101547
(22) 2010.10.28
(43) 2012.06.30
(71) Заявитель: Республиканское научноисследовательское унитарное предприятие "Институт биохимии биологически активных соединений
Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(72) Автор: Надольник Лилия Ивановна
(BY)
BY 18720 C1 2014.12.30
BY (11) 18720
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Республиканское
научно-исследовательское унитарное
предприятие "Институт биохимии
биологически активных соединений
Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) Селятицкая В.Г. и др. Клиническая лабораторная диагностика. - 1996. № 5. - с. 22-24.
ЕРЕМИН Ю.Н. и др. Лабораторное дело. - 1980. - № 7. - С. 428-430.
GNAT D. et al. Clinical Chemistry. 2003. - V. 49. - No. 1. - P. 186-188.
OHASHI T. et al. Clinical Chemistry. 2000. - V. 46. - No. 4. - P. 529-536.
RU 2265847 C2, 2005.
SU 386336, 1973.
(57)
Способ определения общего, белковосвязанного и свободного йода в щитовидной железе экспериментального животного, заключающийся в том, что готовят на 0,15 М растворе хлорида калия гомогенат щитовидной железы, разводят его тридистиллированной
водой, часть разведенного гомогената смешивают с раствором хлорной кислоты, добавляя
ее до конечной концентрации 2,0 %, встряхивают и центрифугируют 45 мин при 1300 g,
разделяют осадок и надосадочную жидкость, после чего определяют каталитическим церий - арсенитным методом в оставшейся части разведенного гомогената щитовидной железы общее содержание йода, в осадке - содержание белковосвязанного йода и в
надосадочной жидкости - содержание свободного йода.
Изобретение относится к области биологической химии, а именно к биохимии щитовидной железы (ЩЖ), и может использоваться для изучения метаболизма йода в ЩЖ экспериментальных животных, при моделировании патологии ЩЖ, для оценки
эффективности фармакологических препаратов, используемых для коррекции функции
ЩЖ. Способ может быть применен в работе на модельных системах: культура клеток
ЩЖ, органных культурах ЩЖ, щитовидная железа человека (послеоперационный материал).
BY 18720 C1 2014.12.30
Необходимость разработки данного метода вызвана актуальностью исследования биохимических аспектов метаболизма ЩЖ и отсутствием простых высокочувствительных
методов оценки основных этапов метаболизма йода (поглощение и органификация).
Известен способ исследования процессов поглощения и органификации йодида в щитовидной железе с применением радиоизитопов йодида (125I, 131I). Этот способ представлен в экспериментальных исследованиях Вольфа-Чайкова по изучению эффектов высоких
доз йода на функцию ЩЖ [1].
Недостатком данного способа является использование радиоизотопов йода (сложности работы с радиоактивными соединениями, неточности анализа из-за локального внутреннего облучения клеток щитовидной железы радиоизотопами йода).
Известен способ определения концентрации йода в моче, основанный на реакции Санделла-Кольтхоффа [2, 3]. Данный метод включает обработку проб мочи раствором хлорноватой кислоты (или смеси хлорноватой и хлорной кислот) при высокой температуре
(окисление соединений йода до йодид иона) и последующее определение концентрации
йода в моче с использованием каталитической церий-арсенитной реакции.
Недостатком данного способа является то, что с его помощью определяют концентрацию йода только в моче.
Из просмотра доступной литературы нам не удалось обнаружить источник, который
бы явился прототипом заявляемого изобретения.
Задача изобретения - разработать способ, позволяющий эффективно измерить концентрацию общего, белковосвязанного свободного йода в ткани ЩЖ.
Поставленная задача решается путем приготовления гомогената щитовидной железы,
разведения его тридистиллированной водой и использования его части, после добавления
раствора хлорной кислоты до конечной концентрации 2,0 %, встряхивания, центрифугирования, разделения осадка и надосадочной жидкости, для определения каталитическим
церий-арсенитным методом в оставшейся части разведенного гомогената щитовидной железы общего содержания йода, в осадке - содержание белковосвязанного йода и в надосадочной жидкости - содержание свободного йода.
Способ осуществляют следующим образом. Выполняют 2 этапа: подготовка проб для
анализа и проведение анализа (основной этап).
1 этап. Подготовка проб. Готовят гомогенат ЩЖ (1:40) на 0,15 М растворе хлорида
калия с использованием стеклянного гомогенизатора объемом 10 мл. Пробы гомогената
разводят в 50 раз (20 мкл гомогената + 0,98 мл воды) в тридистиллированной воде (для
контрольных эутиреоидных крыс, содержащихся на полноценном стандартном рационе
вивария) и соответственно в 10 и в 200 раз (для ЩЖ крыс, потребляющих низкойодную и
высокойодную диеты).
Для осаждения белковосвязанной фракции йода добавляют раствор хлорной кислоты
до концентрации в пробе 2,0 %. В табл. 1 представлена выявленная нами зависимость степени осаждения белковосвязанного йода от концентрации хлорной кислоты.
В табл. 1 представлено изменение концентрации белковосвязанного йода в пробе в зависимости от концентрации хлорной кислоты в пробе.
Таблица 1
Влияние концентрации хлорной кислоты в пробе на содержание йода
(мкг/г ткани) в осадке (белковосвязанная фракция)
Концентрация хлорной
кислоты в пробе, %
Концентрация йода в
пробе, мкг/г ткани
5,77
4,81
3,85
2,88
2,0
0,85
125,3±2,4 130,8±0,6 134,8±1,2 176,8±3,0 217,2±3,4 210,1±4,8
2
BY 18720 C1 2014.12.30
Как видно из таблицы, снижение концентрации кислоты в пробе от 5,77 % (стандартно используемая) до 2 % привело к увеличению содержания йодида в 1,75 раза во фракции осажденных белков.
К 125 мкл приготовленного гомогената ЩЖ добавляют 200 мкл 5,2 % раствора хлорной кислоты (концентрация в пробе при этом составит 2,0 %). Пробирки встряхивают и
центрифугируют в течение 45 мин при 3000 об/мин (1300 g). Далее из надосадочной жидкости отбирают аликвоту (125 мкл) для определения свободной фракции йода, оставшуюся надосадочную жидкость удаляют полностью, к осадку добавляют соответствующий
(125 мкл) объем тридистиллированной воды. Для каждого образца ЩЖ готовят 3 пробы:
в первой пробе - определяют общее содержание йода (Iобщ), она содержит 125 мкл
разведенного гомогената ЩЖ крыс (1 : 40 разводится в 50 раз);
во второй пробе - определяют содержание белковосвязанной фракции йода (Iбс), после осаждения белков (как представлено выше) и удаления надосадочной жидкости, проба
содержит 125 мкл гомогената (1 : 40 разводится в 50 раз);
в третьей пробе - определяют содержание свободной фракции йодида (Iсв), проба содержит 125 мкл супернатанта из пробы 2 (после осаждения белковой фракции).
Схема добавления реагентов представлена в табл. 2.
Таблица 2
Схема добавления реагентов при проведении подготовительного этапа работы
Гомогенат 5,2 % хлор- Супернатант
Показатель
H2O
ЩЖ
ная кислота
пробы № 2
Проба № 1
Йод общий
125 мкл
Йод белковосвязанПроба № 2
125 мкл
200 мкл
125 мкл
ный
Проба № 3
Йод свободный
нет
125 мкл
2 этап (основной этап). Проведение анализа. В подготовленные пробы добавляют по
300 мкл смеси концентрированных хлорноватой и хлорной кислот (в соотношении 5 : 1).
При 100 °С в течение 1 ч проводят сжигание проб в смеси кислот. Хлорноватая кислота
синтезируется перед работой [1] и хранится в холодильнике 4-8 недель. После охлаждения проб к ним добавляют по 1,0 мл 0,5 % раствора арсенита натрия, инкубируют 20 мин
при 20 °С и по секундомеру в каждую пробу добавляют 0,5 мл 1,2 % раствора церий аммоний сульфата (интервал 10 с). Строго через 20 мин каждую пробу спектрофотометрируют непосредственно в пробирке на приборе "Spectromom-401" (Венгрия) при длине
волны 400 нм. Калибровочная кривая строится при проведении каждого анализа. Схема
добавления реагентов представлена в табл. 2. В день проводится определение общего,
белковосвяхзанного и свободного йода в 20-25 опытных пробах (всего 60-75 проб). Анализ проводился в стеклянных пробирках размером 75×100 мм.
Таблица 3
Схема добавления реагентов при проведении основного этапа работы
Смесь концентри0,5 % раствор 1,2 % раствор
рованных перПоказатель
арсенита на- церий-аммоний
хлорной и хлорной
трия, мл
сульфата, мл
кислот, мкл
Проба № 1
Йод общий
300
1,0
0,5
Проба № 2 Йод белковосвязанный
300
1,0
0,5
Проба № 3
Йод свободный
300
1,0
0,5
Используемые реактивы. Все реактивы, используемые в работе, должны быть марки
х.ч. йодат калия, хлорат калия, триоксид мышьяка, церий-аммоний сульфат ("Fluca"), серная и хлорная кислоты, хлорид натрия (Россия).
3
BY 18720 C1 2014.12.30
Приводим доказательства возможности осуществления способа. Разработанный способ определения йодида в ЩЖ апробирован в ряде экспериментальных исследований.
Содержание общего, белковосвязанного и свободного йодида определялось в ЩЖ крыс,
содержащихся на стандартном рационе вивария, получавших высокие дозы йодида калия
[4], животных с метимазол-индуцированным гипотиреозом [5]. Были обнаружены выраженные достоверные изменения содержания различных фракций йода в ткани ЩЖ крыс
(табл. 4), которые коррелировали с уровнем тиреоидных гормонов в крови животных, а
также другими показателями, определяемыми в ткани щитовидной железы.
Таблица 4
Концентрация общего, белковосвязанного и свободного йода (мкг/г ткани) в ткани ЩЖ крыс (контрольная группа, группа, получавшая дополнительно 35 мкг/100 г
массы KI, и группа, получавшая в течение 12 недель низкойодную диету), данные
экспериментальных исследований, M±m
Введение 35 мкг KI
Контрольная
Низкойодная диета
Показатель
на протяжении
группа
в течение 12 недель
14 недель
Йод общий, мкг/г ткани
349,1±5,29
732,8543,43
46,47±8,62
Йод белковосвязанный,
290,7±12,65
348,29±40,78
30,92±6,06
мкг/г ткани
Йод свободный, мкг/г ткани
83,26±9,65
245,03±29,29
5,65±3,78
Соотношение Iбсвяз/Iобщ
0,833±0,042
0,598±0,024
0,836±0,174
Соотношение Iсв/Iбсвяз
0,286±0,025
0,703±0,043
0,121±0,03
Исследование соотношения различных фракций йодида в ткани ЩЖ позволяет характеризовать динамику процессов поглощения и органификации йодида.
Применение предложенного способа и показателей является информативным методом, который может быть использован в экспериментальных исследованиях на животных
[4, 5], при работе с культурой клеток и ткани ЩЖ [6, 7], а также в клинических исследования (как на послеоперационном материале, так и материале, полученном при тонкоигольной биопсии ЩЖ), поскольку чувствительность этого метода очень высокая (0,30,5 мкг/г ткани).
Разработанный способ исследования позволяет:
1. Определить концентрацию общего, белковосвязанного и свободного йода в ЩЖ,
что дает возможность оценить активность процессов поглощения и органификации йода в
ЩЖ.
2. Определять содержание йода в ЩЖ в очень широком диапазоне (от 0,3 до
1150,0 мкг/г ткани и более).
3. Исследовать метаболизм йодида в экспериментальных моделях на животных, культуре клеток и ткани щитовидной железы, операционном материале ЩЖ человека.
4. Проводить исследования без использования высокотоксичных радиоизотопов йода.
5. Прост в проведении, надежен и хорошо воспроизводим.
Использование данного технического решения предоставляет возможность изучения
йодного метаболизма в экспериментальных и клинических исследованиях. Предлагаемое
изобретение является доступным для выполнения и может использоваться в научноисследовательских лабораториях для экспериментального исследования вопросов патогенеза, диагностики и способов коррекции тиреоидной патологии, оценки эффективности
фармакологических препаратов, непосредственно или косвенно влияющих на йодный метаболизм.
4
BY 18720 C1 2014.12.30
Источники информации:
1. Wolff B.J., Chaikoff I.L. Plasma inorganic iodide as homeostatic regulator of thyroid
function //J. Biol. Chem. - 1948. - Vol. 174. - P. 555-560.
2. Dunn J.T. et al. Two simple methods for measuring iodine in urine // Thyroid. - 1993. Vol. 3. - No. 2. - Р. 119-123.
3. Селятицкая В.Г., Пальчикова Н.А., Галкин П.С. Опыт определения йода в моче кинетическим церий-арсенитным методом // Клиническая лабораторная диагностика. 1996. - № 5. - С. 22-24.
4. Лупачик С.В., Надольник Л.И., Нецецкая З.И., Виноградов В.В. Влияние длительного введения высоких доз йодида калия на метаболизм йода в щитовидной железе крыс //
Биомед. химия. - 2006. - № 2. - С. 161-168.
5. Надольник Л.И., Валентюкевич О.И. Метаболизм йода и антиоксидантный статус
щитовидной железы крыс при экспериментальном гипотиреозе // Вес. Нац. акад. навук
Беларусь. Сер. мед. навук. - 2009. - № 4. - С. 44-49.
6. Надольник Л.И., Нецецкая З.В. Влияние H2Oа-индуцированного окислительного
стресса на метаболизм йодида в тироцитах щитовидной железы крыс // Весцi Нац. акад.
навук Беларусi. Сер. бiял. навук. - 2008. - № 1. - С. 90-95.
7. Nadolnik L.I., Niatsetskaya Z.V., Lupachyk S.V. Effect of oxidative stress on rat thyrocyte iodide metabolism // Cell. Biochem. Funct. - 2008. - Vol. 2.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
5
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
103 Кб
Теги
by18720, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа