close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY19396

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2015.08.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
G 01N 33/483
(2006.01)
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОТНОСИТЕЛЬНОЙ УДЕЛЬНОЙ
МАГНИТНОЙ ВОСПРИИМЧИВОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ КЛЕТОК
(21) Номер заявки: a 20100591
(22) 2010.04.20
(43) 2011.12.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт тепло- и
массообмена имени А.В.Лыкова Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Кашевский Бронислав Эдуардович; Жолудь Антон Михайлович; Кашевский Сергей Брониславович; Прохоров Игорь Викторович
(BY)
BY 19396 C1 2015.08.30
BY (11) 19396
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт теплои массообмена имени А.В.Лыкова Национальной академии наук Беларуси"
(BY)
(56) SU 961620, 1982.
КАШЕВСКИЙ Б.Э. и др. Биофизика. 2006. - Т. 51. - Вып. 6. - С. 1026-1032.
КОНДОРСКИЙ Е.И. и др. Биофизика. 1981. - Т. 26. - Вып. 6. - С. 1104-1106.
(57)
Способ определения относительной удельной магнитной восприимчивости биологических клеток, при котором готовят суспензию клеток в несущей жидкости с концентрацией n, соответствующей соотношению:
n≤ 1 3,
(10d )
где d - максимальный диаметр биологических клеток,
причем в качестве несущей жидкости используют изотонический раствор, в частности
раствор Хэнкса для клеток теплокровных животных или раствор Рингера для клеток холоднокровных животных, суспензию клеток вводят в щелевой канал магнитофоретической ячейки и после установления гидростатического равновесия воздействуют на нее
Фиг. 1
BY 19396 C1 2015.08.30
неоднородным магнитным полем, градиент квадрата напряженности которого направлен
горизонтально в плоскости канала и не изменяется по его толщине и высоте, регистрируют траектории движения клеток, затем сопоставляют зарегистрированную и рассчитанную траектории движения каждой клетки путем аппроксимации зарегистрированной
траектории двухпараметрической подгоночной функцией:
1
z( y) = [S(y ) − S0 ] + B,
κ
где z, y - соответственно вертикальная и горизонтальная координаты клетки,
κ, B - подгоночные параметры,
S(y) - функция, которую определяют из соотношения:
−1
2(g ⋅ k ) y  dH 2 
dy,
S(y ) = −
µ 0 0∫  dy 
где g - вектор ускорения свободного падения,
k - единичный вектор-направление оси координат z,
H - напряженность магнитного поля,
µ0 - магнитная постоянная,
S0 - значение функции S для начальной зарегистрированной горизонтальной координаты клетки,
и находят значение подгоночного параметра κ, которое принимают равным величине относительной удельной магнитной восприимчивости клеток.
Изобретение относится к способам физического анализа биологических материалов, а
точнее к способам определения относительной удельной магнитной восприимчивости
биологических клеток, и может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине.
В технической литературе магнитные свойства материалов принято характеризовать
магнитной восприимчивостью (магнитным моментом единицы объема материала, отнесенным к напряженности намагничивающего поля) или удельной магнитной восприимчивостью (магнитным моментом единицы массы материала, отнесенным к напряженности
намагничивающего поля). В случае слабомагнитных материалов для определения этих характеристик применяют пондеромоторные способы, например способ Фарадея [1], заключающийся в сопоставлении измеренной и вычисленной сил, действующих на образец
материала с известным объемом или массой в неоднородном магнитном поле с известным
пространственным распределением напряженности. Данный способ неприменим для определения магнитных характеристик микроскопических объемов вещества, в частности биологических клеток. Это обусловлено сложностью измерения величины магнитной силы, действующей на отдельную клетку, а также ее объема и массы. Для определения магнитных свойств клеток используют косвенные по своей природе магнитофоретические
способы, основанные на сопоставлении зарегистрированных и рассчитанных характеристик движения клеток в жидкости под действием силы, создаваемой неоднородным внешним магнитным полем, и силы вязкого трения.
В известном способе определения магнитных свойств клеток [2] в качестве характеристики магнитных свойств используют магнитную восприимчивость клеток, которую определяют путем сопоставления зарегистрированных и рассчитанных скоростей
горизонтального перемещения клеток в вертикальном слое несущей жидкости при воздействии на слой жидкости с клетками неоднородным магнитным полем, создаваемым
постоянным магнитом со специальным образом профилированными полюсами, при этом
дополнительно определяют радиус клетки, а величину магнитной восприимчивости опре2
BY 19396 C1 2015.08.30
деляют, полагая, что коэффициент вязкого трения клетки совпадает с коэффициентом вязкого трения идеальной твердой сферы в неограниченной жидкости. Недостатком данного
способа является большая погрешность, связанная с не поддающимся точному учету
влиянием на коэффициент вязкого трения клетки ее механических свойств и формы, а
также расстояния от клетки до стенок измерительного канала. Другой недостаток данного
способа обусловлен малой величиной действующей на клетки в жидкости магнитной силы, что обусловлено слабой неоднородностью магнитного поля, создаваемой профилированными полюсами магнита. Это приводит к сужению диапазона измеряемых магнитных
восприимчивостей.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому является способ определения относительной удельной магнитной восприимчивости биологических клеток, описанный в [3] (прототип). В данном способе относительную удельную магнитную
восприимчивость определяют путем сопоставления зарегистрированных и рассчитанных
траекторий движения клетки в неподвижном вертикальном слое несущей жидкости при
воздействии на слой жидкости с клетками гравитационного поля и неоднородного магнитного поля, градиент квадрата напряженности которого направлен горизонтально в
плоскости слоя и существенно не изменяется по его толщине и высоте. При этом в качестве несущей жидкости используют культуральную среду, регистрацию траекторий движения клеток осуществляют путем определения последовательности координат их центров
методом ручной обработки кадров цифровой видеозаписи, сопоставление зарегистрированных и рассчитанных траекторий движения клеток осуществляют путем аппроксимации
каждой из зарегистрированных траекторий однопараметрической подгоночной функцией,
а магнитную восприимчивость клетки определяют по найденной величине подгоночного
параметра, используя при этом дополнительную информацию о плотности клетки и магнитной восприимчивости несущей жидкости. Недостатками данного способа являются
низкая производительность и случайные ошибки, связанные с большой погрешностью определения плотности каждой отдельной клетки, которую определяют по скорости оседания клетки в жидкости, которая зависит от не поддающейся точному определению формы
клетки и от расстояния от клетки до стенок канала.
Задачей настоящего изобретения является устранение погрешностей и расширение
массива данных о магнитных свойствах клеточных популяций, т.е. создание способа определения магнитных свойств биологических клеток, обладающего высокой информационной значимостью.
Задача решается следующим образом.
Способ определения относительной удельной магнитной восприимчивости биологических клеток заключается в том, что готовят суспензию клеток в несущей жидкости с
концентрацией n, соответствующей соотношению:
1
,
n≤
(1)
(10d)3
где d - максимальный диаметр биологических клеток, причем в качестве несущей жидкости используют изотонический раствор, в частности раствор Хэнкса для клеток теплокровных животных или раствор Рингера для клеток холоднокровных животных,
суспензию клеток вводят в щелевой канал магнитофоретической ячейки и после установления гидростатического равновесия воздействуют на нее неоднородным магнитным полем, градиент квадрата напряженности которого направлен горизонтально в плоскости
канала и не изменяется по его толщине и высоте, регистрируют траектории движения клеток, затем сопоставляют зарегистрированную и рассчитанную траектории движения каждой клетки путем аппроксимации зарегистрированной траектории двухпараметрической
подгоночной функцией:
3
BY 19396 C1 2015.08.30
1
z( y) = [S( y) − S0 ] + B,
(2)
k
где z, y - соответственно, вертикальная и горизонтальная координаты клетки, к, B - подгоночные параметры, S(y) - функция, которую определяют из соотношения:
−1
2(g ⋅ k ) y  dH 2 
dy,
S( y) = −
µ 0 0∫  dy 
(3)
где g - вектор ускорения свободного падения, k - единичный вектор-направление оси координат z, H - напряженность магнитного поля, µ 0 - магнитная постоянная, S0 - значение
функции S для начальной зарегистрированной горизонтальной координаты клетки, и находят значение подгоночного параметра к, которое принимают равным величине относительной удельной магнитной восприимчивости клеток.
Согласно изобретению, магнитные свойства биологических клеток характеризуются
относительной удельной магнитной восприимчивостью к, которая связана с магнитной
восприимчивостью клетки χ, магнитной восприимчивостью несущей жидкости χ0, плотностью клетки ρ и плотность несущей жидкости ρ0 соотношением κ = (χ–χ0)/(ρ–ρ0).
Величину относительной удельной магнитной восприимчивости клеток, согласно изобретению, определяют из результатов аппроксимации зарегистрированных траекторий их
движения двухпараметрической подгоночной функцией, определяемой соотношением (2),
при этом найденное в результате подгонки значение подгоночного параметра к дает искомую величину относительной удельной магнитной восприимчивости.
Для теоретического обоснования предложенного способа рассмотрим движение клетки в неподвижном вертикальном слое несущей жидкости при воздействии на слой жидкости с клетками гравитационного поля и неоднородного магнитного поля, градиент
квадрата напряженности которого направлен горизонтально в плоскости слоя и существенно не изменяется по его толщине и высоте.
Движение клетки с плотностью ρ, объемом V, магнитной восприимчивостью χ в жидкости с плотностью ρ0 и магнитной восприимчивостью χ0 описывается уравнением, выражающим условие баланса силы тяжести, силы Архимеда, магнитной силы и силы вязкого
трения:
dR = 1  µ 0 V(χ − χ )grad (H 2 ) + V(ρ − ρ )g 
(4)
0
0

dt α  2
Здесь R - радиус-вектор центра клетки в выбранной системе координат, α - коэффициент вязкого трения клетки, который в общем случае зависит от механических свойств
клетки, состояния ее поверхности, размеров и формы, а также от близости клетки к ограничивающей слой жидкости поверхности. Введем в области регистрации движения декартову систему координат с вертикальной осью z и направленной горизонтально в
плоскости слоя осью y. При условии, что градиент квадрата напряженности поля grad(H2)
в области регистрации движения направлен горизонтально в плоскости слоя и существенно не изменяется по его толщине и высоте, действующая на клетку магнитная сила направлена вдоль оси y и существенно не изменяется по толщине и высоте слоя в области
регистрации. При этом уравнение (4), расписанное по компонентам, принимает вид
2
dy
= 1 V(χ − χ 0 )µ 0 dH ;
(5)
dt 2α ( x )
dy
dz = 1 V(ρ − ρ )(g ⋅ k ) .
(6)
0
dt α( x )
При записи этих уравнений учтено, что коэффициент α зависит от поперечной к слою
координаты x, т.е. от положения частицы относительно стенок камеры. Из уравнений (5),
(6) получаем следующее уравнение траектории клетки
4
BY 19396 C1 2015.08.30
−1
dz
ρ − ρ0 2(g ⋅ k )  dH 2 
.
=−
dy
χ − χ 0 µ 0  dy 
(7)
Как следует из этого уравнения, траектория клетки не зависит от коэффициента ее вязкого трения, т.е. от размеров, формы, механических свойств клетки и ее положения относительно стенок камеры. Это объясняется тем, что уменьшение (увеличение)
коэффициента трения в равной степени влияет на скорость движения в вертикальном и
горизонтальном направлениях, а траектория при этом не изменяется. При заданном распределении магнитного поля форма траектории зависит только от начального положения
клетки и величины
ρ − ρ0
,
χ − χ0
обратной величине относительной удельной магнитной восприимчивости к. Определяемая предложенным способом величина относительной удельной магнитной восприимчивости клетки не зависит от не поддающихся точному определению размера, формы и
плотности клетки. Следовательно, присущие известным способам погрешности определения магнитных свойств клеток полностью исключаются.
Рассчитанная из уравнения (7) траектория клетки дается уравнением
−1
y
1 2(g ⋅ k )  dH 2 
dy .
z = z0 −
κ µ 0 y∫  dy 
(8)
0
Здесь z0, y0 - начальные координаты клетки. Соотношение (8) может быть использовано для подгонки зарегистрированной траектории клетки. Недостаток такой подгонки заключается в том, что рассчитанная траектория жестко привязывается к начальным
зарегистрированным координатам клетки. При этом ошибка регистрации начального положения приводит к ошибке определения относительной удельной магнитной восприимчивости клетки. Согласно изобретению, для устранения этой ошибки подгонка
зарегистрированной траектории производится двухпараметрической функцией, определенной уравнением (2). Она получается из (8) следующим образом. Введем функцию S(y)
согласно формуле (3) изобретения и представим (8) в виде
1
z = z 0 + (S( y) − S( y 0 )).
κ
Первое слагаемое в правой части этого уравнения - начальное зарегистрированное положение частицы по вертикали, которое определяется с погрешностью. Заменяя это слагаемое дополнительным подгоночным параметром, т.е. используя для подгонки функцию
(2) изобретения, данную погрешность устраняют.
При практическом применении предложенного способа имеется вероятность случайных ошибок, связанных с тем, что отдельные клетки могут сближаться на малые расстояния и оказывать существенное взаимное влияние на траектории движения. Согласно
изобретению, вероятность сближения клеток уменьшают, ограничивая концентрацию клеток в исследуемой клеточной суспензии по соотношению (1), которое получено из условия, что среднее расстояние между клетками в суспензии должно составлять величину,
превосходящую десять диаметров клеток, имеющих в исследуемой клеточной популяции
максимальный диаметр. На фиг. 1 изображена схема устройства для реализации предложенного способа. Устройство содержат измерительную ячейку 1, электромагнит 2, оптико-механическую систему, состоящую из тубуса 3, установочной площадки 4, подсветки 5
и видеокамеры 6, соединенной с персональным компьютером 7.
На фиг. 2 представлена схема измерительной ячейки. Ячейка включает корпус 8, в котором выполнен плоский прозрачный измерительный щелевой канал 9, который в нижней
части сообщается с уравновешивающим каналом 10 и образует с ним U-образную систе-
5
BY 19396 C1 2015.08.30
му. В верхней части щелевого канала 9 выполнена приемная камера 11 (расширение),
вдоль его вертикального торца установлен ферромагнитный стержень прямоугольного сечения 12.
Необходимый для реализации способа неподвижный вертикальный слой несущей
жидкости создается в измерительном щелевом канале путем заполнения жидкостью Uобразной системы магнитофоретической ячейки после установления в ней гидростатического равновесия. При условии, что диаметр магнитного стержня 12 гораздо больше ширины измерительного щелевого канала 9, а длина стержня 12 намного больше его
диаметра, вблизи от середины стержня при его намагничивании создаваемым электромагнитом 2 однородным горизонтальным внешним полем, направленным в плоскости щелевого канала, в последнем создается необходимое для реализации способа неоднородное
магнитное поле, градиент квадрата напряженности которого направлен горизонтально в
плоскости слоя и существенно не изменяется по его толщине и высоте. Допустимое изменение этой величины по ширине слоя, в зависимости от требуемой точности определения
магнитных свойств клеток, можно устанавливать за счет изменения соотношения указанных геометрических параметров системы магнитный стержень - щелевой канал. Функцию
S(y), определенную соотношением (3), рассчитывают, используя уравнения магнитостатики.
Способ реализуют следующим образом. Предварительно готовят клеточную суспензию для исследования. Так, если клетки теплокровного животного до исследования находились в какой-либо культуральной среде, производят их осаждение центрифугированием, культуральный раствор сливают и заменяют раствором Хэнкса. Используя
микроскоп и камеру Горяева, подгоняют концентрацию клеток до величины, определяемой соотношением (1). Так, если наибольший диаметр клеток в исследуемой популяции
составляет 10 мкм, то, согласно соотношению (1), необходимая концентрация определяется из условия n ≤ 106 клеток на миллилитр суспензии.
Далее U-образную систему измерительной ячейки (фиг. 2) заполняют через уравновешивающий канал (10) несущей жидкостью (раствором Хэнкса). После установления гидростатического равновесия жидкости в плечах U-образной системы, в приемную камеру
11 измерительного канала 9 вводят 1-2 капли исследуемой суспензии. После этого выжидают 1-2 мин, в течение которых в U-образной системе устанавливается гидростатическое
равновесие путем перетекания введенного объема суспензии клеток, которые при этом
оказываются в поле зрения оптической системы устройства (фиг. 1). Затем включают подсветку 5, видеокамеру 6, электромагнит 2 и производят видеозапись движущихся клеток,
результаты которой сохраняют в памяти компьютера 7. Для повторения видеорегистрации
движения клеток производят отключение электромагнита, подсветки и видеокамеры, в
приемную камеру 11 вводят новую порцию суспензии, выжидают время установления
гидростатического равновесия, включают электромагнит, подсветку и видеокамеру, повторяют описанную выше процедуру регистрации движения клеток.
Далее путем программной обработки последовательности кадров цифровой видеозаписи, осуществляют регистрацию траекторий движения клеток. Обработка последовательности кадров цифровой видеозаписи, полученной в формате градации серого,
производится в следующем порядке. Первой операцией обработки является идентификация клеточных объектов и определение координат их центров. Ее производят следующим
образом. Выбирают пороговое значение яркости, отвечающее яркости фона изображения
и преобразуют каждый кадр в двухбитовый формат, при этом черным цветом (нулевой
бит) представлен фон, белым (единица) - клетки. Далее программно сканируют цифровой
файл изображения, выделяют белые объекты, отбрасывают объекты с размерами, меньше
минимального размера клеток, координаты центров оставшихся объектов вычисляют как
координаты их центров масс. Затем устанавливают последовательность значений координат каждой клетки. Для этого идентифицированным на первом кадре клеточным объектам
вместе с координатами, приписывают порядковые номера. После определения координат
6
BY 19396 C1 2015.08.30
объектов на втором кадре (следуя описанной выше процедуре), определяют расстояния
между объектом с номером 1 на первом кадре и координатами всех объектов на втором.
Ближайший к объекту 1 кадра 1 объект кадра 2 принимают за объект 1 в новом положении. Эту процедуру повторяют в отношении всех пронумерованных объектов. Повторяя
описанную процедуру сравнения 2-го кадра с третьим и т.д., получают файл данных, содержащих последовательность координат всех пронумерованных клеток. Полученные экранные координаты путем масштабирования переводят в метрические.
Подгонку каждой зарегистрированной траектории функцией (2) осуществляют стандартным методом наименьших квадратов. Ее результатом являются значения подгоночных коэффициентов, при которых сумма квадратов отклонений значений функции (2) от
зарегистрированных значений z для всех y минимальна. Найденное по результатом подгонки значение параметра к, согласно изобретению, равно искомой величине относительной удельной магнитной восприимчивости. Для исключения погрешности, связанной с
искажением траекторий движения частиц, подвергшихся существенному взаимному влиянию, подобные траектории выявляют в процессе подгонки по величине среднеквадратичного отклонения. Траектории, для которых среднеквадратичное отклонение превышает
задаваемое пороговое значение, отбраковывают. Пороговое значение задают величиной,
не превышающей диаметр клетки.
Проиллюстрируем описанную процедуру на примере исследования популяции клеток
асцитной карциномы Эрлиха.
На фиг. 3 представлен единичный кадр видеорегистрации положения клеток, на котором отмечены идентифицированные и пронумерованные клетки.
На фиг. 4 представлены зарегистрированные траектории движения нескольких клеток,
пунктирными линиями помечены автоматически отбракованные траектории.
На фиг. 5 представлены результаты теоретической подгонки функцией (2) (сплошная
линия) одной из зарегистрированных траекторий (точки).
На фиг. 6 представлена полученная гистограмма распределения клеток по величине
относительной удельной магнитной восприимчивости.
Источники информации:
1. Чечерников В.И. Магнитные измерения. - М., 1969.
2. Патент US 6 557 430, 2003.
3. Кашевский Б.Э., Кашевский С.Б., Прохоров И.В., Александрова Е.Н., Истомин Ю.П.
Магнитофорез и магнитная восприимчивость опухолевых клеток HeLa // Биофизика. 2006. - Т. 51. - № 6. - С. 1026-1032 (прототип).
7
BY 19396 C1 2015.08.30
Фиг. 2
Фиг. 3
Фиг. 4
8
BY 19396 C1 2015.08.30
Фиг. 5
Фиг. 6
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
9
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
794 Кб
Теги
by19396, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа