close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

внк-21/13-02 - перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вируса ящура и вируса бешенства

код для вставки
РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
RU
(19)
(11)
2 300 562
(13)
C2
(51) МПК
C12N 5/06
(2006.01)
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
(21), (22) За вка: 2005116301/13, 31.05.2005
(24) Дата начала отсчета срока действи патента:
31.05.2005
(45) Опубликовано: 10.06.2007 Бюл. № 16
(54) ВНК-21/13-02 - ПЕРЕВИВАЕМАЯ МОНОСЛОЙНО-СУСПЕНЗИОННАЯ СУБЛИНИЯ КЛЕТОК
позвол ет репродуцировать в промышленных
услови х вирус щура типа А, О, С, Ази , и вирус
бешенства «Щелково-51». Изобретение может
быть использовано в вирусологии.
R U
2 3 0 0 5 6 2
(57) Реферат:
Изобретение
относитс к
области
биотехнологии.
Предложена
перевиваема монослойно-суспензионна сублини клеток почки
новорожденного сирийского хом чка. Лини клеток
Страница: 1
RU
C 2
C 2
ПОЧКИ НОВОРОЖДЕННОГО СИРИЙСКОГО ХОМЯЧКА, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ
РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ЯЩУРА И ВИРУСА БЕШЕНСТВА
2 3 0 0 5 6 2
Адрес дл переписки:
141142, Московска обл., Щелковский р-н, п.
Биокомбинат, 42, кв.3, А.К. Елисееву
(73) Патентообладатель(и):
ОАО "Институт биотехнологий ветеринарной
медицины" (RU)
R U
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: С.Г. ЮРКОВ и др., «Каталог коллекции
клеточных культур ВНИИВВ и М»- Покров-2000 г.стр.60-62.
(72) Автор(ы):
Елисеев Анатолий Константинович (RU),
Мельник Николай Васильевич (RU),
Зенов Николай Иванович (RU),
Литенкова Ирина Юрьевна (RU),
Богач Валентина Николаевна (RU),
Иванов Виктор Серафимович (RU),
Красуткин Сергей Николаевич (RU),
Хайкина Людмила Сергеевна (RU)
RUSSIAN FEDERATION
RU
(19)
(11)
2 300 562
(13)
C2
(51) Int. Cl.
C12N 5/06
(2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY,
PATENTS AND TRADEMARKS
(12)
ABSTRACT OF INVENTION
(21), (22) Application: 2005116301/13, 31.05.2005
(24) Effective date for property rights: 31.05.2005
(45) Date of publication: 10.06.2007 Bull. 16
Mail address:
141142, Moskovskaja obl., Shchelkovskij r-n,
p. Biokombinat, 42, kv.3, A.K. Eliseevu
(54) BHK-21/13-02 - TRANSPLANTABLE MONOLAYER-SUSPENSION SUBLINE OF NEWBORN
reproducing foot-and-mouth virus type A, O, C,
Asia and rabies virus "Shelkovo-51". Invention
can be used in virology.
EFFECT: valuable properties of cells.
R U
2 3 0 0 5 6 2
(57) Abstract:
FIELD: biotechnology, microbiology.
SUBSTANCE: invention proposes a monolayersuspension subline of newborn Syrian hamster
kidney
cells.
Proposed
cell
line
allows
Страница: 2
EN
C 2
C 2
SYRIAN HAMSTER KIDNEY CELLS DESIGNATED FOR REPRODUCTION OF FOOT-AND-MOUTH
VIRUS AND RABIES VIRUS
2 3 0 0 5 6 2
(73) Proprietor(s):
OAO "Institut biotekhnologij veterinarnoj
meditsiny" (RU)
R U
(72) Inventor(s):
Eliseev Anatolij Konstantinovich (RU),
Mel'nik Nikolaj Vasil'evich (RU),
Zenov Nikolaj Ivanovich (RU),
Litenkova Irina Jur'evna (RU),
Bogach Valentina Nikolaevna (RU),
Ivanov Viktor Serafimovich (RU),
Krasutkin Sergej Nikolaevich (RU),
Khajkina Ljudmila Sergeevna (RU)
RU 2 300 562 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Область техники, к которой относитс изобретение.
Изобретение относитс к области биотехнологии, сфере суспензионного
культивировани перевиваемых культур клеток ВНК-21.
Уровень техники.
Характеристика аналогов изобретени :
Перевиваема лини клеток почки новорожденного сирийского хом чка ВНК-21 клон 13,
полученна в 1961 году в Англии Максферсоном и Стокером /Macpherson J, Stoker M. Syrian hamster fibrolast cell line BHK-21 snd its derivatives. - Nature, 1964, 203,
1355-1357/ распространилась по всему Миру.
Из литературных данных /С.Г.Юрков, В.В.Зуев и др. "Каталог коллекции клеточных
культур ВНИИВВиМ" - Покров. -2000 г.- с.59-63/ в нашей стране имеютс клетки ВНК-21,
поступившие из Англии, Франции, Мексики, США, Швеции и подученные в отечественных
профильных учреждени х.
Известны следующие аналоги клеток почки хом чка.
1. ВНК-21/13 - сублини перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского
хом чка, полученна в Институте полиомиелита.
2. ВНК21/13 - сублини перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хом чка,
полученна в НИИС;
3. ВНК-21/2-17а перевиваемый монослойно-суспензионный клон клеток получен во
ВНИЯИ (прототип).
ХАРАКТЕРИСТИКА АНАЛОГОВ
1. ВНК-21/13 - сублини перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хом чка
поддерживалась в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР
/С.Г.Юрков, В.В.Зуев и др. "Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ" - Покров. 2000 г. - с.60/.
Среда культивировани . Адаптирована к выращиванию в пристеночных культурах.
Клетки отдел ют от стекла с помощью 0,25% раствора трипсина, подогретого до 37°С.
Ростовые свойства. При пересеве с коэффициентом 1:2-1:3 монослой формируетс на
2-3 сутки после эксплантации. При условии коррекции рН среды до 7,5-7,6
сформированный монослой сохран етс до 5-6 дней. В литровом матрасе РУ
накапливаетс 40-45 млн. клеток.
Морфологи . Клетки фибробластоподобные.
Кариологи . Культура резко гетероплоидна с вариабельностью хромосомных наборов
от 32 до 78. Стволовую линию (модальный класс) составл ют клетки с 40 хромосомами (3234%), 4-6% клеток в попул ции сохран ют диплоидный набор хромосом.
Среда замораживани . Среда культивировани (90%), диметил-сульфоксид (10%).
Восстановление после хранени в жидком азоте. Жизнеспособность в пределах 85-95%.
Культуры восстанавливают исходные ростовые свойства на 2-3 пассаже.
2. ВНК21/13 - сублини перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хом чка
полученна в НИИС /С.Г.Юрков, В.В.Зуев и др. "Каталог коллекции клеточных культур
ВНИИВВиМ" - Покров. - 2000 г. - с.6-1/.
Среда культивировани . Дл суспензионного выращивани примен ют среду Игла-MEM,
обогащенную 120 мг/л серина и 610 мг/л глутамина с добавлением 0,25% ГЛА и 10%
сыворотки крови КРС. При пристеночном культивировании употребл ют среду Игла MEM
(90%) и сыворотку КРС (10%) рН 7,5-7,6.
Способ поддержани . Поддерживаетс в суспензионных услови х в реакторах
различной емкости. Сохранила способность расти в пристеночных культурах. В этом
случае при очередном пассировании клеточный пласт диспергируют 0,25% раствором
трипсина, подогретого до 37°С.
Ростовые свойства. В суспензионной культуре при посеве в концентрации 500 тыс.
клеток на мл. обеспечивает 3-4 кратный прирост попул ции на 3-4 сутки роста. При
коэффициенте пересева 1:3 монослой формируетс в пристеночных культурах на 2-3 сутки
после посева и переживает не более 3-х дней.
Страница: 3
DE
RU 2 300 562 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Морфологи . Клетки эпителиоподобные.
Кариологи . Попул ци гетероплоидна с разбросом числа хромосом в клетках от 20 до
78. Модальный класс составл ют клетки с диплоидным набором хромосом (16-24%).
Среда замораживани . Ростова среда (90%), диметилсульфоксид (10%).
Восстановление после хранени в жидком азоте. Жизнеспособность на уровне 88-96%.
Культуры восстанавливаютс на 1-2 пассаже.
Характеристика прототипа, выбранного за вителем
3. ВНК-21/2-17а перевиваемый монослойно-суспеизионныч клон клеток /С.Г.Юрков,
В.В.Зуев и др. "Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ" - Покров. - 2000 г. с.62/ получен во ВНИЯИ и хранитс в жидком азоте на уровне 13 пассажа.
Среда культивировани . 0,25% мышечный гидролизат на растворе Эрла (дл монослойных культур) и раствор Хенкса дл суспензионного культивировани с
добавлением 5 аминокислот (аргинин, глутамин, метеонин, цистин, серии), согласно
прописи модифицированной среды Игла и 8 витаминов группы В, сыворотка КРС (5%), рН
среды 6,8-7,2.
Способ поддержани . Суспензионную культуру выращивают объемно-доливным
методом. Монослойную культуру в пристеночных сосудах любой емкости. При очередном
пересеве примен ют смесь 0,25% трипсина и 0,02% раствора версена в соотношении 1:1.
Ростовые свойства. Через 48 часов культивировани в суспензии культура дает 6-7
кратный прирост, достига конечной концентрации 2,3-2,8 млн/мл. При выращивании в
монослое при посевной концентрации 50-100 тыс.клеток на мл. среды монослой образуетс на 2-3 сутки роста.
Морфологи . В суспензии культура представлена одиночными блест щими, округлыми
клетками. В монослое попул ци состоит из фибробластоподобных клеток с прозрачной
гомогенной цитоплазмой.
Кариологи . Культура гетероплоидна . Модальный класс представлен клетками с 42
хромосомами, составл ющими в попул ции 28-40%.
Среда замораживани . Ростова среда (90%), диметилсульфоксид (10%).
Восстановление после хранени в жидком азоте. Жизнеспособность 85-90%, клетки
восстанавливают морфологию и ростовые свойства на 2-3 пассаже.
Чувствительность к вирусам. Культура клеток чувствительна к вирусу щура типа А, О,
С, Ази .
Раскрытие изобретени .
(1) Сведени , раскрывающие сущность изобретени .
1.2. Задача, на решение которой направлено за вл емое изобретение.
Культура клеток ВНК-21/13-02 предназначена дл репродукции в промышленных
услови х вируса щура типа А, О, С, Ази , вируса бешенства шт."Щелково-51",
используемых дл изготовлени противовирусных вакцин против щура и бешенства.
Клетки ВНК-21/13-02 характеризуютс высокой чувствительностью к вирусу щура,
который накапливаетс в количестве 7,01 g ТЦД50/мл, при содержании иммуногенного
компонента до 1 млг/мл, а также чувствительны к вирусу бешенства, обеспечива титр
инфекционности 6,5 ЛД50/мл.
Сущность изобретени "ВНК-21/13-02 - перевиваема монослойно-суспензионна сублини клеток почки
новорожденного сирийского хом чка", адаптированна к суспензионному способу
выращивани с использованием питательной среды дл суспензионного выращивани на
основе солевого раствора Хенкса, содержаща 5-7% сыворотки, 0,125% гидролизата
мышечных белков и 0,125% гидролизата лактальбумина с добавлением п ти аминокислот:
1-аргинина 0,042 г/л; 1-глутамина 0,584 г/л; 1-тирозина 0,02 г/л; 1-триптофана 0,015
г/л; 1-цистина 0,032 г/л и семи витаминов группы В: холин-хлорид 0,0034, пантотенат
кальци (B5) 0,0034, пиридоксаль HCl 0,0034, тиамин (B1) 0,0034, мезо-инозит 0,0068,
никотинамид (РР) 0,0034, рибофлавин (B2) 0,00034, фолиева кислота (B9) 0,0034.
ВНК-21/13-02 депонирована в Российской коллекции клеточных культур (РКК) (СЖК
Страница: 4
RU 2 300 562 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
РАСХН) при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной
ветеринарии им. Я.Р.Коваленко.
Происхождение. Перевиваема лини клеток ВНК-21 клон 13, поступила на Щелковский
биокомбинат из Всероссийского научно-исследовательского и технологического института
биологической промышленности (ВНИиТИБП), который получил эту линию из лаборатории
цитологии Московского научно-исследовательского института вирусных препаратов в 1972
г.
Морфологи . В суспензии культура представлена одиночными округлыми клетками с
небольшим количеством конгламератов, содержащих от 3 до 5 клеток. В монослое
попул ци состоит из фибробластоподобных клеток с прозрачной гомогенной цитоплазмой,
иногда образуетс единый цитоплазматический пласт без границ между клетками с
наличием большого количества дер. Отмечаетс присутствие 2-3-4 и более дерных
симпластов, лежащих изолированно или в структуре клеточного пласта. Также отмечаетс отпочковывание дер от общей дерной массы и формирование микро дер в результате
разрушени дра. Часть клеток отдел етс от стекла и растет в суспензии.
Способ культивировани Монослой клеток ВНК-21/13-02 выращивают в матрацах любой емкости. Дл диспергировани клеточного пласта при пересевах используют смесь 0,25%-ного раствора
трипсина и 0,02%-ного версена в соотношении 1:9 при температуре 37°С. Клетки снимают
бесцентрифужным методом и ресуспендируют в ростовой среде до посевной
концентрации.
В суспензии культуру клеток выращивают отъемно-доливным способом в течение 48
часов до 10-50 последовательных пассажей.
Услови культивировани Суспензионное культивирование провод т в реакторах емкостью 4-40-100-600 литров с
рабочим объемом 3-30-60-450 литров соответственно при следующих параметрах:
- посевна концентраци 0,4-0,5?10 6 кл/мл;
- скорость перемешивани 25-40 об/мин;
- температура культивировани 36,0-36,5°С;
- рН среды в пределах 6,6-7,1;
- аэраци путем барботировани воздухом 0,5-1,5 л/л среды.
Индекс пролиферации при суспензионном культивировании равн етс 6-8, достига концентрации к 48 часам 4?10 6 кл./мл при жизнеспособности 95-99%.
Пассаж 32 пассажа в роллерном монослое, 13 пассажей в суспензии. Клеточна суспензи расфасована в ампулы по 2 см 3 с концентрацией 7?10 6 кл/мл.
Кариологическа характеристика: кариотип суспензионной культуры клеток ВНК-21/13-02
соответствуют кариотипу сирийского хом чка, размах варьировани числа хромосом на
клетку от 31 до 80, модальный класс (36%) составл ют клетки, содержащие 42 хромосомы.
В монослойной культуре количество хромосом на одну клетку варьирует от 31 до 98,
модальный класс (22%) составл ют клетки с числом хромосом, совпадающим с
диплоидным (n=44).
Видова идентичность. Культура идентифицирована как ткань почки сирийского хом чка.
Криоконсерваци , жизнеспособность после консервации. Дл длительного хранени (196°С) используют ампулы, при хранении (-70°С) - флаконы. Консервирование клеток
провод т в питательной среде (73%), сыворотке (20%), криопротектор диметилсульфоксид
(7%). Замораживание суспензии клеток по 2-х ступенчатому режиму понижени температуры от 0 до минус 30°С со скоростью 1°С в минуту, от минус 30°С до минус 70°С
со скоростью 4-6°С в минуту. Охлажденные до минус 70°С ампулы с суспензией клеток
помещают на хранение в сосуды Дьара с жидким азотом -196°С, предварительно подержав
ампулы в парах азота. Жизнеспособность клеток после консервации 85-97%.
Описание способа получени линии клеток.
В качестве исходного материала использовали перевиваемую линию клеток ВНК-21 клон
Страница: 5
RU 2 300 562 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
13, поступившую на Щелковский биокомбинат из Всероссийского научноисследовательского и технологического института биологической промышленности
(ВНИиТИБП), который получил эту линию из лаборатории цитологии Московского научноисследовательского института вирусных препаратов в 1972 г.
Адаптацию клеток к суспензионным услови м культивировани проводили в
биоферментере MD-300 фирмы "MARUBISHI" (Япони ) с автоматическим поддержанием
концентрации водородных ионов (рН 6,9-7,0), температуры (37°С), ручным регулированием
подачи воздуха и скорости перемешивани (до 100 об/мин). Культивирование проводили,
использу питательную среду на основе раствора Хенкса, содержащей 0.25%-тов суммы
гидролизатов лактальбумина и мышечных белков, 7%-тов сыворотки кр. рог. скота, п ти
аминокислот и витаминов группы В.
В первых трех пассажах отмечали некоторое уменьшение численности попул ции к
концу культивировани , что требовало увеличить засевную концентрацию клеток до 500
тыс./мл. Последующие п ть пассажей клетки росли с образованием довольно
значительных клеточных конгламератов, по влением зернистости в цитоплазме. При
дальнейшем пассажировании, с 9-го по 13 пассаж, число конгламератов уменьшалось,
цитоплазма становилась прозрачной и гомогенной. Посадочную концентрацию снизили до
200 тыс./мл, попул ци клеток в суспензии увеличивалась в 6-7 раз, врем генерации
составило 48 часов.
После проведени 13 пассажей в суспензии были получены клетки, отличающиес однообразием морфологии и размера, с небольшим количеством конгламератов и высокой
пролиферативной активностью (индекс пролиферации составил 5-7). Консервирование
клеток осуществили в криосреде (ростова среда - 73%, сыворотка - 20%,
диметилсульфоксид - 7%), в ампулах по 2 мл с концентрацией 7 млн.кл./мл.
Замораживание проводили по двухступенчатому режиму понижени температуры от 0
до -30°С со скоростью 1°С/мин и от -30 до -70°С со скоростью 4°С/мин. Охлажденные
до -70°С ампулы с суспензией клеток поместили на хранение в сосуд Дъюара с жидким
азотом (-196°С), предварительно выдержав их в парах азота. Жизнеспособность клеток
после консервации составила 98%.
Культура клеток прошла контроль на стерильность согласно ГОСТ 28085-89 "Препараты
биологические. Метод бактериологического контрол стерильности".
Данные кариологического анализа, проведенного методом Moorhead P.3. et al 1960 г.,
адаптированной суспензионной культуры клеток ВНК-21/13-02 соответствуют кариотипу
сирийского хом чка, размах варьировани числа хромосом на клетку от 31 до 80,
модальный класс (36%) составл ют клетки, содержащие 42 хромосомы.
В монослойной культуре количество хромосом на одну клетку варьирует от 31 до 98,
модальный класс (22%) составл ют клетки с числом хромосом, совпадающим с
диплоидным (n=44).
Полученный трофовариант клеток ВНК-21/13-02 отличаетс высокой пролиферативной
активностью. Концентраци клеток, выращенных в среде, содержащей 0,25% гидролизата и
7% сыворотки, составила 1,5-3,0 млн.кл./мл в биореакторах промышленных объемов.
ВНК-21/13-02 депонирована в Российской коллекции клеточных культур (РКК) в
специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур
сельскохоз йственных и промысловых животных при Всероссийском научноисследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (СХЖ
РАСХН).
Формула изобретени ВНК-21/13-02 - перевиваема монослойно-суспензионна сублини клеток почки
новорожденного сирийского хом чка, депонированна в Российской коллекции клеточных
культур (РКК), в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных
культур сельскохоз йственных и промысловых животных при Всероссийском научноисследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (СХЖ
Страница: 6
CL
RU 2 300 562 C2
РАСХН) под №61, предназначенна дл репродукции вируса щура типа А, О, С, Ази и
вируса бешенства штамм «Щелково-51», используемых дл изготовлени противовирусных
вакцин против щура и бешенства.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Страница: 7
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
2
Размер файла
82 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа