close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY18772

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2014.12.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
A 61K 38/17
(2006.01)
МОДУЛЯТОРЫ ГЛИКОПРОТЕИНОВОГО
ЛИГАНДА-1 P-СЕЛЕКТИНА
(21) Номер заявки: a 20060348
(22) 2004.09.09
(31) 10/662,906 (32) 2003.09.15 (33) US
(85) 2006.04.15
(86) PCT/US2004/029520, 2004.09.09
(87) WO 2005/027831, 2005.03.31
(43) 2006.10.30
(71) Заявитель: АбДженомикс Коёператиф У.А. (NL)
BY 18772 C1 2014.12.30
BY (11) 18772
(13) C1
(19)
(72) Авторы: ЛИН, РОНГ-ХВА (TW);
ЧАНГ, ЧУНГ, НАН (US)
(73) Патентообладатель: АбДженомикс
Коёператиф У.А. (NL)
(56) US 5840679 A, 1998.
RU 2201254 C1, 2003.
BY 4090 C1, 2001.
(57)
1. Способ предотвращения или снижения опосредованного T-клетками иммунного ответа у пациента, при котором осуществляют введение пациенту с установленным заболеванием или с риском приобретения заболевания, характеризующегося избыточным или
нежелательным опосредованным T-клетками иммунным ответом, мультимерного соединения, которое связывается по меньшей мере с двумя белками гликопротеинового лиганда-1 P-селектина (PSGL-1) на поверхности T-клетки, причем мультимерное соединение
содержит две полипептидные цепи, каждая из которых включает:
(i) связывающий домен, который связывается с PSGL-1 и представляет собой внеклеточный домен мышиного P-селектина или его PSGL-1 связывающий фрагмент, внеклеточный домен мышиного E-селектина или его PSGL-1 связывающий фрагмент,
внеклеточный домен P-селектина человека или его PSGL-1 связывающий фрагмент или
внеклеточный домен E-селектина человека или его PSGL-1 связывающий фрагмент, и
(ii) гетерологическую аминокислотную последовательность, содержащую константную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека, причем полипептидные цепи связаны между собой гетерологической аминокислотной последовательностью с образованием мультимерного соединения,
при этом связывание мультимерного соединения с белками PSGL-1 на поверхности
T-клетки индуцирует путь трансдукции сигнала, который приводит к гибели T-клетки,
предотвращая или снижая тем самым опосредованный T-клетками иммунный ответ у пациента.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что мультимерное соединение является гомомультимерным соединением.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что мультимерное соединение является гетеромультимерным соединением.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полипептидные цепи связаны гетерологической аминокислотной последовательностью ковалентно с образованием мультимерного
соединения.
BY 18772 C1 2014.12.30
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что ковалентная связь является дисульфидной
связью.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что T-клетка является активированной
Т-клеткой.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют введение
пациенту агента, который связывает мультимерное соединение с помощью гетерологической аминокислотной последовательности и способствует перекрестному сшиванию антигенов PSGL-1 на поверхности T-клетки.
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что заболевание является воспалительным заболеванием.
9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что заболевание является аутоиммунным заболеванием.
10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что заболевание обусловлено пересаженным
аллогенным или ксеногенным трансплантатом или подготовкой к ожидаемой пересадке
аллогенного или ксеногенного трансплантата.
11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что заболевание является аллергическим заболеванием.
12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что заболевание является T-клеточным раком.
13. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно проводят определение количества Т-клеток в биологическом образце, взятом у пациента перед введением мультимерного соединения, и сравнение результата с количеством T-клеток в биологическом
образце, взятом у пациента после введения мультимерного соединения.
14. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно проводят определение
биологической активности T-клеток в биологическом образце, взятом у пациента перед
введением мультимерного соединения, и сравнение результата с биологической активностью T-клеткок в биологическом образце, взятом у пациента после введения мультимерного соединения.
15. Способ по п. 1, отличающийся тем, что введение мультимерного соединения приводит к истощению по меньшей мере 10 % активированных T-клеток у пациента.
16. Способ индуцирования гибели T-клетки или клетки - естественного киллера (NKклетки), при котором используют T-клетку или NK-клетку, экспрессирующую PSGL-1 на
своей поверхности, и осуществляют контактирование T-клетки или NK-клетки с мультимерным соединением, которое связывается по меньшей мере с двумя белками PSGL-1 на
поверхности T-клетки или NK-клетки, причем мультимерное соединение содержит две
полипептидные цепи, каждая из которых включает:
(i) связывающий домен, который связывается с PSGL-1, причем связывающий домен
представляет собой внеклеточный домен мышиного P-селектина или его PSGL-1 связывающий фрагмент, внеклеточный домен мышиного E-селектина или его PSGL-1 связывающий
фрагмент, внеклеточный домен P-селектина человека или его PSGL-1 связывающий фрагмент
или внеклеточный домен E-селектина человека или его PSGL-1 связывающий фрагмент, и
(ii) гетерологическую аминокислотную последовательность, содержащую константную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека, причем полипептидные цепи связаны между собой гетерологической аминокислотной последовательностью с образованием
мультимерного соединения,
при этом связывание мультимерного соединения с белками PSGL-1 на поверхности
T-клетки или NK-клетки индуцирует путь трансдукции сигнала, который приводит к гибели T-клетки или NK-клетки.
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что мультимерное соединение является гомомультимерным соединением.
18. Способ по п. 16, отличающийся тем, что мультимерное соединение является гетеромультимерным соединением.
2
BY 18772 C1 2014.12.30
19. Способ по п. 16, отличающийся тем, что полипептидные цепи связаны гетерологической аминокислотной последовательностью ковалентно с образованием мультимерного соединения.
20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что ковалентная связь является дисульфидной связью.
21. Способ по п. 16, отличающийся тем, что T-клетка является активированной
T-клеткой.
22. Способ по п. 16, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют контактирование мультимерного соединения с агентом, который связывает мультимерное соединение с помощью гетерологической аминокислотной последовательности и способствует
перекрестному сшиванию антигенов PSGL-1 на поверхности T-клетки или NK-клетки.
23. Способ по п. 16, отличающийся тем, что дополнительно проводят оценку жизнеспособности T-клетки или NK-клетки после контактирования с мультимерным соединением.
24. Способ по п. 16, отличающийся тем, что дополнительно проводят оценку биологической активности T-клетки или NK-клетки после контактирования с мультимерным
соединением.
25. Набор для предотвращения или снижения опосредованного T-клетками иммунного
ответа у пациента, содержащий мультимерное соединение, способное к связыванию по
меньшей мере с двумя белками PSGL-1 на поверхности T-клетки, причем мультимерное
соединение представляет собой соединение, содержащее две полипептидные цепи, каждая
из которых включает:
(i) связывающий домен, способный к связыванию с PSGL-1, причем связывающий домен представляет собой внеклеточный домен мышиного P-селектина или его PSGL-1 связывающий фрагмент, внеклеточный домен мышиного E-селектина или его PSGL-1
связывающий фрагмент, внеклеточный домен P-селектина человека или его PSGL-1 связывающий фрагмент или внеклеточный домен E-селектина человека или его PSGL-1 связывающий фрагмент, и
(ii) гетерологическую аминокислотную последовательность, содержащую константную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека, причем полипептидные цепи связаны между собой гетерологической аминокислотной последовательностью с образованием мультимерного соединения,
и инструкцию по использованию мультимерного соединения.
Настоящее изобретение относится к составам и способам контролирования иммунных
ответов.
Контроль нежелательных иммунных ответов является важной проблемой при лечении
таких заболеваний, как воспалительные заболевания, аутоиммунные болезни, отторжение
трансплантата, аллергические болезни и различные виды рака, вызываемые T-клетками.
Активность чрезмерно агрессивных T-клеток можно контролировать путем иммуносупрессии или путем индуцирования иммунологической толерантности. Толерантность определяется как состояние, при котором иммунная система становится невосприимчивой к
антигенам, в то время как при иммуносупрессии, снижающей иммунный ответ к антигенам, обычно требуется продолжительное применение лекарственных средств. При трансплантации органов T-клетки играют важную роль при иммунном ответе на аллоантигены.
Существующие иммунодепрессивные режимы обычно предусматривают применение кортикостероида, циклоспорина или рапамицина, блокирующих транскрипцию IL-2, основного фактора роста для T-клеток, либо ингибирующих пролиферацию, обусловленную
IL-2. Тем не менее некоторые моноклональные антитела, действующие либо как факторы,
истощающие популяцию T-клеток (например, CD3, CD4, CD8), либо как ингибиторы ин3
BY 18772 C1 2014.12.30
дукции цитокинов, либо как костимуляторные пути T-клеток (например, CD25, B7-1, B72, CD152, CTLA4), продемонстрировали эффективность при снижении частоты отторжения при ограниченных побочных эффектах или токсичности. Было продемонстрировано,
что некоторые их этих веществ позволяют добиться определенной степени эффективности
при лечении аутоиммунных заболеваний и продлении срока выживаемости трансплантата.
Существует широко распространенное мнение, что апоптоз является жизненно важным для поддержания нормального функционирования иммунной системы и основным
механизмом по устранению нежелательных клеток [Kabelitz et al. Immunol. - No. 14. P. 338-340. - 1993; Raff. Nature. - V. 356. - P. 397-399. - 1992]. Различные сигналы активации, возникающие внутри или снаружи клетки, оказывают влияние на жизнь и некроз
клетки. Антитела против таких поверхностных молекул T-клетки, как Fas (или CD95,
MW = 43 kD), TNFR2 (MW = 75 kD), CD2 (MW = 45 kD) и CTLA-4 (MW = 33 kD), вызывают апоптоз T-клеток [Osborne. Curr. Opin. Immunol. - No. 8. - P. 245-248. - 1996; Lin et al.
J. Immunol. - V. 158. - P. 598-603. - 1997; Zhang et al. Nature. - V. 377. - P. 348-350. - 1995;
Lai et al. Eur. J. Immunol. - No. 25. - P. 3243-3248. - 1995; Mollereau et al. J. Immunol. V. 156. - P. 3184-3190. - 1996; Gribben et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - V. 92. - P. 811-815. 1995]. Попытки использовать молекулы Fas и TNFR2 для контроля нежелательных
T-клеток не увенчались успехом ввиду того, что указанные две молекулы экспрессируются не только на иммунных клетках, но и на некоторых других важных органах, таких как
печень. Этот паттерн экспрессии потенциально ограничивает терапевтическое применение
указанных двух антител [Ogasawara et al. Nature 364: 806-809 (1993); Pfeffer et al. Cell. No. 73. - P. 457-467. - 1993; Engelmann et al. J. Biological Chemistry. - V. 265. - P. 1449714504. - 1990].
Члены суперсемейства селектинов, интегринов и иммуноглобулина (Ig) представляют
собой три основных класса адгезивных молекул, играющих важную роль во взаимодействии лейкоцитов и тромбоцитов либо между собой, либо с внеклеточным матриксом и сосудистым эндотелием [Springer. Nature. - V. 346: - P. 425. - 1990; Osborn. Cell. -V. 62. - P. 3. 1990; Hynes. Cell. - V. 69.- P. 11. - 1992]. Адгезивная молекула на одном типе клетки нередко связывается с другой адгезивной молекулой, экспрессированной на отличном типе
клетки, образуя пару лиганд - рецептор.
Семейство селектинов включает P-селектин (также известный как CD62, CD62P,
GMP140 и PADGEM), E-селектин (также известный как ELAM-1 и CD62E) и L-селектин
(также известный как LECAM-1, Mel-14, LAM-1 и CD62L). Селектины являются высокогомологичными, состоящими из 120-аминокислотного N-концевого домена лектина,
EGF-I подобного домена, переменного числа доменов с множественными короткими консенсусными повторами (SCR), гомологичными доменам, обнаруженным в комплементрегуляторных белках, за которыми следуют трансмембранный домен и короткий цитоплазматический концевой сегмент [Siegelman et al. Science. - V. 243. - P. 1165-1172. - 1989;
Lasky et al. Cell. - V. 56. - P. 1045-1055. - 1989; Tedder et al. J. Exp. Med. - V. 170. - P. 123133. - 1989; Johnson et al. Cell. - V. 56. - P. 1033-1044. - 1989; Bevilacqua et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. - V. 84. - P. 9238-9242. - 1987; Bevilacqua et al.., Science. - V. 243. - P. 11601165. - 1989; Bevilacqua et al.., J. Clin. Invest. - V. 91. - P. 379-387. - 1993, Camerini et al. Nature. - V. 280. - P. 496-498. - 1989]. Селектины имеют перекрывающиеся, но различимые
специфичности для поверхностных рецепторов клеток [Bevilacqua et al. J. Clin. Invest. V. 91. - P. 379-387. - 1993; Feize. Current Opinion in Struct. Biol. - No. 3. - P. 701-710. - 1993;
Berg et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. - V. 184. - P. 1048-1055. - 1992; Foxall et al. J. Cell
Biol. - V. 117. - P. 895-902. - 1992; Larsen et al. J. Biol. Chem. - V. 267. - P. 11104-11110. 1992; Polley et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - V. 88. - P. 6224-6228. - 1991].
P-селектин, E-селектин и L-селектин опосредуют адгезионные взаимодействия первого лейкоцита и эндотелиальной клетки и тромбоцита и лейкоцита при воспалительном
процессе [Bevilacqua et al., 1993, supra]. Как было продемонстрировано, все три селектина
4
BY 18772 C1 2014.12.30
участвовали в начальном "роллинговом" взаимодействии лейкоцитов с активированным
эндотелием [von Andrian et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - V. 88. - P. 7538-7542. - 1991;
Ley et al. Blood. - V. 77. - P. 2553-2555. - 1991; Abassi et al. J. Clin. Invest. - V. 92. - P. 27192730. - 1993; Dore et al. Blood. - V. 82. - P. 1308-1316. - 1993; Jones et al. Biophys. J. - No. 65. P. 1560-1569. - 1993; Mayadas et al. Cell. - No. 74. - P. 541-554. - 1993]. P-селектин, экспрессированный на активированных тромбоцитах и эндотелиальных клетках, связывается с
белками клеточной поверхности на большинстве лейкоцитов [McEveret al. J. Biol. Chem. V. 250. - P. 9799-9804. - 1984; Hsu-Lin et al. J. Biol. Chem. - V. 264. - P. 8121-9126. - 1984].
E-селектин, экспрессированный на активированных цитокином эндотелиальных клетках
(например, после TNF-alpha или IL-1 стимулирования в течение 6-8 ч) связывается с белками клеточной поверхности на большинстве лейкоцитов [McEver et al. J. Clin. Invest. V. 100. - P. 485-492. - 1997; Bevilacqua et al., 1987, supra; Bevilacqua et al., 1989, supra]. Lселектин, экспрессированный на большинстве лейкоцитов, связывается с белками клеточной поверхности на ряде эндотелиальных клеток и на других лейкоцитах [Gallatin et al.
Nature. - V. 304. - P. 30-34. - 1983; Berg et al. Immunol. Rev. - V. 108. - P. 5-18. - 1989; Berg
et al. J. Cell. Biol. - V. 114. - P. 343-349. - 1991; Hallman et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. V. 174. - P. 236- 243. - 1991; Smith et al. J. Clin. Invest. - V. 87. - P. 609-618. - 1991; Spertini et al.
J. Immunol. - V. 147 - P. 2565-2573. - 1991]. Как было показано, все три селектина связываются с белком клеточной поверхности PSGL-1, экспрессия которого в значительной
степени ограничена лейкоцитами и, в частности, T-клетками и NK-клетками. Посттрансляционные модификации PSGL-1 необходимы для связывания с P-селектином, E-селектином и L-селектином [McEver et al., J. Clin. Invest., 1997, supra].
Изобретение основано на открытии того факта, что T-клетки могут быть истощены и
(или) у них может быть индуцирован процесс апоптоза путем связывания поверхностного
антигена T-клетки с гликопротеиновым лигандом-1 P-селектина (PSGL-1). Истощение
T-клетки может быть исключительно эффективным для лечения состояний, связанных с
избыточным или нежелательным иммунным ответом, опосредованным T-клетками, или
избыточной или нежелательной пролиферацией T-клеток. Например, истощение T-клеток
может вызвать снижение или элиминацию нежелательной активности или пролиферации
T-клеток, связанных с воспалительными заболеваниями, аутоиммунными болезнями, отторжением трансплантата, аллергическими болезнями и различными видами рака, вызываемыми T-клетками. Изобретение охватывает способы применения модуляторов функции гликопротеинового лиганда-1 P-селектина (PSGL-1) с целью предотвращения или
сокращения T-клеточно-опосредованного иммунного ответа, а также способы выделения
модуляторов функции PSGL-1.
Одной особенностью настоящего изобретения является то, что в нем предлагается
способ предотвращения или снижения опосредованного T-клетками иммунного ответа у
человека. Способ включает следующие этапы: выбор пациента, которому был поставлен
диагноз наличия или который подвержен риску приобретения заболевания, характеризующегося избыточным или нежелательным опосредованным T-клетками иммунным ответом, и введение пациенту состава, связывающегося с PSGL-1 на поверхности T-клетки,
в котором связывание соединения с PSGL-1 на поверхности T-клетки индуцирует путь
сигнальной трансдукции, вызывающей некроз T-клетки, тем самым предотвращая или
снижая опосредованный T-клетками иммунный ответ у пациента.
Соединение, используемое в таком способе, может включать антитело или его антиген-связывающий фрагмент, который специфически связывается с PSGL-1. В одном примере осуществления изобретения соединение представляет собой моноклональное
антитело, которое специфически связывается с PSGL-1. В одном примере осуществления
изобретения способ включает дополнительный этап введения агента, связывающегося с
моноклональным антителом и индуцирующим перекрестное связывание нескольких антигенов PSGL-1 на поверхности T-клетки.
5
BY 18772 C1 2014.12.30
В некоторых примерах осуществления изобретения способ включает индуцирование
перекрестного связывания множества антигенов PSGL-1 на поверхности T-клетки, в котором перекрестное связывание индуцирует путь сигнальной трансдукции, вызывающей
некроз T-клетки.
В некоторых примерах осуществления изобретения способ включает следующие этапы: (i) выбор пациента, которому был поставлен диагноз наличия или который подвержен
риску приобретения заболевания, характеризующегося избыточным или нежелательным
опосредованным T-клетками иммунным ответом, и (ii) введение пациенту мультимерного
соединения, связывающегося по меньшей мере с двумя белками PSGL-1 на поверхности
T-клетки, в котором мультимерное соединение содержит две полипептидные цепи, при
этом каждая из полипептидных цепей включает: (a) связывающий домен, связывающийся
с PSGL-1, и (b) гетерологическую аминокислотную последовательность, в котором полипептидные цепи связаны через гетерологическую аминокислотную последовательность и
образуют мультимерное соединение и в котором связывание мультимерного соединения
по меньшей мере с двумя белками PSGL-1 на поверхности T-клетки индуцирует путь сигнальной трансдукции, вызывающей некроз T-клетки, тем самым предотвращая или снижая опосредованный T-клетками иммунный ответ у пациента.
Мультимерное соединение может представлять собой гомомультимерное соединение
или гетеромультимерное соединение. Связывающий домен может произвольно включать
внеклеточный домен P-селектина или его PSGL-1 связывающий фрагмент, внеклеточный
домен E-селектина или его PSGL-1-связывающий фрагмент, внеклеточный домен
L-селектина или его PSGL-1 связывающий фрагмент, антитело анти-PSGL-1 или его
PSGL-1 связывающий фрагмент, PSGL-1 связывающий полипептид, выбранный из библиотеки фаговых дисплеев, либо сочетание любых из вышеперечисленных доменов или
фрагментов.
В некоторых примерах осуществления мультимерное соединение не включает антитело анти-PSGL-1 или фрагмент антитела, связывающийся с PSGL-1.
Гетерологическая аминокислотная последовательность может произвольно включать
область связывания рецептора клеточной поверхности, например константную область
тяжелых цепей иммуноглобулинов. В некоторых примерах осуществления изобретения
полипептидные цепи ковалентно связаны, например дисульфидно связаны через гетерологическую аминокислотную последовательность, и образуют мультимерное соединение.
В некоторых примерах осуществления изобретения способ может включать дополнительный этап введения пациенту агента, связывающегося с мультимерным соединением
через гетерологическую аминокислотную последовательность и вызывающего перекрестное связывание множества антигенов PSGL-1 на поверхности T-клетки.
В ряде примеров осуществления изобретения способ, описанный в настоящем патенте,
включает этап выбора пациента, у которого была диагностирована аутоиммунная болезнь.
В другом примере способ включает этап выбора пациента, у которого было диагностировано воспалительное заболевание. В другом примере способ включает этап выбора пациента, которому был пересажен аллогенный или ксеногенный трансплантат или ожидается
такая пересадка. В другом примере способ включает этап выбора пациента, у которого
было диагностировано аллергическое заболевание. В другом примере способ включает
этап выбора пациента, у которого был диагностирован T-клеточный рак.
В некоторых примерах осуществления изобретения T-клетка является активированной
T-клеткой. В одном примере T-клетка является CD4+T-клеткой. В другом примере T-клетка
является CD8+T-клеткой.
В некоторых примерах осуществления изобретения способ включает этап обнаружения числа T-клеток в первом биологическом образце, взятом у пациента до введения соединения (например, мультимерного соединения), и сравнение результатов с числом Tклеток во втором биологическом образце, взятом у пациента после введения соединения
(например, мультимерного соединения).
6
BY 18772 C1 2014.12.30
В ряде примеров осуществления изобретения способ включает этап обнаружения биологической активности T-клеток в первом биологическом образце, взятом у пациента до
введения соединения (например, мультимерного соединения), и сравнение результатов
биологической активности T-клеток во втором биологическом образце, взятом у пациента
после введения соединения (например, мультимерного соединения).
В некоторых примерах осуществления изобретения введение соединения приводит к
истощению по меньшей мере 10 % активированных T-клеток у пациента. В ряде примеров
осуществления введение соединения приводит к истощению по меньшей мере 10, 20, 30,
40, 50 % или более активированных T-клеток у пациента.
В некоторых примерах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или мультимерное соединение индуцирует некроз по меньшей мере
10 % активированных T-клеток у пациента после воздействия антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или мультимерного соединения. В ряде примеров осуществления изобретения введение соединения индуцирует некроз по меньшей мере 10, 20, 30, 40,
50 % или более активированных T-клеток у пациента. Некроз клеток может быть измерен
в любое время, например, спустя один, два, три, четыре, пять, шесть, семь или более дней
после воздействия антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или мультимерного
соединения.
Другой особенностью настоящего изобретения является то, что в нем предлагается
способ индуцирования некроза T-клеток или естественных клеток-киллеров (NK-клеток).
Способ включает этап обеспечения T-клетки или NK-клетки, экспрессирующей PSGL-1 на
своей клеточной поверхности, и контактирование T-клетки или NK-клетки с соединением,
связывающимся с PSGL-1 на поверхности T-клетки или NK-клетки, в котором связывание
соединения с PSGL-1 на поверхности T-клетки или NK-клетки индуцирует путь сигнальной трансдукции, вызывающей некроз T-клетки или NK-клетки.
Соединение, используемое в таком способе, может включать антитело или его антиген-связывающий фрагмент, который специфически связывается с PSGL-1. В одном примере соединение представляет собой моноклональное антитело, которое специфически
связывается с PSGL-1. В одном примере осуществления способ включает этап контактирования моноклонального антитела с агентом, связывающимся с моноклональным антителом и индуцирующим перекрестное связывание нескольких антигенов PSGL-1 на
поверхности T-клетки или NK-клетки.
В одном примере осуществления изобретения способ включает следующие этапы:
(i) обеспечение T-клетки или NK-клетки, экспрессирующей PSGL-1 на своей клеточной
поверхности, и (ii) контактирование T-клетки или NK-клетки с мультимерным соединением, связывающимся по меньшей мере с двумя PSGL-1-белками на поверхности T-клетки
или NK-клетки, в котором мультимерное соединение содержит две полипептидные цепи,
при этом каждая из полипептидных цепей включает: (a) связывающий домен, связывающийся с PSGL-1, и (b) гетерологическую аминокислотную последовательность, в котором
полипептидные цепи связаны через гетерологическую аминокислотную последовательность и образуют мультимерное соединение и в котором связывание мультимерного соединения по меньшей мере с двумя белками PSGL-1 на поверхности T-клетки или
NK-клетки индуцирует путь сигнальной трансдукции, вызывающей некроз T-клетки или
NK-клетки.
Мультимерное соединение может представлять собой гомомультимерное соединение
или гетеромультимерное соединение. Связывающий домен может произвольно включать
внеклеточный домен P-селектина или его PSGL-1 связывающий фрагмент, внеклеточный
домен E-селектина или его PSGL-1 связывающий фрагмент, внеклеточный домен
L-селектина или его PSGL-1 связывающий фрагмент, антитело анти-PSGL-1 или его
PSGL-1-связывающий фрагмент, пептид, выбранный из библиотеки фаговых дисплеев,
либо сочетание любых из вышеперечисленных доменов или фрагментов.
7
BY 18772 C1 2014.12.30
Гетерологическая аминокислотная последовательность может произвольно включать
область связывания рецептора клеточной поверхности, например константную область
тяжелых цепей иммуноглобулинов. В некоторых примерах осуществления изобретения
полипептидные цепи ковалентно связаны, например дисульфидно связаны через гетерологическую аминокислотную последовательность, и образуют мультимерное соединение.
В некоторых примерах осуществления изобретения способ включает дополнительный
этап контактирования мультимерного соединения с агентом, связывающимся с мультимерным соединением через гетерологическую аминокислотную последовательность и индуцирующим перекрестное связывание нескольких антигенов PSGL-1 на поверхности
T-клетки.
В ряде примеров осуществления изобретения способ включает этап индуцирования
перекрестной связи нескольких антигенов PSGL-1 на поверхности T-клетки или NK-клетки,
в котором перекрестное связывание индуцирует путь сигнальной трансдукции, вызывающей некроз T-клеток или NK-клеток.
В некоторых примерах осуществления способов, описанных в настоящем изобретении, T-клетка является активированной T-клеткой. В одном примере T-клетка является
CD4+T-клеткой. В другом примере T-клетка является CD8+T-клеткой.
В некоторых примерах осуществления способов, описанных в настоящем изобретении, способ включает этап оценки жизнеспособности T-клетки или NK-клетки после контактирования с соединением (например, мультимерным соединением).
В ряде примеров осуществления способов, описанных в настоящем изобретении, способ включает этап оценки биологической активности T-клетки или NK-клетки после контактирования с соединением (например, мультимерным соединением).
В ряде примеров осуществления изобретения способ включает индуцирование некроза активированной T-клетки.
Другой особенностью настоящего изобретения является то, что в нем предлагается
способ выделения модулятора функции PSGL-1. Способ включает этапы обеспечения
клетки, экспрессирующей PSGL-1 на поверхности клетки, контактирования клетки с тестовым веществом и измерения жизнеспособности клетки после контактирования клетки с
тестовым веществом с целью определения того, является ли тестовое вещество модулятором функции PSGL-1.
В одном примере осуществления изобретения способ включает этап детектирования
некроза клетки, индуцированного тестовым веществом, с целью определения того, что
тестовое вещество является модулятором функции PSGL-1.
В одном примере осуществления изобретения тестовое вещество является антителом
или его антигенсвязующим агентом, специфически связывающимся с PSGL-1. В одном
примере тестовое вещество является моноклональным антителом, которое специфически
связывается с PSGL-1. В одном примере осуществления изобретения способ включает
этап контактирования моноклонального антитела с агентом, связывающимся с моноклональным антителом и индуцирующим перекрестное связывание нескольких антигенов
PSGL-1 на поверхности клетки.
В одном примере осуществления способ включает этап индуцирования перекрестной
связи множества антигенов PSGL-1 на поверхности клетки, в котором перекрестное связывание индуцирует путь сигнальной трансдукции, вызывающей некроз клетки.
В одном примере осуществления T-клетка является активированной T-клеткой. В одном примере T-клетка является CD4+T-клеткой. В другом примере T-клетка является
CD8+T-клеткой.
В одном примере осуществления изобретения способ включает этап изготовления
большого количества исследуемого вещества и составление рецептуры исследуемого вещества в виде фармацевтически приемлемого носителя.
8
BY 18772 C1 2014.12.30
Другой особенностью настоящего изобретения является то, что в нем предлагается
набор, содержащий соединение, связывающееся с PSGL-1 на поверхности T-клетки, в котором связывание соединения с PSGL-1 на поверхности T-клетки индуцирует путь сигнальной трансдукции, вызывающей некроз T-клетки, и инструкции по использованию
соединения для лечения состояний, связанных с избыточным или нежелательным
T-клеточно-опосредованным иммунным ответом или с избыточной или нежелательной
T-клеточной пролиферацией, такой как воспаление, аутоиммунность, отторжение трансплантата, аллергические заболевания или T-клеточный рак.
В одном примере осуществления изобретения набор включает: (i) мультимерное соединение, связывающееся по меньшей мере с двумя PSGL-1 белками на поверхности
T-клетки, в котором мультимерное соединение содержит две полипептидные цепи, при
этом каждая из полипептидных цепей включает: (a) связывающий домен, связывающийся
с PSGL-1, и (b) гетерологическую аминокислотную последовательность, в котором полипептидные цепи связаны через гетерологическую аминокислотную последовательность и
образуют мультимерное соединение и в котором связывание мультимерного соединения
по меньшей мере с двумя белками PSGL-1 на поверхности T-клетки индуцирует путь сигнальной трансдукции, вызывающей некроз T-клетки; и (ii) инструкции по использованию
соединения для лечения состояний, связанных с избыточным или нежелательным
T-клеточно-опосредованным иммунным ответом или с избыточной или нежелательной
T-клеточной пролиферацией, такой как воспаление, аутоиммунность, отторжение трансплантата, аллергические заболевания или T-клеточный рак.
Преимущество настоящего изобретения заключается в том, что обеспечивается индуцирование истощения T-клеток и/или апоптоз в T-клетках, не вызывая сопутствующего
нежелательного или вредного иммунного ответа. Например, в ряде примеров осуществления введение пациенту антитела анти-PSGL-1 или мультимерного соединения, описанного
в настоящем патенте, не вызывает нежелательного повышения уровней воспалительных
цитокинов, таких как IL-2 или TNF-alpha.
Другое преимущество изобретения заключается в том, что вызывается истощение
T-клеток за счет использования агонистических составов, индуцирующих апоптоз
T-клеток. Соответственно, в изобретении предлагаются, скорее, активные иммунносупрессивные способы, а не пассивная иммунносупрессия, вызываемая в результате использования антагонистических составов (например, антагонистических анти-PSGL-1 антител
или антагонистических растворимых фрагментов селектина), которые действуют путем
связывания иммунных рецепторов и предотвращения иммунной активации, опосредованной такими рецепторами.
Еще одно преимущество настоящего изобретения заключается в том, что обеспечивается нацеливание белка клеточной поверхности, PSGL-1, экспрессия которого ограничена
главным образом лейкоцитами и, в частности, T-клетками и NK-клетками. Таким образом,
соединения, описанные в настоящем изобретении, обычно не индуцируют значительные
уровни апоптоза других типов клеток, таких как клетки печени. Нацеливание T-клеток и
NK-клеток (важный тип клеток CD3, участвующий в трансплантационном отторжении)
для селективного отторжения, не вызывая существенного индуцирования ответов опасных
для жизни системных цитокинов или разрушения других систем органов, является желательной характеристикой иммунносупрессивного агента.
Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют одно и то же значение, которое обычно понятно специалистам в
данной области техники, к которой относится настоящее изобретение. Несмотря на то что
способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем патенте, могут быть применены для практического использования или испытания
изобретения, приемлемые способы и материалы описаны ниже. Все публикации, заявки на
выдачу патентов, патенты и иные справочные материалы, упомянутые в данном описании,
9
BY 18772 C1 2014.12.30
указываются в ссылках. В случае расхождения в терминологии описание настоящего изобретения следует принимать за контрольный образец. Кроме того, описанные материалы и
способы являются исключительно иллюстративными и не являются ограничивающими.
Другие особенности и преимущества настоящего изобретения очевидны из следующего ниже описания и формулы изобретения.
Краткое описание фигур.
Фиг. 1 - результаты динамического эксперимента, в ходе которого исследовалось, когда активированные T-клетки приобретают чувствительность к TAB4 (анти-PSGL-1 моноклональное антитело) - опосредованным апоптотическим сигналам.
Фиг. 2 - результаты биотинилирования и иммунопреципитации клеточной поверхности антигена, распознанного антителом TAB4.
Фиг. 3 - экспрессия антигена PSGL-1 на CD4+T-клетках, CD8+T-клетках, CD19+B-клетках селезенки и NK-клетках.
Фиг. 4 - экспрессия антигена PSGL-1 на тимоцитах CD4+, CD8+и CD4+8+и CD4-8.
Фиг. 5 - уровни IL-2, полученные в смешанной культуре лимфоцитов с использованием клеток селезенки, выделенных из мышей Balb/c (или хомячков Ig), прошедших лечение
TAB4 в качестве респондеров и H2-некомлементарных C3H клеток селезенки в качестве
стимулятора.
Фиг. 6 - вестерн-блот анализы, демонстрирующие, что (A) белки, иммунопреципитированные антителом TAB4, могут быть распознаны серийно выпускаемым анти-PSGL-1
антителом и (B) предварительная очистка лизата T-клеток с помощью анти-PSGL-1 антитела может истощить белки, распознанные TAB4.
Фиг. 7 - процент выживающих трансплантатов у мышей C57BL/6, получивших кожный трансплантат от мышей Balb/c и прошедших лечение анти-PSGL-1 антителом (черный ромб) или контрольным антителом (белый квадрат).
Фиг. 8 - процент апоптотических T-клеток в зависимости от времени после проведения лечения активированных мононуклеаров периферической крови человека античеловеческим PSGL-1 антителом.
Фиг. 9 - частотность диабета у аутоиммунных нетучных самцов мышей с диабетом
(NOD), прошедших лечение анти-PSGL-1 антителом (черный квадрат) или контрольным
антителом (белый квадрат).
Фиг. 10 - связывание мышиного P-селектина, E-селектина и L-селектина с мышиными
активированными T-клетками.
Фиг. 11A-11C - индукция апоптоза мышиных активированных T-клеток мультимерными формами E-селектина (фиг. 11A), P-селектина (фиг. 11B) и L-селектина (фиг. 11C).
Фиг. 12 - индукция апоптоза мышиных активированных T-клеток in vitro путем перекрестного связывания слитого белка растворимого P-селектина-Fc.
В изобретении предлагаются способы модулирования активности T-клеток путем модулирования функции PSGL-1 молекул, находящихся на поверхности T-клетки. Взаимодействие PSGL-1 с агонистическими составами, описанными в настоящем изобретении,
может вызвать истощение T-клеток и (или) индуцировать процесс апоптоза T-клеток. Таким образом, эти агонистические составы являются эффективными в качестве терапевтических агентов для лечения иммунологических заболеваний, таких как воспалительные
заболевания, аутоиммунные болезни, отторжение трансплантата, аллергические болезни и
(или) различные виды рака, вызываемые T-клетками. Агонистические составы также являются эффективными при вызывании истощения T-клеток из любого биологического образца, в котором присутствие или активность T-клеток являются нежелательными.
Белок гликопротеинового лиганда-1 P-селектина (PSGL-1).
PSGL-1 является адгезионной молекулой клеточной поверхности, экспрессированной
на нейтрофилах, T- и B-лимфоцитах, NK-клетках, моноцитах, дендрических клетках и человеческих стволовых CD34 кроветворных клетках-предшественниках. Благодаря своей
10
BY 18772 C1 2014.12.30
способности взаимодействовать с селектинами, PSGL-1 опосредует роллинг лейкоцитов
на эндотелии и экстравазацию лейкоцитов в воспаленные ткани. PSGL-1 опосредованное
связывание T-клеток с E- и P-селектином, или миграция, регулируется дифференциально.
Например, считалось, что появление эпитопа кожного лимфоцитного антигена (CLA) индуцировалось на T-клетках, подвергающих переходы от интактных клеток к клеткам памяти. Только активированные T-клетки-хелперы 1, но не хелперы 2 экспрессируют
функциональный PSGL-1, и он в состоянии мигрировать в воспаленную область кожи.
PSGL-1 является сиаломуцином, который должен быть специфично сиалилирован,
фукозилирован и сульфирован для связывания с P-селектином. Молекула PSGL-1 существует в изоформах, характеризующихся различной степенью сайтов гликозилирования и
сульфатирования на их N-концах. Покоящиеся T- и B-клетки периферической крови, линии лимфоидных клеток и in vitro активированные T-клетки периферической крови экспрессируют аналогичный уровень PGSL-1. Тем не менее только активированные T-клетки
проявляют функциональную форму PSGL-1 и охотно связываются с P-селектином. Такая
связывающая активность, зависящая от активации, оказывается результатом дифференциальной посттрансляционной модификации, на что указывают повышенные уровни активностей альфа (1, 3) фукозитрансфераз в активированных T-клетках. Изоформы PSGL-1
также демонстрируют дифференциальное сродство с L-селектином и E-селектином. Например, человеческие T-клетки, проявляющие CLA-позитивную изоформу, могут связываться и закатывать как E-, так и P-селектин, в то время как T-клетки, экспрессирующие
PSGL-1 без CLA эпитопа, связываются только с P-селектином. Кроме того, связывание
PSGL-1 с P-селектином зависит от присутствия концевого декапептида, содержащего три
остатка тирозина для сульфатирования и один остаток треонина для гликозилирования.
Белок PSGL-1 может быть получен с использованием рекомбинантных способов и
(или) путем выделения нативного белка PSGL-1 из биологического материала. Рекомбинантный белок PSGL-1 может быть получен в прокариотических или эукариотических
клетках либо in vitro, либо in vivo. Нуклеиновые кислоты, кодирующие PSGL-1, могут
быть использованы для рекомбинантного получения белка (см., например, GenBank™ Accession NM_003006 для поиска примера нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид
PSGL-1). Антитела, направленные на PSGL-1, также хорошо известны и могут быть использованы для очистки антигена [Herron et al., 2000. Science Jun 2; 288 (5471): 1653-56;
WO 00/25808] и (или) использованы в способах, приведенных в настоящем описании.
Описание PSGL-1 далее дается со ссылками на Sako et al., 1993. Cell 75: 1179; Vachino et
al., 1995. J. Biol. Chem. 270: 21966; и Veldman et al., 1995. J. Biol. Chem. 270: 16470, но не
ограничивается ими.
Для рекомбинантного получения PSGL-1 может потребоваться одновременная экспрессия как PSGL-1, так и его модифицирующей альфа (1, 3) фукозилтрансферазы, FucTVII, для функциональной экспрессии PSGL-1. Кроме того, дополнительно рекомбинантное получение PSGL-1 может сопровождаться ко-трансфекцией с нуклеиновой кислотой,
кодирующей PACE для удаления пептида и (или) нуклеиновой кислоты, кодирующей тирозин сульфотрансферазу.
Анти-PSGL-1 антитело может быть использовано для выделения и очистки антигена
PSGL-1 от биологического материала. Любой тип клетки, экспрессирующий белок PSGL-1,
например T-клетки, полученные от отдельной линии или линии T-клеток, может быть использован в качестве белка. После очистки белок может быть использован в различных
способах, приведенных в настоящем описании. Например, очищенный белок PSGL-1 может быть использован в тестах модуляторов функций PSGL-1 на T-клетках или в качестве
иммуногена для получения антител, направленных против белка.
Анти-PSGL-1 антитела.
Полипептиды PSGL-1 (или их иммуногенетические фрагменты или аналоги) могут
быть использованы для получения антител, применяемых в способах настоящего изобре11
BY 18772 C1 2014.12.30
тения. Как описывалось выше, полипептиды PSGL-1 или их пептидные фрагменты могут
быть получены с использованием рекомбинантных технологий или синтезированы с использованием способов твердофазного синтеза. Рекомбинантные полипептиды PSGL-1
или их пептидные фрагменты могут быть использованы в качестве иммуногена для получения анти-PSGL-1 антител. Кроме того, анти-PSGL-1 антитело, такое как моноклональное
антитело TAB4, может быть использовано для очистки полипептида PSGL-1, например
полипептида PSGL-1 в его естественной конформации, который затем может быть использован в качестве иммуногена для получения дополнительных анти-PSGL-1 антител.
Антитело в соответствии с настоящим изобретением может быть моноклональным,
поликлональным или рекомбинантным антителом, специфически связывающимся с полипептидом PSGL-1. Антитело, "специфически связывающееся" с конкретным антигеном,
например полипептидом PSGL-1, в основном не распознает другие молекулы в образце и
не связывается с другими молекулами. Следовательно, в изобретении также предлагаются
способы идентификации тест-соединения (например, антитело), которое связывается с полипептидом в соответствии с настоящим изобретением путем контактирования полипептида с тестируемым соединением и путем определения того, связывается ли пептид с
тестируемым соединением (например, путем прямого обнаружения связывания, обнаружения конкурирующей молекулы, прерывающей связывание тестируемого соединения с
полипептидом и (или) обнаружения связывания с помощью анализа для активности, индуцирующей апоптоз).
В основном полипептиды PSGL-1 могут связываться с белком-носителем, таким как
KLH, смешанным с адъювантом и инъецированным в млекопитающее-хозяина. Антитела,
полученные в этом животном, далее можно очищать с помощью аффинной хроматографии пептидных антигенов.
В частности, различные животные-хозяева могут быть иммунизированы путем инъекции полипептида PSGL-1 или его антигенного фрагмента. Широко используемые животные-хозяева включают кроликов, мышей, морских свинок и крыс. Различные адъюванты,
которые могут быть использованы для повышения иммунологического ответа, зависят от
вида хозяина и включают адъювант Фрейнда (полный или неполный), минеральные гели,
такие как гидроокись алюминия, поверхностно-активные вещества, BCG (бацилла Кальметта-Герена) и Corynebacterium parvum. Поликлональные антитела являются гетерогенными популяциями молекул антител, содержащихся в сыворотках иммунизированных
животных.
Таким образом, антитела в рамках настоящего изобретения включают поликлональные антитела и, кроме того, моноклональные антитела, гуманизированные или химерические антитела, одноцепочные антитела, Fab фрагменты, F (ab') 2 фрагменты и молекулы,
полученные с использованием библиотеки экспрессируемых последовательностей Fab.
Моноклональные антитела, которые являются гомогенными популяциями в отношении конкретного антигена, могут быть получены с использованием полипептидов PSGL-1,
описанных выше, и стандартной гибридомной технологии [Kohler et al. Nature. - V. 256. P. 495. - 1975; Kohler et al. Eur J Immunol. - No. 6. - P. 511. - 1976; Kohler et al. Eur J Immunol. - No. 6. - P. 292. - 1976; Hammerling et al. Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,
Elsevier N. Y. - 1981].
В частности, моноклональные антитела могут быть получены на основе любой технологии, предусматривающей получение молекул антител с помощью непрерывных линий
клеток в культуре, описанной в [Kohler et al. Nature. - V. 256. - P. 495. - 1975, и патенте
США 4, 376, 110]; гибридомной технологии B-клетки человека [Kosbor et al. Immunology
Today. - No. 4. - P. 72. - 1983; Cole et al. Proc Natl Acad Sci USA. - No. 80. - P. 2026. - 1983],
и EBV-гибридомной технологии [Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,
Alan R. Liss, Inc. - P. 77-96. - 1983]. Такие антитела могут являться антителами любого
класса иммуноглобулинов, включая IgG, IgM, IgE, IgA, IgD и их любой подкласс. Гибри12
BY 18772 C1 2014.12.30
дома, обеспечивающая получение mAb в соответствии с настоящим изобретением, может
быть культивирована in vitro или in vivo. Способность производить высокие титры mAb in
vivo обеспечивает исключительную эффективность способа производства.
После получения проводится тестирование поликлональных или моноклональных антител на специфическое распознавание PSGL-1 с помощью вестерн-блот-анализа или анализа иммунопреципитации на основе стандартных способов, например, описанных в
Ausubel et al., supra. Антитела, специфически распознающие PSGL-1 и связывающиеся с
ним, являются эффективными в настоящем изобретении. Анти-PSGL-1 антитела, связывающиеся с антигеном PSGL-1 на поверхности T-клетки, например CD3+клетки, и индуцирующие истощение и (или) апоптоз T-клеток у пациента, являются исключительно
эффективными.
Антитела могут найти применение, например, в качестве части- терапевтического режима (например, для снижения или элиминации нежелательного иммунного ответа, например опосредованного T-клеткой иммунного ответа, связанного с такими состояниями,
как воспалительные заболевания, аутоиммунные болезни, отторжение трансплантата, аллергические болезни и различные виды рака, вызываемые T-клетками). Антитела также
могут быть использованы при проведении скринингового анализа для определения способности соединений-кандидатов связываться с PSGL-1.
Кроме того, могут быть использованы технологии, разработанные для производства
"химерных антител" [Morrison et al. Proc Natl Acad Sci USA. - No. 81. - P. 6851. - 1984;
Neuberger et al. Nature. - V. 312. - P. 604. - 1984; Takeda et al. Nature. - V. 314. - P. 452. 1984] путем сплайсинга генов от молекулы мышиного антитела соответствующей антигенной специфичности вместе с генами от молекулы человеческого антитела соответствующей биологической активности. Химерическое антитело является молекулой, в которой
различные части получены от различных видов животных, например имеющих вариабельную область, полученную от мышиного моноклонального антитела и константной области
человеческих иммуноглобулинов.
Кроме того, технологии, описание которых приведено для производства одноцепочных антител [патенты США 4,946,778, 4,946,78 и 4,704,692], могут быть применены для
производства одноцепочных антител против полипептида PSGL-1 или его фрагмента. Одноцепочные антитела формируют путем связывания фрагментов тяжелой и легкой цепи
области Fv через аминокислотный мостик, в результате чего получают одноцепочный полипептид.
Фрагменты антител, распознающие специфические эпитопы и связывающиеся с ними,
могут быть получены с использованием известных технологий. Например, такие фрагменты включают F (ab') 2 фрагменты, которые могут быть получены путем ферментативного
гидролиза пепсином молекулы антитела, и фрагменты Fab, которые могут быть получены
путем восстановления дисульфидных мостиков фрагментов F (ab') 2, но не ограничены
ими. Кроме того, могут быть созданы библиотеки экспрессируемых последовательностей
Fab [Huse et al. Science. - V. 246. - P. 1275. - 1989] с целью обеспечения оперативной и
простой идентификации моноклональных фрагментов Fab с требуемой специфичностью.
Антитела могут быть гуманизированы с использованием известных в данной области
техники способов. Например, моноклональные антитела с требуемой связывающей специфичностью могут быть гуманизированы промышленным способом [Scotgene, Scotland;
Oxford Molecular, Palo Alto, Calif]. Полностью человеческие антитела, такие как антитела,
экспрессированные у трансгенных животных, также являются характерными признаками
изобретения [Green et al Nature Genetics. - No. 7. - P. 13. - 1994 и патенты США 5,545,806 и
5,569,825].
Мультимерные соединения/
Мультимерные соединения, связывающиеся с несколькими белками PSGL-1 на поверхности T-клеток или NK-клеток, могут быть использованы для индуцирования апоптоза в клетке. Мультимерное соединение содержит по меньшей мере две полипептидные
13
BY 18772 C1 2014.12.30
цепи. Каждая из полипептидных цепей содержит: (i) связывающий домен, связывающийся
с PSGL-1, и (ii) гетерологическую аминокислотную последовательность.
В целом, мультимерное соединение связывается по меньшей мере с двумя различными белками PSGL-1 на поверхности данной клетки. Тем не менее мультимерное соединение может сформулировано таким образом, чтобы иметь 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или
более четко выраженных PSGL-1 связывающих доменов, тем самым вызывая связывание
мультимерного соединения с 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, или более различными белками
PSGL-1 на поверхности данной клетки.
Связывающий домен может содержать любую аминокислотную последовательность
(или любую аминокислотную последовательность с модификацией, такой как, например,
гликозилирование и (или) сульфатирование), связывающуюся с PSGL-1. Связывающий
домен может соответствовать либо природной, либо неприродной аминокислотной последовательности. Например, связывающий домен может содержать PSGL-1 связывающий
домен селектина (например, P-селектина, E-селектина или L-селектина). Полипептид, содержащий PSGL-1 связывающий домен селектина, может произвольно включать: (i) внеклеточный домен селектина (например, P-селектин, E-селектин или L-селектин); (ii)
кальций-зависимый лектиновый домен селектина (например, P-селектин, E-селектин или
L-селектин) или (iii) фрагмент внеклеточного домена селектина (например, P-селектин,
E-селектин или L-селектин), опосредующий связывание с PSGL-1. Дополнительно к этим
природным аминокислотным последовательностям одна или несколько аминокислотных
мутаций могут быть введены в природный PSGL-1 связующий домен, в результате чего
получают неприродную последовательность, сохраняющую PSGL-1 связывающую функцию. Например, полипептид может содержать аминокислотную последовательность, которая связывается с PSGL-1 и по меньшей мере идентична на 80, 85, 90, 95 или 98 %
любому из: (i) внеклеточных доменов селектина (например, P-селектин, E-селектин или
L-селектин); (ii) кальций-зависимых лектиновых доменов селектина (например, P-селектин, E-селектин или L-селектин) или (iii) фрагментов внеклеточного домена селектина
(например, P-селектин, E-селектин или L- селектин), опосредующих связывание с PSGL-1.
Для введения мутаций в последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей PSGL-1связующий домен, могут быть использованы стандартные технологии мутагенеза молекулярной биологии. Далее модифицированные связывающие домены могут быть протестированы на их способность связываться с PSGL-1, например иммобилизированный PSGL-1
или PSGL-1 на поверхности клетки. Связующий домен также может содержать PSGL-1
связующий домен анти-PSGL-1 антитела или полипептид, выбранные из библиотеки фаговых дисплеев, или аминокислотную последовательность, связывающуюся с PSGL-1 и
являющуюся идентичной по меньшей мере на 80, 85, 90, 95 или 98 % PSGL-1 связывающему домену анти-PSGL-1 антитела или полипептиду, выбранному из библиотеки фаговых дисплеев.
PSGL-1 связующий домен может содержать аминокислотную последовательность, соответствующую PSGL-1 связующему фрагменту P-селектина. Примером полипептидной
цепи (мультимерное соединение, описанное в настоящем патенте), содержащей такую
аминокислотную последовательность, может служить рекомбинантный мышиный P-селектин/Fc химера (поставляемый R&D Systems, Minneapolis, MN), содержащий следующие компоненты: (i) CD33 сигнальный пептид (Metl-Alal6); (ii) мышиный P-селектин
(Trp42-Ala709 внеклеточного домена); (iii) IEGRMD (SEQ ID NO: 1); и (iv) IgGI человека
(Pro100-Lys330). Вторым примером полипептидной цепи, содержащей такую аминокислотную последовательность, является рекомбинантный P-селектин человека/Fc химера
(поставляемый R&D Systems, Minneapolis, MN), содержащий следующие компоненты:
(i) P-селектин человека (Metl-Ala771, внеклеточный домен); (ii) IEGRMD (SEQ ID NO: 1);
(iii) IgG1 человека (Pro100-Lys330).
14
BY 18772 C1 2014.12.30
PSGL-1-связующий домен может содержать аминокислотную последовательность, соответствующую PSGL-1-связующему фрагменту E-селектина. Примером полипептидной
цепи (мультимерное соединение, описанное в настоящем патенте), содержащей такую
аминокислотную последовательность, может служить рекомбинантный мышиный
P-селектин/Fc химера (поставляемый R&D Systems, Minneapolis, MN), содержащей следующие компоненты: (i) мышиный E-селектин (Metl-Pro557, внеклеточный домен);
(ii) IEGRMD (SEQ ID NO: 1); (iii) IgGI человека (Pro100-Lys330); и (iv) HHHHHH
(SEQ ID NO: 2). Вторым примером полипептидной цепи, содержащей такую аминокислотную последовательность, является рекомбинантный E-селектин человека/Fc химера
(поставляемый R&D Systems, Minneapolis, MN), содержащий следующие компоненты: (i)
E-селектин человека (Metl-Pro556, внеклеточный домен); (ii) IEGRMD (SEQ ID NO: 2);
(iii) IgGI-человека (Pro100-Lys330) и (iv) HHHHHH (SEQ ID NO: 2).
PSGL-1 связующий домен может содержать аминокислотную последовательность, соответствующую PSGL-1 связующему фрагменту L-селектина. Примером полипептидной
цепи (мультимерное соединение, описанное в настоящем патенте), содержащей такую
аминокислотную последовательность, может служить рекомбинантный мышиный
L-селектин/Fc химера (поставляемый R&D Systems, Minneapolis, MN), содержащий следующие компоненты: (i) мышиный L-селектин (Metl-Asn332, внеклеточный домен);
(ii) IEGRMD (SEQ ID NO: 1); (iii) IgGI человека (Pro100-Lys330); b (iv) HHHHHH
(SEQ ID NO: 2). Вторым примером полипептидной цепи, содержащей такую аминокислотную последовательность, является рекомбинантный L-селектин человека /Fc химера
(поставляемый R&D Systems, Minneapolis, MN), содержащий следующие компоненты: (i)
L-селектин человека (Metl-Asn332, внеклеточный домен); (ii) IEGRMD (SEQ ID NO:1);
(iii) IgGI человека (Pro100-Lys330); (iv) HHHHHH (SEQ ID NO: 2).
Мультимерное соединение может быть сформулировано в виде гомомультимерного
соединения или гетеромультимерного соединения. Гомомультимерное соединение содержит только полипептидные цепи, имеющие идентичные PSGL-1 связующие домены. Например, гомомультимерное соединение может содержать полипептидные цепи,
содержащие идентичные PSGL-1 связующие фрагменты P-селектина. Гетеромультимерное соединение содержит полипептидные цепи, имеющие различные PSGL-1 связующие
домены. Например, гетеромультимерное соединение может содержать первую полипептидную цепь, содержащую PSGL-1 связующий фрагмент P-селектина, и вторую полипептидную цепь, содержащую PSGL-1 связующий фрагмент E-селектина.
Гетерологическая аминокислотная последовательность может представлять собой
любую аминокислотную последовательность. Тем не менее аминокислотная последовательность полипептидных цепей, описанная в настоящем патенте, не соответствует последовательности природного белка. Гетерологическая аминокислотная последовательность
содержит одну или несколько аминокислот, обеспечивающих связывание полипептидных
цепей. Например, одна или несколько аминокислот могут ковалентно связывать полипептидные цепи, например, через дисульфитную связь. Одним примером гетерологической
последовательности является константная область тяжелых цепей иммуноглобулинов.
Дисульфидное связывание между Fc областями двух полипептидных цепей может привести к образованию димерного соединения.
Гетерологическая аминокислотная последовательность, кроме того, что она способствует связыванию полипептидных цепей, также может содержать кросс-линкерную связывающую область, например, область связывания рецептора клеточной поверхности. После
связывания агента с такой областью связывания может произойти перекрестное сшивание
полипептидных цепей и белков PSGL-1 клеточной поверхности, с которыми они связаны.
Константная область тяжелых цепей иммуноглобулинов содержит область связывания Fc
рецептора. Кросс-линкер может представлять собой, например, антитело (например, анти-Fc
антитело), специфически связывающееся с кросс-линкерной связующей областью гетерологической аминокислотной последовательности.
15
BY 18772 C1 2014.12.30
Скрининговые анализы соединений, модулирующих PSGL-1-функцию.
Настоящее изобретение также охватывает способы определения соединений, взаимодействующих с PSGL-1 (или доменом PSGL-1), включая соединения, индуцирующие истощение
T-клеток и (или) апоптоз T-клеток после связывания с PSGL-1, но не ограничивающиеся
ими. Также в этот перечень включены соединения, модулирующие взаимодействие PSGL-1
с трансмембранными, внеклеточными или внутриклеточными белками, регулирующими
активность PSGL-1, и соединения, модулирующие активность PSGL-1.
Соединения, которые могут быть подвергнуты скриниговому анализу в соответствии с
настоящим изобретением, включают пептиды, антитела и их фрагменты и иные органические соединения, связывающиеся с PSGL-1 и модулирующие биологическую функцию,
опосредованную PSGL-1, в соответствии с приведенным здесь описанием, но не ограничены ими.
Такие соединения могут включать пептиды, такие как, например, растворимые пептиды,
но не ограничиваются ими, включая библиотеки случайных пептидов, не ограничиваясь
ими [Lam et al. Nature. - V. 354. - P. 82. - 1991; Houghten et al. Nature. - V. 354. - P. 84. 1991], и комбинаторную химически полученную молекулярную библиотеку, составленную из аминокислот D- и (или) L-конфигурации, фосфопептидов (включая членов случайных или частично дегенерированных, направленных полипептидных библиотек, но не
ограничиваясь ими [Songyang et al. Cell. - V. 72. - P. 767. - 1993], антитела (включая поликлональные, моноклональные, гуманизированные, антиидиотические, химерные или одноцепочные антитела и фрагменты библиотек последовательностей FAb, F (ab') 2 FAb и
их эпитоп-cвязующие фрагменты, но не ограниченные ими) и органические и неорганические малые молекулы.
Другие соединения, которые могут быть отобраны в соответствии с настоящим изобретением, включают органические малые молекулы, влияющие на активность белка
PSGL-1, как описано в данном патенте, но не ограничены ими.
Компьютерное моделирование и поисковые технологии позволяют определить соединения или усовершенствовать уже определенные соединения, которые способны модулировать экспрессию или активность PSGL-1. После определения такого соединения или
состава проводится определение активных сайтов или областей. Такие активные сайты
могли бы обычно представлять собой связующий сайт для природного модулятора активности. Активный сайт может быть определен с использованием способов, известных в
данной области техники, включающих, например, определение исходя из аминокислотной
последовательности пептидов, исходя из нуклеотидной последовательности нуклеиновых
кислот или путем исследования комплексов соответствующего соединения или состава с
его природным лигандом. В последнем случае химические или рентгеновские кристаллографические способы могут быть использованы для выявления активного сайта путем обнаружения того, где на факторе находится модулятор (или лиганд).
Кроме описанных выше соединений со ссылками на дизайн и получение соединений,
которые могли бы изменить связывание, можно также выделить библиотеки известных
соединений, включая природные продукты или синтетические химические вещества и
биологически активные материалы, включая белки, для соединений, связывающихся с
белком PSGL-1 и вызывающим истощение T-клеток и (или) апоптоз T-клеток.
Могут быть созданы системы in vitro для определения соединений, способных взаимодействовать с PSGL-1 (или доменом PSGL-1). Определенные соединения могут быть
эффективными, например, при модулировании активности T-клеток в соответствии с приведенным здесь описанием и, следовательно, могут быть эффективными для лечения
заболеваний, связанных с избыточным или нежелательным иммунным ответом, опосредованным T-клетками, или избыточной или нежелательной пролиферацией T-клеток,
таких как воспаление, аутоиммунность, отторжение трансплантата, аллергическое заболевание или T-клеточный рак.
16
BY 18772 C1 2014.12.30
Принцип анализов, используемых для определения соединений, связывающихся с
PSGL-1, включает приготовление реакционной смеси PSGL-1 (или его домена) и пробного
соединения при условиях и в течение времени, достаточных для того, чтобы произошло
взаимодействие двух компонентов и их связывание, в результате чего образуется комплекс, который может быть удален и/или обнаружен в реакционной смеси. Используемые
виды PSGL-1 могут изменяться в зависимости от цели скринингового анализа. В ряде ситуаций предпочтительно использовать пептид, соответствующий домену PSGL-1, слитому с гетерологическим белком или полипептидом, что обеспечивает использование преимуществ
в аналитической системе (например, мечение, выделение полученного комплекса и т.д.).
Скрининговые анализы могут быть проведены различными способами. Например,
один способ проведения такого анализа включает фиксирование белка PSGL-1, полипептида, пептида или слитого белка или пробного вещества на твердой фазе и обнаружение
PSGL-1-комплексов пробного соединения, зафиксированных на твердой фазе, на конечной стадии реакции. В одном примере осуществления такого метода реактант PSGL-1 может быть зафиксирован на твердой поверхности, в то время как пробное соединение,
остающееся незафиксированным, может быть помечено либо прямо, либо косвенно.
На практике титрационные микропланшеты могут быть с успехом использованы в качестве твердой фазы. Фиксированный компонент может быть иммобилизирован путем нековалентных или ковалентных связываний. Нековалентное связывание может быть
достигнуто путем простого нанесения на твердую поверхность раствора белка и высушивания этого раствора. В другом примере иммобилизированное антитело, предпочтительно
моноклональное антитело, специфичное для иммобилизируемого белка, может быть использовано для фиксации белка на твердой поверхности. Поверхность может быть предварительно подготовлена и находиться на хранении.
Для проведения анализа иммобилизированный компонент наносят на поверхность с
покрытием, содержащим фиксированный компонент. После завершения реакции непрореагировавшие компоненты удаляют (например, путем промывки) при таких условиях,
чтобы любые сформированные комплексы оставались иммобилизированными на твердой
поверхности. Обнаружение комплексов, фиксированных на твердой поверхности, может
быть осуществлено с использованием ряда способов.
В тех случаях, когда ранее неиммобилизированный компонент является предварительно помеченным, обнаружение метки, иммобилизированной на поверхности, указывает
на формирование комплексов. В тех случаях, когда ранее неиммобилизированный компонент не является предварительно помеченным, косвенная метка может быть использована
для обнаружения комплексов, фиксированных на поверхности, например, используя меченое антитело, специфичное для ранее неиммобилизированного компонента (антитело, в
свою очередь, может быть прямо помечено или косвенно помечено помеченным анти-Ig
антителом).
В другом примере реакцию можно проводить в жидкой фазе, продукты реакции отделяют
от непрореагировавших компонентов и проводят обнаружение комплексов, например, используя иммобилизированное антитело, специфичное для белка PSGL-1, полипептида,
пептида, или слитого белка, или пробного соединения для фиксации в растворе любых
образовавшихся комплексов, и используя меченое антитело для другого компонента возможного комплекса для обнаружения фиксированных комплексов.
В другом примере может быть использован клеточный анализ для определения соединений, взаимодействующих с PSGL-1. С этой целью могут быть использованы клеточные
линии, экспрессирующие PSGL-1, или клеточные линии, созданные путем генной инженерии
для экспрессии PSGL-1. Клеточные анализы являются исключительно эффективными для
оценки функциональных эффектов соединений, обнаруженных путем вышеописанного
скрининга. Например, после обнаружения соединения на основе его способности связываться с белком PSGL-1 соединение далее может быть проанализировано на его способ17
BY 18772 C1 2014.12.30
ность, например, вызывать апоптоз T-клеток in vitro или in vivo либо истощение T-клеток
in vitro или in vivo.
Фармацевтические составы.
Учитывая тот факт, что целью настоящего изобретения является изменение иммунного ответа у человека, характерным признаком настоящего изобретения также является
фармацевтический состав, содержащий, например, антитела, мультимерные соединения,
малые молекулы или иные соединения, специфически связывающиеся с полипептидами
PSGL-1. В предпочтительном примере соединение выполняет функцию агониста PSGL-1.
Фармацевтические составы, предназначенные для использования в соответствии с настоящим изобретением, могут быть изготовлены по формуле обычным способом с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей или
наполнителей. Следовательно, соединения и их физиологически приемлемые соли и сольвенты могут быть изготовлены для обеспечения их введения пациенту различными способами.
Соединения могут быть приготовлены для парентерального введения путем инъекций,
например путем инъекции ударной дозы вещества или продолженной инфузии. Лекарственные формы для инъекции могут быть представлены в форме единичной дозы, например в форме ампул или в форме упаковки лекарственных средств для многократного
приема с добавленными консервантами. Составы могут быть выполнены в таких формах,
как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных растворителях, и могут содержать такие рецептурные вещества, как суспензирующие, стабилизирующие и (или)
диспергирующие вещества. В другом примере активный ингредиент может находиться в
порошкообразной форме для образования состава с приемлемым растворителем, например стерилизованной апирогенной водой до его применения.
Способы контролирования T-клеточно опосредованного иммунного ответа и истощения популяций T-клеток.
Соединения, такие как подробно представленные в скрининговых анализах, описанных в настоящем патенте, могут быть эффективными, например, при модулировании биологической функции, опосредованной полипептидом PSGL-1 и (или) для лечения
заболеваний, связанных с избыточным или нежелательным иммунным ответом, например
опосредованным T-клетками иммунным ответом. Указанные соединения включают пептиды, антитела и их фрагменты и иные органические соединения, связывающиеся с PSGL1 на поверхности T-клетки и образующие путь сигнальной трансдукции, вызывающей
апоптоз T-клетки, но не ограничены ими. Способ в соответствии с настоящим изобретением произвольно включает добавление перекрестно связующего агента, вызывающего
перекрестное связывание PSGL-1 на поверхности клетки. Описанные в настоящем патенте
соединения могут быть использованы в любом случае, в котором желательным является
истощение или элиминация активности T-клеток. Исключительно эффективное лечение
заболеваний с использованием соединений в соответствии с настоящим изобретением
включает лечение таких заболеваний, как воспалительные заболевания, аутоиммунные
болезни, отторжение трансплантата, аллергические болезни и различные виды рака, вызываемые T-клетками.
Примеры заболеваний, которые можно лечить с использованием анти-PSGL-1 соединений, описанных в настоящем патенте, включают сахарный диабет, артрит (включая
ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, остеоартрит и псориатрический
артрит), рассеянный склероз, энцефаломиелит, миастению gravis, системную красную
волчанку, аутоиммунный тиреоидит, дерматит (включая атопический дерматит и экзематозный дерматит), псориаз, сидром Шегрена, болезнь Крона, афтозную язву, ирит, конъюнктивит, кератоконъюнктивит, диабет I типа, воспалительные болезни кишечника,
язвенный колит, астму, аллергическую астму, кожную красную волчанку, склеродермию,
вагинит, проктит, медикаментозную сыпь, реверсивные реакции лепры, нодозную эритема
18
BY 18772 C1 2014.12.30
leprosum, аутоиммунный увеит, аллергический энцефаломиелит, острую некротическую
геморрагическую энцефалопатию, идиопатическую прогрессирующую нейросенсорную
тугоухость, апластическую анемию, истинную эритроцитарную анемию, идиопатическую
тромбоцитопению, полихондрию, грануломатоз Вегенера, хронический активный гепатит,
синдром Стивенса-Джонсона, идиопатическую спру, красный плоский лишай, базедову
болезнь, саркоидоз, биллиарный первичный цирроз печени, задний увеит, интерстициальный фиброз легких, гомологичную болезнь, случаи трансплантации (включая трансплантацию с использованием аллогенных и ксеногенных тканей), такие как трансплантация
костного мозга, трансплантация печени или трансплантация любого органа или ткани, аллергии, такие как атопическая аллергия, СПИД и T-клеточные неоплазмы, такие как лейкемии и (или) лимфомы, но не ограничены ими.
Способы в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы для истощения T-клеток из популяции клеток либо in vitro, либо in vivo. Например, можно произвести истощение T-клеток in vitro в биологическом образце, взятом у пациента, путем
контактирования образца с анти-PSGL-1 соединением, описанным в настоящем патенте,
произвольно в сочетании со сшивающим агентом. Настоящий способ может быть эффективным, например, обеспечивая насыщение не-T-клеток в клеточной популяции, а также
снижая или элиминируя активность T-клеток из клеточной популяции.
Ниже приведены примеры практического использования изобретения. Их никоим образом не следует толковать как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Пример 1.
Получение моноклонального антитела белка, вызывающего апоптоз анти-T-клеток
("TAIP" Monoclonal Antibody).
TAIP-специфическое моноклональное антитело генерировали путем применения хорошо известных способов слияния клеток Kohler и Milstein [(1976) European Journal of
Immunology 6: 511-519] с целью получения гибридомы, секретирующей требуемые антитела. Производящие антитела клетки из хомячка, которому была сделана инъекция Concanovalin A (Con A)-активированного Balb/c T-клетки селезенки, сливали с клеточной
линией миеломы для образования гибридомы, секретирующей антитела. Две популяции
клеток сливали с полиэтиленгликолем и полученные клетки, производящие антитела, клонировали и размножали с помощью стандартных способов выращивания культур клеток
ткани. Одна гибридома, генерированная в соответствии с указанными способами, секретировала моноклональное антитело, обозначенное TAB4, способное вызывать апоптоз
T-клеток in vitro и истощение популяции T-клеток in vivo. Белок, распознанный TAB4,
был обозначен белком, вызывающим T-клеточный апоптоз (TAIP).
Мыши C57BL/6J (B6) и BALB/c были приобретены у Jackson lab (Bar Harbor, ME).
Сирийские хомячки были приобретены у Animal Core Facility, National Taiwan University
Medical College.
Концентрированный супернатант культуры гибридомы TAB4 центрифугировали при
ускорении 20000 об/мин в течение 10 мин, и супернатант разбавляли в соотношении 1:1
связывающим буфером (0,1 M ацетат натрия, pH 5,0). Колонку с белком G (приблизительно 1 мл объема слоя) промывали три раза в 3-5 мл связующего буфера. Очищенный супернатант культуры загружали в колонку с белком G, собирали промывочную жидкость и
снова загружали в колонку. Колонку промывали 6-10 мл связывающего буфера, а связанное антитело элюировали из колонки с 5 мл элюционного буфера (0,1 M глицин-HCl,
pH 2,8). Каждая фракция содержала 1 мл элюированного антитела, pH элюированной
фракции доводили до нейтрального pH путем смешивания каждого 1 мл фракции с 50 мкл
1 M Tris-HCl, pH 7,5. Фракции, содержащие антитело, смешивали и диализировали в 2 л
забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), pH 7,4 три раза в течение 3 ч
для каждого процесса диализа. Концентрации белка в образцах антитела определяли с использованием процедуры, описанной Bradford, с применением белкового анализа Bio-Rad
(BIO-RAD, Hercules, CA).
19
BY 18772 C1 2014.12.30
Пример 2.
Приготовление суспензии клеток мышиной селезенки и активация и насыщение
T-клеток.
Мышиную селезенку погружали в 8 мл сбалансированного солевого раствора Hank
(HBSS), осторожно измельчали с помощью стерильного покровного стекла, помещали в
15 мл центрифужную пробирку (Costar) и центрифугировали при ускорении 200 об/мин в
течение 5 мин. Супернатант удаляли, а дебрис повторно суспендировали в остаточном
буфере путем легкого постукивания по стенке. Загрязняющие клетки эритроцитов (RBC)
подвергали лизису путем добавления 1 мл лизисного буфера RBC (0,6 M NH4C1, 0,17 M
трис-основание, pH 7,65), затем проводили инкубирование в течение 2 мин при комнатной
температуре и быстрое гашение 9 мл HBSS. Клетки осаждали центрифугированием при
ускорении 200 об/мин в течение 5 мин, дважды промывали и ресуспензировали в среде
RPMI. Концентрацию и наличие клеток в смеси определяли с помощью гемоцитометра и
метода исключения трепанового синего (Cambridge Scientific Inc.).
Клетки селезенки регулировали до окончательной концентрации 3 × 106/мл с помощью среды RPMI и добавляли Concanovalin A до окончательной концентрации 2 мкг/мл
для активации T-клеток. Клеточную суспензию перемещали в культуральный планшет с
6 лунками (5 мл/лунка) или в 10-см планшет для культивирования (10 мл/планшет) и инкубировали при 37 °С, 5 % CO2 в течение 48 ч до сбора клеток, выросших в культуре. Активированные клетки селезенки, включая активированные T-клетки, ресуспензировали в
5 мл HBSS и осторожно наносили поверху 5 мл раствора с 55 % градиентом Перколла в
центрифужной пробирке, следя за тем, чтобы не нарушить разделенные слои. Клетки центрифугировали при ускорении 1900 об/мин в течение 13 мин при 25 °С без перерыва. Обогащенную популяцию T-клеток собирали с поверхности раздела двух слоев, дважды
промывали сбалансированным соляным раствором HBSS и готовили к эксперименту.
Пример 3.
Апоптоз активированных T-клеток.
Активированные T-клетки (пример 2) ресуспензировали до окончательной концентрации 5 × 105 клеток/мл в среде RPMI, содержащей 5 нг/мл IL-2, и обрабатывали контрольным Ig, TAB4, или анти-CD3 в соответствии с условиями, приведенными в табл. 1.
Таблица 1
Группы эксперимента
Обработка*
3 мкг/мл Ig хомячка
Отрицательный
5 нг/мл IL-2
контроль
3 мкг/мл кросс-линкерное антитело (антихомячковый Ig)
3 мкг/мл TAB4 mAb хомячка
TAB4
5 нг/мл IL-2
3 мкг/мл кросс-линкерное антитело (антихомячковый Ig)
1 мкг/мл анти-CD3 mAb
Положительный
5 нг/мл IL-2
контроль
1 мкг/мл кросс-линкерное антитело (антимышиный Ig)
* - Окончательная концентрация обозначенных реагентов в среде.
После инкубационного периода в течение 18-24 ч степень апоптоза в каждой культуре
определяли путем проведения анализа апоптоза 7-AAD. Обработанные клетки перемещали в пробирки FACS (пробирки Фалькона), промывали дважды раствором FACS, охлажденным до 0 °C (1 % фетальная бычья сыворотка, 0,05 % азид натрия в PBS) и осаждали
центрифугированием при 200 × g при 4 °С. Клетки ресуспензировали в охлажденном до
0 °C растворе FACS до окончательной концентрации 1-2 × 107 клеток/мл. Для окрашивания 0,1 мл ресуспензированных клеток смешивали с 7-AAD до получения окончательной
20
BY 18772 C1 2014.12.30
концентрации 2 уг/мл и затем инкубировали при 4 °С в темноте в течение 20 мин. Окрашенные клетки окончательно промывали дважды охлажденным до 0 °C раствором FACS,
ресуспензировали в 0,5 мл растворе FACS и анализировали с помощью проточного цитометра BD LSR (Beckton Dickison).
На фиг. 1 приведены результаты репрезентативного динамического эксперимента, во
время которого исследовалось, когда активированные T-клетки приобретают чувствительность к TAB4 (анти-TAIP)-опосредованным апоптотическим сигналам. Мышиные
спленоциты активировали Con-A и сохраняли в среде, содержащей IL-2. Активированные
T-клетки собирали, ресуспензировали и провоцировали TAB4 моноклональным антителом или контрольным IgG хомячка в присутствии антихомячкового IgG антитела в качестве кросс-линкера. Способность перекрестного связывания TAIP для индуцирования
низкого уровня (6,5 %) апоптотического некроза клеток стала очевидной на первый день.
Тем не менее, степень TAB4-индуцированного апоптоза повысилась с 17 % на 2 день, достигла максимума в размере 52 % на 4 день и снизилась до 44 % на 6 день. Контрольный
IgG хомячка не индуцировал специфический апоптотический некроз T-клеток по сравнению с культурами, получившими только IL-2. Анти-CD3 (положительный контроль) индуцировал апоптоз в 38 % T-клеток после 48 ч активации (данные не приведены).
Пример 4.
Экспрессия антигена TAIP в различных тканях.
Клетки дважды промывали охлажденным до 0 °C раствором FACS (1 % фетальной
бычьей сыворотки, 0,05 % азида натрия в PBS) и центрифугировали при ускорении
200 об/мин при 4 °С в пробирке FACS (Falcon). Клетки ресуспензировали в охлажденном
до 0 °C растворе FACS до окончательной концентрации 1 × 107 клеток/мл и для каждого
анализа использовали 0,1 мл аликвоты ресуспензированных клеток в пробирке FACS
(Falcon). В целях проведения поверхностного окрашивания к клеткам добавляли TAB4
моноклональное антитело или контрольный Ig хомячка при окончательной концентрации
2 мкг/мл и инкубировали смесь при 4 °С в течение 30 мин в темноте. Клетки промывали
один раз охлажденным до 0 °С FACS и затем окрашивали: (1) для клеток селезенки - цихром-конъюгированным анти-CD3 антителом (2 мкг/мл), FITC-конъюгированным антихомячковым Ig и PE-конъюгированным анти-CD8/CD4/CD19/CDI Ib/pan-NK/I-A/I-E/Mac-3
антителом (2 мкг/мл) в 100 мкл охлажденного до 0 °C растворе FACS; и (2) для тимусных
клеток - FITC-конъюгированным анти-хомячковым Ig, PE-конъюгированным анти-CD8 и
цихром-конъюгированными анти-CD4 антителами (2 мкг/мл) в 100 мкл охлажденного до
0 °C растворе FACS. Реакцию проводили при 4 °С в течение 30 мин в темноте. Наконец,
окрашенные клетки дважды промывали охлажденным до 0 °C раствором FACS, ресуспензировали в 1 мл раствора FACS и анализировали с помощью проточного цитометра BD
LSR (Beckton Dickison).
На фиг. 3 и 4 показано распределение TAIP антигена на различных субпопуляциях
сплиноцитов и тимоцитов на основе анализа FACS. Как видно на фиг. 3, CD19+B-клетки
экспрессировали незначительные, но детектируемые количества белков TAIP на поверхности.
Значительно большие количества белков TAIP детектировали на CD3+T-клетках и на
фракции NK-клеток. Большинство CD4+, CD8+и CD4+8+тимусных T-клеток экспрессировали значительные количества белков TAIP. В противоположность этому белки TAIP были
экспрессированы только на небольшой популяции CD4-8-тимусных T-клеток (фиг. 4).
Ткани, взятые у B6 и BALB/c мышей, включая мозг, тимус, сердце, легкие, печень,
желудок, почки, селезенку и кожу, собирали, фиксировали в 10 % формальдегиде в течение ночи при комнатной температуре и заливали в парафиновые блоки. Срезы ткани толщиной 4 нм приготавливали из парафиновых блоков с помощью микротома Leica
RM2135, расплавляли в воде при 45 °С и укладывали на предметные стекла, покрытые
слоем твердой питательной среды. Стекла высушивали при 37 °С и подготавливали для
последующих экспериментов.
21
BY 18772 C1 2014.12.30
Стекла, содержащие парафиновые срезы ткани, депарафинировали и высушивали с
помощью серий ксилол - 100 % этанол в соответствии со стандартным протоколом и, наконец, сохраняли в 100 % этаноле. Срезы регидрировали с помощью последовательной
инкубации 100 % этанол - 90 % этанол - 85 % этанол - 70 % этанол-PBS в соответствии со
стандартным протоколом до получения окончательного раствора PBS. Все следующие реакции проводили во влажной камере. Неспецифичное связывание блокировали путем инкубирования срезов ткани в блокирующем буфере (1 % нормальной козьей сыворотки) в
течение 1 ч при комнатной температуре (или при 4 °С в течение ночи). Блокирующий буфер удаляли, добавляли TAB4 или нормальный Ig хомячка (разбавление 1:200) к срезам и
продолжали инкубирование в течение еще 1 ч при комнатной температуре (или при 4 °С в
течение ночи). Срезы промывали дважды в PBS в течение 5 мин каждый с целью удаления
первичного антитела, проводили реакцию с разбавленной в соотношении 1:250 щелочной
фосфотазы-конъюгированного козьего антихомячкового Ig и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Срезы затем снова дважды промывали PBS в течение
5 мин каждый для удаления конъюгата антитело-фермент и проводили цветную реакцию с
использованием субстратного раствора BCIP/NBT при комнатной температуре в течение
30 мин в темноте. Затем срезы снова промывали PBS для удаления избыточного ферментного субстрата, дегидрировали с помощью последовательности PBS-этанол-ксилолы и устанавливали для проведения микроскопии.
Результаты указывали на то, что экспрессия белков TAIP была обнаружена только в
тканях, полученных из костного мозга, но не на остальных прошедших анализ тканях.
Пример 5.
Биотинилирование клеточной поверхности и иммунопреципитация антигена TAIP.
Клетки 5 × 107 самцов RL 1 или NIH-3T3 были поверхностно биотинилированы в 1 мл
PBS, содержащем 0,5 мг/мл сульфо-NHS-биотина (Pierce) в течение 30 мин на льду. Реакция была завершена путем инкубирования клеток 0,5 мл модифицированной по способу
Дульбекко средой Игла (Life Technologies, Inc.) в течение 10 мин на льду. Клетки промывали 1 мл модифицированной по способу Дульбекко средой Игла один раз и 1 мл забурефенным фосфатом физиологическим раствором,
Меченые клетки лизировали при плотности 5,0 x 107 клеток/мл в холодном лизисном
буфере (1 % Triton X-100, 20 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 160 мМ NaCl, 1 мМ CaCl2), содержащем
коктейль ингибитора протеазы (Roche) в течение 15 мин, и нерастворимый материал осаждали при ускорении 10000 об/мин в течение 10 мин; указанные и все последующие шаги
выполняли при 4 °С. Для иммунопреципитации лизат предварительно инкубировали в течение 30 мин 50 мкл упакованного белка G-сефарозы (Amersham Pharmacia Biotech) для
удаления неспецифически связывающих белков. Гранулы осаждали и аликвоты супернатанта (обычно соответствующего клеткам 5,0 × 107) инкубировали 20 мкл белка G-сефарозы, предварительно нагруженного 10 мкг mAb TAB4 или IgG из нормальной
сыворотки хомячка. После инкубирования в течение 4 ч при 4 °С смолу промывали четыре раза промывочным буфером (0,05 % Triton X-100, 50 мМ Tris-HCl, pH 8,5, 400 мМ
NaCl, 1 мМ CaCl2, 1 мг/мл овалбумин), дважды аналогичным промывочным буфером, содержащим 250 мМ NaCl вместо 400 мМ. Белки, специфически связанные с TAB4, элюировали 50 мкл буфера для образца 1 × SDS. Элюированные белки выделяли 8 % SDSPAGE и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Millipore). Фильтры анализировали
на наличие биотинилированных белков с помощью конъюгированного с пероксидазой
авидина (PharMingen) и проявляли с помощью хемилюминисцентного реагента (NENTM
Life Science Products).
Как показано на фиг. 2, биотинилированный поверхностный белок с молекулярным весом
приблизительно 120-kD был определен с помощью TAB4 в RL. 1 клетках (TAIP+T-клетки),
но не в 3T3-клетках (TAIP-клетках). В противоположность этому белок G-сефароза, покрытый хомячковой нормальной сывороткой, не мог найти этот белок 120-kDa. Эти ре22
BY 18772 C1 2014.12.30
зультаты указывают на то, что этот белок 120-kDa является антигеном, распознанным моноклональным антителом TAB4 на клеточной поверхности T-клеток.
Пример 6.
Истощение T-клеток in vivo.
Для изучения влияния TAB4 на популяции T-клеток и другие клетки in vivo мышам
инъекционно вводили интраперитонеально 300 мкг (ug) TAB4 или контрольного Ig хомячка и на день 4 собирали спеноциты, тимоциты и мононуклеары периферической крови
для определения общего количества клеток и для проведения анализов маркеров клеточной поверхности с помощью FACS.
Для проведения FACS анализов клетки фиксировали 2 % параформальдегидом при
4 °С в течение 20 мин, дважды промывали и ресуспензировали в охлажденном до 0 °C
растворе FACS до окончательной концентрации 1 × 107 клеток/мл. Аликвоту 100 мкл ресуспензированных клеток в FACS пробирке (Falcon) использовали для проведения каждого анализа. TAB4 или контрольный Ig хомячка при окончательной концентрации 2 мкг/мл
добавляли к клеткам, и смеси инкубировали при 4 °С в течение 30 мин в темноте. Клетки
промывали один раз охлажденным 0 °C FACS и проводили реакцию с: (1) для клеток
селезенки - цитохром-конъюгированным анти-CD3 антителом (2 мкг/мл), FITC-конъюгированным антихомячковым Ig и PE-конъюгированным анти-CD8/CD4/CD19/CDI
Ib/pan-NK/I-A/I-E/Mac-3 антителом (2 мкг/мл) в 100 мкл охлажденного до 0 °C растворе
FACS; и (2) для тимусных клеток - FITC-конъюгированным антихомячковым Ig,
PE-конъюгированным анти-CD8 и цитохром-конъюгированными анти-CD4 антителами
(2 мкг/мл) в 100 мкл охлажденного до нуля градусов в растворе FACS. Реакцию проводили при 4 °С в течение 30 мин в темноте. Наконец, окрашенные клетки промывали дважды
охлажденным до 0 °C раствором FACS, ресуспензировали в 1000 мкл растворе FACS и
анализировали с помощью проточного цитометра BD LSR (Beckton Dickison).
Спустя четыре дня после инъекции процент CD3+T-клеток в лейкоцитах периферической крови (PBL) снизился с 36,7 % у контрольных мышей до 4,1 % у мышей, прошедших
лечение TAB4 (табл. 2). Лечение TAB4 привело к незначительному сокращению общего
количества спленоцитов. Тем не менее, у мышей, прошедших лечение TAB4, наблюдалось
62 % сокращение количества CD3+ T-клеток, 50 % сокращение количества NK-клеток и
незначительнее увеличение общего количества CD19+ B-клеток. Общее количество тимоцитов, полученных от мышей, прошедших лечение TAB4, составило только 48 % от уровня, имевшегося у контрольной группы (52 % снижение). Более того, за исключением CD4+
T-клеток произошло сокращение всех других CD8+, CD4+CD8+ и CD4–CD8– T-клеток,
при этом наиболее сильное негативное воздействие было оказано на CD4+CD8+ субпопуляцию (64,7 % снижение).
Таблица 2
× 106
Общее количество
спленоцитов
CD3+ T-клетки
CD3– CD19+
CD3– NK+
CD3+ T-клетки
Отсутствие
лечения
Селезенка
Нормальный
Ig хомячка
Лечение
TAB4
Истощение
(%)
123
93,3
105
14,6
32, 8
28,4
12,4
72,2
53,4
72,9
3,6
2,4
1,80
Лейкоциты периферической крови
Отсутствие
Нормальный
Лечение
лечения
Ig хомячка
TAB4
36,7 %
36 %
4,1 %
23
62,2
-0,8
50
Истощение
(%)
88,8 %
BY 18772 C1 2014.12.30
Продолжение табл. 2
× 106
Отсутствие
лечения
Тимус
Нормальный
Ig хомячка
Общее количество
94
тимоцитов
CD4+
9,3
+
CD8
5,2
+
+
CD4 CD8
73,8
CD4– CD85,6
(типичные данные трех экспериментов)
Лечение
TAB4
Истощение
(%)
229
45
52,1
28,4
7,7
182
10,5
10,9
3,6
26
4,5
-16,6
30,3
64,7
19,3
Пример 7.
Анти-TAIP антитело не вызывает секрецию IL-2 или TNF-альфа.
Мышам Balb/c (H-2d) интраперитонеально инъекционно вводили 300 мкг TAB4 или
контрольного Ig хомячка. Спленоциты выделяли спустя 7 дней после инъекции и использовали их в качестве респондеров в культуре со спленоцитами C3H (H-2k) (в качестве
стимуляторов), обработанными митомицином C. Спустя три дня супернатанты культуры
собирали и измеряли содержание IL-2 с помощью комплекта ELISA (PharMingen). Как показано на фиг. 5, выработка IL-2 была подавлена в клетках-респондерах, полученных от
мышей, прошедших лечение TAB4, по сравнению с выработкой у контрольных мышей.
Были также проанализированы уровни плазмы IL-2 и TNF-alpha, и не было отмечено существенных различий уровней IL-2 (или TNF-alpha) в сыворотках контрольных и прошедших лечение TAB4 мышей. Так как выработка IL-2 является крайне важной для
активности T-клеток, результаты показали, что TAIP-специфичное антитело, такое как
TAB4, может быть использовано in vivo для манипулирования T-клетками и для контроля
нежелательных T-клеточно опосредованных иммунных ответов, например ответов, связанных с иммунными заболеваниями и трансплантационным отторжением.
Пример 8.
Использование анти-TAIP антитела для предотвращения отторжения трансплантата.
Мышей (полученных от Jackson Laboratory) в возрасте от 8 до 12 недель анестезировали ацепромазин малеатом (Fermenta Animal Health Co., Kansas City, MO). До пересадки
кожи нетимэктомированным реципиентным C57BL/6 мышам (H-2b) интраперитонеально
инъекционно вводили 500 мкг TAB4 или изотипических контрольных антител за семь
дней до проведения хирургической трансплантации кожи. Спустя семь дней боковой
фланк кожи от полностью аллогенных несовместимых Balb/cj мышей (H-2d) пересаживали на боковой фланк C57BL/6 мышей, предварительно прошедших лечение антителом.
Семь дней спустя после трансплантации мышам снова инъекционно водили 500 мг TAB4
или изотипическое контрольное антитело. За мышами было установлено наблюдение каждый день после трансплантации лоскута. Лоскуты кожи рассматривались как отторгнутые, если 50 % донорской кожи оказывалось омертвевшей. Процент выживаемости
лоскутов кожи приведен на фиг. 7 (n = 8). Данные показывают, что лечение антителом
TAB4 увеличивало период выживаемости аллогенных лоскутов кожи.
Пример 9.
Идентификация TAIP в качестве PSGL-1.
Гликопротеиновый лиганд-1 P-селектина (PSGL-1), также называемый CD162, является основным лигандом P-селектина, экспрессируемым на лейкоцитах, включая T-клетки
[Sako et al. (1993) Cell 75: 1179; Vachino et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 21966; Veldman et
al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 16470]. Биохимические характеристики TAIP, такие как его
молекулярный вес и его тенденция к димеризации, указывают на возможность того, что
TAB4 может быть аналогичным PSGL-1. Для исследования взаимосвязи между этими
24
BY 18772 C1 2014.12.30
двумя антигенами были проведены следующие анализы: 1) может ли антиген, преципитированный TAB4, быть распознан серийно выпускаемым анти-PSGL-1 антителом; 2) может
ли анти-PSGL-1 антитело истощить TAB4 из лизата клетки.
RL1 T-клетки самцов лизировали при плотности 1,0 × 108 клеток/мл в лизисном буфере (1 % Triton X-100, 20 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 160 мМ NaCl, 1 мМ CaCl2), содержащем
полный коктейль ингибитора протеазы в течение 1 ч, и нерастворимый материал осаждали при ускорении 10000 об/мин в течение 10 мин. Указанные и все последующие стадии
выполняли при 4 °С. Лизат, соответствующий клеткам 5,0 × 107, инкубировали с 20 мкл
белка G-сефарозы, предварительно загруженного 10 мкг анти-PSGL-1 mAb (клон 2PH1,
PharMingen, San Diego, CA), анти-TAIP mAb, TAB4 или IgG из нормальной сыворотки
хомячка. После инкубирования в течение 4 ч при 4 °С гранулы промывали пять раз промывочным буфером (0,05 % Triton X-100, 50 мМ Tris-HCl, pH 8,5, 400 мМ NaCl, 1 мМ
CaCl2, 1 мг/мл овалбумин), дважды аналогичным промывочным буфером, содержащим
250 мМ NaCl вместо 400 мМ. Связанные белки элюировали 40 мкл буфера для образца
1 × SDS. Элюированные белки выделяли 6 % SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Проводили иммуноблоттинг мембран с помощью анти-PSGL-1 mAb, и
выявляли их пероксидаза-конъюгированным козьим антикрысиным IgG (H+L) с последующей хемилюминисценцией (Renaissance, NEN).
Поверхностные биотинилированные RL1 T-клетки самцов лизировали при плотности
1,0 × 108 клеток/мл в лизисном буфере. Клеточный экстракт инкубировали 20 мкг антитела, связанного с 40 мкл белка G-сефарозы при 4 °С в течение ночи. Истощения были проведены анти-PSGL-1 mAb (2PH1) или контрольным IgG крысы, TAB4 или контрольной
нормальной сывороткой хомячка. Далее истощенные лизаты подвергали иммунопреципитации TAB4 или анти-PSGL-1 mAb соответственно. Иммунопреципитаты выделяли на
6 % SDS-полиакриламидном геле и выявляли с помощью флюорографии. Как показано на
фиг. 6, анти-PSGL-1 антитело способно истощать белок TAIP из T-клеточных лизатов.
Кроме того, белки, иммунопреципитированные анти-TAIP антителом (TAB4), могут быть
распознаны анти-PSGL-1 антителом путем проведения вестерн-анализа.
Пример 10.
Индуцирование апоптоза в человеческих T-клетках при помощи анти-PSGL-1 антител.
Для определения роли, которую играет PSGL-1 в апоптозе человеческих T-клеток,
проводили динамические (временные) эксперименты в целях изучения того, когда активированные человеческие T-клетки приобретают чувствительность к PSGL-1-опосредованным
апоптотическим сигналам. Человеческие T-клетки стимулировали фитогемагглютининовым (PHA) митогеном и далее размножали в среде, содержащей IL-2. Производили сбор
активированных T-клеток и затем провоцировали анти-PSGL-1 в присутствии IL-2 и перекрестно связывающих антител.
Периферическую кровь брали у здоровых взрослых людей, гепаринизировали и обогащали мононуклеарами периферической крови (PBMC) на основе дифференциальной
плотности с использованием Ficoll-Paque Plus (Pharmacia Biotech). PBMC активировали
1 % PHA (Life Technologies, GibcoBRL) в течение 48 ч и в последующем сохраняли в рекомбинантном человеческом IL-2 (5 нг/мл) в течение всего периода проведения анализа. С
целью оценки способности античеловеческого PSGL-1 антитела индуцировать апоптоз
активированные клетки обрабатывали: (1) 1 мкг/мл клона KPL-1 (BD PharMingen) антиPSGL-1 антитела плюс кросс-линкерным кроличьим антимышиным Ig (0,5 мкг/мл) (Jackson Immuno Research Laboratories); (2) изотипным контрольным очищенным мышиным Ig
плюс кросс-линкерным кроличьим антимышиным Ig; (3) только кросс-линкерным кроличьим антимышиным Ig. Спустя 6 ч после проведения лечения процент клеток на ранних
стадиях апоптоза определяли с помощью FACS, окрашивая анти-аннексин V (BD PharMingen) и PI (Sigma).
25
BY 18772 C1 2014.12.30
Как показано на фиг. 8, передача сигнала, запускаемого PSGL-1 с использованием анти-PSGL-1 антитела плюс кросс-линкер, индуцировала существенный уровень апоптоза в
PHA-активированных человеческих PBMC (главным образом T-клетки). Процент апоптотических клеток увеличился с 8,5 % на день 3 до 24 % на день 8 в анти-PSGL1 обработанных культурах. Ни изотопический контроль, ни перекрестно связывающие антитела как
таковые не оказывали какого-либо влияния на эти клетки.
Пример 11.
Применение анти-PSGL-1 агонистического антитела для лечения аутоиммунной болезни.
Нетучных диабетических мышей (NOD) - животных, у которых хорошо развивается
аутоиммунный диабет, - выращивали при стандартных условиях. Спонтанный диабет развивался у мышей NOD в возрасте около 20 недель. В экспериментальной группе мыши
получали три дозы интраперитонеально анти-PSGL-1 антитело (TAB4) в количестве
300 мкг на мышь в возрасте 14, 15 и 17 недель. Две дополнительные инъекции с таким же
количеством дозы вводили мышам в возрасте 24 и 26 недель. Контрольной группе мышей
вводили такую же дозу Ig хомячка. У мышей проверяли сахар в моче с помощью индикаторных полосок Medi-Test Glucose (Macherey-Nagel, Germany) дважды в день каждую неделю
после достижения ими 15-недельного возраста. Уровни сахара в моче не натощак свыше
300 мг/дл по двум последовательным измерениям рассматривались как наличие диабета.
Как показано на фиг. 9, лечение TAB4 (анти-PSGL-1) антителом позволило существенно повысить защиту по сравнению с лечением антителом контрольной группы. Следовательно, лечение анти-PSGL-1 антителом позволяет ослабить активность аутоиммунных
T-клеток и замедлить наступление диабета типа 1.
Пример 12.
Связывание P-селектина. E-селектина и L-селектина с активированными T-клетками.
С целью определения способностей селектинов (P-селектин, E-селектин и L-селектин)
связываться с активированными T-клетками свежеприготовленные спленоциты от мышей
C57BL/6 активировали и собирали на 2-й, 4-й и 6-й день. Также проводили анализ неактивированных T-клеток (т.е. свежеприготовленные спленоциты на 0 день). Образец 2 дня
состоял из спленоцитов 3 × 106 клеток/мл, которые были активированы 2 мкг/мл Concanavalin A (Con A) в DMEM+10 % FBS в течение 2 дней. Живые клетки выделяли с помощью
фиколл-градиентного разделения. Образец 4 дня был получен из клеток, активированных
Con A в течение 3 дней и сохранявшихся в среде, содержащей 5 нг/мл IL-2 в течение еще
одного дня. Образец 6 дня был получен из клеток, активированных Con A в течение 3
дней и хранившихся в 5 нг/мл IL-2 в течение 3 дней.
Для проведения анализа образцов 0, 2, 4 и 6 дней с использованием FACS-анализа
2 × 105 клеток на лунку инкубировали при 4 °С в течение 30 мин с 40 ул/лунку мышиного
P-селектина, E-селектина или L-селектина, слитого с Fc-областью IgGI человека (R&D
Systems, Minneapolis, MN) при концентрациях в пределах от 20 мкг/мл с двойным последовательным разведением до 0,156 мкг/мл. После инкубации клетки промывали 1x FACScan буфером (1 × PBS без ионов кальция и магния от Biochrom AG, Berlin и 2 % FBS).
Далее образцы инкубировали при 4 °С в течение 30 мин с 95 мкл/лунку анти-Thy 1, 2 и
вторичным реагентом (FITC-античеловеческим IgG, являющимся специфичным к фрагменту Fc, приобретенным у Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, PA)
при 3,25 мкг/мл и затем промывали 1x FACScan буфером.
Результаты FACSCalibur анализа приведены на фиг. 10. При 20 мкг/мл постепенно
увеличивалось связывание P-селектина с мышиными активированными T-клетками, максимум достигался на 4 день на 6 день происходило незначительное снижение. Связывание
E-селектина значительно повышалось со 2 дня до 4 дня и затем оставалось на максимальном
уровне на 6 день. Связывание L-селектина с мышиными активированными T-клетками не
было очевидным и не изменялось в течение периода активации, т.е. с 0 дня до 6 дня. Ре26
BY 18772 C1 2014.12.30
зультаты, наблюдаемые с L-селектином, могли бы быть обусловлены явным низким значением сродства к связыванию L-селектина к своему лиганду. Аналогичные результаты
также были получены, когда более низкие концентрации трех селектинов были использованы в экспериментах.
Пример 13.
Мультимерные формы E-селектина и P-селектина индуцируют апоптоз активированных T-клеток.
Культуральный планшет с 96 лунками (NUNC) покрывали 50 мкл античеловеческого
Fc Ig при 20 мкг/мл в 1 × PBS при 4 °С в течение ночи, блокировали 1 % BSA при 37 °С в
течение 2 ч и инкубировали с 50 мкл слитого белка селектин - Fc человека (от 0,063 до
5 мкг/мл) при комнатной температуре в течение 2 ч На всех этапах эксперимента каждую
лунку тщательно промывали пять раз 1 × PBS. Далее предварительно активированные Con A
в течение 4 дней 2 × 105 T-клетки добавляли в каждую лунку и инкубировали при 37 °С в
течение 5 ч до центрифугирования культурального планшета при 200 × g в течение 5 мин
при 4 °С. Полученный осадок, содержащий активированные T-клетки, инкубировали с
конъюгатом аннексии V-биотин при комнатной температуре в течение 15 мин и в последующем с конъюгатом авидин (SA-бета-гал при разбавлении 1:5000) дополнительно в течение 30 мин при 37 °С. В процессе каждой реакции связывания каждую лунку трижды
промывали аннексии V-связывающим буфером. Проявление цвета достигалось путем инкубирования как 110 мкл Z-буферной смеси (54 мкл 2-меркаптоэтанола в 20 мл Z-буфера),
так и 30 мкл ONPG (0,04 г/10 мл) при 4 °С в течение ночи. Были зарегистрированы показания оптической плотности при 420 нм.
Уровни селектин-индуцированного апоптоза Con-A активированных T-клеток повышались по мере увеличения концентраций (от 0,063 до 5 мкг/мл) P-селектина (фиг. 11A)
или E-селектина (фиг. 11B), слитого с Fc IgGI человека. Хомячковое антитело TAB4 вызывает апоптоз активированных T-клеток (см. пример 1) и использовалось в качестве положительного контроля в указанных экспериментах. Античеловеческий Fc, Ig человека
(HIg) и BSA не индуцировали апоптоз в качестве отрицательного контроля. Не был обнаружен существенный апоптоз в присутствии слитого белка L-селектин-Fc человека
(фиг. 11C), согласующийся с неспособностью L-селектина эффективно связываться с активированными T-клетками (пример 12).
Таким образом, слитый белок, связанный с поверхностью лунок планшета, содержащий PSGL-1-связующий фрагмент P-селектина или E-селектина и фрагмент Fc человека,
вызывал апоптоз активированных T-клеток.
Пример 14.
Перекрестное связывание слитого белка растворимого P-селектина-Fc индуцирует
апоптоз активированных T-клеток.
Мышиные селектины (P-селектин, E-селектин и L-селектин) сливали с Fc областью
IgGI человека, как подробно описывалось выше, для образования растворимых димерических слитых белков. С целью определения способности растворимых селектинов индуцировать апоптоз активированных T-клеток был проведен эксперимент в соответствии с
подробным описанием в примере 13, за тем исключением, что был пропущен античеловеческий Fc Ig, связанный с поверхностью лунок планшета. Незначительные или низкие уровни апоптоза активированных T-клеток имели место только в присутствии одной
растворимой формы слитого белка P-селектина (димер) (фиг. 12). Тем не менее после добавления кросс-линкера (античеловеческий Fc) апоптотическая активность существенно
повышалась приблизительно до апоптотического уровня, вызываемого в присутствии антитела, связанного с поверхностью лунок планшета. Ни античеловеческий Fc, ни Ig человека (HIg), ни BSA не индуцировали апоптоз.
Аналогичные результаты были получены в отношении слитого белка E-селектина-Fc,
а также в отношении слитого белка P-селектина-Fc. Кроме того, в соответствии с результатами, полученными в отношении связанного с поверхностью лунок планшета (мульти27
BY 18772 C1 2014.12.30
мерная форма) L-селектина, растворимая форма слитого белка L-селектина не индуцировала апоптоз активированных T-клеток.
Другие примеры осуществления.
Специалистам в данной области должно быть очевидно, что несмотря на то, что суть
изобретения была изложена в подробном его описании, вышеприведенное описание предназначено для иллюстрации, а не для ограничения объема изобретения. Другие особенности, преимущества и изменения изобретения не выходят за пределы его объема,
определенного помещенной ниже формулой изобретения.
Фиг. 1
Фиг. 2
28
BY 18772 C1 2014.12.30
Фиг. 3
Фиг. 4
29
BY 18772 C1 2014.12.30
Фиг. 5
Фиг. 6
Фиг. 7
30
BY 18772 C1 2014.12.30
Фиг. 8
Фиг. 9
Фиг. 10
31
BY 18772 C1 2014.12.30
Фиг. 11A
Фиг. 11B
Фиг. 11C
32
BY 18772 C1 2014.12.30
Фиг. 12
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
33
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
1 154 Кб
Теги
by18772, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа