close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY20509

код для вставкиСкачать
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
описАнив
ИЗОБРЕТЕНИЯ
к пАтЕнту
(l9)
BY
trзl
С1
(1l)
20509
201б.10.30
(51) мпк
t+o
(i2)
нлl lионАJlьный tцjltTP
иlIтЕJUlЕкl,уАльной
соБстI]Ijtнос,I,и
с 07к I6/l8
с I2P 2I/08
л бIк 39/395
G OIN 33/53
(2006.01)
(2006.0l)
(2006.01)
(2006.0 l )
АНТИТЕЛО ПРОТИВ ILT7
(54)
(21) Номер заявки: а 20080962
(22) 2006.|2.20
2005-з66465 (з2)2005.12.20 (з3) JP
2008,07.20
Pcl7JP200 бl з25з9 |, 2006,|2.20
Wo 2007 1072866, 2007.06.28
2009.02.28
Заявитель: ЭсБиАй БИОТЕК КО.,
лтд. (JP)
(72) Авторы: КАМОГАВА, Юмико; ЧО,
МинквоIl; АРАИ, Наоко; ИШИДА,
Колжи (JP)
(з1)
(85)
(86)
(87)
(4з)
(71)
ЭсБиАй БИОТЕК
ко., лтд. (JP)
VALES-GOMEZ М. et al. Joumal of Virоlоgу, - 2005. - V. 79. - No. 4. -P.225l-
(73) Патентообладатель:
(56)
2260.
RU 94045919 А1, l996.
(57)
1. Мотtокllоttапьное антиl,еJIо. способное к связыванию с внеклеточным доменом челоl]еческого ||,'|'7 , или eI,o фрагмент с антигенсвязывающей областью, содержащее в качестве CDRI, CDЮ и CDR3 в вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области
легкой цепи аминокислотные последовательности, выбранные из i)- iii):
i) SDYAWN - CDRI вариабельной области тяжелой цепи последовательности SEQ ID
No
с)
(\t
U
о\
58,
YISYSGSI'SYNPSLKSR - CDR2 вариабельной области тяжелой IIепи последователь-
пости SEQ ID NO 59 и
SРРYYАМDY - CDR3 вариабельной области тяжелой цепи последовательнос,ги SEQ
ID NO 60;
KASQDVG1'AVA - CDR1 вариабс;tыlой области легкой цепи последовательности SEQ
ID No бl,
WASTRIIT - CDR2 вариабельной области легкой цепи последовательности SEQ ID
Nо62и
QQYSSYPLT - CDR3 вариабельной области легкой цепи последовательности SEQ ID
NO бЗ;
No
ii) SYWIH - CDRI вариабельной области тяжелой цепи последовательности SEQ ID
64.
RIYPGTGSTYYNEKFKG - СDЮ вариабельной области тяжелой цепи
ln
ности SEQ ID NO 65 и
бl
ID
YPI'YDWYГDV
ID
-
CDR3 вариабельной
последова,t,ель-
об.пасти тяжелой цепи последовательности
SEQ
NO 66;
RASQSISNYL}I - CDRI вариабельной области легкой цепи последовательности SEQ
No
67,
BY
20509
с1
2016.10.30
YASQSIS - СDЮ вариабельной области легкой цепи последовательности SEQ ID NO
68и
QQSNSWPLT - CDR3 вариабельной области легкой цепи последовательности SEQ ID
Nо69и
iii) SDYAWN - CDRl вариабельЕой области тяжелой цепи последовательности SEQ
ID No 70.
YISYSGSTSYNPSLKSR - CDR2 вариабельной области тяжелой цепи последовательнос,t,и SEQ ID NO 7l и
ALPLPWFAY - CDR3 вариабельной области тяжелой цепи последовательности SEQ
ID NO 72;
КДSQDVGТДVА
ID No 73,
-
CDRI вариабельной области легкой цепи последовательности SEQ
WASTRHT - CDЮ вариабельной области легкой цепи последовательности SBQ ID
Nо74и
No
QQYSSYPY'Г - CDR3 вариабельной области легкой цепи последовательности SEQ ID
75.
2. Мопоклональное антитело по п.
l
или его фрагмент с антигенсвязывающей обла-
с,l,ыо, отjIичаюIIlееся 1,ем, что способно к связыванию с внеклеточным доменом человечеcKoгo IL'1-7 на чеJIовеческой интерферонпродуцируюшей клетке.
3. Мопоклоttальное антитело по п. 1 или его фрагмент с анти генсвязывающей обла-
стыо, отличаюпIееся тем, что в качестве вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи содержит зрелую последовательность аминокислотной
последовательности, выбранную из (а)-(с):
а) вариабельная область тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO 39 и вариабеllьная область легкой цепи последовательности SEQ ID NO 4l ,
Ь) вариабельная область тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO 43 и вариабельная область легкой цепи последовательности SEQ ID NO 45 или
с) вариабе-llыlая область rяжелой цепи послеловательности SEQ ID NO 47 и вариабельная об;lасть ;tеt,кой цепи lIослеловательности SEQ ID NO 49.
4. Полиlтуклеотид, кодирующий моноклональное антитело по п. l или 3 или его фрагмент с антигенсвязывающей областью.
5. Вектор экспрессии. содержащий полинуклеотид. кодир)тоший моноклонitльное ан-
'l
титело по п. или 3 или его фрагмент с антигенсвязывающей областью.
6. Траllсформированнrш клетка, сохраняющiц вектор экспрессии по п. 5.
7. Способ получения моноклональЕого антитела по п. 1 или 3 или его фрагмента с антигснсвязывающей областью, при котором осуществляют культивирование трансформироваIIной клетки по п.6 и извлечение из культуры моноклоllalльвого антитела или его
фраI,мента с антигенсвязываIощей областью.
8. Способ получения клетки, продуцируюшей моноклонttльное антитело по п. l, при
котором осущес],вляют след},ющие стадии:
(l) введение иммунному животному клетки, которая экспрессирует экзогенный белок,
содержаший внеклеточный домен человеческого ILT7, и экзогенной молекулы, ассоциированной с человеческим ILT7, представляющей собой белок клеточной мембраны, являIощийся y-цепью Fс-рецептора, и
(2) отбор клеткиl продуцирующей монокJIонаJIьное антитело, связывающееся с внеклеточI{ым доменом человеческого |LT'7, из иммунного животного.
9. Способ по п.8, отличаrощийся тем! что в качестве клетки, которaш экспрсссирует
экзогенный белок, содержащий внеклеточньй домен человеческого ILT7, и экзогенной
молекулы! ассоциированной с человеческим ILT7, использ},ют к;Iетку, сохраняющуо при
экспрессии признаки (а) и (Ь):
(а) экзогенный полинуклеотид, кодир}тощий аминокислотн1rо последовательность,
содержащую вrrеклеточньй домен человеческого ILT7, и
2
BY
20509
с1
201б.10.30
(Ь) экзогенный полинуклеотид, кодирJтощий у-цепь Fс-рецептора.
10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что использ}.ют клетку животного.
1l, Способ по п. l0, отличающийся тем, что используют кJIетку человека.
12. Способ по п, l l, отличающийся тем, что в качестве кJIетки человека используют
клетку 293Т.
l3. Способ по п, 8, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют клонирование о,I,обраIttrой кле,t,ки.
l4. Моttоклональное антитело по п. 1, способное к распознаванию человеческого
ILT7, tl,ли его фрагмсttт с антигенсвязывающей областью, полученное п).тем осуществлеtIия следу,rоцих стадий:
(l) ввеления иммунному животному кJIетки, которая экспрессирует экзогенный белок,
солержащий внеклеточный домен человеческого ILT7, и экзогенной молекулы, ассоциированной с чеJIовеческим ILT7, представляющей собой белок клеточной мембраны, являюпlийся y-цспью Fс-рецептора,
(2) отбора клетки, продуцирующей моноклонzuIьное антитело, связывающееся с внекJIеточIlым доменом человеческого ILT7, из иммунного животного,
(3) культивирования кJIетки, отобранной на стадии (2), и извлечения из культуры моIIокjIонаIьного аI{титела, способного распознавать человеческий ILT7.
l5. Иммуноген для получения моноклональЕого антитела по п. l, представляющий собой клетку животного, в которой (а) полинуклеотид, кодируюtций аминокислотную по-
следовательность, содержащую внеклеточный домен человеческого ILT7, и (Ь)
полинуклеотиll, который кодирует y-цепь Fс-рецептора, удерживаются экзоген}Iо]кспрессируемым образом или во фракции клеточной мембраны.
16, Иммуноген по п. 15, отличающийся тем, что кJIетка животного является клеткой
человека.
l7. Способ обнаружения интерферонпрод)цирующей клетки, при котором осуществ-
JIяют следуюu(ие стадии:
контактирование моноклонального антитела по п. 1 или его фрагмента с антигенсвя-
,rываtоLцей об:tастью с тестируемой клеткой и
выявление моноклонального антитела по п. 1 или его фрагмента с антигеЕсвязываюIrtей областыо. связанного с клеткой.
18. Реагент для обнаружения интерферонпродуцир1тощей клетки, содержащий моноклональное аIIтитело по п. l или его фрагмент с антигенсвязывающей областью.
19. Способ иrтибирвания :tктивности иrперферонпролучирующей клgгки in vitro, при ко,гором интерферонпродуцируоllrylо кJlеп{у приводят в конпкт с компонентом, выбраrтньrм из
(а) моноклона-пьного антитела по п. 1 или его фрагмента с антигенсвязывающей областью, и
(Ь) иммуноглобулина, в который встроена определяющая комплементарность область
монокJIоIIаJIьного антитела, указанного в (а), или его фрагмента с антигенсвязывающей
облас,I,ыо.
20. Способ по п. l9, отличающийся тем, что активность интерферонпродуцируюшей
клетки является интерферонпролучирующей активностью и/или выживаемостью интер-
феронпролуlrирующей tспетки.
21. Ингибитор активности интерферонпродуцирующей клетки, содержащий в качестве активного ингредиента моноклональное антитело по п. l или его фрагмент с антигенсвязываюrrtей областью.
22. Ингибитор активности по п,2l, отличающийся тем, что активность интерферопIIродуI(ируюutей клетки является интерферонпродуцирующей активностью и/или вьlживаемос,гью ин,r,срферонпродучирующей клетки.
з
r
BY
20509
с1
201б.10.30
область техники
Настоящее изобретение относится к антителу, которое связывается с
человеческим lLT7.
Ур8вень техн
д!<и
изобретения
Интерферон о (далее упоминаемый как ИФНq, интерферон - как ИФН), и
интерферон В (ИФНВ) известны как ИФН 1 типа, которые обладают противовирусной
активностью или противоопухолевой активностью. С другой стороны, таюке
выявлено, что ИФНо связан с ауrоиммунным заболеванием. Например, имеются
сообщения о патологической продукции ИФНо у больных с указанными ниже
аутоиммунными заболеваниями. Таюке предполагается, что нейтрализация ИФНо
может уменьшить симптомы ауrоиммунных заболеваний.
Системная красная волчанка (Shiozawa et al., Arthr. & Rheum. 20 35,412, 19S2).
Хронический ревматизм (Hopkins et al., Clin. Ехр. lmmunol. 73, 8В, 1988).
Имеются сообщения о случаях, при которых введение рекомбинантного гена
ИФНо2 или ИФН вызывало манифестацию или ухудшение симптомов аугоиммунных
заболеваний (Wada et al., Am. J. Gastroenterol. 90, 136, 1995; Реrеz et al., Am. J.
Hematol. 49, 365, '1995; Wilson LE et al., Semin. Arthritis. Rheum. З2, 16З-173, 2О02).
Таюке дополнительно выявлено, что ИФНо индуцирует дифференцировку
дендритных меток. !ендритная клетка является Taloкe антигенпрезентирующей
клеткой. Поэтому считается, что индукция дифференцировки дендритных клеток
является важной составляющей механизма аугоиммунных
заболеваний.
Предполагается, что существует глубокая связь мехцу индукцией дифференцировки
дендритных клеток под действием ИФНо и началом системной красной волчанки
(Вlапсо et al., Science, 16:294, 1540-1543, 2001). Таким образом, указывается, что
ИФНо тесно связан
с
противоопухолевой акгивностью,
а таюке с аугоиммунными
заболеваниями. Кроме того, ИФНо глубоко вовлечен в начало псориаза (Nestle FО et
al., J. Ехр. Med.202, 135-143,2005)
Интерферон-продуцирующие клетки (ИПК) определяют как клетки, которые
продуцируют больч.lое количество ИФН 1 типа, связанного с вирусной инфекцией.
Небольшое количество ИПК находятся в крови. Считается, что лимфоциты
периферическоЙ крови составляют
1О/о
или менее ИПК. Вместе с тем, ИПК обладает
очень высокой способностью к продукции ИФН. Способность ИПК продуцировать
ИФН достигает, например,300О пг/мл/l0а клеток. Таким образом, можно сказать, что
4
BY
20509
с1
201б.10.30
в крови большая часть ИФНо или ИФНВ, вырабатываемых при вирусной инфекции,
являются результатом активности ИПК, несмотря на небольшое число этих клеток.
С другой стороны, ИПК представляют собой недифференцированные
лимфатические дендритные клетки, которые считаются меткамипредшественниками дендритных клеток. ИПК могуг называться плазмоцитоидными
дендритными клетками, ИПК дифференцируются в дендритные клетки путем
вирусной стимуляции, и посредством Т-клеток они индуцируют продукцию ИФНу или
интерлейкина ИЛ-10, Дифференцировка ИПК в дендритные клетки происходит таюке
посредством стимуляции ИЛ-3. !ифференцированные пrтем стимуляции ИЛ-3
дендритные клетки посредством Т-клеток индуцируют продукцию цитокина Th2 (ИЛ-
4, ИЛ-5 и ИЛ-10). Таким образом, ИПК имеют свойства, которые позволяют
им
дифференцироваться в разные дендритные клетки посредством разной стимуляции.
Соответственно, существует два вида ИПК: ИФН продуцирующие клетки и
клетки-предшественники дендритных клеток. Обе вида клеток играют важную роль в
иммунной системе. !ругими словами, ИПК являются одними из важных клеток
поддержки различных аспектов иммунной системы.
Непатентный документ
'1
:
Shiozawa et al., Аrthr. & Rheum. 35,412, 1992,
Непатентный документ 2: Hopkins et а1., Clin. Ехр. lmmunol. 73, 88, 1988.
Непатентный документ 3: Wada et al,, Am. J. Gastroenterol. 90, 136, 1995.
Непатентный документ 4: Parez et al., Аm. J. Hematol. 49, 365, "l995.
Непатентный документ 5: Bianco et al., Science, 16:294, '1540-1543, 2001
.
Непатентный документ 6: Ju et al., Gene. 2004 Арr 28; 331: 159-64.
Непатентный документ 7: Соlоппа М et al., Sеmiпаrs in lmmunology 12:121-127,
2000.
Непатентный документ 8: Nakajima Н. et al., J. lmmunology 162: 5-8, 1999.
Непатентный документ 9: Wilson LE et al, Semin Arthritis. Rheum. 32, 163-173,
20о2.
Непатентный документ 10: Nestle FО et al., J. Ехр. Med. 202, 135-143, 2005.
Патентный документ 1: WO03/12061 (опубликованная патентная заявка США
N9
2003-148316)
Раскрытие изобретения
[Проблемы, решаемые настоящим изобретением]
3адача согласно изобретению состоит в обеспечении связывания антитела с
иммуноrлобулиноподобным транскриптом 7 (lLT7) и в обнарркении, идентификации
или выделении ИПК. !ругая задача согласно изобретению представляет собой
5
BY
20509
с1
201б.10.30
реryляцию активности Ипк.
[Средства решения проблем]
,Щля реryляции активности ryморального факгора, такого как ИФН,
эффективно введение антител, которые распознают указанный факгор. Например,
осуществлялись попытки лечения аугоиммунных заболеваний антителами против
интерлейкина (ИЛ)-1 или ИЛ-4 (Guler et al., Arthritis Rheum., 44. 5307, 2001). Кроме
того, предполаrается, что нейтрализация антител может служить средством терапии
ауrоиммунных заболеваний, подобно интерферону (Stewart, ТА. Cytokine Grойh
Factor Rev, 14; 139-'154, 2003). Можно прогнозировать, что подход, аналогичный
описанному выше, будет эффективен для ИФН, продуцируемых ИПК. Вместе с тем,
такой подход основан на эффекте ингибирования ryморальноrо факrора после
продукции указанного факгора. Если продукцию желательного ryморальноrо
фактора можно реryлировать прямым образом, можно достичь более значительных
терапевтических эффекгов.
Имеются сообщения об антителах, распознающих человеческие ИПК.
Например, моноклональное анти-ВDСА-2-антитело представляет собой
человеческое ИПК-специфичное моноклональное антитело (Dzionek А. et al. J.
lmmчпоl. 165: 6037-6046, 2000). Выявлено, что моноклональное анти-ВDСА-2антитело эффекгивно ингибирует продукцию ИФН человеческими ИПК (J. Ехр. Med.
't94: 1В23-'1834, 2001). !ополнительно, имеются данные, что мономональные
антитела, которые распознают интерферон-продуцирующие клетки у мышей,
ингибируют продукцию интерферона (Blood 2004 Jun. 1; 103i1 ,t: 4201-4206. Epub
2003 Dec). Указывается, что уменьшение количества дендритных клеток у мышей
происходило благодаря моноклональным антителам против плазмоцитоидных
дендритных меток (J. Immunol. 2О03, 171:6466-6477).
и
Сходным образом, будр полезны антитела, распознающие человеческие ИПК
способные реryлировать активность. Например, авторы согласно изобретению
ранее показали, что антитело, которое распознает Ly49Q,
специфически
связывается с мышиными ИПК. Вместе с тем, антитело против Ly49Q не влияет на
активность мышиных ИПК (Blood, 1 Аргil 2005, Vol. 105, No.7,
и рр.2787-2792,;
WO2004/13325). С другой стороны, известно, что lLT7 представляет собой молекулу,
специфическая экспрессия которой отмечена
в плазмоцитоидных
дендритных
клетках (Ju XS etal., и Gепе.2004Арr28; 331:159-64; WO03/12061). Вместе стем, не
было получено антител против lLT7. Таким образом, эффекгы антител на ИПК
,остаются неизвестными.
6
BY
20509
с1
2016.10.30
lLT7 является мембранным белком, содержащим иммуноглобулиноподобный
мотив. В публикациях о нем указано, что он представляет собой одну из молекул,
экспрессируемую
в клетках миелоидной системы или лимфатической
(Соlоппа М et al., Seminars
in
системы
lmmunology 12:121-127, 2000). Многочисленные
молекулы, имеющие аналогичные lLT7 струкryры, упоминаются как семейство lLT.
Тао<е семейство lLT имеет струкryрное подобие с рецепторами ингибиторов клетоккиллеров (KlR). Наряду с другими молекулами семейства lLT, lLT7 имеет четыре
иммуноглобулиноподобных домена С-типа. Считается, что lLT7 посылает сигналы
активации
в клетку, как в случае с lLTl , llТl-подобным белком, lLT8 и
Имеются доказательства,
что
LlRбa.
молекула, принадлежащая семейству lLT,
экспрессируется в клетках гемоцитарной системы (Young et al., lmmunogenetics 53:
27О-278,200'1; "The KlR Gene Cluste/'. Саrriпgtоп, Маry and Nоrmап, Paul. Bethesda
(MD): National Library of Medicine (US), NCB|; 2003).
flополнительно, пугем субтракгивной гибридизации выявлена высокая
экспрессия lLT7 в плазмоцитоидных дендритных клетках (ПДК), и низкая экспрессия
lLT7 выявлена
в
дендритных клетках моноцитарного происхощдения (,QКМП).
Экспрессия lLT2 и lLT3 наблюдалась не только в ПДК, но таюке и в дендритных
клетках
(,ЩК),
полученных из положительных клеток,ЩКМП или CD34. Вместе с тем,
поскольку мРНК в lLT7 специфически экспрессируется в П!К, было выявлено, что
мРНК может служить маркером ПДК. Дополнительно было обнарркено, что в этом
случае экспрессия lLT7 снижается пrrем стимуляции CpG (Ju XS et al. Gепе.2004
Арr28;
331
:159-64; WO03/12061).
Авторы согласно изобретению подтвердили, что изучение человеческой ИПК
содействовало специфической экспрессии lLT7 в ИПК. Кроме того, авторы согласно
изобретению делали попытку получить антитела к lLT7 и объяснить эффекгы.
Например, молекулы, составляющие семейства lLT, такие как lLT2 и lLT3, обладают
высокой консервативностью, особенно в аминокислотных последовательностях
внеклеточных доменов (фиг. 9). Эти семейства lLT в разных клетках крови
проявляют, соответственно, харакrерные профили экспрессии. В этой связи очень
важной задачей является получение антитела, которое способно иммунологически
различать другие молекулы семейства lLT и lLT7. Вместе с тем, в силу препятствий,
описанных ниже, с использованием в качестве иммуногена lLT7, факrически трудно
получить антитело, которое специфически связывается с человеческими ИПК.
Обычно белок, полученный технологией рекомбинантных генов, используют в
качестве иммуногена мя получения антитела, которое распознает следовые
1
BY
20509
с1
201б.10.30
количества белков, происходящих из живых организмов. Авторы согласно
изобретению сделали попытку экспрессировать человеческиЙ
информации
о
lLT7 на
основе
последовательности оснований цЩНК человеческого lLT7, который
уже был обнар}Dкен, и аминокислотноЙ последовательности, кодируемой
последовательНбСтью оснований (номер досryпа в GenBank Accession Ns
NM_012276). Вместе с тем, в нормальных условиях авторы соrласно изобретению не
могли получить рекомбинантный человеческий lLT7.
Часто для получения белкового антитела осуществлялись
попытки
использования части аминокислотной последовательности природного белка
в
качестве иммуногена. Вместе с тем, существует небольшое число аминокислотных
последовательностей в белках, специфичных для человеческого lLT7, поскольку в
семействе lLT
чрезвычайно высока гомология
аминокислотных
последовательностей. Кроме того, существует необходимость выбора области,
составляющей участок, который распознается антителами в качестве эпитопа на
поверхности клеток с целью предоставления антителам возможности распознавать
молекулы на поверхности клеток. Поэтому считалось, что невозможно создать
антитело, которое является 'специфичным
для lLT7, плем
использования
фрагмента аминркислотной последовательности в качестве иммуногена.
Авторы согласно изобретению показали, что в указанных условиях можно
получить антитело, которое связывается с ИПК пуrем использования специального
иммуногена. !ополнительно, авторы согласно изобретению выявили, что
полученное таким образом антитело специфически распознает человеческие ИПК и
обладает дополнительным эффекгом реryляции активности, и таким образом
успешно осуществили настоящее изобретение. Таким образом, настоящее
изобретение от[юсится к нижеуказанному анти-lLТ7-антителу, способу его получения
и к его использованию.
[Эффекты, связанные с настоящим изобретениемI
Настоящее изобретение обеспечивает иммуноrен, полезный для получения
антитела, которое распознает человеческий lLT7,
и
способ
получения
античеловеческого антитела lLT7 с использованием иммуногена. lLT7 представляет
собой мембранный белок, принадлежащий семейству lLT.
В
частности,
последовательность внеклеточноrо домена в семействах lLT
является высоко консервативной. Поэтому получение антитела, которое распознает
представителей семейства lLT, посредством общепринятых способов иммунизации,
аминокислотная
"'
представляет собой чрезвычайно трудную задачу.
8
BY
в
20509
с1
201б.10.30
с настоящим изобретением мономональное антитело,
к связыванию с внеклеточным доменом человеческого lLT7, или его
соотвgдствии
способное
фраrмент с антигенсвязывающей областью содержит в качестве CDR1, CDR2 и
CDR3 в вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи
аминокислотные последовательности, выбранные из
i) SDYAWN
-
i)
-
iii):
CDR1 вариабельной области тяжелой цепи последовательности
SEQ lD No 5в,
Y|SYSGSTSYNPSLKSR
- CDR2
последовательности SEQ lD NO 59
и
СDRЗ
SPPYYAMDY -
вариабельной области тяжелой цепи
вариабельной области тяжелой
цепи
последовательности SEQ lD NO 60;
CDR1
-
KASQDVGTAVA
вариабельной области легкой
цепи
последовательности SEQ lD NO 61,
WASTRHT
SEQ lD NO 62
-
CDR2 вариабельной области легкой цепи последовательности
и
QQYSSYPLT - СDRЗ вариабельной области легкой цепи последовательности
SEQ lD NO 63;
ii) SYW|H
-
CDR1 вариабельной области тяжелой цепи последовательности
SEQ lD No 64,
R|YPGTGSTYYNEKFKG - CDR2 вариабельной области тяжелой
последовательности SEQ lD NO 65
и
YPTYDWYFDV
-
CDR3
цепи
вариабельной области тяжелой
цепи
вариабельной области легкой
цепи
последовательности SEQ lD NO 66;
RASaS|SNYLH
CDR1
-
последовательности SEQ lD NO 67,
YASQS|S
SЕQlDNо68и.
-
CDR2 вариабельной области легкой цепи последовательности
QQSNSWPLT - CDR3 вариабельной области легкой цепи последовательности
SEQ lD NO 69
и
iii) SDYAWN - CDR1 вариабельной области тяжелой цепи последовательности
SEQ lD No 70,
YlSYSGSTSYNPSLKSR
- CDR2
последовательности SEQ lD NO 71
ALPLPWFAY -
вариабельной области тяжелой цепи
и
СDRЗ
вариабельной области тяжелой
9
цепи
вY
20509
с1
201б.10.30
последовательности SEQ lD NO 72;
KASQDVGTAVA
- CDR1
вариабельной области легкой
цепи
последовательности SEQ lD NO 7З,
WАSТRНЪ - CDR2 вариабельной области легкой цепи последовательности
SEQ lD NO 74
и
QQYSSYPYT - CDR3 вариабельной области легкой цепи последовательности
SEQ lD No 75.
Предпостительно моноклональное антитело или его фрагмент с
антигенсвязывающей областью способно к связыванию с внеклеточным доменом
человеческого lLT7 на человеческой интерферонпродуцирующей клетке.
в качестве вариабельной области тяжелой цепи и
вариабельной области легкой цепи содержит зрелую последовательность
Таюке предпочтительно
аминокислотной последовательности, которая выбрана из (а)-(с):
а) вариабельная область тяжелой цепи последовательности SEQ lD NO 39 и
вариабельная область легкой цепи последовательности SEQ lD NO 41
Ь) вариабельная область тяжелой цепи последовательности
,
SEQ lD NO 43
и
вариабельная область легкой цепи последовательности SEQ lD NO 45 или
с) вариабёльная область тяжелой цепи последовательности SEQ lD NO 47
и
вариабельная область легкой цепи последовательности SEQ lD NO 49.
,Щругим объектом изобретения является полинуклеотид, кодирующий
моноклональное антитело или его фрагмент с антигенсвязывающей областью.
Еще одним объекгом изобретения является вектор экспрессии, содержащий
полинуклеотид, кодирующий моноклональное антитело
или его фрагмент с
антигенсвязывающей областью.
.Щругим объекrом изобретения является трансформированная метка,
сохраняющая вектор экспрессии по п.5.
В
соответствии с
настоящим изобретением способ
получения
моноклонального антитела или его фрагмента с антигенсвязывающей областью, при
котором осуществляют культивирование трансформированной клетки и извлечение
из кульryры моноклонального антитела или его фрагмента с антиrенсвязывающей
областью.
Еще одним объекrом изобретения является способ получения
клетки,
продуцирующей моноклональное антитело, при котором осуществляют сJIедующие
стадии:
('1)
введение иммунному животному клетки, которая экспрессирует экзогенный
l0
BY
20509
с1
201б.10.30
белок, содержащий внеклеточный домен человеческого lLT7, и экзогенной
молекулы, ассоциированной с человеческим lLT7, представляюtцей собой белок
клеточной мембраны, являющийся y -цепью Fс-рецептора, и
(2) отбор клетки, продуцирующей моноклональное антитело, связывающееся
с внеклеточным доменом человеческого |LT7, из иммунного животного.
Предпочтительно в качестве клетки, которая экспрессирует экзогенный белок,
содержащий внеклеточный домен человеческоrо lLT7, и экзогенной молекулы,
ассоциированной с человеческим lLT7, используют клетку , сохраняющую при
экспрессии признаки (а) и
(а)
(Ь):
экзогенный полинуклеотид, кодируюtлий
аминокислотную
последовательность, содержащую внеклеточн ый домен человеческого l LT7, и
(Ь) экзогенный полинуклеотид, кодирующий y -цепь Fс-рецептора.
Наиболее предпочтительно используют клетку животного. Так же
предпочтительно используют клетку человека. Предпочтетльно в качестве клетки
человека используют клетку 293Т.
В другом усовершенствовании дополнительно осуществляют
клонирование
отобранной клетки.
Моноклональное антитело согласно изобретению способно к распознаванию
человеческого lLr7, или его фрагмент с антигенсвязывающей областью, полученное
пугем осуществления следующих стадий:
(1) введения иммунному животному клетки, которая экспрессирует экзогенный
белок, содержащий внеклеточный домен человеческого lLT7, и экзогенной
молекулы, ассоциированной с человеческим lLT7, представляющей собой белок
клеточной мембраны, являющийся y-цепью Fс-рецептора,
(2) отбора клетки, продуцирующей мономональное антитело, связывающееся
с внеклеточным доменом человеческого lLT7, из иммунного животного,
(3) культивирования клетки, отобранной на стадии (2), и извлечения
из
кульryры моноклонального антитела, способного распознавать человеческий lLT7.
Еще одним объекгом изобретения является иммуноген для получения
моноклонального антитела по п.1, представляющий собой клетку животного,
в
которой (а) полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность,
содержащую внеметочный домен человеческого lLT7, и (Ь) полинуклеотид, который
кодирует у-цепь Fс- рецептора, удерживаются экзогенно-экспрессируемым образом
или во фракции клеточной мембраны. Предпочтительно клетка животного является
клеткой человека.
ll
BY
20509
с1
201б.10.30
,Щругим обьекгом изобретения является
способ
обнаруrкения
интерферонпродуцирующей клетки, при котором осуществляют следующие стадии:
контактирование моноклонального антитела или его фрагмента с
антигенсвязывающей областью с тестируемой клеткой и
выявление моноклонального антитела или
его
фрагмента
с
антигенсвязывающей областью, связанного с клеткой.
Еще одним объекгом изобретения является реагент для
обнарркения
интерферонпродуцирующей клетки, оодержащий моноклональное антитело или его
фрагмент с антигенсвязывающей областью.
В соответствии с настоящим изобретением способ ингибирования активности
интерферонпродуцирующей клетки in vitro, при котором интерферонпродуцирующую
клетку приводят в контакт с компонентом, выбранным из
(а) моноклонального антитела или его фрагмента с антигенсвязывающей
областью,
и
(Ь) иммуноглобулина, в который встроена определяющая комплементарность
область моноклонального антитела, указанного в (а), или его фрагмента с
антигенсвязывающей областью.
Предпочтительно активность интерферонпродуцирующей
активностью иlили
интерферонпродуцирующей
клетки является
выживаемостью
интерферонпродуцирующей клетки.
Еще одним объекrом
изобретения является ингибитор активности
интерферонпродуцирующей клетки, содержащий в качестве активного ингредиента
моноклональное антитело или его фрагмент с антигенсвязывающей областью.
Предпочтительно активность интерферонпродуцирующей клетки является
интерферонпродуцирующей
активностью иlили
выживаемостью
интерферонпродуцирующей клетки.
Авторы согласно изобретению показали, что антитело, распознающее
человеческий lLT7, можно легко получить при использовании клеток животных, в
которых lLT7 коэкспрессируется с белком клеточной мембраны. Анти-lLТ7-антитело,
которое можно получать согласно настоящему изобретению, обладает высокой
специфичностью, и отличает клетки, экспрессирующие другие семейства lLT, от
клеток, которые экспрессируют человеческие Ипк.
В предпочтительном варианте осуществления античеловеческое антитело
lLT7, обеспечиваемое согласно настоящему изобретению, связывается с
человеческими Ипк. flополнительно, антитело согласно изобретению специфически
l2
вY
20509
с1
201б.10.30
распознает человеческие ИПК. Таким образом, оно является полезным для
обнарркения и выделения ИПК. ИПК представляет собой клетку, которая
вырабатывает большую часть интерферона 1 типа. Поэтому ее обнаружение
и
выделение является важным для диагностики и изучения заболеваний, таких как
ауrоиммунные заболевания, в которые вовлечены ИПК. В особенности, согласно
результатам авторов согласно иэобретению, в присутствии ИФНо экспрессия lLT7 в
ИПК не снижается. У больных с аутоиммунными заболеваниями часто повышена
экспрессия ИФНо. Это означает, что анти-lLТ7-антитело согласно изобретению
можно использовать для обнаружения и выделения ИПК, например,
у больных с
аrrоиммунными заболеваниями, у которых повышена экспрессия ИФНо.
В предпочтительном варианте осуществления анти-lLТ7-антитело согласно
изобретению действует в качестве реryлятора активности человеческих ИПК. Таким
образом, анти-lLТ7-антитело согласно изобретению можно использовать для
ингибирования активности ИПК. Как описано ранее, экспрессия lLT7 в ИПК не
снижается в присуrствии ИФНо. Поэтому можно ожидать терапевтический эффекг у
больных с аутоиммунными заболеваниями, при которых повышена экспрессия
ИФНо, при ингибировании активности ИПК антителом согласно изобретению.
Ограниченное число ИПК продуцируют большое количество ИФН. Антитела,
таюке как и молекулы ИФН, необходимы для нейтрализации ИФН. Вместе с тем,
соrласно настоящему изобретению, активация продуцирующих клеток ингибируется
прямым образом. В результате можно ожидать мощного ингибирующего действия на
ИФН, даже в случае использования меньшего количества антител, по сравнению с
нейтрализацией анти-ИФН-антителом. Кроме того,
в случае
продолжительной
продукции ИФН, прогнозируется, что нейтрализация антителами ИФН представляет
собой транзиторное ингибирование. В настоящем изобретении при ингибировании
активности ИПК можно ожидать, что ингибирующее действие на продукцию ИФН
будет происходить на протяжении длительного периода времени.
краткое описание фиryр
Фиryра 'la представляет собой фотографию, на которой способом RТ-ПЦР
(полимеразной цепной реакцией в реальном времени) изучали экспрессию мРНК
гена lLT7. На ней отражен результат анализа экспрессии мРНК гена lLT7
в
человеческих иммуноцитах,
Фиryра 'lb представляет собой диаграмму, на которой показано сравнение
экспрессии мРНК гена lLT7 в разных тканях и клетках человека, изученной с
применением методики количественной
lз
Пцр. На
горизонтальной
оси
показаны
вY
20509
с1
2016.10.30
исследованные ткани и клетки, а на вертикальной оси показан уровень экспрессии
lLT7, который стандартизирован в соответствии с уровнем экспрессии гена GAPDH.
Фиryра
2
представляет собой диаграмму, показывающую струкгуры белка
lLT7, где на фиг.2 (а) приведена аминокислотная последовательность белка lLT7,
на
и
фиryре показана рассчитанная секреция сигнальной
последовательности и трансмембранный домен, и на фиr. 2 (Ь) показана
дополнительно
схематическая диаграмма белков lLT7, которые кодируются сконструированными
векторами экспрессии,
в
Фиryра 3 представляет собой диаграмму, показывающую результат введения
клетки вектора экспрессии lLT7
и
вектора экспрессии FсRу,
исследования экспрессии молекул lLT7
проточной цитометрии
на
и
результат
поверхности клеток посредством
FСМ. На горизонтальной оси отложена
интенсивность
а именно,
интенсивность
флуоресценции, обнарlокиваемая в анти-FLАG-антителе,
экспрессии на клеточной поверхности молекул lLT7, к которым присоединена метка
FLAG, и на вертикальной оси отложено число клеток.
На фиryре 4 показаны фотографии, на которых в клетки были введены вектор
экспрессии lLT7 и векгор экспрессии FсRу, и ассоциацию молекул анализировали
пrгем иммунопреципитации и Вестерн-блоттинга. Слева схематически отображены
результаты блотинга молекулы lLT7 с антиFLАG-антителом после
иммунопреципитации молекулы FсRу анти-mус_антителом (фиryра сверry), и
блоттинг молекулы FсRу с анти-mус-антителом (фиryра снизу), Аналогично, справа
схематически изображены результаты блоггинга молекулы lLT7 с антителом
антиFLАG после иммунопреципитации молекулы FcRy с антителом антиFLАG
(выше) и блоггинга молекулы FcRy с анти-mус-антителом (ниже).
rли
5
представляет собой фотографию, полученную при изучении
козилирования молекулы lLT7 посредством введения в клетку вектора
Фиryра
экспрессии lLT7 и векrора экспрессии FсRу и обработки N-гликозидазой. Слева на
фотографии показаны размеры lLT7 без обработки lLT7 N-гликозидазой, а справа
показаны размеры lLT7 при обработке N-гликозидазой.
Фиryра ба представляет собой диаграмму результатов изучения реактивности
полученного моноклонального анти-lLТ7-антитела пуIем анализа FСМ. (а) показан
результат анализа связывания анти-lLТ7-антитела с фракцией BDCA-2положительных ИПК посредством использования лимфоцитов периферической
крови человека и двойного окрашивания анти-lLТ7-антител и анти-ВDСА-2-антител.
Вертикальная ось показывает реактивность к ВDСА-2-антителу,
l4
а
горизонтальная
BY
20509
с1
201б.10.30
ось показывает реактивность к кащдому из полученных анти-lLТ7-антител.
Фиryра бЬ представляет собой диаграмму результатов исследования пут,ем
анализа FСМ реакrивности полученных моноклональных анти-lLТ7-антител. (Ь)
показан результат связывания анти-lLТ7-антитела с молекулой lLT7, полученный с
использованием клеток 293Т, в которые были встроены векторы экспрессии lLT7
и
FсRу. Вертикальная ось соответствует реактивности анти-FLАG-антитела, а именно,
интенсивности экспрессии молекул lLT7, к которым присоединили метку FLAG, а
горизонтальная
ось
соответствует реактивности соответствующих анти-lLТ7-
антител.
На фиryре 7 представлены диаграммы результатов исследования
путем
анализа FСМ реактивности двух клонов из полученных моноклональных анти-lLТ7антител лимфоцитов периферической крови человека. Три диаграммы слева
соответствуют результатам Ns11, а на трех диаграммах справа показаны результаты
Ns17. На диаграммах слева кащцая ось, отмеченная lLT7, отражает реактивность
lLT7 N911. Аналогично на диаграммах справа кащдая ось, отмеченная lLT7, отражает
реактивность lLT7 Nsl 7.
На фиryре 8 показан результат сравнения и изучения активности связывания
полученных моноклональных анти-lLТ7-антител lLT7 N91 '1 и lLT7 N917 с
человеческими лимфоцитам
с
активностью связывания анти-ВDСА-2-антитела.
Вертикальная ось означает реактивность анти-СD123-антитела, а горизонтальная
ось означает реактивность ках(дого антитела. Таким образом, кащдое антитело
связывается с г{астком СDl23-положительной клетки. На этой диаграмме показаны
результаты анализа реактивности при стимуляции лимфоцитов двумя видами CpGs
и ИФНо.
Фиryра 9а представляет собой диаграмму, показывающую аминокислотные
последовательности молекул семейства с высокой гомологией с молекулами lLT7.
Ках(qая аминокислотная последовательность внеклеточного домена показана
главным образом в виде выравнивания; фиг. 9Ь является продолжением фиг. 9а; и
фиг. 9с является продолжением фиг. 9Ь.
На фиryре 10 показаны результаты изучения реактивности
полученных
моноклональных анти-|LТ7-антител lLT7 Nsl 1 и lLT7 N917 в отношении молекул lLT1
,
lLT2 и lLT3, при использовании клеток, в которые были встроены их векторы
экспрессии. На верхней диаграмме показаны результаты, подтвердившие
реактивность в отношении клеток, в которых молекулы lLT7 с меткой FLAG
коэкспрессировались с FсRу. На нижней диаграмме показаны результаты изучения
15
вY
20509
с1
201б.10.30
реактивности в отношении клеток, в которые вставляли lLTl , lLT2, lLT3 и FcRy
(левая диаграмма: lLT7 N911, правая диаграмма: lLT7 N917). На горизонтальной оси
показана реакти вность ках(qого
Фиryра
а
нти-l LТ7-антитела.
11
представляет собой диаграмму, показывающую действие
полученных моноклональных анти-lLТ7-антител lLT7 Ns'l 1 и |LT7N017 на
интерферонопродуцирующую способность человеческих лимфоцитов.
Горизонтальная ось диаграммы соответствует концентрации ИФНо в супернатанте
культуры при стимуляции лимфоцитов человека вирусом гриппа, а на вертикальной
оси показаны обработанные антитела. Термин "отсугствие инфекции" означает
результаты, полученные на клетках, которые не стимулировали вирусом гриппа.
Фиryра 12 представляет собой диаграмму, показывающую CDC активность
(комплементзависимую цитотоксичность) полренных моноклональных анти-lLТ7антител lLT7 N937, lLT7 N928 и lLT7 Ns33. !аже при использовании моноклональных
анти-lLТ7-антител, полученных из какой-либо гибридомы, 80% или больше CDC
активности проявлялось при концентрации антитела 0,1 мкг/мл или выше. В случае
других антител, отличных от моноклонального анти-lLТ7-антитела, CDC акгивности в
отношении клеток-мишеней не наблюдалось.
Фиryра 1З представляет собой диаграмму, показывающую интернализацию
полученных моноклональных анти-lLТ7-антител |LT7 Ns17, lLT7 N926, lLT7 Ns37, lLT7
Ns28 и lLT7 N933 с клетками-мишенями.
Интенсивность флуоресценции аллофикоцианина (АРС)
является
индикатором количества иммунных комплексов lLТ7-анти-lLТ7-антитело, которые
присугствуют на клеточной поверхности перед инкубацией, - и она обнаруживается
независимо от того, присrгствует ли иммунный комплекс lLТ7-анти-lLТ7-антитело
-
на клетке-мишени или включается в клетку после инкубации. С другой стороны,
интенсивность флуоресценции флуоресцеина изоцианата (FlТС) - является
индикатором количества иммунных комплексов lLТ7-анти-lLТ7-антитело, которые
оста ются
на поверхности клеток после инкубации. Таким образом, интенсивность
флуоресценции FlТС уменьшается при интернализации.
Лччший способ осчще ствления изобретения
Имеются сообщения, что человеческий lLT7 (иммуноглобулиноподобный
транскрипт 7) является молекулой, которая специфически экспрессируется в
плазмоцитоидных дендритных клетках (Gene. 2004 Арr 28i 3З1 :1 59-64;
WO03/12061). С друrой стороны, таюке известно, что человеческие lLT7 можно
использовать как прогностический индикатор для
lб
прогноза
лимфомы
вY
20509
(WO2005/24043). Вместе
с
с1
201б.10.30
тем, не существует принятого способа
получения
антитела, способного распознавать человеческий lLT7
Человеческий lLT7 состоит из 499 аминокислотных остатков, как показано в
SEQ lD NO:2, и представляет собой трансмембранный белок 1 типа, содержащий
в
струкryре четыре иммуноглобулиноподобных домена и одну трансмембранную
область (445-466; от 429 до 450 в SEQ lD NO:2). Из 444 аминокислотных остатков,
включающих в себя N-конец, 16 аминокислотных остатков (от -15 до -'1 в
NO:2) являются сигнальными последовательностями,
аминокислотных остатка (от 1 до 428 в
SEQ
и от 17 до
SEQ lD NO:2) составляют
lD
444
внеклеточный
домен. С другой стороны, С-концевая область представляет собой внугриклеточный
домен. Большинство участков человеческого lLT7 являются внеметочными
доменами, и 33 аминокислотных остатка составляют внуrриклеточный домен (от 467
до 499; от 451 до 483, в SEQ lD NO:2). Не предполагается, что во внrтриклеточном
домене присrгствует мотив, вовлеченный в передачу сигнала. Непроцессированная
аминокислотная последовательность человеческого lLT7 показана в SEQ lD NO:2 и
последовательность оснований ЦНК,
кодирующая аминокислотную
последовательность, показана в SEQ lD NO:1. В этом случае кодирующие области
зрелого пептида (72).,.(1520), показанные в SEQ lD NO:'l, не содержат кодоны
терминации и инициирования. Таким образом, кодирующие белок
последовательности, которые содержат кодоны терминации и инициирования,
указаны в SEQ lD NO:1 от 24 до 152З.
Считается, что лигандный сигнал передается
человеческого lLT7
с
в
клетки пrтем ассоциации
сигнал-трансдуцирующей молекулой. Например,
в
клетках
присуrствует большинство у-цепей Fс-рецептора. !ополнительно, внрриклеточный
домен содержит мотив активации на основе тирозина иммунорецептора (|TAM),
который вовлечен в передачу сигнала. |TAM представляет собой участок
аминокислотной последовательности, которая обычно обнарlокивается в
адапторных молекулах, связанных с иммунорецепторами, такими как Fс-рецепторы.
В
|TAM содержится, например, мотив YxxL (SEa lD NO:76), который является
мишенью фосфорилирования тирозина, и передача сигнала осуществляется
фосфорилированием. Известные примеры сигнал-трансдуцирующей молекулы,
которая содержит |TAM во внугриклеточном домене, включают в себя CD3( и
DAP12, в дополнение к y-цепи рецептора Fс. Среди этих сигнал-трансдуцирующих
молекул молекула, связанная с человеческим lLT7, предположительно является yцепью Fс рецептора. В настоящее время не выявлен лиганд, который связывается с
1,7
вY
20509
с1
201б.10.30
человеческим lLT7.
Авторы согласно изобретению
в
генном анализе подтвердили, что lLT7
специфически экспрессируется в человеческих ИПК. Авторы согласно изобретению
считают, что при изучении ИПК может быть полезным возможность получения
антитела, способного иммунологически отличать человеческие lLT7 от других
молекул. Вместе с тем, в семействе lLT существует множество молекул с
подобными струкryрами, включающими в себя lLT7. Молекулы, такие как lLTl , lLT2,
lLT3, lLT4, ILTS, lLTб или LlR-8, содержат высокогомолоrичные аминокислотные
в их внеклеточных доменах. Поэтому авторы
согласно изобретению считают, что имеются трудности в получении антитела,
способного различать эти молекулы при использовании в качестве иммуногена
последовательности, особенно
пептидный домен, содержащий часть аминокислотной последовательности, которая
составляет внеклеточный домен, 3атем авторы согласно изобретению пробовали
получить антитело против человеческого lLT7, используя в качестве иммуногенов
клетки, экспрессирующие человеческий lLT7.
Вместе с тем, использование общепринятых векторов экспрессии не
приводило к экспрессии ц[НК человеческого lLT7 в животных клетках. Имелись
сообщения, что молекула lLTl, имеющая струкryру, очень сходную со струкryрой
lLT7, связывается с y-цепью Fс-рецептора. Таким образом, когда в качестве клеток-
хозяев использовали клетки, в которых экспрессировалась y-цепь Fс-рецептора,
такие как клетки RBL (базофильной лейкемии крыс) и клетки
PBlS
(мастоцитомы
мышей), наблюдалась экспрессия lLT1 на поверхности клетки. Вместе с тем, если
экспрессию lLT7 вызывали
на
клетках 293,
в
которых у-цепь Fс-рецептора
изначально на экспрессировалась, экспрессия на клеточной поверхности не
С
другой стороны, показано, что экспрессию lLT1 на клеточной
поверхности можно достоверно выявлять, когда lLT1 коэкспрессируется с y-цепью
наблюдалась.
Fс-рецептора (Nakajima Н. et а|,,
J. lmmunology
162:5-8. 1999). Вместе
с тем,
не
существует какой-либо информации об иммуногене для получения антитела lLT7.
Например, по сообщениям, клетки RBL,
используются как иммуногены
в
которые введен ген lLTl
для получения антитела lLT1. Авторы
,
согласно
изобретению пробовали получить антитела lLT7, используя комбинацию клеток RBL
с геном lLT7 тем же образом, как описано выше. Вместе с тем, даже если в клетках
RBL (Р815) вызывалась экспрессия lLT7, экспрессии lLT7 на поверхности клеток не
наблюдалась, и таким образом, его нельзя использовать в качестве иммуногена.
Авторы согласно изобретению провели исследование, предназначенное
18
мя
вY
20509
с1
2016.10.30
получения антитела, способного распознавать человеческий lLT7. В результате
авторы согласно изобретению выявили, что желательное антитело можно получить
путем использования в качестве иммуногена специфически тренсформированной
клетки, и осуществили настоящее изобретение. Таким образом, настоящее
изобретение относится к моноклональному антителу, которое связывается с
внеклеточным доменом человеческого lLT7, и относится к фрагменry, содержащему
его антигенсвязывающую область.
В настоящем изобретении человеческий lLT7 можно определять как молекулу
природного происхощqения, которая экспрессируется в человеческих ИПК, или как
молекулу, которая является иммунолоrическим эквивалентом lLT7, который
экспрессируется в человеческих ИПК. В настоящем изобретении связывание
антител с человеческим lLT7 можно подтверх(дать, например, следуюlлим образом,
-
flоказательство, основанное на реактивности к клеткам человека:
Согласно результатам авторов согласно изобретению, в человеческих ИПК
наблюдалась специфическая экспрессия человеческого lLT7, Вначале человеческий
lLT7 выделяли как ген, экспрессия которого обнарркена
в
плазмоцитоидных
,100;
3295-3303, Gепе. 2004 Арr 28;
дендритных клетках (Blood. 2002
331 :,l59-64).
Кроме того, известно Talot(e, что его можно использовать как маркер
плазмоцитоидных дендритных клеток (WO03/12061). Предполагается, что
плазмоцитоидные дендритные клетки и ИПК представляют собой почти идентичные
популяции клеток, или имеют общие большие участки. Поэтому не существует каких-
либо противоречий мехqцу указанными публикациями и результатами, полученными
авторами соrласно изобретению.
Во-первых, при рассмотрении в настоящем изобретении указанного профиля
экспрессии человеческого lLT7, считается, что одним из важных свойств антитела,
которое связывается с человеческим lLT, является активность связывания ИПК или
плазмоцитоидных
дендритных
клеток
по
субпопуляцией. Маркеры меточной
меньч.lей
мере
с
определенной
поверхности, специфичные для
соответствующих клеточных популяций, можно использовать, чтобы определить,
является ли конкретная клетка меткой ИПК или плазмоцитоидной дендритной
клеткой. Например, связывание с желательными клетками можно подтверщqать
двойным окрашиванием с антителом, которое связывается с маркерами клеточной
поверхности и с антителом, связывающую активность которого необходимо
проверить. Таким образом, ИПК
в настоящем изобретении содержат,
клетки, которые экспрессируют BDCA2.
l9
например,
-
BY
20509
с1
!оказательство, основанное
2016.10.30
на
реактивности
к
трансформированным
клеткам, экспрессирующим человеческий ген lLT7:
Авторы согласно изобретению обнаруlкили восстановление иммунологических
свойств lLT7, экспрессируемого
в
человеческих ИПК, еGли экспрессию
человеческого гена lLT7 проводили в конкретных условиях. Поэтому, реактивность к
человеческому lLT7 таюке можно подтверх!qать на основании реактивности антител
к клеткам, в которые искусственно введен ген, кодирующий lLT7. Таким образом,
настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, которое содержит в
качестве внеметочного домена аминокислотную последовательность,
составляющую внеклеточный домен, и связывается с молекулой, которая
коэкспрессируется с сигнал-трансдуцирующей молекулой или относится к
фрагменry, содержащему его антигенсвязывающую область. В настоящем
изобретении указано, что внеклеточный домен составлен из аминокислотной
последовательности, которая соответствует положениям от 17-ого до 444-ого в N-
концевой аминокислотной последовательности, показанной
(положения от 1 до 428 в SEQ lD NO:2).
Например, иммунологические свойства
lLT7,
в SEQ lD
NO:2
экспрессируемого
в
человеческих ИПК, сохраняются в клетках, совместно трансфицируемых вектором
экспрессии, который содержит .QНК, кодирующую человеческий lLT7, и вектор
экспрессии, который содержит ДНК, кодирующую сигнал-транqдуцируюшую
молекулу. Таким образом, трансформированная клетка, которая коэкспрессирует
человеческий
lLT7 и
предпочтительной
мя
сигнал-трансдуцирующую молекулу, является
подтверщдения связывающей аффинности антител
внеклеточному домену человеческого lLT7 согласно изобретению,
В
к
настоящем
изобретении в качестве контроля желательно использовать нетрансформированную
клетку, если реактивность антител подтверх(дается с
использованием
трансформированной клетки. Кроме того, важно таюке подтверщдение отсуIствия
связывания антител при использовании в качестве контроля той же клетки-хозяина,
которая экспрессирует только сигнал-трансдуцирующую молекулу.
В настоящем изобретении молекулу, которая индуцирует экспрессию
человеческого lLT7 на клеточной поверхности, можно использовать как сигналтрансдуцирующую молекулу для коэкспрессии. В настоящем изобретении сигналтрансдуцирующую молекулу можно таюке определить как молекулу, способную
придавать иммунологическое свойство человеческого
lLT7
природного
происхощдения по меньшеЙ мере внеклеточному домену молекулы lLT7 в клетке,
20
вY
20509
которая экспрессирует lLT7.
с1
201б.10.30
Используемый в настоящем
"иммунологические свойства" человеческого
изобретении термин
lLT7 природного
происхощдения
означает распознавание антителом, которое связывается с человеческими ИПК.
В
частности, предпочтительно использование в качестве сигналтрансдуцирующеЙ молекулы Y-цепи Fс-рецептора или DДР'l2. В настоящем
изобретении у-цепь Fс-рецептора особенно предпочтительна в качестве сигналтранqдуцирующей молекулы. Указанная у-цепь Fс-рецептора представляет собой
молекулу, состоящую из аминокислотных последовательностей, показанных в SEQ
lD NO:16. Сигнал-трансдуцирующая молекула может представлять собой фрагмент,
поскольку человеческий lLT7, предназначенный для коэкспрессии, локализуется на
клеточной поверхности. Так как человеческий lLT7 для коэкспрессии локализуется
на клеточной поверхности, в аминокислотных последовательностях, показанных
SEa lD
в
NO:16, допускаются мrrации или добавления аминокислотной
последовательности. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает
способы получения меток, которые продуцируют моноклональное антитело,
связывающееся
с
внеклеточным доменом человеческого lLT7, которые содержат
следующие этапы:
(1) введение иммунным животным клетки, которая экспрессирует экзогеннЫЙ
белок, содержащий внеклеточный домен человеческого lLT7,
и
молекулы,
содержащей аминокислотные последовательности, описанные в SEQ lD NO:16; и
(2) выбор антитело-продуцируюu]ей клетки, которая продуцирует антитело,
связывающееся с человеческим lLT7, из антитело-продуцирующей клетки иммунных
животных
Соответственно, в качестве антитела, связывающегося с человеческим lLT7, в
настоящем изобретении предпочтительно использовать антитело,
у которого не
наблюдается перекрестной реакции с клеточными популяциями, для которых
известна экспрессия семейств lLT, отличных от lLT7. В частности, в качестве
антитела, связывающегося с человеческим lLT7, в настоящем изобретении
предпочтительно использовать антитело, у которого нельзя выявить связывание с
клеточными популяциями с известным отсутствием экспрессии семейств lLT, кроме
lLT7, в тех же условиях, как и условия, в которых достоверно подтверr(дается
связывание с ИПК. Как ранее описано, например, lLT2 и lLT3 экспрессируются не
только в плазмоцитоидных дендритных клетках П,QК, но таюке и в дендритных
клетках ЦК), происходяlцих из,ЩКМП или CD34 положительных клеток (Gene. 2004
Ар 28:
331
: 159-64). С другой стороны, экспрессию lLT7 невозможно обнаруlкить
2|
вY
20509
блаrодаря дифференцировке ИПК
с1
в
201б.10.30
дендритные клетки. Таким образом, антитело не
может обнарlокить связывание с ДК, происходящими из положительных ,ЩКМП или
CD34 клеток в условиях, при которых можно подтвердить связывание с ИПК, в
которых содержатся антитела, связывающиеся
с
человеческим lLT7 согласно
изобретению.
!алее сообщается о следующих
характеристиках экспрессии
в
отношении
других молекул семейства lLT ("The KlR Gепе Cluste/' Саrriпgtоп, Маry and Nогmап,
Paul. Bethesda (MD): National LiЬrаry of Medicine (US), NCBI; 2003, Gene. 2004 Арr 2В;
3З1: 159-64). Таким образом, антитело, которое связывается с человеческими ИПК
или ПДК, и для которого невозможно подтвердить связывание со следующими
клетками, включено в антитело, обладающее специфичностью к lLT7:
lLT'l :
метки миелоидного происхощqения (моноциты, ДК, происходящие
из
моноцитов, макрофаги);
lLT2: ПflК, В-клетки, CD34 положительные клетки,
положительных клеток, и
lLT5: моноциты,
!К, происходящие
,ЩК,
происходящие из моноцитов;
!К, происходящие
из CD34
из моноцитов;
происходящие из положительных клеток CD34, и
,ЩК,
и
lLT8: клетки, происходящие из моноцитов.
Таким образом, моноклональное антитело, которое связывается с
внеклеточным доменом человеческого lLT7, в настоящем изобретении
предпочтительно содержит моноклональное антитело, обладающее следующими
и
ммунолоrически ми свойствами:
а) моноклональное антитело связывается с человеческими ИПК; и
Ь) связывание моноклонального антитела с одной или больше клетками,
выбираемыми из группы, состоящей из моноцитов, макрофагов, В-клеток, CD34положительных клеток и дендритных клетки, происходящих из указанных меток,
невозможно подтвердить в условиях для связывания с человеческими ИПК.
В
качестве моноклональноrо антитела согласно
предпочтительно использовать антитело,
в котором связывание с
макрофагами, В-клетками, СD34-положительными клетками
и
изобретению,
моноцитами,
дендритными
клетками, происходящими из указанных клеток, невозможно подтвердить в условиях
связывания, в особенности с человеческими Ипк.
Альтернативно, моноклональное антитело, которое связывается с
внеклеточным доменом человеческоrо lLT7, в настоящем изобретении
предпочтительно содержит моноклональное антитело, обладающее следую|лими
22
вY
20509
с1
201б.10.30
иммунологическими свойствами:
с) указанное моноклональное антитело связывается с трансформированной
клеткой, которая совместно трансфицирована вектором экспрессии, экспрессивно
несущим,ЩНК, кодирующую человеческий lLT7, и вектором экспрессии, экспрессивно
несущим ДНК, кодирующую сигнал-трансдуцирующую молекулу;
d) невозможность подтверх(дения связывания с клеткой - хозяином перед
трансформацией
в условиях для связывания с совместно
трансфицированными
клетками, как описано в пункrе с); или
указанное моноклональное антитело согласно изобретению содержит
моноклональное антитело, обладающее следующими иммунологическими
свойствами:
е) связывание с меткой-хозяином, которая экспрессирует только сигналтрансдуцирующей молекулу, невозможно подтвердить в условиях связывания с
совместно трансфицированными клетками, как описано в пункге с).
В
настоящем изобретении факг несовпадения анти-lLТ7 моноклонального
антитела с другими молекулами lLT семейства можно подтвердить, используя
клетки,
в
которых была вызвана экспрессия кащqой молекулы из lLT семейства,
Таким образом, для вызванной экспрессии ФНК, кодирующую ках(дую
из
аминокислотных последовательностей lLT семейства, внедряют в соответствующую
клетку-хозяин. Моноклональное анти-lLТ7-антитело, перекрестную реакцию которого
создают для контакта с полученной трансформированной
клеткой. 3атем появляется возможность подтвердить, что, если не наблюдается
H}DKHo подтвердить,
связывание антитела
с меткой,
которая экспрессирует молекулы семейства lLT,
отличные от lLT7, антитело будет способно к иммунологическому различению lLT7 и
других молекул семейства lLT. Например, в примерах, описанных ниже,
подтверцдается факг несовпадения с lLT1 , lLT2 и lLT3 моноклональных анти-lLТ7антител, полученных согласно настоящему изобретению. Таким образом,
предпочтительным примером моноклонального антитела в настоящем изобретении
является моноклональное антитело, связывающееся
с
lLT7,
в
котором при
аналогичных условиях невозможно обнаружить связывание с lLT1 , lLT2 и lLT3.
В частности, lLT2 и lLT3 являются генами, экспрессия которых в ИПК была
подтверцдена (Ju et al. Gепе 331 , 159-164, 2004). Вместе с тем, эти молекулы могуг
проявлять характер экспрессии, уникальный для кацдого типа клетки, в зависимости
от соответствующих уровней дифференцировки в ИПК или условий, таких
как
стимуляция вирусами или другими цитокинами. Использование антитела, которое
2з
BY
20509
с1
201б.10.30
способно иммунологически отличать эти молекулы семейства lLT от lLT7, позволяет
специфически обнаруrкивать изменения в экспрессии lLT7.
Связывание моноклонального антитела, связывающую активность которого
необходимо подтвердить, с разными типами меток, можно подтверщцать на
основании, например, принципа проточной цитометрии. Для подтверщдения
реактивность антител на основании принципа проточной цитометрии имеет
преимущество мечение антитела молекулой или атомной группой, которая заранее
продуцирует обнаруrкимый сигнал. Обычно применяют флуоресцентные или
люминесцентные метки. Можно использовать флуоресцентный акгивный
сортировщик клеток (FACS)
для анализа связывания флуоресцентно
меченых
антител с клетками на основе принципа проточной цитометрии. Использование
FАСS позволяет эффекгивно подтверцдать связывание многих антител ко мноrим
клеткам.
В частности, например, антитело А, которое ранее считали
споGобным
идентифицировать ИПК, и антитело В, чьи свойства связывания с ИПК необходимо
проанализировать, реагируют с клеточными популяциями, содержащими
одновременно ИПК. Антитело А и антитело В являются мечеными флуоресцентным
сигналом, который заранее взаимно распознается этими антителами. В случае, если
оба сигнала обнарркиваются в одинаковых клеточных популяциях, можно
подтвердить связывание этих антител с этими клеточными популяциями. ,Щругими
словами, выявлено, что оба антитела А и В обладают одинаковыми связывающими
свойствами. В случае, если они связываются с разными клеточными популяциями,
очевидно, что эти два антитела обладают разными связываюцlими свойствами.
Моноклональное антитело согласно изобретению может представлять собой
фрагмент, содержащий его антигенсвязывающую область. Например,
в
качестве
антитела согласно изобретению можно использовать фрагмент антитела,
содержащий область связывания антигена, который получен путем
ферментативноrо расщепления lgG. Конкретно, фрагменты антител, такие как FаЬ и
F(аЬ')2 можно получать расщеплением папаином или пепсином. Известно, что эти
фрагменты антител можно использовать как молекулы антител, обладающие
аффиностью к антителам, С другой стороны, таюке можно использовать антитела,
сконструированные технологией рекомбинантных генов, при условии сохранения
удовлетворительной активности связывания с антигеном. Примеры антител,
сконструированных технологией рекомбинантных генов, содержат химерные
антитела, СDR-трансплантированные антитела (антитела с трансплантированными
24
BY
20509
с1
201б.10.30
участками, определяющими комплементарность), одноцепочечные FvS, димеры,
линейные антитела и полиспецифичные антитела, образованные из фрагментов
антител. Общеизвестно, что указанные антитела можно получать при использовании
моноклональных антител или антитело-продуцирующих клеток, которые
вырабатывают антитела.
Моноклональное антитело согласно изобретению может быть получено при
в качестве иммуногена специфичной трансформированной метки.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения клеток,
продуцирующих моноклональное антитело, которое связывается с внеклеточным
использовании
доменом человеческого lLT7, который содержит следующие этапы:
(1) введение иммунным животным клетки, которая экспрессирует экзогенный
белок, содержащий внеклеточный домен человеческого lLT7,
и
молекулы,
содержащей аминокислотные последовательности, опис€lнные в SEQ lD NO:16; и
(2) выбор антитело-продуцирующей клетки, которая продуцирует антитело,
связывающееся с человеческим lLT7, из антитело-продуцируюшей клетки иммунных
животных.
Полученные таким образом антитело-продуцирующие клетки или
бессмертные антитело-продуцирующие клетки культивируют, и затем желательные
моноклональные антитела можно извлекать из кульryры.
В
отноч.tении способа
получения бессмертных антитело-продуцирующих клеток известны различные
способы.
В способе получения моноклонального антитела согласно
изобретению
применяемые примеры молекулы, которая ассоциируется с человеческим lLT7 для
продукции трансформированной клетки, используемой
в качестве
иммуногена,
содержат белки клеточной мембраны. Среди них сигнал-трансдуцирующая
молекула, которая находится в клеточных мембранах, является предпочтительной
для использования в качестве белка клеточной мембраны согласно изобретению.
Термин <сиrнал-трансдуцирующая молекула)) означает молекулу, которая
ассоциирована с белками и клетками, имеющими рецепторные струкryры во
внеклеточном домене, и передает стимуляцию лигандного связывания на рецепторы
в клетки, Примеры сигнал-трансдуцирующих молекул включают в себя у-цепь Fсрецептора, DAP12 или им подобные. Например, для использования в качестве белка
клеточноЙ мембраны согласно изобретению предпочтительной является Y-цепь Fсрецептора. Аминокислотные последовательности человеческого DДР12 и у-цепи Fс-
рецептора, а таюке последовательность оснований t(ДНК, которая кодирует
25
BY
20509
с1
201б.10.30
указанные последовательности, являются общеизвестными. ГIоследовательность
оснований человеческой y-цепи Fс-рецептора и аминокислотная
последовательность, кодируемая последовательностью оснований, показана в SEQ
lD NO:'15 и 16, соответственно,
В
настоящем изобретении трансформированную клетку, которую будrт
использовать в качестве иммуногена, можно получать, например, пугем
изготовления клетки, экспрессивно несущей следующее из а) и Ь):
(а)
экзогенный полинуклеотид, кодирующий
аминокислотную
последовательность, содержащую внеклеточный домен человеческого lLT7; и
(Ь) экзогенный полинуклеотид, кодирующий у-цепь
Fс-рецептора.
В
настоящем изобретении экзогенный полинуклеотид означает
полинуклеотид, который искусственно внедрен в клетку-хозяина. Если в качестве
клеток используют человеческие клетки, в клетки человека вводят человеческие
гены. В такой комбинации искусственно внедренный полинуклеотид означает
экзогенный полинуклеотид. Поэтому эктопическая экспрессия человеческого lLT7
или y-цепи
Fс-рецептора человека состоит
в
экспрессии
экзогенного
полинуклеотида.
Используемый в настоящем изобретении термин (внеклеточный домен
человеческого lLT7> означает аминокислотную последовательность от 17-ого до
444-оrо положения аминокислотной последовательности, описанной в SEQ lD NO:2,
которая соответствует внеклеточному домену аминокислотной последовательности
(от 1до 428
положения
в SEQ |D
NO:2).
В
качестве аминокислотной
последовательности согласно изобретению, содержащей внеклеточный домен
человеческого lLT7,
предпочтительно использовать
аминокисJlотную
последовательность, которая содержит ках(qую область, например, начиная
с
N-
конца, в следующем порядке:
[сигнальная последовательность + внеклеточный домен + трансмембранный
домен
+
внуrриклеточная область]
Альтернативно, аминокислотная последовательность, которая не имеет части
внутриклеточной области, как описано ниже, включена
в состав
аминокислотной
последовательности, содержащей внеклеточный домен человеческого lLT7 согласно
изобретению. [сигнальная последовательность
трансмембранный домен
Кроме того,
+
+ внеклеточный домен
+
часть внутриклеточной области].
в состав
аминокислотной последовательности, содержащей
внеклеточный домен человеческого lLT7 согласно изобретению включена струкryра,
26
вY
20509
с1
2016.10.30
которая, как упомянrто ниже, не имеет внrтриклеточной области. [сигнальная
последовательность + внеклеточный домен + трансмембранный домен].
В указанной струкrуре области, отличные от внеклеточной области, могуr
представлять собой аминокислотные последовательности, которые выбирают из
аминокислотноЙ последовательности, показанноЙ в
SEQ lD No:2, или могут быть
объединены с другими аминокислотными последовательностями, имеющими
гомологию областей. Например, аминокислотная
посJIедовательность,
составляюlлая сигнальную последовательность, трансмембранный домен и
внугриклеточную область, может представлять собой аминокислотную
последовательность молекул семейства lLT, отличных
от lLT7. Или она
может
объединяться с аминокислотной последовательностью семейства lLT других видов,
кроме человека. ,Щополнительно, аминокислотная последовательность, которая
составляет другие области, кроме внеклеточной области, может содержать мутацию
на уровне, при котором может поддерживаться функция кащдой
Альтернативно, мещцу ках(qой областью могrт вставляться другие
области.
области.
Например, метка эпитопа, такая как FLAG, таюке может быть вставлена ме}{ду
сигнальной последовательностью и внеклеточным доменом. В частности,
сигнальную последовательность удаляют процессированием во время ее переноса
на поверхность клеточной мембраны, после трансляции в белок. Поэтому, в
качестве сигнальной последовательности можно использовать случайную
аминокислотную последовательность, которая индуцирует перенос белка после
трансляции на клеточную мембрану. Более конкретно, как аминокислотную
последовательность, содержащую внеклеточный домен человеческого lLT7,
предпочтительно использовать аминокислотную последовательность (SEQ lD NO:2)
человеческого lLT7.
Поэтому в настоящём изобретении случайная последовательность оснований,
которая кодирует аминокислотную последовательность,
составляющую
вышеупомянутую структуры [сигнальную последовательность + внеклеточный домен
+ трансмембранный домен + внутриметочная область], может использоваться как
полинуклеотид, который составляет экзогенный полинуклеотид, описанный
в
(а).
Например, аминокислотная последовательность SEa lD NO 2: кодируется
последовательностью оснований, описанной в SEQ lD NO:'1.
В настоящем изобретении вектор экспрессии, экспрессивно несущий
вышеупомянуrые полинуклеотиды (а) и (Ь), можно внедрять в соответствующую
клетку-хозяин,
чтобы получить трансформированную клетку, которая
27
будет
вY
использоваться
20509
с1
201б.10.30
в качестве
иммуногена. Один веюгор или разные векторы могrr
нести полинуклеотиды (а) и (Ь). Если кащqый полинуклеотид несуr разные векторы,
клетки-хозяева совместно трансфицируются с двумя видами векторов.
Предпочтительные примеры клеток-хозяев согласно изобретению содержат
клетки млекопитающих. Конкретные примеры клеток-хозяев содержат клетки,
полученные от людей, обезьян, мышей или крыс. Особенно предпочтительными в
качестве клеток-хозяев являются клетки человеческого происхох(дения, Например,
предпочтительно
в качестве
клеток-хозяев согласно изобретению использовать
клетки 293Т человеческого происхощцения. Клетки 293Т можно получать как АТСС
CRL-1 1268. Кроме того, таюке можно в качестве клеток-хозяев использовать клетки,
от иммунных животных. Если в качестве иммуногенов используют
клетки, полученные от иммунных животных, клетки-хозяева дают небольшой
полученные
иммунологический ответ. По этой причине можно эффекгивно получать антитело
против внеклеточного домена экзогенно экспрессируемого lLT7. Таким образом,
например, когда в качестве иммунных животные используются мыши, клетки,
полученные из мышей, таюке можно использовать как клетки-хозяева.
Выtчеупомянрые полинуклеотиды можно трансформировать в клетки пrтем
переноса их на векторе, способном индуцировать экспрессию в клетках-хозяевах.
Можно использоваться коммерчески досryпные векторы, способные индуцировать
экспрессию в клетках млекопитающих. В настоящем изобретении можно
использовать такие векторы экспрессии, как вектор pCMV-Script (R), векгор PSG5
(производимый компанией Stratagene), рЦНК3.1 (производимый компанией
lnvitrogen).
Полученные таким пугем трансформированные клетки вводят иммунным
животным в случае необходимости вместе с дополнительными компонентами,
такими как адъюванты. Примеры применяемых адъювантов содержат полный
адьювант Фрейнда и тому подобное. В случае использования мышей как иммунных
животных, трансформированные клетки можно вводить в диапазоне от 10а до 106
в
клеток, более конкретно,
от
многократной дозы вводят
с равными интервалами, до повыuJения титра антител,
10а
до
106 клеток. Обычно, иммуноген
виде
Например, при краткосрочной иммунизации, трансформированные клетки вводят с
интервалами
от 2 до
4
дней, более конкретно
с
интервалами
3 дня.
После
двукратного или трехкратного введения можно извлекать антитело-продуцирующие
клетки. Альтернативно,
эти клетки вводят один раз в неделю, и
антитело-
продуцирующие клетки таюке можно извлекать через пять или шесть введений,
28
BY
20509
с1
201б.10.30
В настоящем изобретении извлеченные антитело-продуцирующие
клетки
клонируют для получения моноклональных антител. Предпочтительно, что антитело-
продуцирующие метки для клонирования делают бессмертными. Например, можно
использовать способ слияния клеток, такой как способ гибридомы или
трансформированиё вирусом ЭпштеЙна-Барра (EBV), в качестве способа получения
бессмертных антитело-продуцирующих
клеток.
В отношении антитело-продуцирующих клеток, одна метка продуцирует один
вид антитела. Поэтому, посев клеточных популяций, происходящих из одной клетки
(то есть клонирование) дает возможность получать моноклональные антитела,
Способ гибридомы охватывает процесс, в котором антитело-продуцирующие метки
сливают с подходящей бессмертной клеточной линией, и затем подвергают
клонированию, Бессмертные антитело-продуцирующие клетки можно клонировать
такой методикой, как способ предельных разведений. Известно, что существует
множество клеточных линий, полезных для способа гибридомы, Эти клеточные
линии являются превосходными по эффекгивности получения бессмертных
лимфоцитарных клеток и имеют различные генетические маркеры, необходимые
для выбора успешно слитых клеток. !ополнительно, если предполагается
получение антитело-продуцирующих клеток, таюке можно использовать клеточную
линию, неспособную продуцировать антитела,
Например, широко используются клеточные линии миеломы мыши
P3x63AgB.653 (АТСС CRL-1580) и P3x63Ag8U.1 (ATCCCRL-I597) как полезные для
способа клеточного слияния у мышей или крыс. Вообще, гибридому создают
слиянием однородных клеток, тогда как моноклональное антитело таюке можно
получать из гетерогибридомы от разных видов среди близкородственных видов.
Общеизвестны конкретные протоколы слияния меток. То есть, для
осуществления слияния клеток антитело-продуцирующие клетки иммунных
животных смешивают с подходящими партнерами слияния. Примеры используемых
антитело-продуцирующих клеток включают
в себя клетки селезенки, лимфоциты,
забранные из лимфатического узла и В-клетки периферической крови. Можно
использовать различные клеточные линии, описанные выше, в качестве клеток
слияния.
!ля
слияния меток можно применять полиэтиленгликолевый способ
и
способ элекгрического слияния.
3атем, на основе селективных маркеров слитых клеток осуществляют отбор
успешно слитых клеток. Например, если для слияния клеток выбирают НАТсенситивную клеточную линию, проводят отбор успешно слитых клеток, выбирая
29
вY
20509
с1
2016.10.30
клетки, расryщие в среде НАТ (гипоксантин, аминоптерин, тимидин). ,Щополнительно,
антитела, продуцируемые выбранными клетками, обладают подтверяqденной
желательной реактивностью.
Предпочтительные примеры моноклонального антитела согласно
изобретению содержат аминокислотные последовательности, которые составляют
вариабельные области моноклональных антител, а таюке кодирующие
их
последовательности оснований ФНК. Поэтому в настоящем изобретении являются
предпочтительными, например, химерные антитела, получаемые конъюгацией этих
вариабельных областей
к константным областям других иммуноглобулинов.
В
аминокислотных последовательностях, описанных в перечне последовательностей,
зрелый белок составляет аминокислотная последовательность от 1 до С-конца.
Таким образом, идущие подряд посJlедовательности аминокислот от 1 до С-конца
для
кахqцой аминокислотной последовательности представляют собой зрелую
последовательность каяцой аминокислотной последовательности, С другой
стороны, аминокислотная последовательность, представленная по порядковым
номерам от N-конца до
-1 ,
является сиrнальной последовательностью.
Вариабельная область
тяжелой цепи
N91
1
N917
N937
SEQ lD NO:38 (последовательность
оснований)
SEQ lD NO:39 (аминокислотная
последовательность)
SEQ lD NO:42 (последовательность
оснований)
SEQ lD NO:43 (аминокислотная
последовательность)
SEQ ID NO:46 (последовательность
оснований)
SEQ lD NO:47 (аминокислотная
последовательность)
Вариабельная область
легкой цепи
SEQ lD NO:40 (последовательность
оснований)
SEQ lD NO:41 (аминокислотная
последовател ьность)
SEQ lD NO:44 (последовательность
оснований)
SEa lD NO:45 (аминокислотная
последовател ьность)
SEa lD NO:48 (последовательность
оснований)
SEQ lD NO:49 (аминокислотная
последовател ьность)
Например, можно создать мышиное (вариабельная область) - человеческое
(константная область) химерное антитело путем сшивания генов этих вариабельных
областей в константную область тяжелой цепи человеческого lgG1 и ген,
кодирующий константную область легкой цепи человеческого lg каппа,
соответственно. Ниже описаны аминокислотные последовательности такого
химерного антитела и кодирующие их последовательности оснований,
соответственно. Химерные антитела, определяемые этими последовательностями,
показывают конструкцию предпочтительного варианта
моноклонального анти-lLТ7-антитела согласно изобретению.
30
осуществления
В
следующих
вY
с1
20509
2016.10.30
аминокислотных последовательностях химерных антител последовательность
аминокислот от N-конца до -1 соответствует сигнальной последовательности, и
последовательность аминокислот от 1до С-конца соответствует зрелому белку,
Таким образом, предпочтительным в настоящем изобретении является химерное
антитело, состоящее из тяжелых и легких цепей, которые фставлены
последовательности аминокислот
от
'1
до С-конца для кащqой
из
аминокислотной
последовательности.
Nsl
1
Тяжелая цепь
Легкая цепь
SEQ lD NO:50 (последовательность SEQ lD NO:52
оснований)
(последовательность оснований)
SEQ lD NO:51 (аминокислотная SEQ lD NO:53 (аминокислотная
последовательность)
последовател ьность)
Np17 SEQ lD NO:54 (последовательность SEQ lD NO:56
(последовательность оснований)
оснований)
SEQ lD NO:55 (аминокислотная SEQ lD NO:57 (аминокислотная
последовател ьность)
последовательность)
!ополнительно, антиген-связывающую активность моноклональноrо антитела
таюке можно переносить на другие иммуноглобулины. Вариабельная область
иммуноглобулина состоит из области, определяющей комплементарность (CDR) и
каркасной области. Антиген-связывающее свойство кащqого иммуноглобулина
определяется СDR-областью,
и
каркасная область сохраняет струкryру области
связывания антиrена. Аминокислотные последовательности CDR имеют высокое
разнообразие, тогда как аминокислотные последовательность каркасного участка
высоко консервативны. Иэвестно, что аминокислотная последовательность,
составляющая
CDR, включена в
каркасную область других молекул
иммуноглобулина, что позволяет переносить антиген-связывающую активность. Был
создан способ, в котором антиген-связывающие свойства разных иммуноглобулинов
пересаживают
на
человеческий иммуноглобулин пуrем использования этой
методики. Используемый в настоящем изобретении термин <<область связывания
антигена> может содержать CDR, которую пересаживают на каркасную область.
Таким образом, термин <фрагмент, содержащий антигенсвязывающую область
конкретного моноклонального антитела)) содержит фрагмент человеческого
иммуноглобулина, содержащего вариабельную область, на которую пересаживают
CDR
моноклонального антитела. Например, кащдая
из
аминокислотных
последовательностей вышеупомянугых вариабельных областей содержит
следующие аминокислотные последовательности (SEQ lD NO) в качестве CDR.
зl
вY
Nel
'1
тяжелая цепь
Nol 1 легкая цепь
Nel7 тяжелая цепь
N017 легкая цепь
Ne37 тяжелая цепь
Ns37 легкая цепь
20509
с1
201б.10.30
cDR1
SDYAWN
cDR2
YlSYSGSTSYNPSLKSR
сDRз
SPPYYAMDY
KASaDVGTAVA
WASTRHT
QQYSSYPLT
SYWlH
RlYPGTGSTYYNEKFKG
YPTYDWYFDV
RASOSlSNYLH
YASQSlS
QQSNSWPLT
SDYAWN
YlSYSGSTSYNPSLKSR
ALPLPWFAY
KASQDVGTAVA
WASTRHT
QQYSSYPYT
(58)
(61)
(64)
(67)
(70)
(73)
(59)
(62)
(65)
(68)
(71)
(74)
(60)
(63)
(66)
(69)
(72)
(75)
На основе информации о последовательности оснований, которая кодирует
вышеупомянутые аминокислотные последовательности, и информации о
последовательности оснований, которая кодирует каркасную (FR) область
человеческого иммуноглобулина, пrгем конъюгации обеих последовательностей
оснований можно разработать праймер и можно амплифицировать
последовательности оснований. Операцию повторяют
щЩНК,
имеющую
мя кащдой каркасной
и
вариабельной области, в которой можно сконструировать мышиные CDR1 , CDR2, и
CDR3, связанные человеческой FR. ,Qополнительно, если при необходимости
конъюгируют последовательность оснований, которая кодирует константную область
человеческого иммуноглобулина, можно получать ryманизированное антитело с
константной областью.
В
качестве химерного антитела, содержащего
вышеупомянуrые
вариабельные области, или ryманизированноrо антитела, в которое пересаживают
CDR, составляющую вариабельную область, антитело с константной областью,
полученной
из lgG или lgМ, представляет собой
предпочтительное антитело
согласно изобретению. Авторы согласно изобретению подтвердили, что
моноклональное антитело против lLT7 проявляет CDC активность на клетки,
экспрессирующие lLT7. Таким образом, антитело, имеющее константную область,
происходящую
из lgG или lgM,
проявляет цитотоксичность против lLT7-
экспрессирующих клеток в силу СDС-эффекга. Такие антитела являются полезными
для ингибирования ряда клеток, экспрессирующих lLT7, таких как ИПК.
Химерное антитело, способное распознавать lLT7 или ryманизированное
антитело, обеспечиваемое согласно настоящему изобретению, можно получать
пrrем генно-инженерного способа с использованием полинуклеотидов, кодирующих
указанные антитела. Например, полинуклеотид, который
последовательностью оснований, описанной ниже последовательностями
Jl
является
SEQ
lD
BY
20509
с1
201б.10.30
NO, и кодирует аминокислотную последовательность, составляющую зрелый белок
для ках<,дой аминокислотной последовательности, можно использовать в качестве
полинуклеотида, кодирующеrо вариабельные области N91'1 или Np17.
Последовательность аминокислот, расположенных подряд от 1до С-конца для
ка)l{дой аминокислотной последовательности соответствует зрелому белку. Если
каяlдый зрелый белок экспрессируется как отдельный белок, предпочтительно
секреции в N-конец кащдой аминокислотной
последовательности. Например, в аминокислотных последовательностях,
располаrать сигнал
к
показанных в этих SEQ lD NO, последовательность аминокислот от N-конца до
-1
можно использовать как сигнальную последовательность, если такие белки
экспрессируются в животных клетках. Альтернативно, эти вариабельные области
могrг секретироваться как зрелые белки при использовании случайной сигнальной
последовательности, которая позволяет секрецию иммуноглобулина.
Na11
SEQ lD NO:50
(последовательность оснований),
(последовател ьность оснований),
Ns17
SEQ lD NO:54
(последовательность оснований),
SEQ lD
NO:52
SEQ lD
NO:56
(последовател ьность оснований)
Тем же образом, как описано выше в отношении
полинуклеотида,
кодирующего ryманизированное антитело, можно создавать полинуклеотид, который
экспрессирует ryманизированное антитело, используя последовательность
оснований, которая кодирует белок, имеющий сигнальную последовательность,
добавляемую к N-концу. Если отдельные векторы несrг тяжелые и легкие цепи, оба
вектора совместно трансфицируются в одну клетку-хозяина. flля конструирования
молекулы иммуноглобулина с обеими цепями используют тяжелые и легкие цепи,
экспрессируемые от ках(дого вектора. Как полинуклеотид, кодирующий тяжелую
цепь, так и полинуклеотид, кодируюший легкую цепь, таюке могrг переноситься
одним вектором. Клетка-хозяин, в которую ко-трансфицирован вектор, несущий оба
полинуклеотида, экспрессирует тяжелые и
легкие цепи и
продуцирует
иммуноглобулин, имеющий обе цепи.
Эти полинуклеотиды могуг экспрессироваться как антитела,
используя
систему вектор-хозяин, способную к экспрессии гена антитела, Кроме того, если они
экспрессируются в виде единственной молекулы белка пугем соединения
вариабельной области тяжелой цепи с вариабельной областью легкой цепи,
сигнальную последовательность можно располагать на N-конце молекулы белка.
Известный пример такой молекулы антитела включает в себя scFv молекулу, в
JJ
BY
20509
с1
2016.10.30
которой вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи
связаны линкером.
Каlцое из моноклональных антител, полученных таким образом, составляет
моноклональное антитело согласно изобретению. ,Щругими словами,
мономональное антитело, которое состоит из иммуноrлобулина, содержащего
область связывания антигена, и кодируется полинуклеотидом, происходящим из
щ!НК, кодирующей область связывания антигена вышеупомянrгых моноклональных
антител, составляет моноклональное антитело согласно изобретению.
Как описано ранее, клетки RBL, в которых вызвана экспрессия гена lLT1 ,
можно использовать в качестве иммуногена для получения антител lLTl. Вместе с
тем, невозможно подтвердить экспрессию lLT7 на поверхности клеток RBL (PSiS),
и
таким образом, его нельзя использовать в качестве иммуногена. Авторы согласно
изобретению выявили, что экспрессия человеческого lLT7 на клеточной поверхности
может индуцироваться коэкспрессией человеческого lLT7 и других белков клеточной
мембраны, которые ассоциируются
с человеческим lLT7. 3атем авторы
согласно
в качестве иммуногена можно получать антитело,
которое связывается с
человеческими ИПК, при использовании
изобретению выявили, что
трансформированной клетки, экспрессия которой индуцирована таким образом,
и
пришли к осуществлению согласно изобретению.
Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает иммуноген для
получения антитела, которое связывается с внеклеточным доменом человеческого
lLT7, и содержит животные клетки, в которых сохраняется (а) полинуклеотид,
который кодирует аминокислотную последовательность, содержащую внеклеточный
домен человеческого lLT7; и (Ь) полинуклеотид, который кодирует у-цепь Fсрецептора, чтобы экзогенно экспрессироваться, или фракции их клеточной
мембраны.
Прошло более шести лет или больше после выявления струкryры
человеческого lLT7 в 1998 году. Вместе с тем, до настоящего времени еще не
получено антитело, способное к специфичному распознаванию lLT7. В настоящем
изобретении впервые обеспечивается антитело, способное распознавать
человеческий lLT7 при использовании иммуногена. Таким образом, настоящее
изобретение обеспечивает антитело, способное распознавать человеческий lLT7,
которое можно получить следующими этапами:
(1) введение иммунным животным клетки, которая экзогенно экспрессирует
белок, содержащий внеклеточный домен человеческоrо lLT7,
з4
и
молекулы,
вY
20509
с1
2016.10.з0
содержащей аминокислотные посJIедовательности, описанные в SEQ lD NO:16; и
(2) выбор антитело-продуцирующей клетки, которая продуцирует антитело,
связывающееся с человеческим lLT7, из антитело-продуцирующей метки иммунных
животных
(3) культивирование антитело-продуцирующих клеток, выбранных в этапе (2),
и
извлечение из кульryры антитела, способного распознавать человеческий
lLT7.
Выявлено, что человеческий lLT7 специфически экспрессируется в
человеческой ИПК. В серийном анализе генетической экспрессии SAGE,
проведенном авторами согласно изобретению, таюке подтверх4дена специфическая
экспрессия человеческого lLT7 в человеческой ИПК. Вместе
с тем, по
процrлым
сообщениям, уровни экспрессии lLT7 в обоих случаях анализировали на основе
мРНК. Поскольку не было обеспечено антитело, способное к обнарркению
человеческого lLT7, общепринятый анализ состояния экспрессии белка не
проводили. Анализ человеческого белка lLT7 осуu]ествляли при условии, что
антитело связывается с внеклеточным доменом человеческого lLT7 соrласно
изобретению.
Авторы согласно изобретению факrически подтвердили, что мономональное
антитело, которое связывается с внеклеточным доменом человеческого |LT7
согласно настоящему изобретению, специфически обнаруживает человеческие ИПК.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу
обнаружения
интерферонпродуцирующих клеток, который содержит следующие этапы: контакт
тестируемой метки с моноклональным антителом, которое связывается с
внеклеточным доменом человеческого lLT7 или фрагмента, содержащего
антигенсвязывающую область; и обнаружение мономонального антитела, которое
связывается
с клетками или фрагментом, содержащим его
антигенсвязывающую
область.
Обнаружение человеческих lLT7 согласно настоящему изобретению
позволяет определять, является ли конкретная клетка интерферонпродуцирующей
клеткой. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает способ
идентификации ИПК, используя человеческий
lLT7 в качестве
Альтернативно, человеческие ИПК можно выделять пугем с€парации
индикатора.
клеток, в
которых обнарркен человеческий lLT7 согласно настоящему изобретению, Таким
образом, настоящее изобретение обеспечивает способ выделения ИПК, используя в
35
BY
20509
с1
201б.10.30
качестве индикатора человеческий lLT7.
На основе анализа
человеческого антитела lLT7 было подтверх(дено
снижение уровня экспрессии lLT7 в ИПК, дифференцировка которых была
индуцирована CpG и тому подобным. Таким образом, используя в качестве
индикатора |LT7, можно специфически обнарркивать ИПК перед индукцированием
их дифференцировки, Другими словами, моноклональное антитело
согласно
изобретению является полезным, в особенности для обнарркения ИПК перед их
дифференцировкой в дендритные клетки. Используемое в настоящем изобретении
понятие "ИПК перед их дифференцировкой" может обозначать меточные
популяции, которые сохраняют способность продуцировать интерферон.
Моноклональное антитело согласно изобретению, которое связывается с
внеклеточной областью человеческого
lLT7 или фрагмента, содержащего
его
антигенсвязывающую область, заранее можно подвергать мечению. Например,
антитела можно легко обнаруживать пуrем мечения их люминесцентными красками
или флуоресцентными красками. Более конкретно, создают меченое
флуоресцентной краской антитело для контакrа с клеточной популяцией, которая
может содержать ИПК'и затем с метками, связывание антитела настоящего
связанного изобретения с которыми можно обнаруживать, использую
флуоресцентную краску как индикатор. Дополнительно, можно выделять ИПК
посредством сепарации клеток, в которых обнарркена флуоресцентная краска. Ряд
этапов можно легко осуществлять на основе принципа FАСS.
Альтернативно, антитело согласно изобретению может заранее связываться с
твердофазной матрицей, такой как магнитные частицы. Антитело, связанное с
твердофазной матрицей, распознает человеческий lLT7, и затем происходит захват
ИПК в твердофазной матрице. В результате можно обнаруlкивать или выделять
ипк.
Антитело, необходимое для способа обнарркения ИПК согласно настоящему
изобретению, может обеспечиваться в виде реагентов
мя обнарркения ИПК. То
есть, настоящее изобретение обеспечивает реагент мя обнаружения
интерферонпродуцирующих клеток, который содержит мономональное антитело,
с
внеклеточным доменом человеческого lLT7, или фрагмент,
содержащий его антигенсвязывающую область. Реагент для обнарlокения ИПК
связывающееся
согласно изобретению в дополнение
к
антителам можно использовать в комбинации
с положительным контролем или с отрицательным контролем. Например, в качестве
положительного контроля можно использовать трансформированные клетки,
36
BY
20509
с1
2016.10.30
которые экспрессируют внеклеточный домен человеческого lLT7, и используются
для иммуногена, а Taloкe ИПК, полученные от человека. Обычно из периферической
крови можно получить только небольшое количество человеческих ИПК. Поэтому в
качестве положительного контроля в реагенте согласно изобретению особенно
предпочтительно использовать трансформированную клетку. С другой стороны, в
качестве отрицательного контроля может использоваться случайная клетка, которая
не экспрессирует человеческий lLT7.
Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает комплект
для
обнаружения человеческих ИПК, который содержит:
(а) моноклональное антитело, которое связывается с внеклеточным доменом
человеческого lLT7, или фрагмент, содержащий его антигенсвязывающую область; и
(Ь) клетку, которая экспрессирует экзогенный белок,
содержащий
внеклеточный домен человеческого lLT7, и экзогенную молекулу, ассоциированную с
человеческим |LT7.
Авторы согласно изобретению провели анализ действия антитела, которое
связывается с внеклеточным доменом человеческого lLT7 на ИПК. В результате
было подтверх(цено, что антитело, связывающееся с внеклеточным доменом
человеческого lLT7, ингибирует активность ИПК. Таким образом, настоящее
изобретение относится к
способу
ингибирования активности
интерферонпродуцирующих клеток, который содержит этап контакта с
интерферонпродуцирующей клеткой любого из следующих компонентов:
(а) моноклонального антитела, которое связывается с человеческим lLT7
и
ингибирует активность интерферонпродуцирующих клеток, или фрагмента,
содержащего его антиrенсвязывающую область; и
(Ь) иммуноглобулина, на который пересаживают область, определяющую
комплементарность, моноклонального антитела, описанного в пункте (а), или
фрагмент, содержащий его антигенсвязывающую область.
Альтернативно, настоящее изобретение относится к способу ингибирования
активности интерферонпродуцирующих клеток живых организмов, который содержит
этап введения живому организму любого из следующих компонентов:
(а) моноклонального антитела, которое связывается с человеческим lLT7
и
ингибирует активность интерферонпродуцирующих клеток, или фрагмента,
содержащего его антигенсвязывающую область ; и
(Ь) фрагмента, содержащего иммуноглобулин, на который пересаживают
область, определяющую комплементарность, моноклонального антитела,
з1
вY
описанного
в
20509
с1
201б.10.30
пункте (а), или фрагмента, содержащего его антиrенсвязывающую
область; и
(с) полинуклеотида, который кодирует компоненты, описанные в пункгах (а)
или (Ь).
Используемый
в
настоящем
изобретении
термин
<интерферонпродукцирующие клетки (ИПК)> означает клетки, которые обладают
способностью вырабатывать ИФН и экспрессировать lLT7 на клеточной поверхности.
!алее, если не указано иначе, термин <ИПК> охватывает не только клетки, которые
являются клетками-предшественниками дендритных клеток, но Taloкe и клетки,
способные продуцировать ИФН и экспрессировать lLT7 на клеточной поверхности.
Способы идентификации таких ИПК общеизвестны. Выделять ИПК из других меток
крови можно с использованием в качестве индикаторов некоторых маркеров
клеточной поверхности.
В частности, свойства маркеров клеточной
поверхности
человеческих ИПК описаны ниже (Shortman, К. and Liu, YJ. Nаtчrе Reviews 2: 't5'1-
В последние годы был
опубликован ряд предположений, что BDCA-2
положительную клетку определяют как ИПК (Dzionek, А, et al, J, lmmunol. 165; 6037161, 2002).
6046, 2000),
[Характеристика антигенов меточной поверхности человеческих ИПlý
СD4-положительный, CD1 23-положительный,
Происходящие
из
линий (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20,
CD56)
отрицательные и СD1 "|-отрицательные,
Таким образом, можно Taloкe сказать, что ИПК являются клетками,
обладающими свойствами экспрессии указанных известных маркеров, и
обладающими способностью продуцировать ИФН. flополнительно, клетки живых
организмов, способные продуцировать ИФН, входят в ИПК, даже если указанные
клетки представляют собой клеточную популяцию с характеристиками,
отличающимися от параметров экспрессии характеристики экспрессии этих
маркеров. !ополнительно, примеры свойств, которые обычно проявляют
человеческие Ипк, представлены следующим образом: [морфологические свойства
клеток]
- Сходны с плазматическими клетками
- Круглые клетки с гладкой клеточной поверхностью
- Имеют относительно большое ядро
[Функциональные свойства клеток]
- При вирусной инфекции за короткий проме)олок времени продуцируют
з8
BY
с1
20509
201б.10.30
большое количество интерферонов 1 типа.
-
Дифференцируются
в
дендритные клетки после вирусной инфекции.
Используемое в настоящем изобретении понятие <ингибирование активности
ИПК> означает ингибирование по меньшей мере одной из функций ИПК. Примеры
функции ИПК включают
в себя
продукцию ИФН
и
выживаемость клетки,
Выживаемость клетки Talo|(e можно переводить на число клеток. Поэтому в случае
ингибирования этих двух функций или какой-либо из функций, указывается, что
ингибирована активность ИПК, Выявлено что ИФН 1 типа, продуцируемый ИПК,
приводит к возникновению различных заболеваний. В этой связи ингибирование
ряда ИПК и продукции ИФН является полезным в лечении этих заболеваний.
Например, подчеркивается взаимоотношение Mex(qy патологическим
состоянием при ауrоиммунных заболеваниях и ИФНо. Большая часть ИФНо
продуцируется ИПК. Таким образом, прем ингибирования продукции ИФНо можно
облегчать патологические состояния, вызванные ИФНо. Используемое в настоящем
изобретении понятие "ингибирование продукции ИФН посредством ИПК' означает
ингибирование продукции по меньшей мере одного из ИФН, продуцируемых ИПК.
Предпочтительными ИФН согласно изобретению являются ИФН 1 типа, Важное
значение среди них имеет ИФНо.
Таким образом, настоящее изобретение относится к ингибитору продукции
ИФН, который содержит в качестве активного компонента антитело, связывающееся
с
внеклеточным доменом lLT7. Альтернативно, настоящее изобретение
обеспечивает способ ингибирования продукции ИФН, содержащий этап введения
с
внеклеточным доменом lLT7. ,Щополнительно,
настоящее изобретение относится к использованию антитела, которое связывается
антитела, которое связывается
с
внеклеточным доменом lLT7,
для производства лекарственной
композиции,
ингибируюшей продукцию ИФН.
Клетки, в которых большое количество ИФН продуцируется небольшим
в число ИПК. Например, метки-предшественники
дендритных клеток, стимулированные вирусами и тому подобным, продуцируют
количеством клеток, включены
наибольшую часть ИФН, вырабатываемых живым орrанизмом, Ингибирование ряда
ИПК, что вызывает продукцию значительного количества ИФН, приводит к супрессии
продукции ИФН. Таким образом, патологические состояния, вызванные ИФНо,
можно уменьшить путем ингибирования ряда ИПК. Было подтверщдено, что
предпочтительным вариантом осуществления согласно изобретению является
моноклональное анти-lLТ7-антитело, связанное с клетками, экспрессирующими lLT7,
39
вY
20509
с1
201б.10.30
и затем приобретающее цитотоксическое действие от комплементзависимой
цитотоксичности (CDC). Эффекг CDC представляет собой один из важных
механизмов лекарственноrо препарата антитела. Моноклональное анти-lLТ7антитело согласно изобретению таюке обладает моlлной цитотоксичностью против
в силу его СDС-эффекга. Таким
предпочтительном варианте осуществления в отношении
клеток, экспрессирующих lLT7, таких как ИПК,
образом, в
моноклонального анти-lLТ7-антитела, можно ожидать действия ингибирования
продукции ИФН посредством цитотоксичности против ИПК, в дополнение к
механизму ингибирования продукции ИФН.
Антитело, которое распознает внеклеточный домен человеческого lLT7,
используемого в настоящем изобретении, можно получать ранее описанным
способом. Антитело согласно изобретению может быть представлено любым
классом антител, Таюке не ограничены виды организмов, из которых получают
указанное антитело. ,Щополнительно, в качестве антитела можно использовать
фрагмент, содержащий антигенсвязывающую область антитела. Например, в
качестве антитела согласно изобретению может использоваться фрагмент антитела,
содержащий антигенсвязывающую область, которая получена ферментативным
расщеплением lgG. В частности, фрагменты антитела, такие как FаЬ и F(аЬ')2, можно
получать расщеплением папаином или пепсином. Общеизвестно, что эти фрагменты
антитела можно использовать как молекулы антитела, обладающие аффинностью
к
антителам. Альтернативно, таюке можно использовать антитела, сконструированные
технологией рекомбинантных генов, при условии сохранения удовлетворительной
анти
генсвязывающей активности.
Примеры антител, сконструированных технологией рекомбинантных генов,
включают в себя химерные антитела, СDR-трансплантированные антитела,
одноцепочечные Fvs, димеры, линейные антитела и полиспецифические антитела,
образованные из фрагментов антитела. Общеизвестно, что эти антитела моryт быть
обеспечены использованием мономональных антител.
Антитела согласно изобретению при необходимости можно модифицировать.
Согласно настоящему изобретению, антитело, которое распознает внеклеточный
домен человеческого lLT7, обладает ингибируюtлим действием на акrивность ИПК.
Таким образом, предполагается, что само антитело обладает цитотоксичностью
против ИПК. Известны подклассы антител, проявляющие мощное эффекгорное
действие. Альтернативно, ингибирующее действие на активность ИПК можно
дополнительно усиливать прем модификации антитела цитотоксическим агентом.
40
вY
20509
с1
201б.10.30
Примеры цитостатических агентов приведены ниже.
Токсины: эндотоксин Рsечdоmопаs (FЕ), дифтерийный токсин, рицин.
Радиоизотопы: Тс99', Sfg,
1131,
Y90.
Противораковые агенты: калихеамицин, митомицин, паклитаксел.
Токсины, состоящие из белков, можно конъюгировать
с антителами или
их
фрагментам с бифункциональным реактивом. Альтернативно, ген, кодирующий
токсин, связан с геном, кодирующим антитело, и таюке можно получать слитые
белки обоих генов.
Та
юке известен способ конъюгирования антител
с
радиоизотопами. Например, известен способ мечения антител радиоизотопами с
использованием хелирующего агента. Кроме того, противораковые агенты можно
коньюгировать
с антителами, используя сахарные цепи или
бифункциональный
реактив.
Авторы согласно изобретению подтвердили феномен включения в клетки
моноклонального антитела, которое связывается с lLT7, экспрессируемым на
клеточной мембране, после связывания (интернализация). Таким образом,
цитотоксические вещества можно доставлять
в клетки пугем контакта
антител,
конъюгированных с указанными цитотоксическими аrентами согласно изобретению,
с клетками, экспрессирующими lLT7. То есть, настоящее изобретение обеспечивает
акгивный ингибитор клеток, экспрессирующих
к
lLT7, которые
содержат
которому конъюгирован цитотоксический
агент в качестве активного компонента. Альтернативно, настоящее изобретение
моноклональное анти-lLТ7-антитело,
относится
к
использованию моноклонального анти-lLТ7-антитела,
к
которому
конъюгирован цитотоксический агент, для получения активного ингибитора клеток,
экспрессирующих lLT7. fiополнительно, настоящее изобретение обеспечивает
способ ингибирования активности клеток, экспрессируюu]их lLT7, содержащий этап
введения мономонального анти-lLТ7-антитела,
к
которому
конъюгирован
цитотоксический агент.
В настоящем
изобретении таюке можно использовать
в качестве
активного
компонента антитело, cTpylсгypa которого искусственно модифицирована. Например,
известны различные способы модификации для повышения цитотоксичности и
устойчивости антител. В частности, известен иммуноглобулин, в котором
модифицированы сахарные цепи тяжелых цепей (Shinkawa, Т. et al. J. Biol. Chem.
278:3466-347З. 2003). Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность
(ADCC)
иммуноглобулина усиливалась модификацией сахарных цепей.
Альтернативно, таюке известен иммуноглобулин, в котором модифицирована
.1l
вY
20509
с1
201б.10.30
аминокислотная последовательность Fс области. Таким образом, действие ADCC
усиливали пугем искусственного повышения связывающей
иммуноглобулина к Fс-рецептору (Shield, RL. et al. J. Biol. Chem.276;
активность
659'1-6604,
2001).
После связывания lgG с Fс-рецептором он включается в клетки. 3атем lgG
связывается
с
Fс-рецептором, который экспрессируется
в
эндосоме,
и
снова
высвобо>кдается в кровь. Этот феномен был выявлен. После включения в клетку lgG
с высокой активностью связывания с Fс-рецептором имеет лучший шанс повторного
результате время удерживания lgG в крови
увеличивается (Hinton, PR. et al. J Biol Chem. 279: 6213-6216. 2004), В дополнение к
этому указано, что модификация аминокислотной последовательности Fс-области
высвобохqцения
в кровь. В
вызывает изменение активности комплементзависимой цитотоксичности (CDC). Эти
модифицированные антитела можно использовать
в качестве антитела
согласно
изобретению.
При контакте антитела, которое связывается с внеклеточным доменом
человеческого lLT7,
с ИПК,
происходит ингибирование активности ИПК, Поэтому
указанные антитела можно использовать для ингибирования или способа
ингибирования активности ИПК. Таким образом, настоящее изобретение
обеспечивает в качестве активного компонента акrивный ингибитор ИПК, который
содержит по меньшей мере один компонент, выбираемый из группы, состоящей из
следующих пунктов от (а) до (с). Альтернативно, настояlцее изобретение относится
к
способу ингибирования активности ИПК, содержащему этап введения по меньшей
мере одного компонента, выбираемого из группы, состоящей из следующих пунктов
от (а) до (с), !ополнительно, настоящее изобретение относится к использованию
для получения активного ингибитора ИПК по меньшей мере одного компонента,
выбираемого из группы, состоящей из следующих пунктов от (а)
к (с):
(а) моноклонального антитела, которое связывается с человеческим lLT7 или
фрагментом, содер)сlщим его антигенсвязывающую область;
(Ь) иммуноглобулина, на который пересаживают область, определяющую
комплементарность антитела, описанного в п. (а), или фрагмента, содержащего еrо
анти генсвязывающую область; и
(с) полинумеотида, который кодирует компоненты, описzlнные в п.п, (а) или
(ь).
В настоящем изобретении моноклональное антитело, которое
распознает
внеклеточный домен человеческого lLT7, может использоваться как моноклональное
42
вY
20509
с1
20lб.10.30
антитело, которое ингибирует активность Ипк.
В настоящем изобретении
можно
использовать одно или больше моноклональных антител. Например, мя
использования в настоящем изобретении смешивают одно или больше
моноклональных антител, которые распознают внеклеточный домен человеческого
lLT7.
Можно подтвердить наличие ингибирующего действия на выработку ИФН у
антител ИПК таким образом, как описано ниже. ИПК продуцируют большое
количество ИФН в силу вирусной стимуляции. Антитела контактируют с ИПК перед
вирусной стимуляцией ИПК, после, или во время как стимуляции. Способность
у каr(дого из получаемых ИПК сравнивают со способностью
ка)t(цого контроля, с которым не контактируют антитела. Можно оценивать
возможность продуцировать ИФН, измеряя содержание ИФНq или ИФНВ в
продуцировать ИФН
супернатантной кульryре ИПК. По результатам сравнения можно подтвердить, что
тестируемые антитела эффекrивно ингибируют способность продуцировать ИФН,
если количество ИФН в супернатанте значительно уменьшается при добавлении
антител. Известны такие способы измерения ИФН. ИПК вырабатывают большую
часть ИФН в живом организме. Таким образом, состояние продуцирования ИФН в
живом организме может быть отреryлировано прем ингибирования способности
ИПК продуцировать ИФН.
,Щействие ИПК согласно изобретению сохранение количества ИПК. Поэтому
ингибирование действия ИПК
в настоящем изобретении содержит
ингибирование
количества ИПК. При достоверном ингибировании числа ИПК в присутствии антител,
можно выявить, что антитела ингибируют активность ИПК. Как в случае с продукцией
ИФН, в качестве сравнительного контроля может использоваться
инертный
иммуноглобулин, полученный от тех же видов животных, что и антитело, активность
которого необходимо подтвердить. Можно проводить количественное сравнение
ИПК в цитометрах. Число клеток можно подсчитывать с FACS или под микроскопом.
,Щополнительно, указано,
что ИПК дифференцируются в клетки,
которые
индуцируют Th2, называемые дендритными клетками 2 (ДК2) в результате вирусной
инфекции или подобной стимуляцией. Если можно ингибировать продукцию ИФН
вирусной стимуляцией ИПК, их дифференцировка в Th2 таюке может быть
ингибирована. Поэтому предполагается, что моноклональное антитело согласно
изобретению, которое ингибирует продукцию ИФН, таюке может иметь
терапевтический эффекr при различных аллергических заболеваниях.
При введении антитела, распознающего внеклеточный домен человеческого
4з
BY
20509
с1
201б.10.30
lLT7, в орrанизм-хозяин, отличающийся от вида организма, из которого происходит
антитело, желательно обработать антитело
в такую форму, которая с
трудом
распознается хозяином как чркеродный агент. Например, невозможно легко
распознать иммуноглобулин как чужеродный агент при обработке антитела в
следующие молекулы. Известна технология обработки молекулы иммуноглобулина,
описанная ниже. Фрагмент, содержащий антигенсвязывающую область, которая не
имеет константной области (Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, third
edition, Academic Press Limited. 1995; Antibody Епgiпееriпg, А Practical Аррrоасh, lRL
PRESS, 1996)
- Химерное антитело, составленное из антигенсвязывающей
области
моноклональных антител и константной области иммуноглобулина хозяина ("Gene
Expression Experiment Manual", lsao lshida, Tamie Ando, eds., Kodansha, 1994)
-
СDR-замещенное антитело, в которой область, определяющая
комплементарность (CDR) иммуноглобулина хозяина заменяют на CDR
моноклонального антитела ("Gепе Expression Experiment Manual", lsao lshida, Tamie
Ando, eds., Kodansha, 1994)
Альтернативно, человеческое антитело можно получать
с
использованием
животных нечеловеческого происхощдения в качестве иммунных животных,
в
которых включают ген человеческого антитела. Например, трансгенные мыши с
генами человеческого антитела имели практическое использование, как иммунные
животные, для получения человеческих антител (lshida et al., Cloning and Stem Cells,
4:В5-95, 2002). Использование таких животных позволяет получать человеческое
антитело, которое распознает lLT7 с применением иммуногенов, как опис€lно
ранее.
У людей предпочтительно введение человеческого антитела.
Альтернативно, таюке можно получать ген вариабельной области
человеческого иммуноглобулина способом фагового дисплея (McOafferty
J. et
al,,
Nature 34В: 552-554, 1990; KretzschmarT et, al., Счrr. Орiп. Biotechnol,2002 Dec; 13(6):
В способе
фаrового дисплея ген, кодирующий вариабельную область
человеческого иммуноглобулина, вставляется в ген фага. Таюке можно создавать
фаговую библиотеку с использованием разных генов иммуноглобулина в качестве
598-602).
источников. Фаг экспрессирует вариабельную область, как в слитом белке из белка,
составленного из фага. Вариабельная область, экспрессируемая фагом на
поверхности фага, сохраняет антигенсвязывающую активность. Поэтому выбирают
фаги, которые связываются с антигенами или клетками, в которых экспрессируются
антигены, что позволяет, таким образом, скрининг в фаговой библиотеке фага, в
44
BY
20509
с1
201б.10.30
котором экспрессируется вариабельная область, имеющая
желательную
связывающую активность. !ополнительно, в фаговых частицах сохраняется
выбранный таким образом ген, кодирующий вариабельную область, которая имеет
желательную связывающую активность. То есть
в способе фагового дисплея,
в
качестве индикатора может быть получен ген, кодирующий вариабельную область с
желательной связывающей активностью, при использовании связывающей
активности вариабельной области.
Рассматривая акгивный ингибитор ИПК или способ ингибирования активности
ИПК согласно изобретению, антитело, которое распознает внеклеточный домен
человеческого lLT7, или фрагмент антитела, который содержит по меньшей мере
антигенсвязывающую область антитела, можно вводить
в виде белка
или
полинуклеотида, кодирующего белок. При введении полинуклеотидов желательно
использовать вектор,
в котором полинуклеотид, кодирующий желаемый
белок,
находится под контролем соответствующего промотора, для экспрессии требуемого
белка. Таюке в вектор можно помещать ген-усилитель и терминатор. Известен
вектор, который несет ген тяжелых и легких цепей, составляющих иммуноглобулин,
и способный к экспрессии молекулы иммуноглобулина.
Векгор, способный экспрессировать иммуноглобулин, можно вводить
внедрением его в клетки. При введении живым организмам, вектора с возможностью
инфицирования клеток путем введения их в живые организмы, его можно внедрять
прямым образом. После выделения лимфоцитов из живого организма вектор
внедряют в лимфоциты, которые можно обратно вводить в живой организм (ех vivo).
Рассматривая активный ингибитор ИПК или способ ингибирования активности
ИПК согласно настоящему изобретению в отношении количества моноклональных
антител, которые будр вводитьGя живым организмам, иммуноглобулин обычно
вводят в диапазоне от 0,5 мг до 100 мг, например, от 1 мг до 50 мг, предпочтительно
от 2 мг до 10 мг на 'l кг веса тела. Интервалы введения антитела в живые организмы
можно реryлировать подходящим образом, чтобы концентрация иммуноглобулина в
живых организмах во время лечения поддерживалась на эффекгивном уровне. В
частности, например, антитело можно вводить с интервалами от '| до 2 недель.
Можно выбирать путь введения. Специалисты в данной области техники могут
подходящим образом выбирать эффекгивный путь введения при лечении.
Конкретные примеры прей введения включают в себя пероральное или
парентеральное введение. Антитела вводят системно или местно, например, пугем
внрривенной инъекции, внугримышечной инъекции, внррибрюшинной инъекции,
45
BY
20509
с1
201б.10.30
подкожной инъекции, или подобными пrrями. Примеры подходящих рецепryр
согласно изобретению мя парентерального введения вмючают в себя растворы
для инъекций, суппозитории и распыляемые растворы. Если антитело контактирует
с клетками, иммуноглобулин добавляют к кульryральной среде обычно в диапазоне
1
мкг/мл, предпочтительно '10 мкr/мл, более предпочтительно
50
мкг/мл,
дополнительно предпочтительно 0,5 мг/мл.
Рассматривая акгивный ингибитор ИПК или способ ингибирования активности
ИПК согласно настоящему изобретению, моноклональное антитело можно вводить
живым организмам дополнительными способами. Обычно моноклональное антитело
с фармацевтически приемлемой основой. При необходимости можно
смешивать моноклональное антитело с добавками, такими как заryстители,
стабилизаторы, консерванты и солюбилизаторы. Примеры такой основы или
смешивают
добавок включают в себя лакrозу, лимонную кислоry, стеариновую кислоry, стеарат
магния, сахарозу, крахмал, тальк, желатин, агар, растительное масло и
этиленгликоль. Термин "фармацевтически приемлемый" означает одобрение
реryлирующим органом кащдого правительства или перечисJlение в Фармакопее
кахqqой страны, или в другой общепризнанной фармакопее для использования у
животных, у млекопитающих, и более конкретно, у людей. Акгивный инrибитор ИПК
согласно изобретению таюке может обеспечиваться в виде однократных или
множественных доз лиофилизированных пороtuков или таблеток. Дополнительно,
лиофилизированные порошки или таблетки можно использовать в комбинации со
с физиологическим раствором или буферным
разведения композиций с целью получения желательной
стерильной водой для инъекций,
раствором мя
концентрации перед введением.
flополнительно, когда моноклональное антитело вводят как вектор,
экспрессирующий иммуноглобулин, тяжелые и легкие цепи ко-трансфицируют в
друryю плазмиду, и кащдую плазмиду можно вводить в диапазоне от 0,'1 до 10 мг,
например, от 1 до 5 мг, на 1 кг веса тела. ,Щля введения плазмиды в клетки iп vitro
содержание используемых векторов будет составлять от '| до
!алее в настоящем изобретении это будет
5
конкретно опис€lно
мкг/106 клеток.
посредством
примеров.
Все предшествующие документы из данной области техники, цитируемые
настоящем изобретении, включены со ссылкой во всей их полноте.
Пример
1
А. Анализ экспDессии lLT7
46
в
вY
20509
с1
201б.10.30
А-'1 Анализ с использованием библиотеки
SAGE
Экспрессию rенов в человеческих моноцитах, ИПК
и ИПК,
обработанных
вирусом простого герпеса HSV, сравнивали и анализировали способом серийного
анализа генетической экспрессии (Торговая марка; SAGE). Способ анализа описан
ниже. Из человеческой периферической крови выделяли моноциты, как BDCA-4
положительные клетки, и ИПК выделяли как CD14 положительные клетки, используя
клеточный сортер. .Щополнительно, ИПК культивировали
в течение 12 часов в
затем приготавливали
присутствии вируса простого герпеса (HSV), и
дифференцированные ИПК. РНК получали из соответствующих клеток, с
последующим получением библиотеки SAGE, используя комплект I-SAGE (торговая
марка) (производства lnvitrogen). flанные из полученных последовательностей
оснований около 100000 меток анализировали, используя программное обеспечение
анализа SAGE (производства lnvitrogen). В результате был найден ген, в котором, по
подсчетам, соотношение моноцит/ИПlОИПК+НSV составляло 0/16/0, а именно, lLT7
(GenBank Асс NoNM_O12276), известный как ген, проявляющий специфичную
ИПК. lLT7
представляет собой мембранный белок с
иммуноглобулиноподобными доменами, кодируемый последовательностью
оснований, которая показана в SEQ lD NO:1 (фиг, 2 (а). Сообщается, что мРНК из
экспрессию
lLT7 экспрессируется в ИПК (Blood 100, З295-3303 (2002)),
А-2) Rт-пцр
Более подробно исследовали экспрессию lLT7
в
гемоцитарных клетках,
Каж,дую клетку предварительно выделяли из человеческой периферической крови
клеточным сортером. РНК извлекали из ках(дой из выделенных клеточных
популяций,
из которых синтезировали
цЩНК. Количественную Пl-]Р проводили
согласно общепринятому способу, используя в качестве матрицы получаемую
цЩНК,
и анализировали уровень экспрессии мРНК из lLT7.
Применяли следующие условия для последовательностей оснований
праймеров и ПЦР:
3'(SEa lD NO:3)
5'ТТС ССА AGG СТС САС САС ТСТ 3'(SEa lD NO:4)
Прямой праймер: 5'СТС САА ССС СТА ССТ GCT GTC
Обратный праймер:
1 цикл ПЦР (при 94"С в течение 3
минр)
25 циклов Пl-]Р (при 94"С в течение 30 секунд, при 58"С в течение 30 секунд, и
при 72"С в течение '| минры)
1 цикл Пl-]Р (при
72'С
в течение б
минр)
При стимуляции ИПК моноцитами проводили изучение ИПК, HSV и CD194,7
вY
20509
с1
201б.10.30
положительных клеток (то есть, В-клеток), СD3-положительных клеток (то есть, Тклеток), Т-клеток, стимулированных РМА и СD56-положительных клеток (то есть, NKклеток), и было выявлено, что lLT7 специфически экспрессируется в ИПК (фиг. 1 (а).
А-3) Количественный RТ-ПЦР
!ополнительно, исследовали экспрессию в других органах и тканях пrгем
количественной ПL{Р, используя ABl PR|SM 7000 (производства Applied Biosystem). В
качестве панели фНК использовали BD (Торговая марка), МТС - множественную
тканевую KflHK панель (Human l; Cat.No.636742, Human immune; Cat.No.63674B,
Нчmап blood fractions: Cat. No.636750; все из перечисленного производства Becton
Dickinson), и те же цЩНК, полученные из гемоцитарных клеток, как описано в п.2).
Использовали следующие последовательности оснований праймеров:
Прямой праймер для lLT7: 5'ССТ САА ТСС AGC АСА A;qA GАА GT
3'(SEa
lD
NO:5)
Обратный праймер для lLT7: 5'CGG ATG AGA ТТС ТСС АСТ GТG ТАА
3'(SEa
lD NO:6)
Прямой праймер для GAPDH: 5'ССА ССС ATG GCA ААТ ТСС 3'(SEa lD NO:7)
Обратный праймер
мя
GAPDH: 5'TGG GAT ТТС САТ TGA TGA САА G 3'
(SEQ lD NO:8)
ПL{Р проводили, используя ABl PR|SM 7000 (производства Applied Biosystem)
и комплект SYBR green PCR master mix (производства той же компании). ,Щля
анализа использовали программное обеспечение системы обнаруrкения
последовательности (производства той же компании).
Применяли следующие условия реакции:
Этап
'1: 1
цикл ПЦР (при 50"С в течение 2 минр)
Этап 2: 1 цикл Пl-{Р (при 95"С в течение
'10
минр)
Этап 3: 40 циклов Пl-]Р (при 95'С в течение 15 секунд, при 60"С в течение
1
минры)
Сравнение окспрессии гена lLT7 проводили мещду ках(4ой тканью путем
стандартизации по уровню экспрессии гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы
(GAPDH) с известной конституrивной экспрессией. В результате было отмечено, что
lLT7 не экспрессируется в каких-либо органах, кроме лимфатических тканей, и
специфически экспрессируется в ИПК.
В. Полрение lLT7 и векгоров экспрессии FcRy
flля экспрессии белков lLT7 последовательно проводили клонирование генов
и получение векторов экспрессии.
48
BY
20509
с1
201б.10.30
В-1) Клонирование генов lLT7
Поли(А)*РНК, выделенную из человеческой периферической крови, извлекали
из ИПК, из которых синтезировали цЩНК, используя праймер oligo dT и комплект для
синтеза
ЦНК Sчреr Script Choice System. Адаптер EcoRl
лигировали
в
синтезируемую кДНК, которую лигировали в вектор pMEl8S, расщепляемый EcoRl,
что приводило к получению библиотеки щ!НК человеческой ИПК. Ген lLT7
амплифицировали способом Пl_{Р, используя полученную библиотеку
качестве матрицы, а
так же используя праймеры со
ФНК
в
следующими
последовательностями оснований. ,Щля реакции ПL{Р применяли 1 единицу KOD
плюс,QНК полимеразу (производства TOYOBO СО., LTD). Устанавливали условия
94'С в течение 15 секунд, при 55"С в течение 30
секунд, и при 68"С в течение 2 минр) после 1 цикла Пl-{Р при 94'С в течение 2
реакции в 25 циклов Пl-]Р (при
минут.
Прямой праймер: 5'CAG GGC CAG GAG GAG GAG ATG
3'(SEa lD
NO:9)
Обратный праймер: 5'ТСА GCA GAC АСТ ТСС ССА АСТ 3' (SEa lD NO:10)
Амплифицированный фрагмент lLT7 ЦНК в 2 kb выделяли и извлекали
электрофорезом, используя 17о агарозный гель, затем его клонировали в
плазмидный векгор pCR4 Вlчпt-ТОРО (производства lnvitrogen), используя комплект
мя
клонирования Zero Blunt ТОРО
PCR Сlопiпg kit
(производства lnvitгogen).
Проводили анализ последовательностей оснований полученных генов, и было
выявлено, что получен желательный ген lLT7, показанный в SEQ lD NO:1.
В-2) Получение векторов экспрессии lLT7 с меткой FLAG
Была сконструирована соответствующая плазмида, экспрессирующая белок, в
котором метки FLAG были слиты с N- и С-концами lLT7. lLT7 сливали с меткой, что
позволяло подтвердить экспрессию белка
lLT7 путем обнарркения
метки.
Желательную последовательность амплифицировали способом Пl-]Р, используя в
качестве матрицы ген ILT7, полученный, как описано в п. 1), а таюке используя
праймеры
со следующими последовательностями оснований. Для реакции ПЦР
применяли 1 единицу KOD плюс flHK полимеразу (производства ТОYОВО СО,, LTD).
Устанавливали условия реакции в 25 циклов Пl-]Р (при 94'С в течение 15 секунд, при
55"С в течение 30 секунд, и при 68'С в течение 2 минр) после 1 цикла ПL{Р при
94"Свтечение2минут,
,Щля
N-FLAG lLT7
Прямой праймер (SEa lD NO:11): 5' CCG ctc gag ATG АСС СТС АТТ СТС АСА
AGC CTG СТС ТТС ТТТ GGG CTG AGC CTG GGC IGAT ТАС AAG GAT GAC GAC
49
BY
20509
с1
201б.10.30
GAT AAG] ССС AGG АСС CGG GTG CAG GCA GAA 3,
Обратный праймер (SEa lD NO:12): 5' С TAG act agt ТСА GAT CTG ТТС ССА
AGG
стс
,Щля
3,
C-FLAG lLT7
Прямой праймер (SEa lD NO:13): 5'CCG ctc gag ATG АСС СТС АТТ СТС АСА
AGc
3,
Обратный праймер (SEa lD NO:14): 5' С TAG act agt ТСА tСТТ АТС GTC GTC
АТС СТТ GTA ATCI GAT CTG ТТС ССА AGG СТС
В
3,
вышеупомянуrых последовательностях оснований кахqqый подчеркнрый
участок в скобках показывает последовательность оснований, кодирующую
прикрепленную метку FLAG, и кащдая строчная буква показывает сайт расщепления
для фермента рестрикции Xhol или Spel. Фрагменты !НК, амплифицированные
посредством Пl-{Р, были расщеплены Xhol и Spel, которые после этого выделяли
электрофорезом в геле. Извлеченные фрагменты ДНК в 2 kb лигировали в векrор
рМЕl8Х, расщепленный Xhol и Spel тем же способом, как описано выше. 3атем
конструировали два типа плазмид, способных экспрессировать желательный белок
слияния, то есть pMElBX-N-FLAG lLT7 и рМЕ18 X-C-FLAG lLT7, соответственно.
В-3) Клонирование генов FcRy
Белок FcRy считался белком, способным к ассоциации с белком lLT7.
Молекула согласно изобретению является геном с последовательностями
оснований и аминокислотными последовательностями SEQ lD NO:15 и 16
(GenbankAcc Ns NM_004106, J. Biol. Chem.265,6448-6452 (1990)). Указанная
молекула представляет собой молекулу (у-цепь), которая составляет Fс ý Rl, то есть
высоко аффинный рецептор lgE, Таюке он называется Fс ( Rl у, но далее в
настоящем изобретении он будет упоминаться как FcRy. В этом отношении
настоящая молекула таюке известна как компонент FсуR или FcoR. Настоящий ген
был клонирован способом Пl-{Р, как показано ниже, для получения
экспрессии. Ген FcRy амплифицировали способом Пl-{Р, используя в
матрицы библиотеку ц[НК человеческих ИПК, как описано в п.
праймеры
'1),
векторов
качестве
а таюке используя
со следующими последовательностями оснований. Для реакции ПЦР
применяли 1 единицу KOD плюс !НК полимеразу (производства TOYOBO СО., LTD).
Устанавливали условия реакции в 25 циклов Пl-{Р (при 94"С в течение 15 секунд, при
55"С в течение 30 секунд, и при 68'С в течение 2 минут) после '| цикла ПL{Р при
94'Свтечение2минр.
Прямой праймер: 5'ССС AAG ATG АТТ ССА GCA GTG 3'(SEa lD NO:17)
50
BY
20509
с1
201б.10.30
3'(SEa lD NO:18)
Амплифицированный фрагмент FcRy цЩНК в 0,3 kb выделяли и извлекали
элекгрофорезом, используя 2yо агарозный гель, затем его клонировали в
Обратный праймер: 5'GGA AGA АСС AGA AGC САА AGA
плазмидный векгор pCR4 Blunt-TOPO (производства lnvitrogen), используя комплект
для клонирования Zero Blunt ТОРО PCR Cloning kit (производства
lnvitrogen).
Проводили анализ последовательностей оснований полученных генов,
и
было
подтверщдено, что клонирован желательный ген FcRy, показанный в SEQ lD NO:15.
В-4) Получение Мус-меченых векторов экспрессии FсRу
Плазмиду, экспрессирующую белок, в котором Мус-метку присоединяли к Сконцу, конструировали таким образом, чтобы было можно подтвердить экспрессию
белка FсRу. Желательную последовательность амплифицировали способом Пl-{Р,
используя в качестве матрицы ген FcRy, полученный согласно описанию в п.3), а
таюке используя праймеры со следующими последовательностями оснований.
!ля
реакции ПL{Р применяли 1 единицу KOD плюс flHK полимеразу (производства
TOYOBO СО., LTD). Устанавливали условия реакции в 25 циклов Пl-]Р (при 94'С в
течение 15 секунд, при 55'С в течение 30 секунд, и при 68'С в течение 2 минр)
после 1 цикла ПЦР при 94'С в течение 2 минр.
Прямой праймер (SEa lD NO:19): 5'CCG ctc gag ATG АТТ ССА GCA GТG GTC
TTG
3,
Обратный праймер
(SEa lD NO:20): 5' СТА Gac tag tCT AICA GAT ССТ СТТ
CAG AGA TGA GTT ТСТ GCT СlСТ GTG GTG GTT ТСТ САТ G
3,
В вышеупомянрых праймерных последовательностях подчеркнутый участок в
скобках показывает последовательность оснований, кодирующую прикрепленную
метку Мус, и кащ4ая строчная буква показывают сайт расщепления для фермента
рестрикции Xhol или Spel. Фраrменты,ЩНК, амплифицированные посредством Пl-]Р,
были расщеплены Xhol и Spel, которые после этого выделяли элекгрофорезом в
геле. Извлеченные фрагменты !НК в 0,3 kb лигировали в вектор рМЕl8Х,
расщепленный
Xhol и Spel тем же способом, как описано выше.
3атем
конструировали плазмиду, способную экспрессировать желательный белок слияния,
то есть pMEl8X-Myc-FcRy
С. Экспрессия lLT7
.
в
животных клетках
Изучали экспрессию lLT7 в животных клетках, используя векторы экспрессии,
полученные, как описано выше.
С-1) Экспрессия в клетках 293Т
flHK, состоящие из следующих пяти комбинаций, были введены в 293Т клетки
5l
BY
20509
с1
201б.10.30
(7х105 клеток), используя комплект для трансфекции Effectene (производства
Qiagen). Через два дня после введения проводили анализ проточной цитометрии
(анализ FСМ).
(1)
pMEl8X-N-FLAG lLT7 2 мкг
pMEl8X-C-FLAG lLT7 2 мкг
(З) pMEl8X-N-FLAG lLT7 1 уц1
(2)
+
рМЕl8Х-Мус-FсRу 1 мкг
(а) pMElBX-C-FLAG lLT7 1 мкг + pMElBX-Myc-FcRy 1 мкг
(5) pMEl8X-Myc-FcRy 2 мкг
Анализ способом FСМ осуществляли тем же образом, как описано в п. А-4
следующего примера 2. ,Щля реакции использовали Су3 конъюгированное антиFLАG-антитело (производства Sigma), и мя анализа использовали FАСSсап
В
результате было выявлено, что только
небольчlое число lLT7 экспрессировались на клеточной поверхности, при реакции
(производства Becton Dickinson).
единственным, тогда как lLT7 экспрессировался внеклеточно
и
мощно при
совместном воздействии с FcRy (фиг. 3). Известно, что мышиный FсRу имеет
высокую гомологию с человеческим FсRу. Вместе с тем, если в качестве хозяев
использовали клетки р815 (мышиной мастоцитомы), которые экспрессируют
мышиный FсRу, экспрессия lLT7 не наблюдалась.
С-2) Анализ иммунопрецип итации и способ вестерн-блоттинга.
Коэкспрессию
lLT7
с FcRy на
клеточной поверхности подтверщqали
следующим образом. После иммунопреципитации
мя
кащдой клетки 293Т
проводили анализ разных антител, которые коэкспрессировались с обоими генами в
соответствующих комбинациях, описанных в п, от (1) до (5). В клетки 293Т (7x't05
клеток) вводили ДНК, из которой через два дня после введения клетки 293Т
извлекали тем же образом, как описано в п. (1). Клеточные фракции растворяли в
лизирующем буфере (0,5% тритон, 150 мМ NaCl) и оставляли на льду на 20 минуr.
3атем несколько раз проводили повторную аспирацию с использованием иrльl (27
G), с последуюrлим центрифугированием при '15 К об/мин в течение 20 минр. К 200
мкг лизата получаемых продуктов добавляли
анти-mус-антитело
(2
мкг,
производства Santa сrчz biotechnology) или антиFLАG_антитело (2 мкг, производства
Sigma), и дополнительно перемешивали вращением при 4"С в течение 4 часов.
3атем добавляли белок ДG A/G Sepharose 4 Fast Flow mix (производства Аmеrshаm
Bioscience) и перемешивали вращением при 4"С в течение 't часа. После этого
полученные преципитацией фракции промывали
следующей композиции.
52
З раза лизирующим
буфером
вY
20509
с1
2016.10.30
Лизирующий буфер:
0,5% тритонХ_100,
50 мМ НЕРЕ8 (уровень рН 7,6),
'150
мМ NaCl,
1 мМ ЭflТА,
10% глицерин,
1 мМ дитиотреитола (,QТТ),
2 мМ фенилметилсульфонил фторида (ПМСФ),
1 мкг/мл апротинина,
1
м
кг/мл лейпептина,
1 мкг/мл пепстатина А,
0, 1
мкг/мл химистатина,
1 мМ NазVО4,
0,1 мМ В-глицерофосфата
Буфер для образца элекгрофореза в полиакриламидном геле в присrтствии
додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) добавляли к промытым преципитатам,
которые кипятили в течение 5 минр и центрифугировали, с последующим
с
гелем додецилсульфата (SDS). После
электрофореза образцы переносили из гелей на поливинилиденфторидную
мембрану РVDF (мембрана lmmobilon-p-transfer: производства Мilliроrе) согласно
обшепринятой методике. Блоттинг проводили с антиFLАG-антителом и анти-mуспроведением элекrрофореза
10О/о
антителом. Подтверщqали, что в клетках 293Т присрствовал lLT7, ассоциированный
с FcRy, поскольку их присуIствие выявлено в кащдом иммунопреципитате (фиг.4).
С-3) Анализ сахарной цепи
Поскольку
в
анализе вестерн-блоттинг наблюдали несколько полос lLT7,
изучена возможность
гл
икозил ирован
ия |LT7. Проводили
иммунопреципитацию
антиFLАG-антителом 200 мкг лизата клеток 293Т, которые экспрессировали N-FLAG
|LT7 и Мус-FсRу, тем же образом, как описано в п. 1) и 2). 3атем суспендировали
в 60 мкл буфера N-гликозидазы с нижеуказанной
композицией, и аликвотные количества 30 мкл ка)t(дого полученного раствора
преципитированные фракции
помещали в пробирки.
Буфер N-гликозидазы:
10 мМ ЭДТА,
0,2% SDS,
0,5% тритонХ 100,
53
вY
'l
%
20509
с1
201б.10.30
2-меркаптоэтанола в ФБР (фосфатно-буферном растворе).
После этого в одну пробирку добавляли 3 единицы 3 мt<лt N-гликозидазы
(N91365177, производства Roche) для реакции при 37"С в течение 't5 часов.
flополнительно к этому добавляли 7 мм буфера для образца, который нагревали
при 100"С в течение 5 минр, с последующим проведением элекгрофореза с 10%
SDS, После электрофореза rель переносили на мембрану PVDF, на
которую
добавляли '1 мкл поликлонального анти-lLТ7-антитела, как описано в п. 4), и
оставляли мя реакции при в 4"С в течение ночи. Получаемый продукг промывали с
проводили реакцию с меченым перексидазой хрена (HRP)
антикроличьим антителом (производства Jackson) в 100000-кратном разведении при
буфером TBS-T
и
комнатной темпераryре, 3атем проводили окрашивание
вестерн-блотгинга
ECL
с системой
(производства Amersham bioscience).
обнару,rкения
В
результате
кажущуюся молекулярную массу уменьшали пугем обработки N-гликозидазой. Таким
образом, предполагалось, что сахарные цепи добавляли к lLT7 (фиг. 5).
С-4) Получение поликлонального анти-lLТ7-антитела
Используемое поликлональное анти-lLТ7-антитёло, согласно описанию в п.
3),
получали следующим образом. Осуществляли химический синтез пептида из 23
аминокислот, соответствующих С-концу lLT7 (CSQEANSRKDNAPFRWEPWEQl; SEQ
lD NO:21), и присоединяли его к белку гемоцианина лимфы улитки (KLH), который
являлся носителем, и использовали получаемый продуlсг в качестве иммуногена.
Кроликов внуrрикожно иммунизировали иммуногеном, смешанным
с
полным
адъювантом Фрейнда. После проведения у всех кроликов шести иммунизаций (один
раз в неделю) подтверх<дали повышенный титр антитела в сыворотке, и затем
проводили отбор цельной крови. После этого некоторое количество сыворотки
подвергали аффинной очистке, используя пептидную колонку тех
последовательностей. Получаемый продукr был идентифицирован
же
как
поликлональное анти-l LT7-a нтитело.
Пример 2
А. Полччение моноклонального анти-lLТ7-антиrела
А-1 )
Получение иммуногена
Клетки для использования в качестве иммуногенов приготовляли пrтем
внедрения генов в клетки 293Т, как описано ниже. flобавляли 46,4 мкг трансгена
(23,2 мкг рМЕ18 X-C-FLAG lLT7 и 23,2 мкг рМЕl8Х-Мус-FсRу) на дно 100 мм чашки,
покрытой коллагеном (lWAKl), сверху наносили 3мл среды opti-MEM (GIBCO)
и
перемешивали. После этого, помимо раствора трансrена, 58 мкл липофекгамина
54
BY
20509
с1
201б.10.30
(Торговая марка) -2000 (lnvitrogen) разводили 3 мл opti-MEM, которой давали
отстояться при комнатной темпераryре в течение 5 минр, и приготовляли раствор
липофекгамина. 3атем раствор липофекгамина аккуратно добавляли в чашку,
содержащую трансгенный раствор, и перемешивали. После отстаивания при
минр в чашку аккуратно добавляли 10 мл
концентрации 1х105 клеток/мл, используя
комнатноЙ темпераryре в течение 20
293Т-клеток, разведенных до
культуральную среду DMEM (S|GMA), содержащую 10% ЭБС (эмбриональной
бычьей сыворотки), Полуrаемую среду подвергали статическому культивированию в
инкубаторе при 37"С
в атмосфере СО2 в тёчёние 48 часов, из
котороЙ клетки
извлекали пуrем раскапывания пипеткой. Полученные клетки использовали
в
качестве трансфектантов для иммуногенов.
А-2) Получение гибридом
3а один день до иммунизации клеток вводили 50 мкл эмульсии, полученной
пугем смешивания 200 мкл ФБР с 200 мм полного адъюванта Фрейнда (FREUND)
(RM606-1 , производства Mitsubishi Kagaku latron, lпс), в подошвы обеих лап четырех
самок мышей Balb/c (в возрасте четырех недель) для иммунизации. На следующий
день проводили иммунизацию 5О мкл 2х107 клеток, суспендированных в 400 мкл
ФБР. Вторую и третью иммунизации осуществляли ках(дые четыре дня. Через три
дня после третьей иммунизации выполняли слияние клеток следующим образом.
Клетки забирали из лимфатических узлов конечностей иммунизированных мышей.
Клетки мышиной миеломы P3-X63-Ag8-U1, культивированные в кульryральной среде
RPM|'1640 (S|GMA), содержащей 10% ЭБС, смешивали с клетками, полученными из
лимфатических узлов и миеломы таким образом, чтобы отношение клеток мышиной
миеломы к клеткам, полученным из лимфатических узлов и миеломы, составляло от
2:1 до 10:1, и из этой смеси
центрифугированием извлекали клетки.
Полиэтиленгликоль PEG4000 (MERCK) разведенный в равных частях кульryральной
средой RPMl1640, добавляли
полученным клеточным фракциям, которые
к
подвергали слиянию клеток. После промывания клеток получаемый продуlсг
суспендировали в 160 мл 15% среды ЭБС-НАТ, содержащей комплемент, и затем
высевали в шестнадцать 96-луночных планшет в количестве 200 мкл на лунку. Через
три дней проводили замену кульryральной среды. Через одну-две
недели
наблюдений за образованием колоний проводили первичный скрининг.
А-3) Скрининг гибридомы клеточным анализом ELISA.
Гибридому, продуцирующую антитело-мишень, подвергали скрининry
следующим клеточным анализом ELISA. Клетки, полученные согласно описанию в
55
п.
вY
1),
использованные
20509
в
с1
201б.10.30
количестве 1хlО7 клеток
на
96-луночных планшет,
суспендировали в 0,5% бычьего сывороточного альбумина БСА/2 мМ ЭflТfuФБР,
и
затем аликвотные количества 100 мкл/на лунку добавляли в планшет для клеточного
анализа EL|SA (NUNC 249570 96V NW PS). L{ентрифугирование осуществляли со
скоростью 2000 оборотов
в
минуry при 4"С,
и
затем удаляли супернатант.
Собранную супернатантную кульryру добавляли в количестве 50 мкл/на лунку, и
проводили реакцию при комнатной темпераryре в течение 30 минр. !ва>tцы
проводили операцию промывания, в которую входило добавление 0,5% БСА/2 мМ
и
ЭДТДФБР в ках(цую лунку, центрифугирование со скоростью 2000 оборотов в
минуту при 4"С в течение 2 минут, и затем удаление супернатанта. После
промывания в кащqую лунку добавляли разведенное в 'l0000 раз меченое
пероксидазой антимышиное козье антитело lgc (lM0819; Beckman coulter) в
количестве 50 мкл/на лунку, которое реагировало в течение 30 минр. Операцию
промывания
с
использованием 0,5%
БСД2 мМ-Э,ЩТДФБР
проводили двах(цы, с
последующим добавлением раствора для окрашивания. Приготовленный раствор
антитела заменяли на ФБР G) посредством диализной мембраны (10000 отверстий,
производства PlERCE), для получения очищенных анти-lLТ7 химерных антител.
А-4) Оценка реактивности антитела анализом проточной цитометрии (FСМ).
Супернатант культуры гибридомы подвергали анализу проточной цитометрии
(FСМ). Клетки, полученные согласно описанию в п. 1), суспендировали в 0,5% БСД2
мМ ЭДТДФБР, после чего переносили в центрифужную пробирку в концентрации
'1
х105 на один образец,
с
последующим добавлением 40 мкл ках{4ой культуры и
проведением реакции при комнатной темпераryре в течение 30 минр. Операция
промывания, проводимая дващцы, включала в себя добавление
'1
мл 0,5% БСА/2 мМ
ЭДТА/ФБР на кащдую пробирку, центрифугирование при 1200 оборотах в минуry при
4'С в течение 3 минут и удаление супернатанта. 40 мкл разведенного в 100 раз
FlТС-меченого антимыtлиного козьего антитела lgG (lM0819; Beckman coulter),
добавляли после промывания в кащ4ую лунку, и проводили реакцию при комнатной
темпераryре в течение 30 минр. Операцию промывания
с
использованием 0,5%
БСД2 мМ-Э,ЩТДФБР проводили двацды, с последующим анализом
проточной
цитометрии FС500 (Весkmап coulter). Выбирали гибридому, которая продуцировала
антитело, реагирующее не только на клетку-хозяин, а специфически реагирующее
на клетку, в которую вставляли ген. Выбираемую гибридому клонировали способом
предельных разведений,
и были
получены гибридомы
продуцируют моноклональные антитела.
56
Ns'1
'l и
No17, которые
BY
20509
с1
2016.10.30
В. Оценка реактивности анти-lLТ7-антитела
Подобно методике, описанной в п. С-1) примера 1, lLT7, в котором метку FLAG
присоединяли к N-концу, коэкспрессировали с молекулой FсRу в клетки 293Т. 3атем
анализом FСМ подтверщцали реактивность антитела, полученного в примере 2,
используя FАСSсап (Becton Dickinson). В результате получали подтверх(цение, что
все антитела, продуцируемые гибридомами
Ns1
1 и Nol7, полученными согласно
описанию в п. А), реагируют на клетки, в которые был введен ген lLT7 и которые
экспрессировал lLT7 (фиг.6 (Ь)). Дополнительно, из периферической крови человека
выделяли лимфоциты, используя оборудование Fiсоll, и затем проводили двойное
окрашивание
с
полученным анти-lLТ7-антителом
и
антителом (Miltenyi). После этого изу{али реактивность
FЕ-меченым анти-ВDСА-2к
лимфоцитам. В результате
выявлено связывание моноклонального антитела, продуцируемого гибридомами
N911 и N9'l7, с ВDСА-2-положительной клеткой. Таким образом, подтверщдено, что
оба моноклональных антитела распознавали молекулы lLT7,
экспрессируемые
человеческими ИПК (фиг. 6 (а). Эти моноклональные антитела обозначены, как анти-
lLТ7-антитело
Ns1
1и
анти-lLТ7-антитело Ne17, соответственно. Осуществляли
более подробный анализ.
Проводили анализ
множественного окрашивания лимфоцитов
периферической крови человека, используя полученное анти-lLТ7-антитело, антидифференцировочное-'| -антитело (анти-СD3, CD14, CD16, CD19, антитела CD56;
Becton Dickinson), анти-СD123-антитело (Becton Dickinson) и анти-ВDСА-2-антитело
(Miltenyi). В
отношении
lLТ7-антитело-положительных фракций,
линиеспецифический маркер был отрицательным, CD123 был положительным и
BDCA-2 был положительным. Результаты подтвердили, что ИПК окрашивались
только lLT7Ns11 и lLT7Ns17 (фиг.7).
!ополнительно, анализ FСМ проводили изучения экспрессии разных молекул,
при которой лимфоциты периферической крови человека стимулировали CpG или
ИФНо
в
течение 24 часов. CpGODN22,16 использовали как CpGA, который
индуцирует продукцию ИФН из ИПК,
и CpGODN2006 использовался в
качестве
CpGB, который способствует созреванию дендритных клеток (Moseman et al.
J.
lmmunology. 173, 443З-4442,2004). Устанавливали окно для отрицательной фракции
линиеспецифического маркера. После анализа реакгивности анти-ВDСА-2-антитела
и анти-|LТ7-антитела к CD't 23-положительной клеточной популяции, больtлая часть
lLТ7-положительных фракций исчезала даже после стимуляции CpG в течение 24
часов, С другой стороны, некоторые клетки BDCA-2 оказывались положительными
57
BY
20509
после стимуляции CpG
в
с1
течение
201б.10.30
24 часов (фиг. 8).
Предполагается, что
дифференцировка ИПК в разные клетки происходит немедленно после стимуляции
CpG. Было показано, что анти-lLТ7-антитело согласно изобретению является
полезным в качестве первичного специфического антитела к ИПК. Дополнительно,
было подтверщqено, что ИПК в лимфоцитах периферической крови
не
дифференцируются в присуrствии ИФНq, в этом случае при высоком коэффициенте
выживаемости у ИПК сохранялась экспрессию lLT7, дополнительно lLT7 стабильно
присутствовало в ИПК при аутоиммунных заболеваниях с вероятным высоким
уровнем ИФН в сыворотке.
С. Оценка специфичности анти-lLТ7-антитела.
lLT7 принадлежит к семейству lLT/LlR, и существует множество молекул с
высокой гомологией, в особенности с высокой гомологией во внеклеточной области
(фиг. 9). Сообщается об экспрессии в ИПК мРНК молекул, в особенности таких как
lLT2 и lLТЗ (Ju et al. Gепе 331, 159-164, 2004). Поэтому реактивность этих молекул
подтверждали с использованием трансгенных клеток.
С-1) Клонирование молекулы lLTl и получение векторов экспрессии.
Синтезировали цЩНК от РНК, полученной из миндалины человека, используя
олигопраймер dT и комплекr системы отбора SuperScript для синтеза фНК. Затем,
адаптер Notl лигировали в вектор pMEl8S, расщепляемый Notl, что приводило
получению библиотеки цЩНК человеческой миндалины.
Ген lLT'|
с
к
меткой FLAG на С-конце амплифицировали способом Пl-]Р,
используя полученную библиотеку кДНК в качестве матрицы, а так же используя
праймеры со следующими последовательностями оснований. Дя реакции ПЦР
применяли 1 единицу KOD плюс flHK полимеразу (производства TOYOBO СО., LTD).
Устанавливали условия реакции в 25 циклов ПL{Р (при 94"С в течение 15 секунд, при
55'С в течение 30 секунд, и при бВ'С в течение 2 минл) после 1 цикла ПL{Р при
94'Свтечение2минут.
Прямой праймер (SEa lD NO:22): 5'CCG ctc gag ATG АСС ССС АТС СТС ACG
GTc с
3,
Обратный праймер
(SEa lD NO:23): 5' СТА Gac tag tTC АIqГ_ЦI_QýТ.!GТ
САТ ССТ TGT ААТ CICC ТСС CGG CTG САТ СТТ G
3,
В вышеупомянрых праймерных последовательностях ка>цдый подчеркнрый
участок в скобках показывает последовательность оснований, кодирующую
прикрепленную метку FLAG, и кащqая строчная буква показывает сайт расщепления
для фермента рестрикции Xhol или Spel. Фрагменты ДНК, амплифицированные
58
вY
20509
с1
201б.10.30
посредством Пl-{Р, были расщеплены Xhol и Spel, которые после этого выделяли
элекгрофорезом в геле. Извлеченные фрагменты ,ЩНК в 2 kb лигировали в вектор
рМЕlВХ, расщепленный Xhol и Spel тем же способом, как описано выше. 3атем
конструировали плаэмиду, способную экспрессировать желательный белок слияния,
то есть pMEl8X-N-FLAG
lLT1
. Последовательность оснований и
аминокислотная
последовательность показана в SEQ lD NO:24 и 25.
С-2) Получение экспрессирующих клеток и оценка реактивности антитела
Для lLT2 (SEa lD NO:26) и lLТЗ (SEQ lD NO:28) использовали
векторы
экспрессии, в которых соответствующие гены были клонированы в сайты Xbal или
Xhol из pcDNA4.'| (производства lnvitrogen). ДНК следующих комбинаций вводили в
клетки 293Т (7х105 клеток) тем же образом, как описано в п. С-1). Через два дня
после введения проводили анализ FСМ, и затем анализировали анти-lLТ7-антитело.
(1) pMEl8X-N-FLAG lLT7 1 уц1 + pMEl8X-Myc-FcRy 1 мкг
(2) pMEl8X-C-FLAG lLT1 0,5 мкг + рМЕl8Х-Мус-FсRу 0,5 мкг + pcDNA4.1-1LT2
0,5 мкг + рсDNД4,1-1LТ3 0,5 мкг
В результате выявлено отсуrствие реакции на клетки любых антитела,
в
которых наблюдалась экспрессия lLT1. Поэтому предполагается, что эти анти-lLТ7антитела специфически распознают молекулы lLT7 на ИПК (фиг. 10).
Пример 3
!ействие анти-lLТ7-антитела на способность продуцировать человеческий
иФн.
Лимфоциты периферической крови человека высевали
на
96-луночную
планшеry в количестве 2х105 клеток/на лунку, и проводили их реакцию с 5 мкг/мл
разных антител при 37"С. После культивирования в течение 1 часа в лунки
добавляли вирус гриппа PR8. Через 24 часа культивирования измеряли ИФНо в
супернатантной кульryре комплектом для анализа EL|SA (Вепdеr Med System). Как
результат, отмечали ингибирование продукции ИФН добавлением анти-lLТ7антитела (фиг. 11). В частности, было выявлено, что на продукцию ИФН из ИПК
влияет анти-lLТ7-антитело согласно изобретению.
Пример 4
СDС-акгивность анти- ILТ7-антител
А. Получение моноклональных анти-lLТ7-антител
Клон, продуцирующий моноклональное антитело, получали тем же образом,
в п. от А-1) до А-4) примера 2. Реакгивность оценивали тем же
как описано в п. В примера 2, и специфичность оценивали согласно
как описано
способом,
59
BY
20509
с1
2016.10.30
С примера 2. В результате были получены гибридомы
N937, N928 и
N933, которые продуцируют моноклональные анти-lLт7-антитела
хорошей
описанию в п.
с
реактивностью и специфичностью. СDС-акгивность измеряли, как описано ниже, с
использованием моноклонального анти-lLТ7-антитела, которое продуцировали три
вида этих гибридом.
В. Определение СDС-акгивности
В-1) 3а один день до получения клеточной линии-мишени (клеточная линия
|LT7-CHO), нижеуказанную
!НК
вводили
в
клетки CHO-k1
,
которые высевали в
с использованием реагента
трансфекции Effectene (производства aLAGEN) и затем выбирали устойчивые
количестве бх105 клеток на чашку (6 см в диаметре),
tuтаммы, используя 800 мкг/мл зеоцина (производства lnvitrogen).
Введенная ДНК: ркЦНК3.1-С-FLАG lLT7 1 мкг
рМЕl8Х-Мус FсRу 2 мкг.
После этого получали клеточную линию с высокой экспрессией lLT7,
+
используя клеточный сортер (BD FАСSАriа, производства Becton Dickinson).
Анализом FСМ подтверщ4али, что выбранная клеточная линия проявляет высокую
экспрессию lLT7, Анализ FСМ осуществляли согласно способу, описанному в п. А-4)
примера 2, за исключением того, что для FСМ использовали BD FACSCaliber
(производства BD).
!ля
первичного антитела
и
вторичного антитела использовали,
соответственно, следующие антитела.
Первичное антитело: 5 мкг/мл мышиного анти-lLТ7-антитело (N937),
вторичное антитело: R-фикоэритрин (R-PE)
-
конъюгированное козье
антимышиное специфичное многоклональное антитело против иммуноглобулина
(BD)
В-2) Реакция клеток-мишеней на анти-lLТ7-антитела
Извлекали полученные клетки-мишени, как описано
в п. В-1)
(клетка lLT7-
СНО), используя 5 мМ раствора ЭДТýФБР, которые затем суспендировали в среде
CDC с
нижеуказанной композицией, чтобы концентрация составляла 4хlО5
клеток/мл. Суспензию в аликвотных количествах 50 мкл/на лунку высевали в ках(дую
лунку 96-луночного планшета.
Среда CDC:
RPMl1640
0,1%
БсА
'100 ед/мл пенициллина
1
00 мкг/мл стрептомицина
60
BY
10 мМ Hepes
20509
с1
2016.10.30
(N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновая
кислота),
уровень рН 7,6)
2 мМ L-глутамина
В
кащqую лунку добавляли 50 мкл раствора анти-lLТ7-антитела,
приготовленного в среде CDC, и смешивали таким образом, чтобы конечная
концентрация антител составляла 0,1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл и 5 мкг/мл.
flополнительно в лунки добавляли 50 мкл среды CDC, содержащей комплемент с
нижеуказанной композицией, и перемешивали таким образом, чтобы конечная
концентрация комплемента составляла 6%, с последующим культивированием при
37"Свтечение2часов.
Среда CDC, содержащая комплемент:
'1 мл комплемента
новорощденного кролика (N9
в
каталоге: CL3441
,
производства CEDARLANE)
Среда CDC (см, выше)
3атем суспензию центрифугировали (условия центрифугирования: 250 об/мин
в течение 4 минр), и супернатант извлекали, обращая внимание на помержание
стерильности для меток. Количество лактатдегидрогеназы (ЛДГ)
в
супернатанте
измеряли общепринятым способом, определяемым по "количеству
ЛДГ,
проникающей из клетки-миtлени посредством активности комплемента" (тестовый
образец).
Таюке для определения активности CDC были подготовлены следующие
параметры:
-
Спонтанное высвобождение ЛДГ из клетки-мишени: проводили
культивирование и приготовление только клеток-мишеней в том же объеме, как
объем образца,
-
Максимальное высвобощqение Л,QГ
из
клетки-мишени: проводили
культивирование и приготовление только клеток-мишеней в объеме, равном объему
образца, и затем за 60 минуг до извлечения супернатанта к ним добавляли раствор
тритонХ-100, входящий
состав комплекта, чтобы конечная концентрация
в
составляла
0,8оlо.
- Контроль коррекции объема: приготовляли количество тритонХ-100, равное
количеству, добавленному для приготовления максимального высвобощдения ЛДГ
из клетки-мишени, добавляли к кульryральной среде того же объема, как объем
образца.
- Уровень кульryральной среды: приготовляли объем кульryральный среды,
бl
вY
20509
с1
201б.10.30
равный обьему образца и раствора, к которому добавляли комплемент, содержащиЙ
среду
cDc,
и добавляли к культуральной среде, чтобы она имела тот же объем, как
образец.
Объем культуральной средыl равный объему образца, вычитали
спекгральной поглощательной способности максимального показателя мишени
спонтанного показателя мишени. Раствор,
к которому добавляли
из
и
комплемент,
содержащий среду CDC, добавляли в кульryральную среду, чтобы он имел объем,
равный объему образца, вычитали из спектральной поглощательной способности
тестового образца и корректировали. Акгивность CDC вычисляли нижеуказанным
уравнением. Результаты показаны в таблице 1 и на фиryре 'l2. Даже в случае
использования моноклональных анти-|LТ7-антител, полученных
гибридомы, 8ОYо или больше активности
из
CDC проявлялось при
какой-либо
концентрация
антитела 0,5 мкг/мл или больше.
Активность
CDC (%) = (Тестовый образец -
мишени)/(максимальный показатель мишени
спонтанный показатель
- объем контроля -
спонтанный
показатель мишени)х1 00
Кон центрация
антител
(м
l-|итотоксич ности
14,78
в5,50
86,13
90,26
18,52
в0,97
83,64
88,17
4,42
82,16
в5,39
86,18
1,53
1,47
3,6в
3,06
2,10
3,16
0,60
2,93
1,87
0,60
1,в2
1,99
з,32
1,58
3,35
2,7в
0,5
1
0,1
#2в
0,5
1
Е
0,1
#33
0,5
1
5
0"l
Мышиный lgG2a
0,5
1
Отсрствие АЬ
1
(стандартная)
кг/мл)
0,1
#з7
аблица
l-|итотоксичность
(средняя)
5
0
Сравнительный пример
1,71
0,60
2,50
2,90
1,72
0,49
1
Аналогичное исследование проводили тем же образом, как описано в п. В и
С
п.
примера 4, кроме использования мышиного lgG2a вместо анти-lLТ7-антитела.
62
BY
20509
с1
Результаты показаны в примере 4, а
клеткам-мишеням
не
201б.10.30
та о<е
наблюдалась
в таблице 5 и фиryре. Акгивность CDC
у других антител, кроме
к
анти-lLТ7
моноклонального антитела.
Пример 5
Интернализация анти-lLТ7-антитела к клеткам-мишеням
А. Моноклональное анти-lLТ7-антитело
Использовали следующие моноклональные анти-lLТ7-антитела.
Моноклональные анти-lLТ7-антитела: N917, N926, N937, N928 и N933
В. Наблюдение интернализации
B-'l ) Получение клеточной линии-мишени (клеточная линия lLT7-CHO)
Клеточная линия-мишень (клеточная линия |LT7-CHO) была получена тем же
способом, как описано в п, В-1 примера 4.
В-2) Реакция клеток-мишеней на анти-lLТ7-антитело
Извлеченные клетки |LT7-CHO суспендировали в ледяном буфере (Т (-) + lОИ
ФБР), имеющем нижеуказанную композицию,
в
концентрации 1хlОб клеток/мл,
используя 5 мМ раствора ЭДТА/ФБР.
Среда Т
(-):
RPMl1640
1
00 единиl!мл пенициллина
1
00 мкг/мл стрептомицина
10 мМ Hepes (уровень рН 7,6)
2 мМ L-глрамина
1
мМ пирувата натрия
50 мкМ 2-меркаптоэтанола
10оlо
нагретая инактивированная эмбриональная бычья сыворотка
1мл суспензии помещали в центрифркные
объемом 15 мл, и проводили центрифугирование (условия
Согласно описанию выше,
пробирки
центрифугирования: '1200 об/мин, при
4'С, в течение 5 минр), и затем удаляли
супернатант. К дебрису добавляли 200 мкл суспензии моноклонального анти-lLТ7антитела (10 мкг/мл), перемешивали и культивировали при 4'С в течение 30 минл, с
последующим двукратным промыванием ледяной Т (-) средой (количество
используемой среды: 10 мл на промывание, условия центрифугирования: 1200
оборотов в минrгу, при 4'С, в течение 5 минут).
В-3) Модификация иммунного комплекса
присуrствующего на поверхности клеток-ми шеней
бз
lLТ7-анти-lLТ7-антитело,
BY
20509
с1
201б.10.30
3атем осуществляли модификацию иммунного комплекс€l lLТ7-анти-lLТ7антитело, находящегося на клеточной поверхности, вторичным антителом, имевшим
флуоресцентную метку для обнаруlкения. Конкретный способ описан них<е, АРСмеченое (аллофикоцианином) козье анти-мышиное полимональное антитело
против lgG (No
в
каталоге: 5508268D, производства Bioscience|), содержащее
ледяную Т (-) среду, добавляли
к
дебрису, полученному согласно описанию в п. В-2),
которое культивировали с затемнением при
4'С
в течение 20
минл с последующим
двукратным промыванием ледяной Т (-) средой (количество используемой среды: 10
мл на промывание, условия центрифуrирования: 1200 оборотов в минуту, при 4"С, в
течение 5 минуr). 3атем к этому добавляли ледяную Т (-) среду и использовали в
виде суспензии в концентрации 1х106 клеток/мл.
В*4) Индукция интернализации пrгем инкубации при
37'С
Суспензию, полученную, как опис€lно в п. В-3, в равных частях разделяли на
две пробирки
(обозначенные пробирками
(а) и (Ь)) Пробирки (а) и
(Ь)
культивировали при 37" и 4'С, соответственно, с затемнением в течение 60 минр.
.Qля прекращения интернализации добавляли 1% ЭБС/ФБР (ледяную) после
инкубации. Полученный раствор центрифугировали (условия центрифугирования:
1200 оборотов в минrту, при 4'С, в течение 5 минут), и затем удаляли супернатант с
последующим двукратным промыванием'l% ЭБС/ФБР (ледяным) (количество
раствора: 10 мл на 1 промывание, условия центрифугирования: 1200 оборотов в
минrry, при 4'С,
в течение 5 минут).
В-5) Модификация иммунного комплекса
lLТ7-анти-lLТ7-антитела,
остающеrося на поверхности клеток-мишеней после инкубации
Иммунный комплекс lLТ7-анти-lLТ7-антитело, который оставался
поверхности клетки после инкубации, модифицировали третичным антителом
на
мя
обнарркения флуоресценции, Конкретный способ описан ниже. 20 мкл суспензии,
содержащей третичные антитела (FlТС-меченое ослиное антикозье антитело против
lgG (Ne в каталоге: sc-2024, производства Santa сrчz biotechnology), добавляли
к
дебрису, полученному, как описано в п, В-4), затем перемешивали и отстаивали при
4"С в течение 15 минр в условиях затемнения. Полученный раствор промывали
(количество раствора: 10 мл на промывание, условия центрифугирования: 1200
оборотах в минrry, при 4"С, в течение 5 минр).
В-6) Анализ анти-lLТ7-антитела, присrгствующего в клетках-мишенях
Впоследствии
к
дебрису, полученному согласно описанию в п. В-5, добавляли
150 мкл 1% ЭБС/ФБР,), который суспендировали и собирали в микротитровальную
о4
BY
20509
пробирку объемом 1,2 мл,
с
с1
201б.10.30
последующим проведением анализа FСМ.
В
этом
анализе отдельно оценивали среднюю интенсивность флуоресценции (MPl) ка>щдой
клетки в случае FlТС и АРС. Дополнительно, вычисляли отношение интенсивность
флуоресценции (%) следующим уравнением:
Коэффициент интенсивности флуоресценци и
флуоресценции клеток, инкубированных при З7"С
(О/о)
= (средняя интенсивность
в течение 60 минр)/(средняя
интенсивность флуоресценции клеток, инкубированных при 4"С в течение 60
минут)х100
ГГаблица 2I
Flтс
Средняя
интенсивность
флуоресценции
Арс
Коэффициент
Средняя
интенсивности
интенсивность
флуоресцен ции флуоресценции
(%)
Темпераryра
Коэффициент
интенсивности
флуоресценции
(%)
Тем пераryра
инкубации ("С)
4
з7
инкубации ("С)
4
37
#17
35,7
15,9
44,5
1з84
1320
95,4
#26
29,в
16,5
55,4
844
816
96,7
#з7
1
0
2в,5
55,9
2194
2155
98,2
#2в
40,6
19,3
47,5
1746
1709
97,9
#33
47,7
22,6
47,4
1845
9в,0
lgG2a
3,7
4,2
116,2
1882
?
3,64
121 ,з
Виды первичных антител
Пример 5
Сравнительный
пример 2
абли ца
Коэффициент интенсивности
флуоресценции (%)
Анти-lLТ7-антитело Ns1 7
Анти-lLТ7-антитело Ns26
Анти-lLТ7-антитело N937
Анти-lLТ7-антитело N92B
днти-lLТ7-антитело Ns33
Мышиный lgG2a
Арс
Flтс
95,4
96,7
98,2
97,9
98,0
121,3
44,5
55,4
55,9
47,5
47,4
116,2
Интенсивность флуоресценции FlТС является индикатором количества
иммунного комплекса lLТ7-анти-lLТ7-антитело, которыЙ остается на поверхности
клетки после инкубации. Средняя интенсивность флуоресценции FlТС меток,
культивированных при 37"С в течение 60 минл, снижалась примерно на 50% по
сравнению с метками, культивированными при 4"С.
65
BY
20509
с1
201б.10.30
С другой стороны, интенсивность флуоресценции АРС представляет собой
индикатор количества иммунного комплекса
lLТ7-анти-lLТ7-антитело,
присrтствующего на клеточной поверхности перед инкубацией. Иммунный комплекс
антитела lLТ7-анти-lLТ7 выявляется независимо от того, прислствует ли он на
поверхности клетки, или включается
в
клетку после инкубации.
В
примере 5
АРС флуоресценции после инкубации при темпераryре 37'С была
эквивалентна интенсивности АРС флуоресценции в случае инкубации при 4'С, Это
указывает на то, что иммунный комплекс lLТ7-анти-lLТ7-антитело может иметь
интенсивность
любую локализацию в клетках-м ичJенях, даже в случае инкубации при произвольной
темпераryре. Как упомянуто выше, было выявлено, что моноклональное анти-lLТ7антитело вызывало интернализацию lLT7 посредством инкубации при 37'С.
Сравнительный пример 2
Аналогичную операцию выполняли тем же образом, как описано в примере 5,
за исключением того, что вместо анти-lLТ7-антитела использовали мышиный lgG2a.
Результаты показаны в примере 5, а таюке в таблице 2, таблице 3 и фиryре 13. В
случае, если использовали мышиный lgG2a, не наблюдались какие-либо изменения
в интенсивности флуоресценции FlТС и АРС, таким образом, было выявлено, что
мышиный lgG2a не вызывал интернализацию lLT7.
Пример 6
Изучение струкryры античеловеческого мышиного моноклонального антитела
lLT7
(Последовательности вариабельных областей)
А. Клонирование ФНК, кодирующей вариабельную область мышиного антиlLТ7-антитела
A-1) Изучение гибридом, которые продуцируют мышиные анти-lLТ7-антитела
Следующие гибридомы использовали в качестве гибридом, продуцирующих
мышиные анти-lLТ7-антитела.
- Гибридома No11 (инвентарный номер: FERM BP-l0704)
- Гибридома No17 (инвентарный номер: FERM ВР-10705)
А-2) Выделение непроцессированных РНК
Непроцессированные РНК выделяли
из гибридом, описанных в п.
А-1),
используя коммерчески досryпный комплект "RNeasy Mini Kit" (Ns в каталоге:74106,
производства Qiagen) согласно инструкции, прилаrаемой
в
комплекте.
В
обоих
случаях, из 1х107 гибридом было получено около 200 мкг непроцессированных РНК,
А-3) Амплификация
и
фрагментация
66
фНК, кодирующей
вариабельную
BY
20509
с1
201б.10.30
область тяжелой цепи мыши
Проводили амплификацию ц[НК, кодирующую вариабельную область
тяжелой цепи мыши посредством способа 5' RACE, используя 5 мкг
непроцессированных РНК, выделенных, как описано в п. А-2. flля амплификации
использовали коммерчески досryпный комплект '5' RACE System fоr Rapid
Amplification of cDNA ENDs, Version 2.0 Kit" (Ns в каталоге: 18374-058, производства
flалее приводится конкретное описание. Вначале синтезировали с
обратной транскриптазой первую цепь ЦНК из непроцессированных РНК,
lnvitrogen).
полученных, как описано в п. А-2). Последовательности оснований антисмысловых
праймеров (GSP1), используемых при этом, показаны в таблице 4.
Используемая
гибридома
наи менован ие
праймера
SEQ
lD No
#11
Mu |gG3VH5RACE-
30
GSP1
5,
ССА TAG ТТС САТ ТТТ АСА GTT
Асс
3,
(24-мерн
Mu lgG3VH5RACE-
31
Mu
32
GSP2
#17
ГIаблица 4I
Последовательность
lgG2aVH5RACEGSP1
зз
Mu
lgG2aVH5RACEGSP2
ый)
5,GGG Асс AAG GGA TAG АсА GA
(20-мерный)
3,
5,ТСС AGA GTT ССА GGT САА GGT
сАс
3,
(24-мерный)
5,Gcc AGT GGA TAG Асс GAT GG
(20-мерный)
3,
3атем непроцессированные РНК расщепляли РНКазой и первая цепь кДНК
оставалась единственной цепью, и очищалась способом низкоплавкой агарозы
('1,5%).
Дополнительно, dC (то есть, нуклеотидный гомополимер) присоединяли к 3'-
концу первой цепи ЦНК, используя концевую дезоксинуклеотидилтрансферазу
(TdT). Амплификацию цЩНК проводили П|-]Р-способом, используя якорные праймеры
(SEQ lD NO:34), обладающие комплементарностью нумеотидного полимера к dC
(якорная последовательность) на 3'-конце, в таблице
4
показаны антисмысловые
праймеры (GSP2). !ополнительно, полученные Пl-]Р продукты использовали в
качестве матрицы. Амплификацию ЦНК проводили способом вложенной ПL{Р
(Nested PCR), используя праймер AUAP (SEQ lD NO:35) и антисмысловые праймеры
(GSP2), показанные в таблице 4. !ополнительно, продукты ПL{Р очищали методикой
низкоплавкой агарозы (1,5%).
Якорный праймер для 5' RACE (SEQ lD NO:3a)
5'-GGC САС GCG TCG АСТ AGT ACG GGl lGG Gll GGG llc-3'(36-мерный)
праймер ADAP для 5' RACE (SEQ lD NO:35)
6,7
BY
20509
с1
201б.10.30
5'-GGC САС GCG TCG АСТ AGT АС-3' (20-мерный)
А-4) Амплификация
и
фрагментация
ЦНК,
кодирующей вариабельную
область легкоЙ цепи мыши
Проводили амплификацию цЩНК, кодирующую вариабельную область легкой
цепи мыши из непроцессированных РНК, выделенных, как описано в п. А-2, тем же
способом, как описано
в п, А-3).
Последовательности оснований праймеров,
используемых при этом, показаны в таблице 5. Полренные продукгы ПL{Р очищали
методикой низкоплавкой агарозы (1,5%).
Праймеры, используемые
ва иабельн ю
Используемая наименование
гибридома
праймера
Mu |gVL5RACEGSP1
[Габлица 5]
для амплификации гена, кодирующего
область легкой цепи мыlли
sEQ
Последовател ьность
lD No
36
5,ТТС АСТ GСС АТС ААТ СТТ ССА
стт
#11,#17
3,
(24-мерный)
Mu IgVL5RACE-
5,GAT GGA тАс AGT TGG TGc АGс
37
GSP2
(21-мерный)
3,
А-5) Подтверщдение последовательности оснований ФНК и определение
области CDR
Проводили клонирование вариабельной области тяжелой цепи, полученной
согласно описанию в п. А-3), и цЩНК фрагмента вариабельной области легкой цепи,
полученной, как описано
в п.
А-4),
в
вектор pCR4 BluntTOPO, используя
коммерчески досryпный комплект "Zero Blunt ТОРО PCR Cloning Kit" (Nя в каталоге:
1З251З7, производства lnvitrogen) согласно инструкции, прилагаемой в комплекте,
в компетентные клетки Escherichia coll, чтобы получить
трансформант Еsсhеriсhiа coli, Из трансформанта получали вышеупомянуryю
плазмиду, после чего подтверщqали последовательность оснований ФНК в
плазмиде, используя автоматический секвенатор lHK "PCR-based ABl PR|SM 3100
Genetic Analyze/' (производства Applied Biosystems). Правильные
который затем вводили
последовательности выделяли пугем исключения транскриптов, полученных из
неакгивной РНК благодаря qдвиry рамки, и бессмысленным муrациям рядом с
областью, определяющей комплементарность (далее называемой "СDR-областью").
3атем проводили сравнение гомологии последовательности оснований
щЩНК,
составляющих плазмиду, с базой данных Kabat, и определяли последовательности
СDR-области и вариабельной области в соответствующих вариабельных областях.
Для
гибридомы Ns37, полученной
последовательности СDR-области
и
68
в
примере
4,
таюке
вариабельной области
в
определяли
вариабельных
BY
20509
с1
201б.10.30
областях аналогичной методикой, как описано в п. от А-'1) до А-5) из примера б с
использованием гибридомы Ns'l7. flалее в следующих SEQ lD NO показаны
последовательности оснований кДНК вариабельных областей тяжелой цепи
и
вариабельных областей легкой цепи анти-lLТ7 моноклональных антител,
продуцируемых ка>6qой гибридомой, и аминокислотные последовательности,
кодируемые указанными последовательностями.
Ns1
Вариабельная область
тяжелой цепи
1
N917
N937
SEQ lD NO:38 (последовательность
оонований)
SEQ lD NO:39 (аминокислотная
последовател ьность)
SЕQ lD NO:42 (последовательность
оснований)
SEQ lD NO:43 (аминокислотная
последовательность)
SEQ lD NO:46 (последовательность
оснований)
SEQ lD NO:47 (аминокислотная
последовательность)
Вариабельная область
легкой цепи
SEQ lD NO:40
(последовательность оснований)
SEQ lD NO:41 (аминокислотная
последовател ьность)
SEQ lD NO:44
(последовательность основа н ий)
SEQ lD NO:45 (аминокислотная
последовательность)
SEO lD NO:48
(последовательность оснований)
SEQ lD NO:49 (аминокислотная
последовательность)
[Подтвержден ие изотипа константной области]
В отношении супернатантной культуры гибридомы, подтверщдали изотип
константной области полученноrо моноклонального антитела, используя
коммерчески досryпный комплект для изотипирования мышиного моноклонального
антитела (No
в
каталоге: ММТ1, производство Serotec Product). Константной
областью тяжелой цепи античеловеческого мышиного антитела lLT7 Nsl 1 являлся
lgy3, и константной областью легкой цепи являлся |gK. ,Щополнительно, каждая из
константных областей тяжелой цепи античеловеческого мыtлиного антитела lLT7
Ns17 и античеловеческого мышиного антитела lLT7 Ns37 представляла собой lgY2a,
и каждой константной областью легкой цепи являлся lgK.
Пример 7
Получение химерных антител
А. Клонирование фНК, кодирующей константную область человеческого lgG
Константная область тяжелой цепи человеческого lgG't и константная область
легкой цепи человеческого lg-каппа были выбраны из библиотеки ЦНК
человеческих ИПК. 3атем осуществляли клонирование выбранных областей в
векгор pCR4 BlunbTOPO, используя коммерчески досryпный комплект "Zero Blunt
ТОРО PCR Сlопiпg Kit" (Ns в каталоге: 1З25137, производства lпчitrоgеп) согласно
инструкции, прилагаемой
в комплекте, который затем вводили в
69
компетентные
BY
20509
с1
201б.10.30
клетки Escherichia coli, чтобы получить трансформант Escherichia coli, Из
трансформанта получали вышеупомянутую плазмиду, после чего подтверщqали
последовательность оснований фНК в плазмиде использованием автоматического
секвенатора
!НК "PCR-based ABl PR|SM 3100 Genetic Analyzei'
(производства
Applied Biosystems).
В. Лигирование вариабельной области с константной областью
и
клонирование
Использовали полученную согласно описанию
в п. А)
цЩНК, кодирующую
константную область тяжелой цепи, и цЩНК, кодирующую вариабельную область
тяжелой цепи, полученную, как описано в п. А-5) из примера 6, соответственно. В
обеих ДНК присуrствовала область с наложением последовательностей оснований
ДНК. 3атем получали двунитевую .ЩНК способом распространения наложения
последовательностей, используя область. Конкретно методика изложена
н
иже.
С-1) Приготовление цЩНК, кодирующей тяжелую цепь химерного антитела
lLT7
"Плазмиду с
йНК, кодирующей вариабельные области тяжелой цепи
Ns1
1и
Nol7", которая была получена согласно описанию в п. А-5), расщепляли ферментами
рестрикции Notl и Xbal, и затем очищали способом агарозного геля (1, 5%). Кая<дый
из получаемых продуктов растворяли в буфере ТЕ с нижеуказанной композицией, до
концентрации 100 пмоль/мкл, чтобы приготовить раствор
фрагмент вариабельной области тяжелой цепи.
фНК,
кодирующей
Буфер ТЕ:
10 мм Трис-НСl
1 мМ
ЭflТА
Уровень рН от 7,5 до 8,0
!ополнительно, "плазмиду с ФНК, кодирующей константную область тяжелой
цепи", полученную согласно описанию в п. В, обрабатывали тем же способом, как
описано выше, для приготовления раствора 100 пмоль/мкл. 3атем оба раствора
смешивали, и после этого обе области наложения подвергали гибридизации
их вначале при 70"С в течение 'l0 минр, и затем
отстаиванием при 37'С в течение 5 минр. После этого ФНК амплифицировали
посредством отстаивания
способом Пl-]Р, полученную фНК расщепляли ферментами рестрикции Notl и Xbal
очищали способом агарозного низкоплавкого геля (1,5%).
и
С-2) Приготовление цЩНК, кодирующей легкую цепь химерного антитела lLT7
Использовали, соответственно, ЦНК, кодирующую константную область
10
вY
20509
с1
201б.10.30
легкоЙ цепи, полученную согласно описанию в п. А), и ЦНК кодирующую
вариабельную область легкой цепи, полученную, как описано в п. А-5) из примера 6.
Способом, аналогичным описанному в п. С-1), получали ЦНК, кодирующую легкую
цепь химерного антитела lLT7, используя эти цЩНК.
С-3) Клонирование
Полученную, как описано в п. С-1), фНК, клонировали в плазмидный вектор
рсDNА3,1-зеоцин (производства lnvitrogen) используя Notl
и ХЬаl
как сайты
клонирования, чтобы получить вектор экспрессии тяжелой цепи химерного антитела
lLT7. ,Щополнительно, щЩНК, полученную, как описано
в
п.С-2), клонировали в
плазмидный векгор pcDNA3.1 -гигромицин (производства lпчitrоgеп), используя Notl
и
ХЬа| в качестве сайтов клонирования, для получения вектора экспрессии леrкой
цепи химерного антитела lLT7. Наименование ках{дого вектора показано в таблице
6.
[Таблица
#11
Наименование плазмидных векто ов
Тяжелая цепь химерного lLT7Легкая цепь химерного lLT7антитела мя экспрессии
антитела мя экспрессии
pcDNA-#1 1VН
pcDNA#1 1VL
pcDNA-#,17VH
#17
6]
pcDNA#l7VL
D. Экспрессия химерного антитела lLT7
D-1 )
Транзиторная трансформация
Вектор экспрессии тяжелой цепи химерного антитела lLT7 в количестве 1 мкг
и 1 мкг вектора экспрессии легкой цепи химерного антитела lLT7, которые были
получены согласно описанию в п. С-3), были ко-трансфицированы в клетки 293Т,
используя комплект трансфекции Effectene (Ne в каталоге: 301427, производства
Qiagen). После этого полученные продукгы культивировали при З7"С с
использованием кульryральноЙ среды DMEM с 2% ФБР с низким содержанием lgG,
со следующей композицией.
Культуральная среда DMEM с 2% ФБР с низким содержанием lgG:
Культуральная среда DMEM (No в каталоге: D5796, производства Sigma)
2% ФБР с низким содержанием lgG (N0 в каталоге: SH30151 .0З, производства
HyClone)
2 мМ L-глрамина
100 ед/мл пенициллина
'1
00 мкг/мл стрептомицина
Уровень рН 7,2 до рН 7,4
После введения векторов полученную среду культивировали в течение 96
]1
часов,
и
вY
20509
с1
201б.10.30
собирали супернатантную кульryру. 3атем удаляли фрагменты меток
прем центрифугирования для получения неочищенного раствора антитела.
D-2) Гомеостатическая трансформация
Векгор экспрессии тяжелой цепи химерного антитела lLT7 в количестве 'l мкг
и 1 мкг вектора экспрессии леrкой цепи химерного антитела lLT7, которые были
получены согласно описанию в п, С-3), были ко-трансфицированы в клетки YB2l0
(клетки, полученные из миеломы крысы, дТССNоСRL-1622) используя комплект для
трансфекции Effectene (N9
в
каталоrе: З01427, производства Qiagen). Среди
используемых плазмидных векторов вектор экспрессии тяжелой цепи является
маркером устойчивости к зеоцину, и вектор экспрессии легкой цепи является
маркером устойчивости к гигромицину. Поэтому, клетки, в которые были введены
оба векгора, можно выращивать в кульryральной среде, к которой добавлены
одновременно зеоцин
и
гигромицин. Таким образом, клетки культивировали в
кульryральной среде RPMI,
к которой были добавлены зеоцин и
гигромицин,
и
производили отбор устойчивых штаммов.
Культуральная среда RPM| с добавлением зеоцина и гигромицина:
Культуральная среда RPM|1640 (N9 в каталоге: R8758, производства Sigma)
10% ФБр
0,01 м HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота)
1
мМ пирувата натрия
2 мМ L-глрамина
100 едlмл пенициллина
1
00 мкл/мл стрептомицина
55 мкМ 2-меркаптоэта нола
0,5 мг/мл зеоцина
0,5 мг/мл гигромицина
Уровень рН от 7,2 до рН 7,4
Через три дня определяли количество полученного антитела в
супернатантной кульryре способом ELlSA. Была выбрана клеточная линия,
продуцирующая химерное антитело lLT7, с высоким уровнем экспрессии и
достаточным увеличением количества клеток. Кроме того, осуществляли
единственное клонирование выбранных клеточных линий методикой клеточного
сортера, чтобы полрить сJlедующие клеточные линии:
клеточная линия Nsl 1, продуцирующая химерное антитело |LTT7:
клеточных линий и
N91 1
- '16 клеточных линий
72
Ns1
1-
5
BY
20509
с1
201б.10.30
клеточная линия N917, продуцирующая химерное антитело lLT7: Nsl7
-
24
-
16
клеточных линий
Вышеупомянугые клеточные линии
(N9'1
1 - 5 клеточных линий,
N911
клеточных линий и N917 - 24 клеточных линий) соответственно, культивировали в
среде RPMl с добавлением
50/о
ФБР, со следующей композицией. Устанавливали
темпераryру инкубации и время инкубации, соответственно, 37"С и 96 часов,.
Культуральная среда RPM| сдобавлением 57о ФБР:
Кульryральная среда RPMl'l640 (N9 в каталоге: R875BS, производства Sigma)
5% ФБр
0,01 моль HEPES
1
мМ пирувата натрия
2 мМ L-глутамина
't00 ед/мл пенициллина
'l
00 мкг/мл стрептомицина
1
00 мкл/мл стрептомицина
55 мкМ 2-меркаптоэтанола
Уровень рН от 7,2 до рН 7,4
Супернатантную кульryру собирали
и затем
центрифугированием удаляли
клеточные фраrменты, чтобы получить неочищенный раствор антитела.
Е. очистка антител
растворов антитела, полученных как описано в п. D-1
и D-2, очищали на колонке, использую афинность белков (Рrоtеiп А Sepharose FF, No
Ка>qцый из неочищенных
в каталоге 17-1279-01, производства Amershram Рhаrmасiа). Условия очистки были
следующими. Аффинную очистку проводили
с использованием буфера ФБР
(-), с
указанной ниже композицией, в качестве адсорбционного буфера и 0,1 моля буфера
цитрата натрия (уровень рН 3) в качестве буфера элюции, согласно прилагаемой
инструкции. К элюированным фракциям добавляли 1 моль Трис-НСl (уровень рН В,0)
для реryлирования уровня рН примерно до 7,2. Показатели измеренной оптической
плотности OD составляли от 450 до 620 нм и затем выбирали лунки, показывающие
положительную реакцию. В отношении концентрации очищенных антител
определяли спектральную поглощательную способность в 280 нм и вычисляли на
основе'1,38 ОD/мг/мл. Отношения между полученными химерными антителами lLT7,
гибридомами, из которых был получен ген вариабельной области
хозяева, суммарно отражены в таблице 7.
ФБР
(-)
буфер:
7з
и
клетками-
BY
с1
20509
2016.10.30
0,2 гiл монокалия дигидрофосфат
0,2 г/л хлорида калия
8 г/л хлорида натрия
1, 15 гlл безводный моногидрофосфат динатрия
Пол ченные химе ные антитела
Виды
Наименование полученных
Используемые
гибридомы
трансформации
химерных антител
No1 '1 химерное антитело lLT7
#11
Транзиторный
способ
No17 химерное антитело lLT7
#17
гомеостаз
Ns1'l - 5 химерное антитело lLT7
#11
N91 1 - 16 химерное антитело lLT7
#11
N917 -24 химерное антитело lLT7
#17
[аблица
7]
Клетки
введен ия
293т
Yв
2/0
Ниже показаны последовательности оснований кЦНК и аминокислотные
последовательности тяжелых и легких цепей полученных химерных антител,
соответственно. В
аминокислот
от
ка>цдой
аминокислотной последовательности последовательность
N-конца
до -1 является сигнальной
последовательностью,
и
последовательность аминокислот от 1 до С-конца является зрелым белком. Таким
образом, тяжелые и легкие цепей, составляющие указанные химерные антитела,
состоят из последовательности аминокислот от 1до С-конца указанных ниже
аминокислотных последовательностей.
Тяжелая
цепь
Легкая цепь
N911 SEQ lD
SEQ lD No:52 (последовательность
(последовательностьоснований) оснований)
SEQ lD NO:51 (аминокислотная SEQ lD NO:53 (аминокислотная
последовательность)
последовательность)
SEQ lD NO:56 (последовательность
Ns'17 SEQ lD NO:54
(последовательностьоснований) оснований)
SEQ lD NO:55 (аминокислотная SEQ lD NO:57 (аминокислотная
последовательность)
последовательность)
No:50
промышленная применимость
Настоящее изобретение обеспечивает иммуноген, полезный
для
производства антитела, специфически распознающего человеческий lLT7 и способ
использованием иммуногена. Антитело,
получения анти-lLТ7-антитело
с
специфически распознающее человеческий lLT7 согласно изобретению,
специфически распознает lLT7 в прислствии семейства lLT. Поэтому антитело
согласно изобретению можно использовать для обнаружения и выделения
человеческого lLT7. Например, используя антитело согласно изобретению, таюке
можно анализировать локализацию lLT7. Предполагается, что lLT7 представляет
собой молекулу, близко связанную с дифференцировкой и функцией ИПК или
74
BY
20509
с1
201б.10.30
дендритных клеток. Поэтому антитело, которое распознает lLT7 с высокой
специфичностью, является полезным для анализа функции ИПК или дендритных
клеток. Известны раковые клетки, подобные ИПК (имеющие свойства, при которых
экспрессируется BDCA-2) (Chaper L et al. Ечr, J. lmmчпоl, 34;418-426,2004, Maeda Т
et al., lnt. J. Hemato|.81; 148-154,2005). Подтверх(qение экспрессии lLT7 в этих
клетках может позволить диагностировать рак и использовать их в качестве
терапевтического агента,
В случае ауrоиммунных заболеваний, указано, например, на глубокую связь
между ИФНо, который продуцируют ИПК, и развитием кожноrо заболевания
псориаза (Nestle FО et al., J. Ехр. Med. 2О2, 1З5-143,2005). Таким образом, тяжесть
псориаза можно оценивать идентификацией ИПК в ткани кожи больных псориазом,
то есть в образцах биопсии, используя анти-lLТ7-антитело.
Известно, что развитие СПИ,Qа у ВИЧ-инфицированных больных коррелирует
с количеством ИПК. В частности, у больных, не проявляющих
симптоматики,
выявляют большое количество ИПК, и в начале заболевания наблюдается снижение
количества ИПК (Soumells V. et al., Blood 98; 906-9'12,2001). Таким образом, это
эффекгивно для прогноза вирусной инфекции, такой как ВИЧ.
Например, lLT7 представляет собой молекулу, которая специфически
экспрессируется
в
человеческой ИПК. Поэтому, анти-lLТ7-антитело соrласно
изобретению можно использовать для обнаружения, идентификации или выделения
ИПК. ИПК представляют собой клетки, которые производят большую часть
интерферона 1 типа. Поэтому их обнаружение, идентификация или выделение
являются важной задачей для диагностики и изучения заболеваний, в которые
вовлечен интерферон 1 типа. Примерами таких заболеваний, при которых
интерферон вовлекается в формирование патологическоrо состояния, могут быть
различные ауrоиммунные заболевания и инфекции.
flополнительно, анти-lLТ7-антитело согласно изобретению обладает
ингибирующим действием на активность ИПК. Таким образом, можно ингибировать
прем использования анти-lLТ7-антител согласно изобретению.
Кроме того, прем ингибирования активности ИПК можно лечить заболевания, в
которые вовлечен интерферон '1 типа. В частности, анти-lLТ7-антитело согласно
активность ИПК
мя
различных ауrоиммунных заболеваний и инфекций, при
которых интерферон вовлечен в формирование патологического состояния. В
изобретению полезно
частности, анти-lLТ7-антитело способно эффекгивно уничтожать ИПК, так как
обладает высокой специфичностью.
Национztltьный ценlр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
30 850 Кб
Теги
by20509, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа