close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

рекомбинантная плазмида psvh0106, обеспечивающая синтез gl7aca-ацилазы в клетках escherichia coli, и рекомбинантный штамм escherichia coli bl21(de3)/psvh0106-продуцент gl7aca-ацилазы

код для вставки
РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
RU
(19)
(11)
2 300 566
(13)
C2
(51) МПК
C12N
C12N
C12N
C12R
15/55 (2006.01)
15/70 (2006.01)
1/21 (2006.01)
1/19 (2006.01)
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
(21), (22) За вка: 2005120603/13, 04.07.2005
(72) Автор(ы):
Хатунцева Светлана Анатольевна (RU),
Эльдаров Михаил Анатольевич (RU),
Зейналов Орхан Ахмед оглы (RU),
Скр бин Константин Георгиевич (RU)
(24) Дата начала отсчета срока действи патента:
04.07.2005
(45) Опубликовано: 10.06.2007 Бюл. № 16
(73) Патентообладатель(и):
Центр "Биоинженери " РАН (RU)
(54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pSVH0106, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ Gl7ACA-
2 3 0 0 5 6 6
E.coli предложенной рекомбинантной плазмидой и
селекции трансформированных клонов получен
новый
рекомбинантный
штамм
E.coli
ВL21(DЕ3)/рSVН0106-продуцент Gl7ACA-ацилазы,
обеспечивающий
высокий
выход
активного
фермента. Благодар эффективной и стабильной
экспрессии рекомбинантной Gl7АСА-ацилазы в
предложенной системе применение насто щего
изобретени позвол ет масштабировать процесс
получени данного
фермента,
широко
используемого в производстве антибиотиков. 2 с.п.
ф-лы, 4 ил., 2 табл.
R U
(57) Реферат:
Насто щее изобретение относитс к области
биотехнологии, в частности к генетической
инженерии, и может быть использовано в
микробиологической
промышленности
при
получении
полусинтетических
бета-лактамных
антибиотиков нового поколени . Сконструирована
рекомбинантна плазмида pSVH0106, содержаща природную последовательность гена ацилазы
глутарил-7-аминоцефалоспориновой кислоты
штамма Brevundimonas diminuta BKM В-1297,
котора кодирует полноразмерный предшественник
фермента. В результате трансформации штамма
Страница: 1
RU
C 2
C 2
АЦИЛАЗЫ В КЛЕТКАХ Escherichia coli, И РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ Escherichia coli
BL21(DE3)/pSVH0106-ПРОДУЦЕНТ Gl7ACA-АЦИЛАЗЫ
2 3 0 0 5 6 6
Адрес дл переписки:
117312, Москва, пр. 60- Окт бр , 7, корп.1,
Центр "Биоинженери " РАН
R U
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: ЕР 0469919 А, 05.02.1992. ISHIYE М.,
NIWA M., Biochim. Biophys. Acta, 1132, 233239,1992. ЕР 0496993 В, 05.08.1992.
C 2
C 2
2 3 0 0 5 6 6
2 3 0 0 5 6 6
R U
R U
Страница: 2
RUSSIAN FEDERATION
(19)
RU
(11)
2 300 566
(13)
C2
(51) Int. Cl.
C12N
C12N
C12N
C12R
15/55 (2006.01)
15/70 (2006.01)
1/21 (2006.01)
1/19 (2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY,
PATENTS AND TRADEMARKS
(12)
ABSTRACT OF INVENTION
(21), (22) Application: 2005120603/13, 04.07.2005
(72) Inventor(s):
Khatuntseva Svetlana Anatol'evna (RU),
Ehl'darov Mikhail Anatol'evich (RU),
Zejnalov Orkhan Akhmed ogly (RU),
Skrjabin Konstantin Georgievich (RU)
(24) Effective date for property rights: 04.07.2005
(45) Date of publication: 10.06.2007 Bull. 16
(73) Proprietor(s):
Tsentr "Bioinzhenerija" RAN (RU)
2 3 0 0 5 6 6
this enzyme used broadly in manufacturing antibiotics.
EFFECT: valuable properties of plasmid.
2 cl, 4 dwg, 2 tbl, 9 ex
R U
(57) Abstract:
FIELD:
biotechnology,
genetic
engineering,
biochemistry, antibiotics.
SUBSTANCE: invention proposes a constructed
recombinant plasmid pSVH0106 comprising the
natural gene sequence for acylase of glutaryl-7aminocephalosporinic
acid
of
the
strain
Brevundimonas diminuta BKM B-1297 that encodes a
full-scale
enzyme
precursor.
As
result
of
transformation
of
E.
coli
strain
with
the
proposed recombinant plasmid and selection of
transformed clones the novel strain of E. coli
BL21(DE3)/pSVH0106 is obtained that represents a
producer of G17ACA acylase providing high yield
of active enzyme. Owing to the effective and
stable expression of recombinant G17ACA acylase
in the proposed system using the proposed
invention allows scaling a process for preparing
Страница: 3
EN
C 2
C 2
Escherichia coli CELLS, RECOMBINANT STRAIN OF Escherichia coli BL21(DE3)/pSVH0106 AS
PRODUCER OF Gl7ACA ACYLASE
2 3 0 0 5 6 6
(54) RECOMBINANT PLASMID pSVH0106 PROVIDING SYNTHESIS OF Gl7ACA ACYLASE IN
R U
Mail address:
117312, Moskva, pr. 60-ja Oktjabrja, 7,
korp.1, Tsentr "Bioinzhenerija" RAN
RU 2 300 566 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Насто щее изобретение относитс к области биотехнологии, в частности к генетической
инженерии, и может быть использовано в микробиологической промышленности при
получении полусинтетических бета-лактамных антибиотиков нового поколени .
Предлагаетс рекомбинантна плазмида pSVH0106, содержаща фрагмент ДНК,
который кодирует полную аминокислотную последовательность ацилазы глутарил-7аминоцефалоспориновой кислоты штамма Brevundimonas diminuta BKM В-1297, и
обеспечивающа высокий уровень ее экспрессии в клетках Escherichia coli, и
рекомбинантный штамм E.coli BL21(DE3)/pSVH0106- продуцент Gl7АСА-ацилазы
Уровень техники
Важнейшим соединением-предшественником дл получени антибиотиков из семейства
цефалоспоринов вл етс 7-аминоцефалоспоринова кислота (7-АСА) [1]. Конверси цефалоспорина С в 7-АСА может осуществл тьс либо путем химического гидролиза,
требующего использовани крайне токсичных соединений и специальных условий
инкубации при сверхнизких температурах, либо за счет энзиматического превращени .
Известные процессы энзиматической трансформации могут быть разделены на 2 группы: а)
одностадийные с использованием, например, цефалоспорин С-ацилазы из Pseudomonas[2]
и б)двустадийные, включающие превращение цефалоспорина С в глутарил-7-АСА
(Gl7ACA) с использованием фермента оксидазы D-аминоксилот (DAO; ЕС-1.4.3.3), в
частности получаемой из Trigonopsis variabilis, Aspergillus, Penicillium, Neurospora,
Pseudomonas, Cephalosporium, и последующий гидролиз глутарил-7-АСА с образованием 7АСА либо под действием специфической 7-бета-(4-карбоксилбутанамино) ацилазы
(Gl7АСА-ацилазы) [3], либо под действием ферментов других классов, относ щихс к
гамма-глутамил-траснферазам или цефалоспорин-С-деацетилазам [4].
Наибольший практический интерес дл биокаталитического синтеза 7-АСА представл ет
фермент Cl7АСА-ацилаза [5], относ щийс к обширному семейству пенициллин-амидаз (ЕС
3.5.1.11), способных превращать пенициллины и цефалоспорины в ценные промежуточные
соединени , используемые дл производства новых антибиотиков [6,7]. Gl7АСА-ацилазы
представл ют собой гетеротетрамеры, состо щие из 2-х ? и 2-х ? субьединиц [8] и
характеризуютс высокой активностью по отношению к Gl7ACA при низкой активности по
отношению к цефалоспорину С[3].
К насто щему времени известны первичные структуры генов бактериальных Gl7АСАацилаз из различных штаммов Pseudomonas, описаны рекомбинантные плазмидные ДНК,
обеспечивающие синтез этих ферментов в клетках E.coli и Bacillus subtilis, а также
способы получени рекомбинантных форм ферментов с их использованием [4, 8-14].
Общими недостатками известных методов гетерологичной экспрессии Gl7ACA-ацилаз
вл ютс невысокий уровень синтеза рекомбинантного продукта [15] и во многом
св занные с этим сложности процессов масштабировани ферментации штаммов [16,17], а
также необходимость освобождени полученных препаратов Gl7АСА-ацилаз от примесей
неспецифических бета-лактамаз [3]. В св зи с этим актуальной остаетс задача
разработки новых средств, обеспечивающих повышение выхода Gl7АСА-ацилазы при
получении ее технологией рекомбинантных ДНК и упрощение методов очистки этих
ферментов.
Раскрытие изобретени Решение задачи повышени выхода активной рекомбинантной Gl7АСА-ацилазы
предполагает идентификацию бактериальных штаммов, эффективно синтезирующих в
естественных услови х этот фермент, выделение из них кодирующих фермент генов и
создание оптимальных векторных конструкций дл их эффективной и стабильной
экспрессии в гетерологичной бактериальной клетке. Эти аспекты и составили цель
предлагаемого изобретени .
Поставленна цель была достигнута за счет того, что
1) в коллекции микроорганизмов обнаружен штамм (Brevundimonas diminuta BKM В1297), активно продуцирующий Gl7АСА-ацилазу (BrdGl7ACA);
2) из этого штамма получен ген Gl7АСА-ацилазы и определена последовательность
Страница: 4
DE
RU 2 300 566 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
ДНК, кодирующа полную аминокислотную последовательность фермента;
3) сконструирована рекомбинантна плазмидна ДНК pSVH0106, обеспечивающа синтез BrdGl7ACA в клетках кишечной палочки с высоким выходом;
4) в результате трансформации клеток экспрессирующей плазмидой pSVH0106 получен
рекомбинантный штамм Escherichia coli BL21(DE3)/ pSVH0106 с высоким уровнем
индуцибельного синтеза активной Gl7АСА-ацилазы.
Штамм Brevundimonas diminuta ВКМ В-1297 депонирован ранее во Всероссийской
коллекции микроорганизмов и отобран нами как наиболее активный продуцент Gl7ACAацилазы (BrdGl7ACA).
Полна кодирующа последовательность гена BrdGl7ACA получена методом
полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием в качестве матрицы хромосомной
ДНК, выделенной из штамма Brevundimonas diminuta ВКМ В-1297, а в качестве праймеров синтетических олигонуклеотидов с нуклеотидными последовательност ми SEQ ID №12
(праймер 7-aca-F) и SEQ ID№13 (праймер 7-aca-R), специфичными по отношению к N- и Сконцевым област м кодирующей части (от положени 103 до положени 2265)
изолированного фрагмента гена BrdGL7ACA с SEQ ID N06.
Данна последовательность кодирует белок размером 74кДа (SEQ ID N0 7),
обладающий высокой степенью гомологии с другими известными предшественниками
бактериальных Gl7ACA-ацилаз, и включает N-концевую сигнальную последовательность
секреции и последовательность, кодирующую две субъединицы фермента, разделенные
спейсерным пептидом.
На первом этапе создани рекомбинантной плазмиды дл экспрессии фрагмента ДНК,
кодирующего Gl7ACA-ацилазу, был сконструирован вектор-носитель рАСТ7, физическа и
генетическа карты которого представлены на фиг.3. Данный вектор включает промотор и
терминатор РНК-полимеразы фага Т7, разделенные участком полилинкера, репликон p15A
и kanR-ген, кодирующий аминогликозид-3-фосфотрансферазу и обеспечивающий
устойчивость клеток E.coli, несущих плазмиду, к канамицину. Использование в качестве
маркера гена устойчивости к канамицину, а не традиционно примен емого в подобных
конструкци х гена устойчивости к ампициллину, освобождает от необходимости
последующей сложной очистки целевого белка дл удалени примесей бета-лактамаз.
Экспрессирующа рекомбинантна плазмида pSHV0106 получена путем встраивани кодирующей последовательности гена BrdGl7ACA в вектор рАСТ7 по сайтам рестрикции
EcoRI и Sac I (фиг.4).
Рекомбинантный штамм-продуцент BrdGL7ACA был получен путем трансформации
клеток Escherichia coli BL21(DE3) сконструированной плазмидой pSVH0106. Выбор штаммареципиента обусловлен тем, что он несет ген РНК-полимеразы фага Т7, котора необходима дл обеспечени эффективной транскрипции целевых генов, наход щихс в
векторной конструкции под контролем промотора фага Т7, а также тем, что данный штамм
дефектен по синтезу протеаз, что существенно повышает выход синтезируемых
гетерологичных белков. Синтез BrdGL7ACA в штамме BL21(DE3)/ pSVH0106
осуществл етс при культивировании на обычных селективных средах с добавлением
индуктора изопропил-D-тиогалактозида (ИПТГ) или лактозы.
Полученный рекомбинантный штамм Escherichia coli BL21(DE3)/ pSVH0106
характеризуетс высокой физиологической стабильностью (снижение активности
продуцируемого фермента после 50 генераций не превышает 20%) и высоким выходом
активного продукта, который не менее чем в 1,5 раза превышает продуктивность
известных штаммов.
Таким образом, насто щее изобретение включает два объекта.
Первым объектом вл етс рекомбинантна плазмида pSVH0106, обеспечивающа синтез ацилазы глутарил-7-аминоцефалоспориновой кислоты (Gl7ACA-ацилазы) в клетках
Escherichia coli, котора характеризуетс тем, что содержит фрагмент ДНК с
нуклеотидной последовательностью SEQ ID №6 от нуклеотида в положении 103 до
нуклеотида в положении 2265, кодирующий полную аминокислотную последовательность
Страница: 5
RU 2 300 566 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Gl7ACA-ацилазы штамма Brevundimonas diminuta ВКМ В-1297, встроенный по сайтам
рестрикции EcoRI и SacI в область полилинкера вектора рАСТ7, состо щего из фрагмента
модифицированной в области полилинкера плазмиды рЕТ21d, содержащего промотор и
терминатор РНК-полимеразы фага Т7, разделенные участком полилинкера, и фрагмента
плазмиды рСYC117, содержащего репликон р15А и ген устойчивости к канамицину,
объединенных между собой, как показано на фиг 3.
Второй объект изобретени - рекомбинантный штамм Escherichia coli BL21(DE3)/
pSVH0106-продуцент BrdGL7ACA.
Технический результат, достигаемый при осуществлении насто щего изобретени ,
заключаетс в создании новых средств (вектора экспрессии и рекомбинантного штамма),
обеспечивающих повышение количества (выхода) и качества (отсутствие примесей беталактамазы) получаемой рекомбинантной Gl7ACA-ацилазы.
Особенности насто щего изобретени по сн ютс лучшими вариантами его выполнени со ссылками на фигуры.
Краткое описание фигур.
Фиг.1 Сравнение нуклеотидных последовательностей центральной кодирующей части
гена Gl7ACA штамма Brevundimonas diminuta ВКМ-1267 (Query) и гомологичного участка
гена глутарил ацилазы Pseudomonas SY-77 (Sbjct) с помощью программы BLAST. Степень
сходства последовательностей составл ет 98%.
Фиг.2а и 2б Сравнение аминокислотных последовательностей известных Gl7ACA ацилаз
из Pseudomonas sp.130 (AAC34685), Pseudomonas sp.SY-77 (AAN39264), Pseudomonas
sp.THA1 (AAP68796) c последовательностью BrdGl7ACA. Степень сходства
последовательностей составл ет 98%.
Фиг.3 Физическа и генетическа карты вектора pACT7. Обозначены положени индикаторных сайтов рестрикции, участки промотора и терминатора РНК-полимеразы фага
Т7 (Т7пром и Т7 терм), область начала репликации (p15Aori), ген устойчивости к
канамицину (обозначен KN(R), заполнение черным).
Фиг.4 Физическа и генетическа карты плазмиды pSVH0106. Обозначено положение
гена BrdGl7ACA, (заполнение серым), остальные обозначени - как на Фиг.3.
Осуществление изобретени При осуществлении изобретени помимо методов, подробно раскрытых в
нижеследующих примерах, использовали хорошо известные специалистам методики,
описанные в руководствах по молекул рной биологии и генетической инженерии [18, 19].
Пример 1. Идентификаци штамма Brevundimonas с высоким уровнем биосинтеза
Gl7ACA-ацилазы
Культуры изол тов различных штаммов лабораторной коллекции выращивали в колбах
Эрленмейера объемом 100 мл в 15 мл среды, содержащей 2% гидролизат казеина, 0,5%
глутамат натри , 0,5% дрожжевой экстракт, 0,2% кукурузный экстракт, 0,1% глутарова кислота (рН 8,2) при 28°С и посто нном перемешивании (150 об/мин) в течение 16 часов.
Когда плотность культуры достигала величины 2 ОЕ при длине волны 600 нм, клетки
собирали центрифугированием (6000 об/мин; 10 мин; +4°С), промывали в буфере ТЕ (50
мМ Tris pH 8,0 50 mM EDTA), суспендировали в том же буфере (0.1 г влажных клеток на
200 мкл буфера) и хранили до использовани в замороженном виде.
В каждом из полученных образцов определ ли глутарил-ацилазную активность, дл чего
использовали колориметрический метод, аналогичный методу, предложенному дл определени 6-аминопенициллиновой кислоты [20]. Дл этого 100 мкл 65 mM раствора
глутарил-7-АСА в 0.1M фосфатном буфере (рН 7,0) добавл ют к 900 мкл суспензии клеток,
приготовленной на том же (0.1M фосфатном) буфере, содержащем 3 мг/мл клавулината
кали , и инкубируют смесь при 37°С от 30 мин до 4 часов. Через определенные промежутки
времени смесь центрифугируют, отбирают 500 мкл супернатанта и смешивают его с 3 мл
смеси (2:1) 20% уксусной кислоты и 0,5 М раствора NaOH дл остановки реакции. К пробе
добавл ют 0.5 мл p-диметиламинобензальдегида (PDAB) и после развити окраски
измер ют поглощение при 415 нм. За одну единицу активности фермента принимаетс его
Страница: 6
RU 2 300 566 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
количество, необходимое дл превращени 1 мкмоль субстрата в указанных услови х в
течение 1 мин инкубации.
Уровень определенной таким образом ацилазной активности в 64 проанализированных
штаммах колебалс от 0,01ед/л до примерно 4 ед/л культуры. Наиболее высокой
активностью обладали штаммы Brevundiminas diminuta ВКМ B-1297 и Brevundimonas
vesicularis ВКМ B-974-, полученные из Всероссийской коллекции микроорганизмов. Штамм
Brevundimonas diminuta ВКМ B-1297 был отобран дл дальнейшей работы.
Пример 2. Получение хромосомной ДНК из штамма Brevundimonas diminuta ВКМ B-1297
К 200 мкл суспензии клеток штамма B.diminuta ВКМ В-1297, полученной, как описано в
примере 1, добавл ют 10% SDS до конечной концентрации 2% и 20 мкл протеиназы К (3000
ед /мл) и инкубируют сначала 30 мин при 37°С, а затем 15 мин при 75°С. К суспензии
добавл ют 200 мкл промытых кислотой стекл нных бус (диаметром 0,1 мм) и подвергают
интенсивному встр хиванию на вортексе в течение 5 минут. Затем к суспензии добавл ют
300 мкл насыщенного буфером ТЕ раствора фенола и встр хивают на вортексе 30 сек.
Смесь центрифугируют, супернатант отбирают и дважды экстрагируют водонасыщенным
раствором хлороформа. Водную фазу отбирают и добавл ют 5М раствор ацетата кали (рН 6,0) до конечной концентрации 1,5 М. Раствор центрифугируют и отбрасывают осадок
калиевой соли SDS. К супернатанту добавл ют равный объем изопропанола. Осадок
нуклеиновых кислот собирают центрифугированием, раствор ют в 300 мкл 0,5 М ацетата
кали , повторно осаждают добавлением 3 объемов этанола и раствор ют в 100 мкл
деионизованной воды при нагревании в течение 30 мин при 65°. Полученную данным
способом хромосомную ДНК штамма Brevundiminas diminuta ВКМ B-1297 использовали дл получени гена, кодирующего Gl7ACA- ацилазу.
Пример 3. Выделение центрального фрагмента гена BrdGl7ACA
Предварительно было проведено сравнение аминокислотных и нуклеотидных
последовательностей бактериальных Gl7ACA-ацилаз с использованием информации,
доступной с помощью Интернет на сайте Национального Центра Биотехнологической
Информации США. Были вы влены наиболее консервативные участки GL7ACA-ацилаз
бактериального происхождени и синтезированы два синтетических олигонуклеотида brd1
(SEQID N01) и brd2 (SEQ ID N02), ограничивающие центральную кодирующую
последовательность гена Gl7ACA-ацилазы:
Дл осуществлени ПЦР хромосомную ДНК Brevundiminas diminuta ВКМ B-1297,
выделенную, как описано выше, денататурируют путем нагревани при 100°С в течение 5
минут, помещают в лед, подвергают 30 циклам в 50 мкл смеси следующего состава:
5 мкл 10-кратного Taq-SE ПЦР-буфера (Сибэнзим)
5 мкл геномной ДНК (200 нг/мкл)
5 мкл 3 мкМ праймера brd1
5 мкл 3 мкМ праймера brd2
5 мкл 2,5 мМ dNTP (смесь всех четырых видов дезоксинуклеотидтрифосфатов)
25 мкл деионизованной воды
1 мкл Taq-SE полимеразы (5 ед/мкл, Сибэнзим)
Услови проведени реакции: 94°, 5' (денатураци ), 94°, 30'', 50°, 30'', 72°,1'
(амплификаци ). После амплификации 5 мкл ПЦР смеси анализируют электрофорезом в
1% агарозном геле. При разделении в электрофорезе идентифицировали гомогенный
фрагмент размером около 1 тпн. Фрагмент выдел ли из гел с помощью набора Wizard
PCR Preps Kit (Promega, США) (в соответствии с инструкцией производител ) и
подвергали автоматическому секвенированию на приборе ABIPrizm 3100 DNA Sequencer с
использованием праймеров brd1, brd2 и набора Applera "fluorescent Big dye Cycle
sequencing kit".
Сравнение полученной нуклеотидной последовательности с базой данных GenBank с
помощью программы BLAST показало, что она обладает высокой степенью гомологии с
соответствующими кодирующими последовательност ми других бактериальных Gl7ACАацилаз (фиг 1). На этом основании был сделан вывод, что полученный фрагмент
Страница: 7
RU 2 300 566 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
соответствует центральной части гена Brd Gl7ACA - ацилазы штамма Brevundiminas
diminuta ВКМ B-1297.
Пример 4. Получение, секвенирование и анализ фрагмента ДНК, включающего полную
кодирующую последовательность гена BrdGl7ACA
Фрагмент ДНК, включающий полную кодирующую последовательность, получают с
помощью ПЦР-амплификации с праймерами (BrdGl7ACA_F с SEQID N03 и BrdGl7ACA_R с
SEQ ID N04), специфичными к консервативным участкам, фланкирующим полные
кодирующие последовательности известных генов Gl7ACA-ацилаз псевдомонад.
1 мкг геномной ДНК подвергают 25 циклам ПЦР-амплификации с праймерами
BrdGl7ACA_F / BrdGl7ACA_R и использованием набора Expand Long Template PCR system
("Roche Diagnostics GmbH", Mannheim, Германи ) в соответствии с инструкцией
изготовител .
Реакционную смесь раздел ют электрофорезом в 1% агарозном геле и вы вл ют
продукт реакции - единичный фрагмент размером около 2, 25 т.п.н. Фрагмент выдел ют из
гел с помощью набора "Wizard PCR preps Purification System" (Promega, США) и
секвенируют с использованием праймеров BrdGl7ACA_F, BrdGl7ACA_R, brd1, brd2 и brd 3
(SEQ ID N05).
Установленна таким образом нуклеотидна последовательность гена BrdGl7ACA
приведена в перечне под номером SEQ ID N06. Выведенна из нее аминокислотна последовательность белка BrdGl7ACA (SEQ ID N07) имеет 98%-ное сходство с
аминокислотными последовательност ми других известных бактериальных GL7ACAацилаз (фиг 2), при этом имеющиес отличи локализованы в сайтах, удаленных от
участков активного центра фермента и областей межсубъединичных контактов [8]. Эти
данные позвол ют с высокой степенью веро тности заключить, что фермент BrdGl7ACA
соответствует другим бактериальным Gl7ACA-ацилазам и по своим энзиматическим и
физико-химическим свойствам.
Пример 5. Конструирование вектора-носител pACT7
Векторы на основе промотора фага Т7 обеспечивают высокую экспрессию
гетерологичных генов в штаммах E.coli, синтезирующих T7 полимеразу [21], и
коммерчески доступны [22]. В то же врем известно, что иммобилизованные препараты
Gl7ACA-ацилаз, используемые дл биотрансформации цефалоспориновых антибиотиков,
не должны содержать примесей бета-лактамаз. Присутствие бета-лактамазы также
затрудн ет количественный анализ уровней продукции Gl7ACA-ацилаз в рекомбинантных
штаммах-продуцентах. Поэтому дл экспрессии BrdGl7ACA и других ферментов
биотрансформации антибиотиков, свободных от примесей бета-лактамаз, целесообразно
использовать векторы, несущие маркеры плазмидной устойчивости, отличные от AmpR.
Такие векторы обладают также более высокой сегрегационной стабильностью [22], котора может быть дополнительно повышена за счет использовани репликона p15A вместо
репликона ColE1[23].
Конструирование вектора pACT7, удовлетвор ющего указанным услови м, проводили в
несколько стадий.
А) Конструирование промежуточной плазмиды pET2ldRI.
C использованием метода "инвертированной ПЦР" и праймеров pETR1_F (SEQ ID N08) и
pETR1_R (SEQ ID N09) на матрице пламиды pET21d [21] с использованием набора Expand
Long Template PCR system получают уникальный ПЦР фрагмент размером 5,4 тпн, который
выдел ют из агарозного гел , как описано в примере 4. 100 нг полученного фрагмента
гидролизуют 5 единицами рестриктазы EcoRI (Fermentas) и лигируют с помощью Т4 ДНК
лигазы. Полученной лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма
Escherichia coli XL1-Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F'proAB
lacI qZ M15 Tn10 (Tet r)] (Stratagene, США), затем из полученных ампициллин-устойчивых
трансформантов выдел ют препараты плазмидной ДНК с использованием набора Wizard
MiniPreps Kit (Promega, США). Полученные образцы ДНК анализируют совместным
гидролизом рестриктазами EcoRI/PstI и BamHI/PstI и отбирают "положительные" клоны,
Страница: 8
RU 2 300 566 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
содержащие EcoRI/PstI фрагменты размером 1300 и 4100 п.н. При этом за счет делеции
сайта BamHI в BamHI/PstI гидролизате ДНК плазмидных клонов присутствует уникальный
фрагмент размером 5400 пн, в то врем как в препарате плазмидной ДНК pET21d,
гидролизованной BamHI/PstI, обнаруживаютс фрагменты размером 1300 и 4100 п.н.
Несколько "положительных" клонов провер ют секвенированием с использованием
праймеров Т7prom (SEQ ID N0 10) и T7term (SEQ ID N0 11) и отбирают клон с
модифицированным таким образом участком полилинкера, не содержащий
неспецифических мутаций, который обозначают как pET21dR1.
Б) Конструирование плазмиды pET21dRl/Tet.
Дл удалени гена AmpR из плазмиды pET21dR1 и замены его геном устойчивости к
тетрациклину проводили конструирование плазмиды pET21dR1/Tet. Дл этого дл получени "вставки" несущей ген устойчивости к тетрациклину 2 мкг плазмидной ДНК
pKRP12[24] гидролизовали рестриктазой PstI и выдел ли из агарозного гел фрагмент
размером 1200 п.н. В качестве вектора использовали гидролизованную по сайту PstI
плазмиду pET21dR1. Использовали следующие услови лигировани : 1 мкл вектора (20
нг/мкл), 1 мкл фрагмента (50 нг/мкл), 2 мкл 5-кратного лигазного буфера (Gibco-BRL),
5 мкл воды и 1 мкл Т4 ДНК лигазы (1 ед/мкл, Сибэнзим). Смесь инкубировали в течение
14 часов при 12°С, затем прогревали 15 мин при 65°С, охлаждали во льду и 5 мкл смеси
использовали дл трансформации компетентных клеток штамма E. coli JM109[19].
Отбирали тетрациклин-устойчивые клоны, чувствительные к ампициллину.
Дополнительную селекцию нужных клонов проводили с помощью рестриктного анализа
препаратов плазмидной ДНК (по образованию фрагментов размером 1200, 1300, 4300 п.н.
при гидролизе EcoRI+PstI). Один из отобранных клонов обозначили как pET21dR1/Tet и
использовали в дальнейшей работе.
В) Конструирование плазмиды pACYCpET.
Дл получени производного вектора pET21dRI с репликоном p15A ДНК плазмиды
pACYC177 [20] гидролизовали совместно рестриктазами BamHI+PstI и выдел ли из
агарозного гел фрагмент размером 3000 п.н., включающий область репликона р15А, ген
устойчивости к канамицину и С-концевую кодирующую часть гена бета-лактамазы
(устойчивости к ампициллину). Плазмиду pET21dR1 гидролизовали совместно BglII+PstI и
выдел ли из агарозного гел фрагмент размером 1,5 т.п.н., включающий участок
полилинкера, промотор и терминатор Т7-фага и N-концевую кодирующую часть гена беталактамазы. Два фрагмента лигировали, полученной лигазной смесью трансформировали
штамм E. Coli Xl1Blue и отбирали трансформанты, устойчивые одновременно к
ампициллину и канамицину.
Выделенные из культур полученных клонов плазмидные ДНК анализировали путем
рестрикции эндонуклеазой SmaI и отбирали клоны, образующие фрагменты размером 3,2 и
1,2 тпн. Один из отобранных клонов обозначили как pACYCpET.
Г) Конструирование вектора pACT7.
Дл удалени гена бета-лактамазы из вектора pACYCpET препарат плазмидной ДНК
гидролизуют совместно рестриктазами NaeI/FspI, выдел ют из агарозного гел фрагмент
размером 3,4 тпн, лигируют "сам на себ " по "тупым концам" и лигазной смесью
трансформируют компетентные клетки штамма E. coli JM109. Из отобранных канамицинустойчивых и ампициллин-чувствительных трансформантов выдел ют плазмидную ДНК и
идентифицируют нужный клон по данным рестриктного анализа (наличие фрагментов
размером 1.2 и 2,2 тпн в SmaI-гидролизатах препаратов плазмидной ДНК).
Пример 6. Конструирование плазмид дл экспрессии BrdGL7ACA в E.coli.
Сначала методом ПЦР получают фрагмент ДНК штамма Brevundiminas diminuta ВКМ B1297, содержащий полную кодирующую последовательность BrdGl7ACA (без прилежащих
не кодирующих последовательностей) и фланкированный уникальными сайтами
рестрикции.
Дл этого 1 мкг геномной ДНК штамма ВКМ B-1297 подвергают 25 циклам ПЦРамплификации с праймерами 7-aca_F/7aca_R (SEQ ID N012,13) с использованием набора
Страница: 9
RU 2 300 566 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Expand Long Template PCR system ("Roche Diagnostics GmbH", Mannheim, Германи ) в
соответствии с инструкцией изготовител . Использованные праймеры ограничивают
фрагмент гена BrdGL7ACA, включающий инициаторный кодон трансл ции, расположенного
в положении (+103) последовательности SEQID N06, и терминаторный кодон TGA,
расположенный в положении+2265 той же последовательности и несут сайты дл рестриктаз EcoRI и SacI, отсутствующие в кодирующей последовательности гена
BrdGl7АСА.
Реакционную смесь раздел ют электрофорезом в 1% агарозном геле и вы вл ют
продукт реакции - единичный фрагмент размером около 2,16 т.п.н. Выделенный из
агарозного гел фрагмент гидролизуют рестриктазами EcoRI/SacI и клонируют в
EcoRI/SacI вектор pET21dR1/Tet (см. пример 5 "Б"). Отбирают тетрациклин-устойчивые
трансформанты штамма E.coli JM109 по критерию образовани фрагментов размером 2,2 и
6,5 тпн в EcoRI/SacI гидролизатах полученных препаратов плазмидной ДНК.
С целью вы влени клона, несущего вставку с интактным геном BrdGL7ACA без
возможных мутаций, привнесенных за счет ПЦР-амплификации, провер ют способность
отобранных плазмид направл ть синтез функционально-активной BrdGL7ACA при их
переносе в штамм E.coli BL21(DE3) [22].
Дл этого индивидуальные трансформанты штамма E.coli BL21(DE3), несущие
полученные плазмиды, выращивают на LB-среде, содержащей 10 мкг/мл тетрациклина в
объеме 5 мл до ОП600~ 1,0. После этого в культуры внос т ИПТГ до конечной
концентрации 1 мкМ дл индукции промотора фага Т7 и продолжают культивирование в
течение 18 часов при температуре 25-30°С. Клетки собирают центрифугированием и
провод т определение активности Gl7ACA-ацилазы, как описано в примере 1. Отобранные
"положительные клоны" секвенируют с использованием праймеров T7prom, T7term, brd1,
brd2, brd3 и идентифицируют клон, несущий вставку с интактным геном BrdGl7ACA,
кодирующа последовательность которого идентична последовательности фрагмента ДНК
от положени +103 до положени +2265 определенной кодирующей последовательности
гена BrdGl7ACA, приведенной в перечне последовательностей под номером SEQ ID N07.
Плазмиду, выделенную из отобранного клона, обозначают pSVH18.
Дл получени экспрессирующей BrdGl7ACA плазмиды c репликоном p15A EcoR1/Sac1
фрагмент с геном BrdGl7ACA из плазмиды pSVH18 клонируют в вектор pACТ7 с
образованием плазмиды pSVH0106.
Пример 7 Получение рекомбинантных штаммов E. coli с использованием плазмид
pSVH18 и pSVH0106.
Дл получени штаммов-продуцентов рекомбинатной BrdGl7ACA с использованием
стандартных методов [18] провод т трансформацию реципиентного штамма E.coli
BL21(DE3) [22] полученными рекомбинантными плазмидными ДНК. На чашках с LB средой,
содержащей 10 мг/л тетрациклина, отбирают индивидуальные тетрациклин-устойчивые
трансформанты, полученные с использованием плазмидной ДНК pSVH18. Первичные
трансформанты культивируют в жидкой среде LB, содержащей 10 мг/л тетрациклина,
провод т индукцию синтеза BrdGl7ACA с использованием ИПТГ, как описано в примере 6.
Один из отобранных клонов обозначают как E.coli BL21(DE3)/pSVH18, выращивают его в 5
мл жидкой среды LB, содержащей 10 мг/л тетрациклина до ОП600~ 5,0, добавл ют к
культуре равный объем стерильного 30% глицерина, разливают по 500 мкл в стерильные 2
мл пробирки, замораживают и хран т при - 70°С.
Аналогичным образом получают первичные трансформанты штамма E.coli BL21(DE3)
плазмидой pSVH0106. Индивидуальные канамицин-устойчивые трансформанты
выращивают в жидкой среде LB с добавлением 30 мг/л канамицина, провер ют на
способность к синтезу функционально активной BrdGl7ACA, отбирают отдельный клон
E.coli BL21(DE3)/ pSVH0106 и хран т при - 70°С.
Пример 8 Определение уровней продукции рекомбинантной BrdGl7ACA и
физиологической стабильности продуцирующей способности рекомбинантных штаммов.
Дл сравнительного количественного определени уровн экспрессии BrdGl7ACA в
Страница: 10
RU 2 300 566 C2
5
10
полученных рекомбинантных штаммах E.coli BL21(DE3)/ pSVH18 и E.coli BL21(DE3)/
pSVH0106 клетки выращивают в колбах Эрленмейера объемом 300 мл в 50 мл LB среды с
добавлением соответствующего антибиотика при температуре 25°С до А600 1,0 ОЕ. Далее
внос т индуктор - ИПТГ до концентрации 0,2mM и провод т инкубацию в течение 22 часов.
Периодически отбирают аликвоты суспензии клеток и используют их дл определени роста культуры и активности фермента, как описано в примере 1.
Как видно из представленных данных (Таблица 1), активность фермента достигает
максимума через 20 часов инкубации; при этом в штамме E.coli BL21(DE3)/ pSVH0106 она
существенно выше (максимальное значение составл ет 1200 мЕ/мл культуры), чем в
штамме E.coli BL21(DE3)/ pSVH18.
Таблица 1
Динамика накоплени BrdGl7ACA при культивировании рекомбинантных штаммов E.coli BL21(DE3)/pSVH18 и E.coli BL21(DE3)/pSVH0106
Врем культивировани после индукции, (час)
15
20
25
30
0
5
10
20
Активность, мЕ/мл культуры
Плотность культуры, А600, нм
pSVH18
pSVH0106
pSVH18
pSVH0106
100
200
450
800
70
150
400
1200
1,0
1,5
2,1
4,8
1,0
1,7
2,5
5,6
Проверку физиологической стабильности продуцирующей активности рекомбинантных
штаммов в услови х продолжительного культивировани осуществл ют следующим
образом.
1. Провод т первый цикл культивировани на среде LB так, как это описано выше, и в
конце культивировани определ ют активность ацилазы (1-й цикл культивировани ,
соответствует примерно 30 генераци м).
2. 1 мл культуры, полученной после первого цикла, используют в качестве посевного
материала, который внос т в 50 мл свежей среды LB и повтор ют весь цикл еше раз (2-й
цикл культивировани , примерно 5 генераций).
3. Повтор ют процедуру еще 4 раза - до 50 генераций.
Как следует из приведенных в Таблице 2 данных, штамм BL21(DE3)/ pSVH0106
обладает более высокой физиологической стабильностью по сравнению со штаммом
BL21(DE3)/ pSVH18.
Таблица 2
Физиологическа стабильность продукции BrdGl7ACA в клетках рекомбинантных штаммов E.coli BL21(DE3)/pSVH18 и E.coli
BL21(DE3)/pSVH0106
Штамм
35
40
45
50
Активность BrdGl7ACA (мЕ/мл культуры) в зависимости от числа генераций
30
35
40
45
50
E.coli BL21(DE3)/pSVH18
800±15
750±12
700±20
650±15
600 ±20
E.coli BL21(DE3)/pSVH0106
1200±30
1150±25
1120±20
1100±20
1070±15
Пример 9. Характеристика рекомбинантного штамма E.coli BL21(DE3)/pSVH0106
С учетом того, что удельна активность ацилаз, гомологичных BrdGL7ACA, в среднем
составл ет около 10000 мЕ/мг белка, выход рекомбинатной BrdGL7ACA в штамме
BL21(DE3)/pSVH0106 равен примерно 100 мг белка на литр культуры продуцента.
Сопоставление полученных данных с известными ранее литературными сведени ми о
характеристиках рекомбинантных штаммов E.coli, продуцирующих бактериальные
Gl7ACA_ацилазы, позвол ют утверждать, что уровень продукции рекомбинантной
Gl7ACA_ацилазы в штамме BL21(DE3)/ pSVH0106 не менее чем в 1,5 раза превышает
продуктивность известных штаммов [9,12].
Морфологические признаки
Клетки имеют продолговатую палочковидную форму, при делении не почкуютс .
Культуральные признаки
Клетки хорошо растут на обычно используемых питательных средах. Врем генерации
около 30 мин в жидкой LB-среде. На 2-2,5% питательном агаре "Difco" образуютс круглые, гладкие, желтоватые колонии с ровными кра ми. При выращивании на жидких LBи YT-средах образуетс интенсивна ровна мутность.
Физиолого-биохимические признаки
Страница: 11
RU 2 300 566 C2
5
Оптимальна температура культивировани - от 25 до 30°C, оптимум рН - 7,6.
Источником азота служат органические соединени (в виде триптона, дрожжевого
экстракта).
Уровень синтеза BrdGL7ACA (по данным определени активности в образцах биомассы
штамма-продуцента) составл ет около 100 мг/л при титре культуры 1Ч10 9 кл/мл.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Страница: 12
RU 2 300 566 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Страница: 13
RU 2 300 566 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Страница: 14
RU 2 300 566 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Страница: 15
RU 2 300 566 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Страница: 16
RU 2 300 566 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Страница: 17
RU 2 300 566 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Страница: 18
RU 2 300 566 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Страница: 19
RU 2 300 566 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Страница: 20
RU 2 300 566 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Страница: 21
RU 2 300 566 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Страница: 22
RU 2 300 566 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
Формула изобретени 1. Рекомбинантна плазмида pSVH0106, обеспечивающа синтез ацилазы глутарил-7аминоцефалоспориновой кислоты (Gl7АСА-ацилазы) в клетках Escherichia coli, котора характеризуетс тем, что содержит фрагмент ДНК с нуклеотидной последовательностью
SEQ ID №6 от нуклеотида в положении 103 до нуклеотида в положении 2265, кодирующий
полную аминокислотную последовательность Gl7АСА-ацилазы штамма Brevundimonas
diminuta BKM В-1297, встроенный по сайтам рестрикции EcoRI и SacI в область
полилинкера вектора рАСТ7, состо щего из фрагмента модифицированной в области
полилинкера плазмиды pET21d, содержащего промотор и терминатор РНК-полимеразы
фага Т7, разделенные участком полилинкера, и фрагмента плазмиды pCYC117,
содержащего репликон р15А и ген устойчивости к канамицину, объединенных между собой,
как показано на фиг.3.
2. Рекомбинантный штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pSVH0106-продуцент Gl7АСАацилазы.
45
50
Страница: 23
CL
RU 2 300 566 C2
Страница: 24
DR
RU 2 300 566 C2
Страница: 25
RU 2 300 566 C2
Страница: 26
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
1 327 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа