close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

способ получения питательной среды для культивирования yersinia enterocolitica

код для вставки
РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
(19)
RU
(11)
2 300 560
(13)
C2
(51) МПК
C12N 1/20 (2006.01)
C12Q 1/04 (2006.01)
C12R 1/00 (2006.01)
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
(21), (22) За вка: 2005108115/13, 22.03.2005
(72) Автор(ы):
Плешакова Валентина Ивановна (RU),
Налепова Марина Юрьевна (RU),
Трапезников Семен Викторович (RU),
Конев Алексей Владимирович (RU)
(24) Дата начала отсчета срока действи патента:
22.03.2005
(43) Дата публикации за вки: 10.10.2006
Адрес дл переписки:
644007, г.Омск, Окт брьска , 92, Институт
ветеринарной медицины Ом ГАУ
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ YERSINIA
(57) Реферат:
Изобретение относитс к биотехнологии и
может быть использовано дл культивировани микроорганизмов,
накоплени биомассы
микроорганизмов,
а
также
приготовлени биопрепаратов.
Способ
предусматривает
приготовление м сопептонного агара, охлаждение
его до температуры 45-50 °С и внесение в него
экстракта головного мозга крупного рогатого
скота. Готов т экстракт путем экстрагировани измельченного головного мозга крупного рогатого
скота в водопроводной воде в течение 2 ч при
температуре 37°С, добавлением в него 0,5%-ного
раствора
хлорида
натри .
Изобретение
обеспечивает обильный рост культуры Yersinia и
позвол ет сократить сроки культивировани . 5
табл.
R U
2 3 0 0 5 6 0
ENTEROCOLITICA
Страница: 1
RU
C 2
C 2
2 3 0 0 5 6 0
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: РОЗАНОВ Н.И. Справочник по
микробиологической технике. - М.: 1957, с.46.
КОЗЛОВ Ю.А. Питательные среды в медицинской
микробиологии. - М.: МЕДГИЗ, 1950, с.199-202.
СИДОРОВ М.А., СКОРОДУМОВ Д.И., ФЕДОТОВ
В.Б. Определитель зоопатогенных
микроорганизмов. - М.: КОЛОС, 1995, с.153157. RU 2192472 С2, 10.11.2002. RU 2226398
С2, 10.04.2004. RU 2193061 C1, 20.11.2002.
(73) Патентообладатель(и):
Омский государственный аграрный университет
(RU)
R U
(45) Опубликовано: 10.06.2007 Бюл. № 16
RUSSIAN FEDERATION
RU
(19)
(11)
2 300 560
(13)
C2
(51) Int. Cl.
C12N 1/20 (2006.01)
C12Q 1/04 (2006.01)
C12R 1/00 (2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY,
PATENTS AND TRADEMARKS
(12)
ABSTRACT OF INVENTION
(21), (22) Application: 2005108115/13, 22.03.2005
(72) Inventor(s):
Pleshakova Valentina Ivanovna (RU),
Nalepova Marina Jur'evna (RU),
Trapeznikov Semen Viktorovich (RU),
Konev Aleksej Vladimirovich (RU)
(24) Effective date for property rights: 22.03.2005
(43) Application published: 10.10.2006
(73) Proprietor(s):
Omskij gosudarstvennyj agrarnyj universitet (RU)
Mail address:
644007, g.Omsk, Oktjabr'skaja, 92, Institut
veterinarnoj meditsiny Om GAU
ENTEROCOLITICA
addition
of
0.5%
sodium
chloride
solution.
Invention provides abundant growth of culture
Yersinia and allows reducing culturing time.
Invention
can
be
used
in
culturing
microorganisms, accumulation of microorganism
biomass and preparing biopreparations.
EFFECT: improved preparing method.
5 tbl, 4 ex
R U
2 3 0 0 5 6 0
C 2
C 2
(57) Abstract:
FIELD: biotechnology, microbiology.
SUBSTANCE: method involves preparing beefextract agar, its cooling to temperature 45-50°C and
addition of cattle brain extract to agar. Extract
is prepared by extraction of milled cattle brain
in tap water for 2 h at temperature 37°C with
Страница: 2
EN
2 3 0 0 5 6 0
(54) METHOD FOR PREPARING NUTRIENT MEDIUM FOR CULTURING YERSINIA
R U
(45) Date of publication: 10.06.2007 Bull. 16
RU 2 300 560 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Изобретение относитс к ветеринарной микробиологии и может быть использовано дл культивировани микроорганизмов, накоплени биомассы микроорганизмов, а также
приготовлени биопрепаратов (антигенов дл реакций агглютинации, непр мой
гемагглютинации).
Известно культивирование чистых культур микроорганизмов на обычных питательных
средах, в частности - на м сопептонном агаре (МПА) (Розанов Н.И. Справочник по
микробиологической технике. Москва, 1957, с.46). Данный метод основан на внесении в 1
л м сной воды 10 г пептона и 5 г поваренной соли. Компоненты питательной среды
нагревают до кипени в течение 30 секунд, устанавливают рН 7,2-7,4, добавл ют 30 г
агар-агара, нагревают до полного растворени и провер ют рН среды, фильтруют через
ватно-марлевый фильтр, затем среду стерилизуют при 120°С в течение 15-20 мин. Однако
известный способ имеет существенные недостатки: при выращивании чистых культур
микроорганизмов рода Yersinia на поверхности МПА наблюдают скудный рост Y.
enterocolitica и длительное культивирование (в течение 48-72 ч).
Выделение микроорганизмов и производство бактерийных препаратов завис т от
полноценного состава примененных питательных сред: это касаетс , прежде всего,
содержани в питательной среде пластического материала дл построени тела
микробных клеток, а также источников энергии.
Задачей изобретени вл етс повышение эффективности культивировани микроорганизмов рода Yersinia, способ осуществл етс путем приготовлени м сопептонного агара, его стерилизации и охлаждени , причем охлаждают до 45-50°С,
добавл ют в него экстракт головного мозга крупного рогатого скота в количестве 5-10
мас.%, полученный путем экстрагировани измельченного головного мозга крупного
рогатого скота в водопроводной воде в течение двух часов при 37°С, добавлением в него
0,5%-ного раствора хлорида натри и стерилизации в автоклаве в течение 15-20 минут
при 121°С, полученную питательную среду взбалтывают.
Предлагаемый метод позвол ет сократить сроки культивировани микроорганизмов в 22,5 раза и обеспечивает обильный рост культуры Yersinia.
Экстракт головного мозга крупного рогатого скота стимулирует рост бактерий за счет
содержани разнообразных веществ: белков, углеводов, липидов, минеральных и
экстрактивных веществ.
Химический состав нервной ткани очень сложный. В сером и белом веществе головного
мозга содержитс вода - 74,0-82,7; белки - 33,0-51,0; общий азот 2,06-3,19 и липиды 25,0-40,0 (Чечеткин А.В. и др. Биохими животных, М., 1982, с.493).
В сером веществе мозга присутствуют белки нейроглобулины и нейростромин, в составе
которых содержитс до 0,5% фосфора. Около 20-45% всех органических веществ дер
серого и белого вещества приходитс на долю нуклеиновых кислот. В нервной ткани
содержатс гликоген (100-150 мг%), глюкоза 150 мг%, пентозы, гликолипиды, которые
состо т из остатков глюкозы, галактозы, сфингозина, высших жирных кислот и
нейраминовой кислоты. Состав липидных веществ головного мозга отличаетс от их
состава в других органах и ткан х большим количеством фосфолипидов, холестерола и
холестеридов, цереброзидов и в небольшом количестве - глицеридов. Минеральные
вещества нервной ткани распределены в разных отделах нервной системы равномерно. В
массе головного мозга присутствуют К, Na, Са, Mg, Cu, Fe, Al, Zn, Mn, Co, P, Cl, I,
S. В нервной ткани содержатс азотистые и безазотистые низкомолекул рные вещества.
Из азотистых экстрактивных веществ присутствуют креатин, фосфокреатин, АТФ и АДФ,
свободные аминокислоты, холин, ацетилхолин, серотонин, аминомасл на кислота,
мочева кислота, глютамин, гистамин, аспарагин и др. К безазотистым экстрактивным
веществам относ т глюкозу, инозит, лактат, пируват, триозо- и гексозофосфаты.
Таблица 1
Сравнительные показатели минерального состава тканей скелетной мускулатуры и головного мозга
Содержание химических элементов, мг% к сырой массе
Скелетна мускулатура
Na
65-150
150-220
К
250-400
290-340
Страница: 3
DE
Головной мозг
RU 2 300 560 C2
Са
4-9
8-10
Mg
2,2-2,8
14-17
Cl
60-70
108-222
Р
18
7
S
6
10
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Таким образом, вышесказанное свидетельствует о том, что головной мозг крупного
рогатого скота содержит больше разнообразных минеральных, экстрактивных веществ,
белков, углеводов и липидов, чем скелетна мускулатура.
Описание опыта
Культуры Y. enterocolitica серовариантов 0:3 и 0:9 выращивали в чашках Петри на
поверхности питательного агара, содержащего 10% экстракта головного мозга крупного
рогатого скота, инкубировали аэробно при +28°С.
Питательный агар готовили согласно инструкции, указанной на флаконе (дата
изготовлени 06.2002. Парти №103. Ярославска обл., г.Углич, OOO «БиоКомпас-С». ТУ
10-02-02-789-176-94).
Экстракт головного мозга готовили по следующей методике: свежий, очищенный от
оболочек головной мозг крупного рогатого скота массой 200 г нарезали кубиками и
пропускали через насадку (диаметр отверстий 5 мм) бытовой м сорубки, смешивали с
двукратным объемом водопроводной воды. С целью экстрагировани в течение двух часов
полученную кашицу инкубировали при +37°С.
Экстракт фильтровали через ватно-марлевый фильтр в чистый флакон и добавл ли в
качестве буфера 0,5%-ный раствор хлорида натри до 400 мл (рН 7,0-7,2). После чего
флакон с экстрактом головного мозга помещали в автоклав при 121°С на 15-20 мин.
Соединение компонентов экспериментальной питательной среды осуществл ли с
соблюдением асептики в стерильном боксе: 100 мл питательного агара охлаждали до 4550°С, после чего стерильной пипеткой вносили 10 мл экстракта головного мозга.
На экспериментальную среду высевали взвеси Y. enterocolitica серовариантов 0:3 и 0:
9 в разведении 10 5 с исходной концентрацией 1 млрд. м.т., приготовленные на 0,5-0,55%ном растворе хлорида натри . На поверхность агаровой пластинки наносили взвесь
иерсиний в объеме 0,4 мл и растирали по поверхности шпателем.
Результаты роста учитывали после инкубировани посевов при температуре 28°С в
течение 24 ч, сравнива образовавшиес колонии иерсиний в опытных и контрольных
чашках Петри (МПА без экстракта мозга).
Биохимические свойства культур Y. enterocolitica серовариантов 0:3 и 0:9,
выращенные на опытной и контрольной средах, сравнивали, использу набор
биохимических тестов (Энтеробактерии. Руководство дл врачей, под ред. Покровского
В.И. Москва, 1985, с.226).
Пример 1. Подбор оптимальной температуры МПА
МПА готовили согласно инструкции, после чего в среду вносили экстракт головного
мозга при различных температурных режимах.
Экспериментально установлено, что при температуре ниже 45-50°С МПА приобретает
плотную консистенцию и не смешиваетс с экстрактом, а при 50-55°С и 55-60°С МПА
сохран ет жидкую консистенцию и при внесении в среду экстракта образуютс серо-белые
хлопь вследствие свертывани белков.
Поэтому считаем, что оптимальна температура МПА дл смешивани с экстрактом
головного мозга вл етс 45-50°С.
Пример 2. Соотношение компонентов питательной среды
Изучение характера роста иерсиний на питательной среде проводили при следующих
соотношени х экстракта к МПА: 1/100, 5/100, 10/100, 15/100, 20/100 и 0/100 (контроль).
Таблица 2
Подбор количества экстракта головного мозга в МПА
Страница: 4
RU 2 300 560 C2
Содержание экстракта Компоненты питательной
головного мозга, %
среды
Морфологическа характеристика колоний Y. Enterocolitica
МПА, Экстракт головного
мл
мозга, мл
5
10
15
20
25
30
1
100
1
мелкие (0.3-0,5 мм), серо-белые, непрозрачные, с ровными кра ми и блест щей,
гладкой поверхностью
5
100
5
сочные, выпуклые, непрозрачные, серо-белые колонии, диаметром 2-6 мм, с
ровными кра ми и блест щей, гладкой поверхностью
10
100
10
сочные, выпуклые, непрозрачные, серо-белые колонии, диаметром 2-6 мм, с
ровными кра ми и блест щей, гладкой поверхностью
15
100
15
сочные, выпуклые, непрозрачные, серо-белые колонии, диаметром 2-6 мм, с
ровными кра ми и блест щей, гладкой поверхностью
20
100
20
сочные, выпуклые, непрозрачные, серо-белые колонии, диаметром 2-6 мм, с
ровными кра ми и блест щей, гладкой поверхностью
0 (контроль)
100
-
мелкие (0.3-0,5 мм), серо-белые, непрозрачные, с ровными кра ми и блест щей,
гладкой поверхностью
Из таблицы 2 видно, что при внесении 1 мл (1 мас.%) экстракта в 100 мл МПА скорость
и характер роста микроорганизмов существенно не отличались от контрол . Так, через 48
часов на поверхности МПА с экстрактом иерсиний формировали мелкие (0,3-0,5 мм), серобелые, непрозрачные колонии округлой формы с блест щей, гладкой поверхностью и
ровными кра ми.
При внесении в 100 мл МПА 5-10 мл (5-10 мас.%) экстракта наблюдали обильный рост
иерсиний через 20-24 часа инкубации. Иерсинии формировали сочные, выпуклые,
непрозрачные, серо-белые колонии, диаметром от 2 до 6 мм, с ровными кра ми и
блест щей, гладкой поверхностью. В дальнейшем при увеличении содержани экстракта в
МПА до 20 мл (20 мас.%) скорость и характер роста иерсиний не отличались от
показателей предыдущего варианта (табл.2).
Таким образом, оптимальное содержание экстракта головного мозга в МПА составл ет
5-10 мас.% или 5-10 мл в 100 мл МПА.
Пример 3. Экспозици и температурный режим экстрагировани головного мозга
Экстрагирование измельченного головного мозга крупного рогатого скота проводили при
температуре 25, 37 и 45°С в термостате в течение 1, 2 и 4 часов. Затем
профильтрованный экстракт вносили в МПА, после чего сравнивали количество колоний
иерсиний, образовавшихс через 20-24 часа инкубировани в термостате при 28°С на
поверхности известной (контроль) и предлагаемой (с экстрактом мозга) питательной
среды (табл.3).
Таблица 3
Количество колоний иерсиний на экспериментальной среде при различных режимах
35
40
45
50
Температура экстрагировани , °С
Экспозици , час
1
2
4
25
98
119
127
37
135
Сплошной рост
Сплошной рост
45
141
123
117
В контрольных чашках Петри (без экстракта) образовалось 84 колоний Y. enterocolitica.
Экспериментально установлено, что количество колоний иерсиний, образовавшихс на
поверхности питательной среды с экстрактом головного мозга, полученного при
экстрагировании в течение 1-4 часов при 25°С, существенно не отличалось от контрол и
составл ло 98, 119 и 127 колоний соответственно.
На поверхности экспериментальной среды с экстрактом головного мозга, полученного
путем экстрагировани при 37°С в течение часа, образовалось 135 колоний, а при
экстрагировании в течение 2-4 часов отмечали сплошной рост Y. enterocolitica.
В дальнейшем при увеличении температуры экстрагировани до 45°С в течение 1, 2 и
4 часов количество колоний иерсиний, образовавшихс на поверхности питательной среды
с экстрактом головного мозга, уменьшалось до 141, 123 и 117 соответственно.
Таким образом, оптимальный режим дл получени экстракта головного мозга крупного
рогатого скота вл етс экспозици 2 часа при 37°С.
Пример 4. Сравнение культурально-биохимических свойств иерсиний при известном и
Страница: 5
RU 2 300 560 C2
5
10
предлагаемом способе
На поверхности МПА с экстрактом головного мозга через 18 ч инкубировани отмечали
формирование единичных колоний, через 20-24 ч культуры иерсиний образовывали
сочные, выпуклые, непрозрачные, серо-белые колонии с ровными кра ми и блест щей,
гладкой поверхностью, диаметром до 6 мм. При этом колонии иерсиний сероварианта 0:9
были крупнее (4-6 мм), чем колонии иерсиний сероварианта 0:3 (2-4 мм). Через 36 ч
культивировани кра колоний иерсиний соедин лись, образу сплошной рост на
поверхности экспериментальной среды (табл.4, 5).
Таблица 4
Морфологическа характеристика колоний и биохимические свойства Y. Enterocolitica серовариантов 0:3 и 0:9
Прототип (культивирование иерсиний на питательном агаре)
Предлагаемый способ (культивирование иерсиний на
питательном агаре с экстрактом головного мозга)
Y. enterocolitica
Y. enterocolitica
0:3
0:9
0:3
0:9
Морфологи колоний
мелкие (0,3-0,5 мм),
серо-белые,
непрозрачные, с ровными
кра ми и блест щей,
гладкой поверхностью
мелкие (0,3-0,5 мм),
серо-белые,
непрозрачные, с ровными
кра ми и блест щей,
гладкой поверхностью
сочные, выпуклые,
непрозрачные, серо-белые
колонии, диаметром 2-4 мм,
с ровными кра ми и
блест щей, гладкой
поверхностью
сочные, выпуклые,
непрозрачные, серо-белые
колонии, диаметром 4-6 мм,
с ровными кра ми и
блест щей, гладкой
поверхностью
Глюкоза
+
+
+
+
Сахароза
+
+
+
+
15
Биохимические тесты
20
25
30
35
40
45
50
Лактоза
-
-
-
-
Сорбит
+
+
+
+
Галактоза
+
+
+
+
Мальтоза
+
+
+
+
Рамноза
-
-
-
-
Раффиноза
-
-
-
-
D-арабиноза
-
-
-
-
Желатин
-
-
-
-
Маннит
+
+
+
+
Цитохромоксидаза
-
-
-
-
Нитратредуктаза
+
+
+
+
Каталаза
+
+
+
+
Подвижность
+
+
+
+
Фенилаланиндезаминаза
-
-
-
-
Аргениндегидролаза
-
-
-
-
Лизиндекарбоксилаза
-
-
-
-
Индол
-
-
-
-
Сероводород
-
-
-
+
Уреаза
+
+
+
Цитрат Симмонса
-
-
-
-
Ацетат натри -
+
-
+
Реакци ФогесаПроскауэра
+
+
+
+
Реакци с метиловым
красным
+
+
+
+
В контроле (МПА без экстракта головного мозга) формирование мелких (0,3-0,5 мм),
серо-белых, непрозрачных колоний Y. enterocolitica с ровными кра ми и блест щей,
гладкой поверхностью наблюдали через 48 ч (табл.5).
В окрашенных по Граму мазках, приготовленных из колоний иерсиний, выросших на
экспериментальной и контрольной среде, Yersinia enterocolitica представл ли мелкие
грамотрицательные палочки с закругленными концами.
При изучении подвижности Y. enterocolitica выделенные культуры засевали в
полужидкий агар и культивировали при 28°С в течение 48 часов. О наличии подвижности
иерсиний свидетельствовало помутнение среды в пробирках. Культуры иерсиний уже в
первые сутки ферментировали глюкозу, сахарозу, сорбит, галактозу, мальтозу, маннит;
обладали ферментами нитратредуктазой, каталазой и не расщепл ли D-арабинозу,
рамнозу, раффинозу, лактозу, не разжижали желатин; не обладали энзимами оксидазой,
Страница: 6
RU 2 300 560 C2
5
аргининдегидролазой, фенилаланиндезаминазой, триптофандезаминазой,
лизиндекарбоксилазой; не продуцировали сероводород. Мочевину ферментировали в
течение 24 часов при 28°С. Y. enterocolitica не утилизировали натри цитрат, а ацетат
натри использовали микроорганизмы сероварианта 0:9. Реакци Фогеса-Проскауэра и с
метиловым красным при 28°С положительна.
Экспериментально установлено, что иерсинии, выращенные на МПА и МПА с экстрактом
головного мозга не отличаютс по биохимическим свойствам, что позвол ет рекомендовать
предлагаемую среду дл накоплени биомассы иерсиний.
Таблица 5 Сравнительна таблица сроков культивировани Y. enterocolitica
10
Врем культивировани , час
Способ
Известный (МПА), кол-во колоний Предлагаемый (МПА с экстрактом головного мозга), кол-во колоний
15
20
25
30
35
40
12
-
16
-
-
18
-
7
20
-
145
24
-
254
36
6
Сплошной рост
48
99
Сплошной рост
Данные таблицы 5 доказывают, что количество колоний иерсиний на предлагаемой
питательной среде увеличиваетс , а срок по влени колоний Y. enterocolitica
сокращаетс в 2-2,5 раза
Таким образом, предлагаема питательна среда дл накоплени биомассы
микроорганизмов позвол ет:
1) выращивать микроорганизмы;
2) получать обильный рост культур микроорганизмов;
3) выдел ть чистые культуры микроорганизмов посевом на МПА с добавлением 5-10
мас.% экстракта головного мозга крупного рогатого скота;
4) использовать полученную биомассу микроорганизмов дл приготовлени биопрепаратов;
5) длительно сохран ть свежевыделенные и производственные культуры;
6) сократить сроки культивировани в 2-2,5 раза.
Формула изобретени Способ получени питательной среды дл культивировани Yersinia enterocolitica,
предусматривающий приготовление м сопептонного агара, его стерилизацию и
охлаждение, отличающийс тем, что м сопептонный агар охлаждают до 45-50°С,
добавл ют в него экстракт головного мозга крупного рогатого скота в количестве 5-10
мас.%, полученный путем экстрагировани измельченного головного мозга крупного
рогатого скота в водопроводной воде в течение двух часов при 37°С добавлением в него
0,5%-ного раствора хлорида натри и стерилизации в автоклаве в течение 15-20 мин при
121°С полученную питательную среду взбалтывают.
45
50
Страница: 7
CL
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
2
Размер файла
96 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа