close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

способ электрофоретического определения состава многокомпонентных растворов и устройство для его осуществления

код для вставки
РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
(19)
RU
(11)
2 300 099
(13)
C1
(51) МПК
G01N 27/26 (2006.01)
B01D 57/00 (2006.01)
G01N 33/00 (2006.01)
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
(21), (22) За вка: 2006106665/04, 26.02.2006
(24) Дата начала отсчета срока действи патента:
26.02.2006
(45) Опубликовано: 27.05.2007 Бюл. № 15
(73) Патентообладатель(и):
Общество с ограниченной ответственностью
"ВИНТЕЛ" (RU)
2 3 0 0 0 9 9
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: Система капилл рного электрофореза.
Основы метода. Аппаратура. Примеры
использовани система капилл рного
электрофореза "Капель-103, - 104, - 105".
Спб, изд-во "Петрополис", 2001. SU 1597628
А1, 07.10.1990. SU 1087864 A1, 23.04.1984. SU
500502 A1, 17.05.1976. SU 1827636 A1,
15.07.1993. SU 1567957 A1, 30.05.1990. SU
2484804 A1, 11.12.2003.
2 3 0 0 0 9 9
R U
(54) СПОСОБ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТАВА МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ
РАСТВОРОВ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
измеренных времен выхода компонентов пробы.
Устройство включает емкости дл электролита и
проб, капилл р, средства установки капилл ра,
выполненные с возможностью помещени концов
капилл ра в указанные емкости дл электролита и
пробы, средства создани потока электролита
через капилл р, пневматически св занные со
средствами установки капилл ра, средства
создани напр жени между концами капилл ра,
детектор, св занный с капилл ром, систему
управлени и обработки сигналов, а также
средства измерени потенциала течени , которые
выполнены таким образом, что имеют возможность
при промывке капилл ра электролитом замыкать
измерительную электрическую цепь, включающую
электролит в емкост х и в капилл ре, а также
размыкать
ее
при
электрофоретическом
разделении.
Существенно
увеличиваетс воспроизводимость
и
повышаетс производительность при электрофоретическом
определении
состава
многокомпонентных
растворов. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 6 ил.
Страница: 1
RU
C 1
C 1
Адрес дл переписки:
190005, Санкт-Петербург, Московский пр-т, 19,
ЛЮМЭКС, А.А. Строганову (дл И.С. Бочаровой)
(57) Реферат:
Группа изобретений относитс к аналитической
химии, в частности к методу капилл рного
электрофореза, и может быть использована при
электрофоретическом
определении
состава
многокомпонентных
растворов.
Способ
электрофоретического
разделени многокомпонентных растворов включает промывку
капилл ра раствором электролита, введение
пробы
в
капилл р,
электрофоретическое
разделение компонентов пробы в капилл ре под
воздействием напр жени , приложенного между
концами капилл ра, детектирование и измерение
времен выхода разделенных компонентов пробы,
причем в процессе промывки капилл ра раствором
электролита определ ют величину потенциала
течени путем измерени разности потенциалов
между концами капилл ра при определенной
разности давлений между указанными концами
капилл ра, а идентификацию компонентов пробы
производ т в соответствии с измеренной
величиной потенциала течени и величинами
R U
(72) Автор(ы):
Зинченко Михаил Иванович (RU),
Каменцев Ярослав Сергеевич (RU),
Каменцев Михаил Ярославович (RU),
Сл днев Максим Николаевич (RU),
Строганов Александр Анатольевич (RU)
C 1
C 1
2 3 0 0 0 9 9
2 3 0 0 0 9 9
R U
R U
Страница: 2
RUSSIAN FEDERATION
(19)
RU
(11)
2 300 099
(13)
C1
(51) Int. Cl.
G01N 27/26 (2006.01)
B01D 57/00 (2006.01)
G01N 33/00 (2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY,
PATENTS AND TRADEMARKS
(12)
ABSTRACT OF INVENTION
(21), (22) Application: 2006106665/04, 26.02.2006
(24) Effective date for property rights: 26.02.2006
(45) Date of publication: 27.05.2007 Bull. 15
(73) Proprietor(s):
Obshchestvo s ogranichennoj otvetstvennost'ju
"VINTEL" (RU)
2 3 0 0 0 9 9
R U
capillary, aids for generating voltage between
ends
of
capillary,
detector
connected
with
capillary, signal control and processing system
and aids for measuring flow potential. The aids
and units mentioned above are made in such a way
that they are able of closing the measuring
electric circuit, which consists of electrolyte
in containers and in capillary, as well as open
it
during
electrophoresis
separation
when
capillary is washed through by electrolyte.
EFFECT:
improved
reproducibility;
higher
productivity.
10 cl, 6 dwg
Страница: 3
EN
C 1
C 1
COMPONENT SOLUTIONS
(57) Abstract:
FIELD:
analytical
chemistry;
capillary
electrophoresis.
SUBSTANCE:
method
of
electrophoresis
separation of multiple component solutions is
based upon washing capillary by electrolyte
solution
through,
introducing
sample
into
capillary,
electrophoresis
separating
of
components of sample in capillary under influence
of voltage applied between ends of capillary,
detecting and measuring times of output of
separated components of sample. During process of
washing
capillary
through
by
electrolyte
solution,
value
of
potential
of
flow
is
determined by measurement of potential difference
between ends of capillary. Components of sample
are identified according to measured value of
flow potential and values of times of exit of
sample components. Device has containers for
electrolyte and for samples, capillary, aids for
mounting capillary made for placement of ends of
capillary
into
mentioned
containers
for
electrolyte and samples, aids for generating flow
of electrolyte through capillary, which aids are
pneumatically connected with aids for mounting
2 3 0 0 0 9 9
(54) METHOD AND DEVICE FOR ELECTROPHORESIS DETERMINATION OF MULTIPLE
R U
Mail address:
190005, Sankt-Peterburg, Moskovskij pr-t, 19,
LJuMEhKS, A.A. Stroganovu (dlja I.S. Bocharovoj)
(72) Inventor(s):
Zinchenko Mikhail Ivanovich (RU),
Kamentsev Jaroslav Sergeevich (RU),
Kamentsev Mikhail Jaroslavovich (RU),
Sljadnev Maksim Nikolaevich (RU),
Stroganov Aleksandr Anatol'evich (RU)
RU 2 300 099 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Изобретение относитс к аналитической химии, в частности к методу капилл рного
электрофореза, и может быть использовано дл выполнени анализов многокомпонентных
растворов.
Известны варианты реализации способа электрофоретического определени состава
многокомпонентных растворов (1, 2, 3), которые основаны на разделении компонентов
сложных смесей в кварцевом капилл ре под действием приложенного электрического пол высокого напр жени . В упом нутых вариантах способа пробу анализируемого раствора
ввод т в капилл р, предварительно промытый и заполненный раствором электролита,
называемым также буферным раствором или буфером. После подачи к концам капилл ра
высокого напр жени компоненты смеси начинают двигатьс в капилл ре с разной
скоростью. При достижении движущимс компонентом пробы зоны детектировани ,
отсто щей от входного отверсти капилл ра на заданное рассто ние, производ т
детектирование этого компонента, то есть измер ют амплитуду сигнала детектора,
завис щую от количества компонента в пробе, а также измер ют врем выхода этого
компонента пробы, равное интервалу времени между началом электрофоретического
разделени и моментом детектировани этого компонента. При использовании
фотометрического, флуориметрического или иного оптического детектора зона
детектировани , как правило, находитс в капилл ре. При использовании массспектрофотометрического детектора зона детектировани находитс на выходе из
капилл ра. Временную развертку сигнала детектора при прохождении одиночного
компонента называют электрофоретическим пиком. Зарегистрированна временна развертка сигнала детектора называетс электрофореграммой и служит дл качественной
идентификации пиков и количественного определени веществ, соответствующих разным
пикам. Дл идентификации разных компонентов пробы используют сопоставление их
времен выхода со временем выхода компонентов калибровочного (градуировочного)
раствора, а сравнение амплитуд сигналов детектора, полученных при
электрофоретических разделени х калибровочных (градуировочных) растворов и проб,
используют дл определени количества идентифицированных компонентов в пробе.
Известен патент US (5), в котором описаны способ и устройство дл измерени и
контрол электроосмотического потока в реальном времени.
При электрофоретическом разделении растворов скорость перемещени зар женной
частицы в капилл ре складываетс алгебраически из скорости электромиграции частицы,
котора зависит только от свойств самой частицы (ее зар да, массы и конформации), и
скорости перемещени электроосмотического потока (ЭОП), котора зависит от свойств
капилл ра. Скорость ЭОП при заданном составе и концентрации буферного электролита
определ етс уравнением
где Аeof - скорость ЭОП, ? - электрокинетический потенциал поверхности, ? диэлектрическа посто нна раствора, Е - напр женность электрического пол , ? в зкость раствора буферного электролита. Уравнение показывает, что скорость ЭОП, при
прочих равных услови х, пропорциональна величине электрокинетического
потенциала (? -потенциала) поверхности, определ емого составом и структурой двойного
электрического сло , образующегос между внутренней поверхностью капилл ра и
электролитом. Равновесное значение ?-потенциала дл чистой поверхности капилл ра при
данных услови х вл етс величиной максимальной, при этом скорость ЭОП наибольша ,
а врем выхода компонента наименьшее. Если не примен ть процедуру отмывки
капилл ра после анализа, то при последовательных вводах пробы врем выхода
компонента увеличиваетс . Это свидетельствует об уменьшении величины ? -потенциала
вследствие загр знени внутренней поверхности капилл ра адсорбировавшимис примес ми, изменившими состав двойного электрического сло . При значительном
изменении времен выхода компонентов вследствие загр знени капилл ра возникают
Страница: 4
DE
RU 2 300 099 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
ошибки идентификации компонентов многокомпонентной смеси.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению вл етс способ (4), который включает
в себ выполнение калибровочных и аналитических измерений, состо щих из промывки
капилл ра раствором электролита, введени в заполненный электролитом капилл р
раствора калибровочной смеси при калибровочных измерени х и введени раствора пробы
при аналитических измерени х, электрофоретического разделени компонентов введенных
растворов в капилл ре под воздействием приложенного между концами капилл ра
напр жени , детектировани и измерени времен выхода компонентов введенных
растворов, а также идентификацию компонентов пробы по временам выхода.
Промывка капилл ра после выполнени анализа обеспечивает удаление из капилл ра
компонентов пробы, которые мигрировали навстречу электроосмотическому потоку, а также
обеспечивает очистку стенки капилл ра от адсорбировавшихс примесей. Дл наиболее
эффективной очистки капилл ра, в зависимости от особенностей его эксплуатации,
подбирают различные промывные составы. В частности, новый или длительное врем неиспользуемый капилл р промывают последовательно раствором кислоты, водой,
раствором щелочи, снова водой и кондиционируют промыванием раствором электролита.
Необходима степень очистки стенки капилл ра от адсорбировавшихс примесей
достигаетс эмпирическим подбором состава промывных растворов и времени промывки
каждым из них. Эффективность промывки вы сн етс после проведени очередного
анализа по воспроизводимости времен выхода определ емых компонентов.
Дл реализации вышеуказанного способа описано устройство (4), включающее
капилл р, емкости дл электролита и проб, средства установки капилл ра и емкостей,
выполненные с возможностью помещени концов капилл ра в указанные емкости,
средства создани потока электролита через капилл р, средства создани напр жени между концами капилл ра, св занный с капилл ром детектор, а также систему управлени и обработки сигналов.
Существенными недостатками упом нутого способа и устройств на его основе вл етс то, что эффективность промывки вы сн етс только после проведени очередного
анализа, а также тот факт, что правильность эмпирического подбора условий промывки
капилл ра зависит от квалификации оператора, то есть не объективизирована.
Результатом при недостаточной или неопределенной степени очистки стенок капилл ра
вл етс недостаточна воспроизводимость времен выхода определ емых компонентов,
котора вы сн етс лишь после выполнени анализа. Причиной невоспроизводимости
вл етс неконтролируемый разброс от одного анализа к другому скорости
электроосмотического потока (ЭОП) Аeof, котора может измен тьс вследствие сорбции
из раствора пробы на поверхность капилл ра примесей, нарушающих строение двойного
электрического сло . Это затрудн ет идентификацию компонентов пробы и увеличивает
ошибку при количественной оценке концентраций компонентов, а в некоторых случа х
требует повторного анализа пробы.
Дл компенсации неконтролируемых изменений скорости электроосмотического потока в
прототипе (4) используют метки электроосмотического потока (далее - метки ЭОП), т.е.
специально вводимые в пробу компоненты с нулевой или низкой электроподвижностью
(скоростью электромиграции) в данном буфере, по времени выхода которых можно оценить
скорость электроосмотического потока и скорректировать времена выхода анализируемых
компонентов, то есть ввести расчетные поправки. Применение указанных меток ЭОП
значительно увеличивает затраты на проведение анализов. Кроме того, такой метод не
универсален, т.к. дл разных типов буферного раствора требуетс выбирать разные метки
ЭОП. Недостатком способа с использованием меток ЭОП вл етс также то, что он не
применим при отрицательных скорост х электроосмотического потока, т.к. метки ЭОП в
этом случае вообще не достигают зоны детектировани .
Задачей данного изобретени вл етс повышение воспроизводимости
электрофоретического определени состава многокомпонентных растворов, а также
повышение производительности анализов при электрофоретическом разделении большого
Страница: 5
RU 2 300 099 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
количества проб.
Дл решени поставленной задачи предлагаетс способ электрофоретического
определени состава многокомпонентных растворов, включающий выполнение
калибровочных и аналитических измерений, состо щих из промывки капилл ра раствором
электролита, введени в заполненный электролитом капилл р раствора калибровочной
смеси при калибровочных измерени х и введени раствора пробы при аналитических
измерени х, электрофоретического разделени компонентов введенных растворов в
капилл ре под воздействием приложенного между концами капилл ра напр жени детектировани и измерени времен выхода компонентов введенных растворов,
идентификацию компонентов пробы по временам выхода, причем при промывке капилл ра
раствором электролита определ ют величину потенциала течени путем измерени разности потенциалов между концами капилл ра при определенной разности давлений
между указанными концами капилл ра.
Дл реализации указанного способа электрофоретического определени состава
многокомпонентных растворов предлагаетс устройство, включающее капилл р, емкости
дл электролита и проб, средства установки капилл ра и емкостей выполненные с
возможностью помещени концов капилл ра в указанные емкости, средства создани потока электролита через капилл р, средства создани напр жени между концами
капилл ра, св занный с капилл ром детектор, а также систему управлени и обработки
сигналов, причем в устройство введены средства измерени потенциала течени ,
выполненные с возможностью измерени разности потенциалов между концами капилл ра
при определенной разности давлений между указанными концами капилл ра, и с
возможностью обеспечени электрической св зи с концами капилл ра при промывке таким
образом, что указанные средства измерени потенциала течени и электролит,
наход щийс в емкост х и в капилл ре, образуют замкнутую измерительную электрическую
цепь.
Сущность за вленного изобретени заключаетс в измерении потенциала течени при
промывке капилл ра раствором электролита во врем подготовки капилл ра к анализу.
Предлагаемое решение базируетс на существовании однозначного соответстви между
величиной потенциала течени и величиной скорости электроосмотического потока Аeof.
Действительно, потенциал течени Us, измер емый при промывке капилл ра раствором
электролита путем измерени разности потенциалов между концами капилл ра при
определенной разности давлений Р между указанными концами капилл ра, так же, как и
скорость электроосмотического потока Аeof, пропорционален электрокинетическому
потенциалу (? -потенциалу) поверхности
Сущность за вленного изобретени по сн етс чертежами, где
на фиг.1 приведен график изменени во времени разности потенциалов между концами
капилл ра при серии последовательных промывок сильно загр зненного капилл ра;
на фиг.2 приведен график зависимости времени выхода метки ЭОП от величины
потенциала течени Us;
на фиг.3 приведена блок-схема за вл емого устройства с использованием
высоковольтного реле дл размыкани измерительной цепи;
на фиг.4 приведена блок-схема устройства с использованием измерительных
электродов и средства перемещени емкостей дл размыкани измерительной цепи;
на фиг.5 приведен график изменени во времени разности потенциалов между концами
капилл ра в начальный период режима промывки при отсутствующем, нарастающем и
стабилизированном давлении между концами капилл ра;
на фиг.6 приведен график изменени во времени разности потенциалов между концами
капилл ра при серии последовательных промывок чистого капилл ра.
Дл подготовки к электрофоретическому разделению капилл р промывают
промывочными растворами, выбранными в соответствии с типом адсорбировавшихс Страница: 6
RU 2 300 099 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
ранее веществ, а также с типом использовавшегос при предшествующих анализах
буферного электролита. Последней об зательной стадией промывки вл етс кондиционирование капилл ра, то есть промывание его раствором того же буферного
электролита, который будет использован при последующем анализе. На завершающей
стадии промывки при кондиционировании капилл ра производ т определение величины
потенциала течени Us.
Дл чистого капилл ра значение Us, полученного перед проведением измерени калибровочного раствора обозначим Ueq.
Промывку капилл ра перед аналитическими измерени ми производ т до тех пор,
пока Us не достигнет заданного порогового значени Us0.
В процессе промывки величина потенциала течени стремитс к предельному значению,
отвечающему равновесному значению ? -потенциала. На фиг.1 изображено типичное
изменение потенциала течени при последовательных промывках сильно загр зненного
капилл ра. Видно, что при последовательных промывках потенциал течени последовательно нарастает, стрем сь к равновесному значению.
Изобретение предусматривает, по меньшей мере, две возможности реализации задачи
повышени воспроизводимости электрофоретического определени состава
многокомпонентных растворов путем определени потенциала течени .
В первом случае за счет выполнени промывки капилл ра раствором электролита до
достижени предельного значени потенциала течени , равного величине, полученной
перед выполнением электрофоретического разделени калибровочного (градуировочного)
раствора, снижают разброс скоростей электроосмотического потока и, следовательно,
времен выхода компонентов пробы до пренебрежимо малого уровн .
Во втором случае промывку провод т до достижени значени потенциала течени несколько меньшего предельного, а дл идентификации компонентов используют поправки,
определ емые из соотношени предельной величины потенциала течени и реально
достигнутой при промывке.
В обоих случа х используют вышеописанную однозначную св зь между скоростью
электроосмотического потока и величиной потенциала течени . На фиг.2 показано
изменение скорости электроосмотического потока, характеризуемой временем выхода
метки ЭОП при различных значени х потенциала течени Us. Данные получены в
эксперименте, в котором загр знение капилл ра моделировали путем введени в капилл р
небольших количеств катионов цетилтриметиламмони , которые, сорбиру сь на
поверхности капилл ра, частично нарушали строение двойного электрического сло , и
уменьшали величину потенциала течени . Видно, что эксперимент подтверждает наличие
однозначного соответстви между величиной потенциала течени и величиной скорости
электроосмотического потока. Таким образом, предлагаемое в насто щем изобретении
определение величины потенциала течени при промывке капилл ра позвол ет
определить, какова будет скорость электроосмотического потока при последующем
электрофоретическом разделении компонентов пробы, и повысить тем самым
воспроизводимость электрофоретического определени состава многокомпонентных
растворов.
Предложенный способ в обоих случа х применим дл любого типа буферного
электролита. Ниже оба варианта рассмотрены подробнее.
В первом случае, предпочтительном дл обеспечени максимальной воспроизводимости
определени состава многокомпонентных растворов, дл идентификации компонентов
пробы используют заданные значени времен выхода известных компонентов, а при
промывках добиваютс одинаковой чистоты капилл ра как перед разделением растворов
калибровочных смесей, так и перед разделением проб, компоненты которых подлежат
идентификации и количественному определению. В качестве критери достижени одинаковой чистоты капилл ра используют величину допустимого отклонени потенциала
течени dUs от равновесного значени Ueq, характеризующего чистый капилл р. В этом
случае выбирают такое пороговое значение Us0, которое меньше равновесного значени Страница: 7
RU 2 300 099 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
потенциала течени Ueq на указанную величину допустимого отклонени dUs,
т.е. Us0=Ueq-dUs.
В качестве заданных времен выхода известных компонентов могут использоватьс литературные или иные априорные данные. В предпочтительном варианте изобретени указанные заданные значени времен выхода известных компонентов определ ют
экспериментально при электрофоретическом разделении калибровочной смеси этих
известных компонентов, причем перед указанным разделением калибровочной смеси
провод т промывку с измерением потенциала течени до достижени пороговой величины
потенциала течени Us0.
В первом случае реализации изобретени дл обеспечени высокой чистоты капилл ра
и повышени воспроизводимости в качестве допустимого отклонени потенциала течени dUs от равновесного значени Ueq выбирают величину пор дка величины погрешности
измерени потенциала течени .
Однако при выполнении электрофоретического разделени растворов с небольшим
количеством компонентов, времена выхода которых значительно различаютс , в первом
случае реализации изобретени , как правило, увеличивают величину допустимого
отклонени dUs с целью сокращени затрат времени на промывку. Дл этого определ ют
допустимый разброс времен выхода компонентов пробы, в пределах которого не возникает
ошибок идентификации компонентов при использовании заданных значений времен
выхода известных компонентов, например, измеренных при разделении раствора
калибровочной смеси известных компонентов. Исход из допустимого разброса времен
выхода определ ют допустимый разброс скоростей электроосмотического потока.
Использу зависимость времени выхода метки электроосмотического потока от потенциала
течени (фиг.2), определ ют допустимое отклонение потенциала течени dUs от
равновесного значени , характеризующего чистый капилл р.
На фиг.1 порогова величина потенциала течени , выбранна в соответствии с первым
случаем, соответствует первой пороговой величине Us0-1, котора достигаетс только при
п той промывке. При последующих промывках изменение потенциала течени несущественно, поэтому последующие промывки исключают. Таким образом, первый
случай реализации изобретени обеспечивает существенное повышение
воспроизводимости электрофоретического разделени за счет того, что разброс скоростей
электроосмотического потока не превышает допустимой величины.
Во втором случае реализации изобретени , предпочтительном по производительности
при выполнении большого числа анализов однотипных проб, при идентификации
компонентов пробы производ т сопоставление измеренных времен выхода компонентов и
заданных времен выхода известных компонентов с использованием поправок,
определ емых из соотношени измеренной предельной величины потенциала течени Us
с заданной величиной потенциала течени Us-set.
Указанные поправки определ ют, использу зависимость скорости
электроосмотического потока от потенциала течени . Указанную зависимость определ ют
либо расчетным методом, например, с использованием формул (1) и (2), либо определ ют
экспериментально, например, с использованием меток ЭОП при разных значени х
потенциала течени (фиг.2), либо путем разделени контрольных растворов с известными
компонентами при разных значени х потенциала течени .
Использование указанных поправок компенсирует вли ние разброса скоростей
электроосмотического потока на времена выхода компонентов. Поэтому во втором случае
при промывках добиваютс , чтобы скорость электроосмотического потока достигла или
превысила минимально допустимое значение, при котором общее врем разделени пробы
не превышает заданное.
Использу зависимость времени выхода метки электроосмотического потока от
потенциала течени (фиг.2), по минимально допустимой скорости электроосмотического
потока определ ют пороговое значение Us0.
Так же, как и в первом случае, предпочтительно определ ть указанные заданные
Страница: 8
RU 2 300 099 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
значени времен выхода известных компонентов экспериментально при
электрофоретическом разделении калибровочной смеси этих известных компонентов,
причем перед указанным разделением калибровочной смеси производитс промывка с
измерением потенциала течени до достижени пороговой величины потенциала течени Us0, a измеренна перед завершением промывки величина потенциала течени Us-cal
фиксируетс и используетс при идентификации компонентов раздел емой пробы
неизвестного состава, причем изобретение предусматривает два способа использовани этой величины при калибровке. В первом вышеупом нутую заданную величину потенциала
течени Us-set, используемую дл определени поправок при идентификации, принимают
равной измеренной перед разделением калибровочной смеси величине Us-cal, а указанные
заданные значени времен выхода выбирают равными значени м времен выхода
известных компонентов, измеренным при указанном разделении калибровочной смеси. Во
втором в качестве указанных заданных значений времен выхода известных компонентов
выбирают значени времен выхода известных компонентов, измеренные при
электрофоретическом разделении калибровочной смеси известных компонентов, с
поправками, определ емыми из соотношени величины потенциала течени Us-cal,
определенной перед электрофоретическим разделением калибровочной смеси известных
компонентов, с заданной величиной потенциала течени Us-set. Второй способ калибровки
предпочтителен в том случае, когда дл калибровки требуетс произвести разделение
нескольких калибровочных растворов известных компонентов, а величины потенциала
течени Us-cal, измеренные перед разделением разных калибровочных смесей,
различаютс .
Как правило, во втором случае реализации изобретени пороговое значение потенциала
течени существенно ниже, чем в первом, и, следовательно, достигаетс значительно
раньше. На фиг.1 порогова величина потенциала течени , выбранна в соответствии со
вторым вариантом, соответствует второй пороговой величине Us0-2, котора достигаетс уже при второй промывке. Таким образом, второй случай реализации изобретени позвол ет существенно повысить производительность выполнени большого количества
анализов однотипных проб и существенно повышает воспроизводимость
электрофоретического разделени за счет использовани поправок, компенсирующих
вли ние разброса скоростей электроосмотического потока на времена выхода
компонентов.
На фиг.3 показана блок-схема устройства дл электрофоретического определени состава многокомпонентных растворов, реализующего за вленный способ.
Устройство содержит капилл р 1, помещенный в средства установки капилл ра 2,
емкость дл электролита 3,3' и емкость дл пробы 4, средства перемещени указанных
емкостей 5, выполненные с возможностью помещени концов капилл ра в указанные
емкости.
Средства создани потока электролита через капилл р 6 св заны с той емкостью, в
которую помещен входной конец капилл ра 1 (на фиг.3 и 4 левый). С теми емкост ми, в
которые помещены концы капилл ра 1, электрически св заны средства создани напр жени между концами капилл ра 7.
Средства измерени потенциала течени 9 выполнены с возможностью электрической
св зи с концами капилл ра 1 при промывке. Устройство содержит детектор 8, выполненный
с возможностью св зи с капилл ром 1. Система управлени и обработки сигналов 10
св зана с детектором 8, со средствами создани напр жени 7, а также со средствами
создани потока электролита через капилл р 6 и со средствами измерени потенциала
течени 9.
Средство перемещени емкостей 5 представл ет собой устройство дл перемещени емкостей с растворами и выполн етс известным из уровн техники образом, например, с
применением электромеханического привода или пневмопривода. Положение выбранной
емкости, при которой она подведена к выбранному концу капилл ра, будем далее называть
рабочим положением емкости.
Страница: 9
RU 2 300 099 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Капилл р 1, как правило, выполн етс в виде кварцевого капилл ра с защитной
полимерной оболочкой, удаленной на погружаемых торцах капилл ра и на участке
капилл ра, св занном с детектором 8 при использовании оптического детектора.
Средства установки капилл ра 2 выполнены с возможностью погружени концов
капилл ра 1 в емкости 3 и 3', наход щиес в рабочем положении, отделени внутренней
полости по меньшей мере одной из наход щихс в рабочем положении емкостей от
окружающей атмосферы и св зи указанной внутренней полости со средствами создани потока электролита через капилл р 6. В предпочтительном варианте конструкци средств
установки капилл ра 2 предусматривает размещение капилл ра 1 внутри канала прокачки
жидкого теплоносител с заданной температурой, что обеспечивает лучшую стабилизацию
температуры капилл ра при электрофоретическом разделении и уменьшение разброса
времен выхода компонентов вследствие неконтролируемого изменени температуры.
Средства создани потока электролита через капилл р 6 представл ют собой
устройство дл создани и поддержани заданного перепада давлений между концами
капилл ра, погруженными в емкости с растворами и выполн ютс известным из уровн техники образом, например с применением компрессора и датчика перепада давлени с
возможностью поддержани заданного давлени в упом нутой внутренней полости.
Средства создани напр жени 7 представл ют собой стабилизированный источник
высокого напр жени , выполненный любым известным образом с возможностью установки
выбранной амплитуды высокого напр жени в диапазоне от нулевой до максимальной. Как
правило, максимальна амплитуда лежит в диапазоне 20-40 киловольт. В
предпочтительном варианте средства создани напр жени 7 выполнены с возможностью
переключени пол рности высокого напр жени , приложенного между концами капилл ра
1. Средства создани напр жени 7 снабжены электродами 11, установленными с
возможностью погружени их концов в емкости 3 и 3', наход щиес в рабочем положении.
В качестве электродов 11, как правило, используют платиновые электроды.
Средства измерени потенциала течени 9 включают устройство измерени разности
потенциалов 12 между концами капилл ра, выполн ющиес известным из уровн техники
образом, например в виде дифференциального усилител с большим входным
сопротивлением, значительно превосход щим электрическое сопротивление заполненного
электролитом капилл ра. Поскольку электрическое сопротивление капилл ра,
заполненного электролитом, может достигать нескольких сотен МОм, в предпочтительном
варианте входное сопротивление усилител выбирают в диапазоне дес тков ГОм.
Средства измерени потенциала течени 9, электролит в емкост х 3, установленных в
рабочее положение, и заполненный электролитом капилл р 1 образуют измерительную
электрическую цепь.
Средства измерени потенциала течени 9, включают также средства размыкани измерительной электрической цепи 13, выполненные с возможностью предотвращать
воздействие высокого напр жени на указанное устройство измерени разности
потенциалов 12.
Средства размыкани измерительной электрической цепи 13 могут выполн тьс любым
известным образом, например, с использованием высоковольтного реле, электрически
св занного, по меньшей мере, с одним из электродов 11.
В варианте изобретени , предпочтительном по точности измерени потенциала течени ,
представлен альтернативный способ коммутации электрических цепей: высоковольтной
при электрофоретическом разделении и низковольтной, измерительной при промывке.
Средства размыкани измерительной электрической цепи включают измерительные
электроды 14 (Фиг.4), электрически св занные с устройством измерени разности
потенциалов 12 средств измерени потенциала течени 9 и установленные в заполненных
буферным электролитом емкост х 3 и 3', которые посредством средств перемещени емкостей 5 устанавливаютс в рабочее положение при кондиционировании капилл ра 1 и
измерении в нем потенциала течени . Перед подачей на электроды 11 высокого
напр жени в рабочее положение устанавливаютс емкости 4 и 4' с буферным
Страница: 10
RU 2 300 099 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
электролитом, а емкости 3 и 3' с измерительными электродами 14 вывод тс из рабочего
положени , в результате чего измерительна электрическа цепь оказываетс разомкнутой. В качестве измерительных электродов 14 используют электроды с малой
остаточной пол ризацией, например, хлор-серебр ные, что уменьшает погрешность
измерени потенциала течени .
В качестве детектора 8 используют любой известный тип детектора дл капилл рного
электрофореза, например, оптический, электрохимический или масс-спектрометрический.
Специалистам пон тно, что в случае использовани масс-спектрометрического детектора
при разделении только входной конец капилл ра помещен в емкость с буферным
электролитом, а средства измерени потенциала течени выполн ютс с учетом
совместимости с входным интерфейсом масс-спектрометрического детектора.
Система управлени и обработки сигналов 10 выполн етс известным из уровн техники
образом, например, с использованием микропроцессорного контроллера и персонального
компьютера.
Рассмотрим подробнее пример реализации за вленного способа с использованием
за вленного устройства по фиг.3.
Дл подготовки к электрофоретическому разделению капилл р 1 промывают растворами
предварительной промывки, выбранными в соответствии с типом адсорбировавшихс ранее веществ, а также с типом использовавшегос при предшествующих анализах
буферного электролита. Новый или длительное врем не бывший в работе капилл р
предварительно промывают раствором кислоты, водой, раствором щелочи, снова водой.
Затем производ т кондиционирование капилл ра, то есть промывку раствором того же
буферного электролита, который будет использован при последующем анализе.
Промывки осуществл ютс следующим образом: выбранную промывочную емкость с
раствором очередной предварительной промывки или с буферным электролитом
устанавливают в рабочее положение, в котором конец капилл ра 1 оказываетс погруженным в промывочный раствор выбранной емкости, а внутренн полость
выбранной емкости отделена от окружающей среды и пневматически св зана со
средствами создани потока электролита через капилл р 6, которые создают избыточное
давление, вытесн ющее указанный промывочный раствор через капилл р 1 в сливную
емкость (не показано).
На завершающей стадии промывки при кондиционировании капилл ра производ т
определение величины потенциала течени . Дл этого в рабочее положение напротив
входного и выходного концов капилл ра 1 устанавливают емкости 3 и 3' с буферным
электролитом, в который погружают концы капилл ра. Синхронно с концами капилл ра в
емкость с раствором буферного электролита попадают и концы электродов 11, Средства
создани напр жени 7 отключают от электродов с помощью высоковольтного реле 13,
вход щего в средства измерени потенциала течени , причем средства измерени потенциала течени 9 замыкают измерительную электрическую цепь, включающую
электроды 11 и буферный электролит в обеих указанных емкост х и в капилл ре. Средства
создани потока 6 посредством создани нулевого перепада давлени между концами
капилл ра обеспечивают нулевой поток через капилл р. При этом средства измерени потенциала течени измер ют величину фоновой разности потенциалов между концами
капилл ра, соответствующую на фиг.5 участку 0-10 сек. Затем средства создани потока
6 увеличивают разницу давлений между концами капилл ра от нулевой до выбранной
величины, обеспечива нарастание скорости потока буферного электролита через
капилл р. На фиг.5 видно, что рост разницы давлений меж??у концами капилл ра на
участке 10-13.5 сек сопровождаетс пропорциональным приростом разницы потенциалов
между концами капилл ра. После достижени выбранной величины разницы давлений
средства создани потока 6 поддерживают указанную выбранную разницу давлений между
концами капилл ра и обеспечивают выбранную скорость потока буферного электролита
через капилл р. Поддержание посто нной скорости потока на фиг.5 соответствует участку
13.5-30 сек. Видно, что установившейс скорости потока соответствует установивша с Страница: 11
RU 2 300 099 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
(рабоча ) разность потенциалов между концами капилл ра. При этом устройство
измерени разности потенциалов измер ет величину рабочей разности потенциалов между
концами капилл ра при поддержании выбранной разности давлений между ними. Система
управлени и обработки сигналов 10 получает измеренные данные и вычисл ет потенциал
течени , вычита из величины рабочей разности потенциалов величину фоновой разности
потенциалов.
На фиг.6 показано изменение во времени величин разности потенциалов между концами
чистого капилл ра при попеременном наличии и отсутствии перепада давлени между его
концами. Фоновой разности потенциалов соответствуют участки меандров с низкими
значени ми, а рабочей - с более высокими значени ми разности потенциалов. Видно, что
как фонова , так и рабоча разности потенциалов со временем измен ютс вследствие
дрейфа измерительной системы, при этом значение потенциала течени остаетс посто нным. Поэтому в предпочтительном варианте дл повышени точности измерени потенциала течени производ т серию последовательных промывок, причем при
очередной промывке через заданный промежуток времени после ее начала разницу
давлений между концами капилл ра сбрасывают до нул и снова измер ют фоновую
разность потенциалов. Измеренное таким образом изменение фоновой разности
потенциалов используетс дл коррекции вычисл емой величины потенциала течени , что
значительно уменьшает ошибки, св занные с упом нутым дрейфом.
Если измеренный и скорректированный таким образом потенциал течени Us окажетс равным или превысит заранее заданное пороговое значение Us0, процедуру промывки
завершают. Если же Us окажетс меньше заданного порогового значени Us0, начинают
новую промывку, в результате которой будут измерены новые значени фоновых и рабочих
разностей потенциалов, а также определено новое достигнутое значение Us. Вс процедура повтор етс до тех пор пока Us не достигнет или не превысит заданного
порогового значени Us0.
После завершени промывки капилл ра производ т дозированный ввод выбранной
пробы в капилл р. Дл этого посредством средства перемещени емкостей 5
устанавливают емкость 4 с выбранной пробой в рабочее положение, соответствующее
входному концу капилл ра 1. В качестве пробы может быть выбран либо раствор
калибровочной смеси известных компонентов, либо раствор неизвестного состава,
компоненты которого подлежат идентификации и количественному определению. Ввод
пробы осуществл ют любым известным образом, например электрокинетическим. В
предпочтительном варианте изобретени пробу ввод т с помощью средств создани потока через капилл р 6, создава в течение выбранного интервала времени выбранный
перепад давлени между концами капилл ра 1. После ввода пробы в рабочее положение
вместо емкости с пробой 4 устанавливают емкость с буферным электролитом 3, размыкают
электроды 11 от измерительной цепи и замыкают их на высоковольтную цепь. После чего
провод т процедуру электрофоретического разделени , подава на электроды 11
выбранное высокое напр жение от средств создани напр жени 7 и передава сигналы с
детектора 8 в систему управлени и обработки сигналов 10.
Вследствие подачи к концам капилл ра высокого напр жени компоненты введенной
пробы начинают двигатьс в капилл ре 1 с разной скоростью. В силу того, что величина
сигнала детектора 8 зависит от количества компонента в пробе, при прохождении
очередным движущимс компонентом пробы св занной с детектором 8 зоны
детектировани капилл ра 1, величина сигнала детектора 8 измен етс . Система
управлени и обработки сигналов 10 регистрирует изменение сигнала детектора 8 во
времени и вычисл ет врем выхода каждого детектируемого компонента пробы, равное
интервалу времени между началом электрофоретического разделени и моментом
детектировани этого компонента.
Измеренные дл разных компонентов пробы времена выхода используют дл их
идентификации, сопоставл с заданными временами выхода известных компонентов, а
измеренные амплитуды сигналов детектора используют дл расчета концентраций
Страница: 12
RU 2 300 099 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
идентифицированных компонентов в пробе.
В качестве заданных времен выхода известных компонентов могут использоватьс литературные или иные данные, полученные на другом устройстве. В предпочтительном
варианте изобретени указанные заданные значени времен выхода известных
компонентов определ ют при электрофоретическом разделении калибровочной смеси этих
известных компонентов, производимом вышеописанным образом с использованием того же
устройства, которое используетс дл электрофоретического разделени проб.
В первом вышеописанном случае реализации изобретени дл идентификации
компонентов пробы производ т сопоставление измеренных времен выхода компонентов и
заданных времен выхода известных компонентов. При этом существенное повышение
воспроизводимости электрофоретического разделени достигаетс за счет того, что
разброс скоростей электроосмотического потока от одного анализа к другому не
превышает допустимой величины.
Во втором вышеописанном случае реализации изобретени дл идентификации
компонентов пробы производ т сопоставление измеренных времен выхода компонентов и
заданных времен выхода известных компонентов с использованием поправок,
определ емых вышеописанным образом из соотношени измеренной величины
потенциала течени с заданной величиной потенциала течени . При этом существенно
повышаетс производительность выполнени большого количества анализов однотипных
проб и существенно повышаетс воспроизводимость электрофоретического определени состава проб за счет использовани поправок, компенсирующих вли ние разброса
скоростей электроосмотического потока на времена выхода компонентов.
В приборах различных систем капилл рного электрофореза, в которых промывку
капилл ра осуществл ют с помощью пневматических устройств, используют давлени от
неконтролируемо низкого (ориентировочно от 500 мбар при ручном нагнетании воздуха) до
5-10 бар. Чем выше разность давлений между концами капилл ра при промывке, тем
больше абсолютна величина потенциала течени , и оператор может выбрать такую
разность давлений, при которой измер емые значени потенциала течени будут доступны
измерительной аппаратуре, имеющейс в его распор жении. В модельных экспериментах
использовали разность давлений 1000±1 мбар.
Величина высокого напр жени , примен ема при разделении компонентов, не
оказывает никакого вли ни на величину потенциала течени и услови его измерени .
Она выбираетс как компромисс между продолжительностью анализа и разрешающей
способностью системы записи сигнала детектора. Чем выше напр жение при разделении,
тем быстрее мигрируют компоненты в капилл ре, короче интервал времен между
соседними пиками и, вместе с тем (!), труднее идентификаци пиков на
электрофореграмме. В общем случае рекомендуемое напр жение определ етс методикой
выполнени измерений.
В качестве примера разделени и анализа многокомпонентной смеси приводим анализ
модельной смеси, состо щей из бензилового спирта, N-фенилантранилата лити и
бензоата лити в 0,001 М растворе тетрабората натри . Приготовленный раствор был
использован дл градуировки экспериментального макета системы КЭ с блоком измерени потенциала течени . Градуировка была выполнена с помощью программы сбора и
обработки данных и записана в метод. Все дальнейшие определени выполн ли по этому
же методу с использованием записанной градуировки. Времена выхода компонентов,
усредненные по трем измерени м, и их концентрации (по процедуре приготовлени )
приведены в таблице 1.
Таблица 1.
Усредненные параметры градуировочных электрофореграмм.
Бензиловый спирт
50
N-фенилантранилат
Бензоат лити Врем , мин Концентр, мг/дм 3 Врем , мин Концентр, мг/дм 3 Врем , мин Концентр, мг/дм 3
Результат
3.879
400.00
5.641
50.00
6.474
100.00
Измеренна величина потенциала течени перед проведением градуировочных
Страница: 13
RU 2 300 099 C1
5
10
измерений составила в среднем 82,0±0,2 мВ.
Чтобы смоделировать неподконтрольное оператору загр знение капилл ра,
аналогичное тому, что бывает после выполнени анализов проб с разным содержанием
примесей, перед промывкой капилл ра в него вводилс бромид цетилтриметиламмони так, чтобы его концентраци составила 0,001 моль/дм 3, и после этого капилл р
промывалс в течение разного времени, заведомо недостаточного дл полной отмывки
внутренней поверхности капилл ра. То есть введенна после промывки проба
анализировалась в услови х различной степени очистки капилл ра. При этом в нескольких
последовательных анализах были найдены следующие времена выхода и концентрации
определ емых компонентов:
Таблица 2.
Результаты электрофоретического определени пробы после «неконтролируемого» загр знени капилл ра.
Бензиловый спирт
N-фенилантранилат
Бензоат лити Врем , мин Концентр, мг/дм 3 Врем , мин Концентр, мг/дм 3 Врем , мин Концентр, мг/дм 3
15
№1-гр зь
4.733
312.86
7.579
51.03
9.187
111.26
№2-гр зь
4.251
262.59
6.488
40.54
7.641
84.47
№3-гр зь
4.23
264.29
6.449
38.48
7.598
81.12
№4-гр зь
4.223
296.79
6.455
43.34
7.606
90.90
№5-гр зь
4.174
301.53
6.341
44.96
7.448
93.22
№6-гр зь
4.186
298.18
6.375
45.00
7.505
93.91
20
№7-гр зь
4.084 488.66 5.96
ср. знач
4.27 317.84 6.52
45.53
7.70
94.51
Абс. СКО
0.21
5.87
0.70
10.98
77.69
0.50
55.35 6.946 106.67
откл. от градуир. 10.0% -20.5% 15.6% -8.9% 19.0% -5.5%
Отн. СКО
25
30
35
40
45
50
5.0% 24.4% 7.7% 12.9% 9.0% 11.6%
Типичные значени потенциала течени перед аналитическими измерени ми
составл ли от 63 до 78 мВ.
Последние две строчки таблицы показывают насколько отклонились результаты
измерений табл.2 от значений дл градуировочных измерений табл.1 (откл. от градуир.),
а также каков разброс результатов измерений в этой серии из семи последовательных
анализов (Отн. СКО=относительное среднеквадратичное отклонение результатов от
среднего).
Видно, что отклонение от градуировочных значений по времени выхода пика дл всех
трех анализировавшихс веществ отклонение составл ет от 10 до 19 процентов, а по
вычисленной концентрации от 5,5 до 20 процентов. При этом и воспроизводимость
результатов измерени (Отн. СКО) также имеет достаточно плохие показатели: по времени
выхода от 5 до 9 процентов, а по вычисленной концентрации от 8 до 24 процентов.
Дл демонстрации эффекта увеличени воспроизводимости времен выхода пиков и
повышени точности определени концентраций от использовани знани величины
потенциала течени при промывке был проведен следующий эксперимент. После каждого
ввода загр зн ющего раствора бромид цетилтриметиламмони капилл р промывали
раствором ведущего электролита (0,01 М раствор буры): сначала основна промывка в
течение трех минут без измерени потенциала течени , а затем дополнительна промывка,
чередующа с с этапами измерени потенциала течени . Периодичность дополнительной
промывки была выбрана равной 1 минуте: 30 секунд промывка и 30 секунд измерение
потенциала течени . В качестве предельного значени потенциала течени , при котором
капилл р считалс подготовленным к дальнейшему вводу пробы, было выбрано значение
81 мВ. Промывка капилл ра автоматически заканчивалась при достижении указанного
значени (как правило, после 3-ей - 4-ой дополнительной промывки). После этого
выполн ли анализ модельного раствора. Полученные данные приведены в таблице 3.
Таблица 3.
Пример воспроизводимости времен выхода компонентов и определени их концентраций с использованием промывки капилл ра до
достижени заданного значени потенциала течени .
Бензиловый спирт
Врем , мин
Концентр, мг/дм 3
N-фенилантранилат
Врем , мин
Страница: 14
Концентр, мг/дм 3
Бензоат лити Врем , мин
Концентр, мг/дм 3
RU 2 300 099 C1
5
10
15
№1-чисто
3.862
405.93
5.625
49.90
6.466
№2-чисто
3.85
387.95
5.621
50.12
6.464
100.97
101.80
№3-чисто
3.866
368.88
5.647
51.26
6.505
105.21
№4-чисто
3.907
408.79
5.755
50.13
6.645
101.26
№5-чисто
3.923
407.31
5.789
51.25
6.69
104.47
№6-чисто
3.935
394.27
5.817
51.15
6.735
105.96
103.28
ср. знач
3.89
395.52
5.71
50.64
6.58
Абс. СКО
0.04
15.44
0.09
0.65
0.12
2.19
откл. от градуир.
0.3%
-1.1%
1.2%
1.3%
1.7%
3.3%
Отн. СКО
0.9%
3.9%
1.5%
1.3%
1.8%
2.1%
На основе последних строк таблиц 2 и 3, относ щихс к отклонени м результатов
измерений от градуировочных и параметрам воспроизводимости дл этих серий
измерений, составлена таблица 4, в которой показано во сколько раз улучшились
параметры отклонени от градуировочных значений и параметр воспроизводимости
результатов (как по временам выхода, так и по вычисл емым значени м концентрации).
Таблица 4.
Эффект от промывки капилл ра до достижени величины ПТ заданного значени (на основе данных таблиц 2 и 3).
Бензиловый спирт
N-фенилантранилат
Бензоат лити Врем , мин Концентр, мг/дм 3 Врем , мин Концентр, мг/дм 3 Врем , мин Концентр, мг/дм 3
откл. от градуир.
33.9
18.3
12.9
7.0
11.2
1.7
Отн. СКО
5.4
6.3
5.0
10.1
4.9
5.5
20
25
30
35
40
45
50
Из таблицы 4 видно, что дл выполнени электрофоретического определени состава
многокомпонентных проб с использованием измерени потенциала течени наблюдаетс улучшение воспроизводимости как времен выхода, так и определени концентраций. Так
уменьшение отклонени времен выхода дл трех веществ модельного раствора составило
от 4.9 до 5.4 раз, а уменьшение отклонени вычисленной концентрации компонентов
составило от 5.5 до 10 раз. А дл отклонени средних значений времен выхода от
результатов градуировочных измерений улучшение еще более значительное: дл времен
выхода от 11 до 34 раз, а дл концентраций от 2 до 18 раз.
Специалистам пон тно, что приведенное выше подробное описание приведено в
качестве примера, и может быть предложено множество других вариантов, не выход щих
за пределы насто щего изобретени , включающих, например, не описанные здесь
подробно: вариант измерени потенциала течени сразу после электрофоретического
разделени с определением соответствующих поправок или вариант создани потока
электролита через капилл р путем создани отрицательного перепада давлени на
выходном конце капилл ра, а также вариант модификации реализации способа в
устройстве при использовании масс-спектрометрического детектора, но не
ограничивающихс этими примерами.
Литература
1. R.Weinberger. Practical Capillary Electrophoresis. 2 Edit., Academic Press, 2000.
2. Dale R.Baker. Capillary Electrophoresis. John Wiley & sons, Inc., 1995.
3. Руководство по капилл рному электрофорезу. Под ред. А.М.Волощука, М., 1996 г
4. Система капилл рного электрофореза. Основы метода. Аппаратура. Примеры
использовани систем капилл рного электрофореза «Капель-103, - 104, - 105». СПб, издво «Петрополис» 2001 г.
5. Патент US №05441613 (он же WO-A1 №1996022151).
Формула изобретени 1. Способ электрофоретического определени состава многокомпонентных растворов,
включающий выполнение калибровочных и аналитических измерений, состо щих из
промывки капилл ра раствором электролита, введени в заполненный электролитом
капилл р раствора калибровочной смеси при калибровочных измерени х и введени раствора пробы при аналитических измерени х, электрофоретического разделени компонентов введенных растворов в капилл ре под воздействием приложенного между
Страница: 15
CL
RU 2 300 099 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
концами капилл ра напр жени , детектировани и измерени времен выхода компонентов
введенных растворов; идентификацию компонентов пробы по временам выхода,
отличающийс тем, что при промывке капилл ра раствором электролита определ ют
величину потенциала течени путем измерени разности потенциалов между концами
капилл ра при определенной разности давлений между указанными концами капилл ра,
причем полученное значение величины потенциала течени используют дл идентификации компонентов пробы путем сравнени величин потенциала течени ,
измеренных при промывке перед калибровочными и аналитическими измерени ми.
2. Способ по п.1, отличающийс тем, что промывку капилл ра раствором электролита
осуществл ют до тех пор, пока значение потенциала течени не достигнет заданной
величины.
3. Способ по п.2, отличающийс тем, что указанную заданную величину потенциала
течени выбирают равной или меньшей величины потенциала течени , измеренной при
промывке капилл ра раствором электролита перед электрофоретическим разделением
калибровочной смеси.
4. Способ по п.1 или 2, отличающийс тем, что дл идентификации компонентов пробы
используют значени времен выхода известных компонентов, измеренные при
электрофоретическом разделении калибровочной смеси, с использованием поправок,
определ емых из соотношени величины потенциала течени , измеренной перед
электрофоретическим разделением пробы, с величиной потенциала течени , измеренной
перед электрофоретическим разделением калибровочной смеси.
5. Способ по п.1, отличающийс тем, что дл определени величины потенциала
течени концы капилл ра помещают в емкости с электролитом и привод т в электрический
контакт со средствами измерени потенциала течени таким образом, чтобы средства
измерени потенциала течени и электролит, наход щийс в емкост х и капилл ре,
образовывали замкнутую измерительную электрическую цепь, а при электрофоретическом
разделении размыкают указанную измерительную электрическую цепь, причем емкости с
электролитом, в которые помещают концы капилл ра, привод т в электрический контакт с
источником высокого напр жени таким образом, чтобы источник высокого напр жени и
электролит, наход щийс в емкост х и капилл ре, образовывали замкнутую
высоковольтную электрическую цепь.
6. Устройство дл электрофоретического определени состава многокомпонентных
растворов, включающее капилл р, емкости дл электролита и проб, средства установки
капилл ра и емкостей, выполненные с возможностью помещени концов капилл ра в
указанные емкости, средства создани потока электролита через капилл р, средства
создани напр жени между концами капилл ра, св занный с капилл ром детектор и
систему управлени и обработки сигналов, отличающеес тем, что оно снабжено
средствами измерени потенциала течени , выполненными с возможностью измерени разности потенциалов между концами капилл ра и с возможностью электрической св зи с
концами капилл ра при промывке таким образом, что указанные средства измерени потенциала течени и электролит, наход щийс в емкост х и в капилл ре, образуют
измерительную электрическую цепь, а средства создани потока электролита через
капилл р выполнены с возможностью создани и поддержани определенной разности
давлений между концами капилл ра.
7. Устройство по п.6, отличающеес тем, что средства установки капилл ра и емкостей
выполнены с возможностью обеспечени пневматической св зи внутренней полости
емкости с раствором, в которую помещен один из концов капилл ра, со средствами
создани потока электролита через капилл р, а средства создани потока выполнены с
возможностью поддержани заданного давлени в этой полости.
8. Устройство по п.6, отличающеес тем, что средства измерени потенциала течени включают средства размыкани указанной измерительной цепи.
9. Устройство по п.8, отличающеес тем, что указанные средства размыкани содержат
первую и вторую емкости дл электролита, установленные с возможностью помещени Страница: 16
RU 2 300 099 C1
конца капилл ра в первую емкость при измерении потенциала течени и во вторую емкость
при электрофоретическом разделении, а в указанную первую емкость установлен
измерительный электрод.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Страница: 17
RU 2 300 099 C1
Страница: 18
DR
RU 2 300 099 C1
Страница: 19
RU 2 300 099 C1
Страница: 20
?мальной воспроизводимости
определени состава многокомпонентных растворов, дл идентификации компонентов
пробы используют заданные значени времен выхода известных компонентов, а при
промывках добиваютс одинаковой чистоты капилл ра как перед разделением растворов
калибровочных смесей, так и перед разделением проб, компоненты которых подлежат
идентификации и количественному определению. В качестве критери достижени одинаковой чистоты капилл ра используют величину допустимого отклонени потенциала
течени dUs от равновесного значени Ueq, характеризующего чистый капилл р. В этом
случае выбирают такое пороговое значение Us0, которое меньше равновесного значени Страница: 7
RU 2 300 099 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
потенциала течени Ueq на указанную величину допустимого отклонени dUs,
т.е. Us0=Ueq-dUs.
В качестве заданных времен выхода известных компонентов могут использоватьс литературные или иные априорные данные. В предпочтительном варианте изобретени указанные заданные значени времен выхода известных компонентов определ ют
экспериментально при электрофоретическом разделении калибровочной смеси этих
известных компонентов, причем перед указанным разделением калибровочной смеси
провод т промывку с измерением потенциала течени до достижени пороговой величины
потенциала течени Us0.
В первом случае реализации изобретени дл обеспечени высокой чистоты капилл ра
и повышени воспроизводимости в качестве допустимого отклонени потенциала течени dUs от равновесного значени Ueq выбирают величину пор дка величины погрешности
измерени потенциала течени .
Однако при выполнении электрофоретического разделени растворов с небольшим
количеством компонентов, времена выхода которых значительно различаютс , в первом
случае реализации изобретени , как правило, увеличивают величину допустимого
отклонени dUs с целью сокращени затрат времени на промывку. Дл этого определ ют
допустимый разброс времен выхода компонентов пробы, в пределах которого не возникает
ошибок идентификации компонентов при использовании заданных значений времен
выхода известных компонентов, например, измеренных при разделении раствора
калибровочной смеси известных компонентов. Исход из допустимого разброса времен
выхода определ ют допустимый разброс скоростей электроосмотического потока.
Использу зависимость времени выхода метки электроосмотического потока от потенциала
течени (фиг.2), определ ют допустимое отклонение потенциала течени dUs от
равновесного значени , характеризующего чистый капилл р.
На фиг.1 порогова величина потенциала течени , выбранна в соответствии с первым
случаем, соответствует первой пороговой величине Us0-1, котора достигаетс только при
п той промывке. При последующих промывках изменение потенциала течени несущественно, поэтому последующие промывки исключают. Таким образом, первый
случай реализации изобретени обеспечивает существенное повышение
воспроизводимости электрофоретического разделени за счет того, что разброс скоростей
электроосмотического потока не превышает допустимой величины.
Во втором случае реализации изобретени , предпочтительном по производительности
при выполнении большого числа анализов однотипных проб, при идентификации
компонентов пробы производ т сопоставление измеренных времен выхода компонентов и
заданных времен выхода известных компонентов с использованием поправок,
определ емых из соотношени измеренной предельной величины потенциала течени Us
с заданной величиной потенциала течени Us-set.
Указанные поправки определ ют, использу зависимость скорости
электроосмотического потока от потенциала течени . Указанную зависимость определ ют
либо расчетным методом, например, с использованием формул (1) и (2), либо определ ют
экспериментально, например, с использованием меток ЭОП при разных значени х
потенциала течени (фиг.2), либо путем разделени контрольных растворов с известными
компонентами при разных значени х потенциала течени .
Использование указанных поправок компенсирует вли ние разброса скоростей
электроосмотического потока на времена выхода компонентов. Поэтому во втором случае
при промывках добиваютс , чтобы скорость электроосмотического потока достигла или
превысила минимально допустимое значение, при котором общее врем разделени пробы
не превышает заданное.
Использу зависимость времени выхода метки электроосмотического потока от
потенциала течени (фиг.2), по минимально допустимой скорости электроосмотического
потока определ ют пороговое значение Us0.
Так же, как и в первом случае, предпочтительно определ ть указанные заданные
Страница: 8
RU 2 300 099 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
значени времен выхода известных компонентов экспериментально при
электрофоретическом разделении калибровочной смеси этих известных компонентов,
причем перед указанным разделением калибровочной смеси производитс промывка с
измерением потенциала течени до достижени пороговой величины потенциала течени Us0, a измеренна перед завершением промывки величина потенциала течени Us-cal
фиксируетс и используетс при идентификации компонентов раздел емой пробы
неизвестного состава, причем изобретение предусматривает два способа использовани этой величины при калибровке. В первом вышеупом нутую заданную величину потенциала
течени Us-set, используемую дл определени поправок при идентификации, принимают
равной измеренной перед разделением калибровочной смеси величине Us-cal, а указанные
заданные значени времен выхода выбирают равными значени м времен выхода
известных компонентов, измеренным при указанном разделении калибровочной смеси. Во
втором в качестве указанных заданных значений времен выхода известных компонентов
выбирают значени времен выхода известных компонентов, измеренные при
электрофоретическом разделении калибровочной смеси известных компонентов, с
поправками, определ емыми из соотношени величины потенциала течени Us-cal,
определенной перед электрофоретическим разделением калибровочной смеси известных
компонентов, с заданной величиной потенциала течени Us-set. Второй способ калибровки
предпочтителен в том случае, когда дл калибровки требуетс произвести разделение
нескольких калибровочных растворов известных компонентов, а величины потенциала
течени Us-cal, измеренные перед разделением разных калибровочных смесей,
различаютс .
Как правило, во втором случае реализации изобретени пороговое значение потенциала
течени существенно ниже, чем в первом, и, следовательно, достигаетс значительно
раньше. На фиг.1 порогова величина потенциала течени , выбранна в соответствии со
вторым вариантом, соответствует второй пороговой величине Us0-2, котора достигаетс уже при второй промывке. Таким образом, второй случай реализации изобретени позвол ет существенно повысить производительность выполнени большого количества
анализов однотипных проб и существенно повышает воспроизводимость
электрофоретического разделени за счет использовани поправок, компенсирующих
вли ние разброса скоростей электроосмотического потока на времена выхода
компонентов.
На фиг.3 показана блок-схема устройства дл электрофоретического определени состава многокомпонентных растворов, реализующего за вленный способ.
Устройство содержит капилл р 1, помещенный в средства установки капилл ра 2,
емкость дл электролита 3,3' и емкость дл пробы 4, средства перемещени указанных
емкостей 5, выполненные с возможностью помещени концов капилл ра в указанные
емкости.
Средства создани потока электролита через капилл р 6 св заны с той емкостью, в
которую помещен входной конец капилл ра 1 (на фиг.3 и 4 левый). С теми емкост ми, в
которые помещены концы капилл ра 1, электрически св заны средства создани напр жени между концами капилл ра 7.
Средства измерени потенциала течени 9 выполнены с возможностью электрической
св зи с концами капилл ра 1 при промывке. Устройство содержит детектор 8, выполненный
с возможностью св зи с капилл ром 1. Система управлени и обработки сигналов 10
св зана с детектором 8, со средствами создани напр жени 7, а также со средствами
создани потока электролита через капилл р 6 и со средствами измерени потенциала
течени 9.
Средство перемещени емкостей 5 представл ет собой устройство дл перемещени емкостей с растворами и выполн етс известным из уровн техники образом, например, с
применением электромеханического привода или пневмопривода. Положение выбранной
емкости, при которой она подведена к выбранному концу капилл ра, будем далее называть
рабочим положением емкости.
Страница: 9
RU 2 300 099 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Капилл р 1, как правило, выполн етс в виде кварцевого капилл ра с защитной
полимерной оболочкой, удаленной на погружаемых торцах капилл ра и на участке
капилл ра, св занном с детектором 8 при использовании оптического детектора.
Средства установки капилл ра 2 выполнены с возможностью погружени концов
капилл ра 1 в емкости 3 и 3', наход щиес в рабочем положении, отделени внутренней
полости по меньшей мере одной из наход щихс в рабочем положении емкостей от
окружающей атмосферы и св зи указанной внутренней полости со средствами создани потока электролита через капилл р 6. В предпочтительном варианте конструкци средств
установки капилл ра 2 предусматривает размещение капилл ра 1 внутри канала прокачки
жидкого теплоносител с заданной температурой, что обеспечивает лучшую стабилизацию
температуры капилл ра при электрофоретическом разделении и уменьшение разброса
времен выхода компонентов вследствие неконтролируемого изменени температуры.
Средства создани потока электролита через капилл р 6 представл ют собой
устройство дл создани и поддержани заданного перепада давлений между концами
капилл ра, погруженными в емкости с растворами и выполн ютс известным из уровн техники образом, например с применением компрессора и датчика перепада давлени с
возможностью поддержани заданного давлени в упом нутой внутренней полости.
Средства создани напр жени 7 представл ют собой стабилизированный источник
высокого напр жени , выполненный любым известным образом с возможностью установки
выбранной амплитуды высокого напр жени в диапазоне от нулевой до максимальной. Как
правило, максимальна амплитуда лежит в диапазоне 20-40 киловольт. В
предпочтительном варианте средства создани напр жени 7 выполнены с возможностью
переключени пол рности высокого напр жени , приложенного между концами капилл ра
1. Средства создани напр жени 7 снабжены электродами 11, установленными с
возможностью погружени их концов в емкости 3 и 3', наход щиес в рабочем положении.
В качестве электродов 11, как правило, используют платиновые электроды.
Средства измерени потенциала течени 9 включают устройство измерени разности
потенциалов 12 между концами капилл ра, выполн ющиес известным из уровн техники
образом, например в виде дифференциального усилител с большим входным
сопротивлением, значительно превосход щим электрическое сопротивление заполненного
электролитом капилл ра. Поскольку электрическое сопротивление капилл ра,
заполненного электролитом, может достигать нескольких сотен МОм, в предпочтительном
варианте входное сопротивление усилител выбирают в диапазоне дес тков ГОм.
Средства измерени потенциала течени 9, электролит в емкост х 3, установленных в
рабочее положение, и заполненный электролитом капилл р 1 образуют измерительную
электрическую цепь.
Средства измерени потенциала течени 9, включают также средства размыкани измерительной электрической цепи 13, выполненные с возможностью предотвращать
воздействие высокого напр жени на указанное устройство измерени разности
потенциалов 12.
Средства размыкани измерительной электрической цепи 13 могут выполн тьс любым
известным образом, например, с использованием высоковольтного реле, электрически
св занного, по меньшей мере, с одним из электродов 11.
В варианте изобретени , предпочтительном по точности измерени потенциала течени ,
представлен альтернативный способ коммутации электрических цепей: высоковольтной
при электрофоретическом разделении и низковольтной, измерительной при промывке.
Средства размыкани измерительной электрической цепи включают измерительные
электроды 14 (Фиг.4), электрически св занные с устройством измерени разности
потенциалов 12 средств измерени потенциала течени 9 и установленные в заполненных
буферным электролитом емкост х 3 и 3', которые посредством средств перемещени емкостей 5 устанавливаютс в рабочее положение при кондиционировании капилл ра 1 и
измерении в нем потенциала течени . Перед подачей на электроды 11 высокого
напр жени в рабочее положение устанавливаютс емкости 4 и 4' с буферным
Страница: 10
RU 2 300 099 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
электролитом, а емкости 3 и 3' с измерительными электродами 14 вывод тс из рабочего
положени , в результате чего измерительна электрическа цепь оказываетс разомкнутой. В качестве измерительных электродов 14 используют электроды с малой
остаточной пол ризацией, например, хлор-серебр ные, что уменьшает погрешность
измерени потенциала течени .
В качестве детектора 8 используют любой известный тип детектора дл капилл рного
электрофореза, например, оптический, электрохимический или масс-спектрометрический.
Специалистам пон тно, что в случае использовани масс-спектрометрического детектора
при разделении только входной конец капилл ра помещен в емкость с буферным
электролитом, а средства измерени потенциала течени выполн ютс с учетом
совместимости с входным интерфейсом масс-спектрометрического детектора.
Система управлени и обработки сигналов 10 выполн етс известным из уровн техники
образом, например, с использованием микропроцессорного контроллера и персонального
компьютера.
Рассмотрим подробнее пример реализации за вленного способа с использованием
за вленного устройства по фиг.3.
Дл подготовки к электрофоретическому разделению капилл р 1 промывают растворами
предварительной промывки, выбранными в соответствии с типом адсорбировавшихс ранее веществ, а также с типом использовавшегос при предшествующих анализах
буферного электролита. Новый или длительное врем не бывший в работе капилл р
предварительно промывают раствором кислоты, водой, раствором щелочи, снова водой.
Затем производ т кондиционирование капилл ра, то есть промывку раствором того же
буферного электролита, который будет использован при последующем анализе.
Промывки осуществл ютс следующим образом: выбранную промывочную емкость с
раствором очередной предварительной промывки или с буферным электролитом
устанавливают в рабочее положение, в котором конец капилл ра 1 оказываетс погруженным в промывочный раствор выбранной емкости, а внутренн полость
выбранной емкости отделена от окружающей среды и пневматически св зана со
средствами создани потока электролита через капилл р 6, которые создают избыточное
давление, вытесн ющее указанный промывочный раствор через капилл р 1 в сливную
емкость (не показано).
На завершающей стадии промывки при кондиционировании капилл ра производ т
определение величины потенциала течени . Дл этого в рабочее положение напротив
входного и выходного концов капилл ра 1 устанавливают емкости 3 и 3' с буферным
электролитом, в который погружают концы капилл ра. Синхронно с концами капилл ра в
емкость с раствором буферного электролита попадают и концы электродов 11, Средства
создани напр жени 7 отключают от электродов с помощью высоковольтного реле 13,
вход щего в средства измерени потенциала течени , причем средства измерени потенциала течени 9 замыкают измерительную электрическую цепь, включающую
электроды 11 и буферный электролит в обеих указанных емкост х и в капилл ре. Средства
создани потока 6 посредством создани нулевого перепада давлени между концами
капилл ра обеспечивают нулевой поток через капилл р. При этом средства измерени потенциала течени измер ют величину фоновой разности потенциалов между концами
капилл ра, соответствующую на фиг.5 участку 0-10 сек. Затем средства создани потока
6 увеличивают разницу давлений между концами капилл ра от нулевой до выбранной
величины, обеспечива нарастание скорости потока буферного электролита через
капилл р. На фиг.5 видно, что рост разницы давлений меж?
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
2
Размер файла
366 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа