close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

штамм rhodococcus globerulus н-42 для разложения нефти и нефтепродуктов

код для вставки
РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
RU
(19)
(11)
2 300 561
(13)
C1
(51) МПК
C12N
C02F
B09C
C12R
1/20 (2006.01)
3/34 (2006.01)
1/10 (2006.01)
1/00 (2006.01)
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
(21), (22) За вка: 2005138609/13, 13.12.2005
(24) Дата начала отсчета срока действи патента:
13.12.2005
(45) Опубликовано: 10.06.2007 Бюл. № 16
(73) Патентообладатель(и):
Автономна некоммерческа организаци "Научно-техническое объединение "ИТИН" (RU)
2 3 0 0 5 6 1
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: RU 2023686 C1, 30.11.1994. UA 6945 U,
15.05.2005. DE 3909324, 26.07.1990. ЯГАФАРОВА
Г.Г. и др. Биоочистка почвы и воды от нефти и
синтетических жирных кислот. Актуальные
вопросы прикладной биохимии и биотехнологии.
Материалы конференции биохимиков Урала и
Западной Сибири. - Уфа, 1998, с.267-270.
ТАСКАЕВ А.И. и др. Опыт биологической
рекультивации (см. прод.)
НЕФТЕПРОДУКТОВ
воздействии космических излучений на штамм
Rhodococcus globerulus TCH-OK и депонирован во
Всероссийской
Коллекции
Промышленных
Микроорганизмов под номером ВКПМ АС-1641.
Изобретение позвол ет повысить скорость
утилизации нефти и нефтепродуктов. 3 табл.
(56) (продолжение):
земель в услови х крайнего севера. Экологи и промышленность России, спецвыпуск, 2004, с.27-31.
R U
2 3 0 0 5 6 1
(54) ШТАММ RHODOCOCCUS GLOBERULUS Н-42 ДЛЯ РАЗЛОЖЕНИЯ НЕФТИ И
Страница: 1
RU
C 1
C 1
Адрес дл переписки:
141100, Московска обл., г.Щелково, пл.
Ленина, 1, кв.183, пат.пов. Л.А.Кн зевой
(57) Реферат:
Изобретение относитс к биотехнологии, в
частности к микробиологической промышленности,
и касаетс новой культуры микроорганизмов,
разрушающих нефть и нефтепродукты. Штамм
Rhodococcus
globerulus
H-42
выделен
при
R U
(72) Автор(ы):
Власов Сергей Александрович (RU),
Краснопевцева Наталь Валентиновна (RU),
Крашенинникова Тать на Константиновна (RU),
Синицын Алексей Николаевич (RU),
Украинцев Анатолий Дмитриевич (RU)
RUSSIAN FEDERATION
RU
(19)
(11)
2 300 561
(13)
C1
(51) Int. Cl.
C12N
C02F
B09C
C12R
1/20 (2006.01)
3/34 (2006.01)
1/10 (2006.01)
1/00 (2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY,
PATENTS AND TRADEMARKS
(12)
ABSTRACT OF INVENTION
(21), (22) Application: 2005138609/13, 13.12.2005
(24) Effective date for property rights: 13.12.2005
(45) Date of publication: 10.06.2007 Bull. 16
Mail address:
141100, Moskovskaja obl., g.Shchelkovo, pl.
Lenina, 1, kv.183, pat.pov. L.A.Knjazevoj
(73) Proprietor(s):
Avtonomnaja nekommercheskaja organizatsija
"Nauchno-tekhnicheskoe ob"edinenie "ITIN" (RU)
PETROLEUM PRODUCTS
globerulus TCH-OK and deposited in All-Russian
Collection of Industrial Microorganisms at number
VKPM AC-1641. Invention provides enhancing the
utilization rate value of petroleum and petroleum
products.
EFFECT: valuable properties of bacterial strain.
3 tbl, 2 ex
R U
2 3 0 0 5 6 1
C 1
C 1
(57) Abstract:
FIELD: biotechnology, industrial microbiology.
SUBSTANCE: invention relates to a novel
microorganism culture decomposing petroleum and
petroleum products. The strain
Rhodococcus
globerulus H-42 is isolated after effect of
cosmic radiation on the strain Rhodococcus
Страница: 2
EN
2 3 0 0 5 6 1
(54) STRAIN RHODOCOCCUS GLOBERULUS H-42 FOR DECOMPOSITION OF PETROLEUM AND
R U
(72) Inventor(s):
Vlasov Sergej Aleksandrovich (RU),
Krasnopevtseva Natal'ja Valentinovna (RU),
Krasheninnikova Tat'jana Konstantinovna (RU),
Sinitsyn Aleksej Nikolaevich (RU),
Ukraintsev Anatolij Dmitrievich (RU)
RU 2 300 561 C1
5
10
15
20
25
30
35
Изобретение относитс к микробиологической промышленности и касаетс новой
культуры микроорганизмов, разрушающих нефть и нефтепродукты, котора может быть
использована, например, дл очистки загр зненных поверхностей.
Известна смесь специально селекционированных штаммов бактерий Rhodococcus
erythropolis ВКПМ В-3078 (36а-1), Rhodococcus luteus ВКПМ В-3077 (25) и Micrococcus
flavus ВКПМ В-3079 (53) (ав. св. СССР №1493666, C02F 3/34, 1989 г), используема дл деструкции нефти и нефтепродуктов.
Использование указанных культур микроорганизмов возможно только в аэротенках.
Выращивание смеси культур возможно при больших материально- и энергозатратах.
Известен штамм бактерий Rhodococcus erythropolis BKM Ас-1339Д, используемый дл разложени нефти и нефтепродуктов, который примен етс дл очистки воды и почвы от
указанных продуктов. Недостатком известного штамма вл етс недостаточна скорость
утилизации нефти и неспособность осуществл ть утилизацию нефти и нефтепродуктов при
высоком содержании их к объему загр зненного объекта.
Наиболее близким аналогом вл етс консорциум микроорганизмов "Деворойл", активно
окисл ющий нефтепродукты как в зоне контакта с водой, так и непосредственно в
нефт ной пленке. В состав консорциума вход т бактериальные и дрожжевые клетки.
Композици выделена из пластовых вод нефт ного месторождени (пат. РФ 2023686).
Целью данного изобретени вл етс получение нового штамма, характеризующегос высокой скоростью утилизации нефти и нефтепродуктов, которые вл ютс единственными
источниками углерода и энергии.
Дл достижени поставленной цели предложен штамм Rhodococcus globerulus H-42
ВКПМ АС-1641, выделенный при воздействии космических излучений на штамм ТСН-ОК
(справка о депонировании прилагаетс ).
Выделение штамма осуществл лось путем мутагенного воздействи и последующего
рассева образца штамм ТСН-ОК после экспозиции.
Идентификаци штамма была осуществлена на основании изучени его культуральноморфологических и физиолого-биохимических характеристик в соответствии с описанием,
данным в определении бактерий Bergey /Bergey Smanual of Syste matic Bacteriology
vol.1. 1984 р./. а также на основании изучени последовательности генов 16S рРНК по
Edwards U. Et all.
Хранитс штамм на агаризованных питательных средах при температуре 6-8°С в
течение мес ца. Более длительное хранение штамма осуществл етс в герметично
запа нных ампулах в лиофильно-высушенном состо нии. Составы среды дл хранени штамма:
М со-пептонный агар (г/л):
М сна вода
Агар
- 20,0
NaCl
40
- 100,0
- 5,0
Пептон
- 10,0
Глюкоза
- 7,0
Вода водопроводна - до 1 литра
Агаризована среда Раймонда с нефтью (г/л):
Na2СО3
45
50
- 0,1
CaCl2
- 0,01
MnSO4
- 0,02
FeSO4
- 0,01
MgSO4
- 0,2
NH4Cl
- 0,2
NaCl
- 3,0
Na2HPO4
- 1,5
КН2PO4
- 1,0
Агар
- 20,0
М со-пептонный бульон
- 500
Страница: 3
DE
RU 2 300 561 C1
Нефть
- 0,5% об.
Вода дистиллированна - до 1 литра
5
10
15
20
25
30
Данный штамм характеризуетс следующими морфолого-культуральными признаками.
Культура представл ет собой подвижные, грамвариабельные короткие, палочковидные
мелкие клетки и клетки округлой формы, расположенные парами или по несколько в
строчку, а также по одиночке. Культура полиморфна. Встречаютс ветв щиес цепочки и
палочки, расположенные под углом друг к другу, а также отдельные коковидные клетки.
Клетки подвижные, спор не образуют. Клетки размером (0,7-0,80)Ч(0,8-2,5) мкм.
Штамм растет на многих натуральных и синтетических средах. На МПА через 18-20
часов роста при 30°С культура образует круглые колонии, не очень крупные, чуть
выпуклые, с матовой поверхностью и ровными кра ми, слегка кожистой консистенции с
розовым пигментом.
Как правило, при выращивании на плотных средах на 2-3 сутки обнаруживаетс сплошной рост по штриху в виде выпуклых образований розового цвета.
Культура не лизогенна, после хранени на плотных питательных средах в течение 2-3
недель негативных п тен не обнаружено (при Т=30-35°С).
На м со-пептонном бульоне при 30°С в стационарных услови х через 3-е суток
наблюдаетс помутнение среды, беловатый осадок, заметно образование тонкого
пристеночного кольца, небольшое количество агломератов клеток в толще среды в виде
хлопьев, слаба пленка на поверхности среды. Оптимум роста 29-31°С, рН 6,8-7,2.
На минеральной среде Раймонда с глюкозой образует беловатый осадок, слегка
опалесцирующую муть в толще среды и тонкое пристеночное кольцо.
На минеральной среде Раймонда с нефтью в качестве единственного источника
углерода наблюдаетс слегка опалесцирующа муть в толще среды. Визуально нефть
значительно деградирована - при встр хивании образуетс взвесь в виде мелкодисперсной
фазы коричневого цвета, что совершенно не характерно дл нативной нефти.
Размножение культуры осуществл ли путем пересева на м со-пептонном агаре или
агаризованной среде Раймонда, состав которых представлен выше.
Услови культивировани на ферментационной питательной среде: температура 29-31
град, рН 6,8-7,2, продолжительность культивировани 22-24 часа.
Состав ферментационной питательной среды (вес.%):
Кормовые дрожжи БВК
Кукурузный экстракт
Вода водопроводна - 2%
- 1%
- до 100%
35
40
45
50
Активность (продуктивность) штамма, а также другие производственные показатели: на
производственной питательной среде продуктивность культуры по биомассе составл ет (23)Ч10 9 клеток/мл, активность на среде Раймонда - на 5 сутки биодеградации нефти (при
содержании нефти 10%) отмечаетс в разведении 10 -1-10 -10. Активность определ ли на
среде Раймонда с нефтью визуально по степени деградации нефти, а также
гравиметрическим методом и методом газожидкостной хроматографии.
Результаты проведенных исследований патогенности за вл емого штамма показывают,
что средневирулентна доза штамма при однократном внутрибрюшинном введении белым
мышам составила более 109 клеток на животное. Штамм не обладает способностью к
транслокации и диссеминации во внутренние органы и кровь животных.
Штамм не обладает токсичными и токсигенными свойствами.
Наблюдение за животными в течение 30-ти суток не вы вило каких-либо клинических
признаков заболевани , а изучение внутренних органов не вы вило патологических
изменений, регистрируемых морфологически.
Изучаемые микроорганизмы не обладают раздражающим действием на слизистую
оболочку глаза, не проникают через естественные барьеры верхних дыхательных путей, не
диссемилируют во внутренние органы при интраназальном поступлении в организм.
Примеры конкретного использовани .
Страница: 4
RU 2 300 561 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Применение на практике данного штамма обуславливаетс его физиологобиохимическими особенност ми. За вл емый штамм предназначен дл ликвидации
последствий загр знени воды и почвы нефтью и нефтепродуктами.
Пример 1
Культуру выращивали в колбах объемом 250 мл с рабочим объемом заполнени питательной средой 30 мл на качалке при 350 об/мин, что обеспечивает коэффициент
массопередачи по кислороду K1a=90 час -1 Продолжительность культивировани составл ет 22-24 часа, конечна концентраци клеток в культуральной жидкости
составл ет в среднем 3Ч10 9 кл/мл.
Пример 2
Экспериментальна оценка способности штамма микроорганизмов биодеградировать
нефть проводилась в лабораторных услови х, в пилотных и полевых экспериментах
комплексно по следующим показател м: убыли суммы углеводородов, изменению
фракционного состава нефти в процессе биодеструкции, изменению площади остаточной
нефти по отношению к общей площади загр зненной поверхности.
Культуральную жидкость после выращивани штамма бактерий-деструкторов нефти
сгущали сепарированием до концентрации клеток 1Ч10 9-10 10 кл/мл.
Дл биообработки водных поверхностей культуральную жидкость за вл емого штамма
разводили до конечной концентрации клеток 1Ч10 6 кл/мл в пресной воде, добавл ли 0,2%
нитроаммофоски. Наносили готовый раствор из расчета 10 л/м 2 поверхности почвы. Через
10-15 дней проводили повторную биообработку загр зненной поверхности. При
необходимости, в случае высокого уровн загр знени , проводили третью биообработку
через 10-15 дней после второй. На почвах при пересыхании обрабатываемой поверхности
проводили полив и рыхление, если это было возможно. Обработку почвы и воды в
пилотных испытани х осуществл ли из садовых леек, в полевых - с помощью поливальной
или пожарной машины вместимостью 5-10 м 3.
В лабораторных услови х обработку почвы, искусственно загр зненной нефтью,
осуществл ли в лабораторной посуде объемом 0,25-0,50 л. Лабораторные эксперименты
проводили при комнатной температуре.
Пилотные испытани проводили на поверхности водоемов площадью 1-2 м 2 и более
или на аварийно загр зненных почвах, где предварительно определ ли уровень
загр знени .
Полевые испытани проводили на природных объектах после аварийных разливов
нефти на них. И пилотные, и полевые испытани проводили в летне-осенний период.
Пробы дл анализов изначально и в динамике отбирали по п титочечной схеме
стандартным пробоотборником.
Массовый анализ исходного уровн загр знени и дальнейший мониториг процесса
очистки почвенных объектов и воды от нефт ных загр знений проводили
гравиметрическим методом. Качественный состав загр зн ющего агента проводили
методами газожидкостной хроматографии. Количественный состав нефт ных фракций
определ ли с помощью площади пиков, качественный - по времени держани . В качестве
контрол использовали нативную нефть, не подвергавшуюс биодеградации.
Эффективность биодеградации загр знени оценивали по убыли углеводородов нефти
в процессе проведени биообработок, принима за 100% исходную концентрацию
загр знени .
Учет численности живых клеток микроорганизмов во всех экспериментах проводили
общеприн тым методом предельных разведении на элективных средах.
В таблицах 1, 2, 3 приведены результаты тестировани биодеградирующей способности
штамма в лабораторных услови х, полевых и пилотных экспериментах.
В таблице 1 приведены результаты сравнительного тестировани деградирующей
способности штамма Rhodococcus globerulus Н-42 ВКПМ АС-1641 и препарата Деворойл на
модели почвы в лабораторных услови х. В качестве модели был использован образец
загр зненной почвы Павелецкого предпри ти по обеспечению нефтепродуктами.
Страница: 5
RU 2 300 561 C1
Контролем служил загр зненный углеводородами образец почвы с того же участка без
внесени каких бы то ни было дополнительных микроорганизмов.
Таблица 1.
Название препарата
5
10
Исходна конц-ци углеводов Через 1 мес ц УВ Через 2 мес ца УВ Степень очистки, %
г/кг
%
г/кг
%
г/кг
%
Деворойл
18,8
100
9,6
51,1
8,9
47,3
52,7
Штамм Rhodococcus globerulus H-42 ВКПМ AC-1641
18,8
100
5,5
39,6
4,7
18,7
82,3
Контроль
18,8
100
12,5
66,5
11,6
61,7
38,3
В таблице 2 представлены результаты полевых тестов биодеградирующей способности
штамма Rhodococcus globerulus Н-42 ВКПМ АС-1641 на природном объекте (река Черна ),
загр зненном углеводородами (УВ) в результате аварийных разливов нефти.
15
20
В таблице 3 представлены результаты тестировани штамма Rhodococcus globerulus Н42 ВКПМ АС-1641 в сравнении в сравнении с отечественным препаратом в пилотных
экспериментах, которые были поставлены на застарелом нефт ном загр знении.
25
30
35
Таким образом полученные результаты свидетельствуют о том, что с помощью штамма
Rhodococcus globerulus Н-42 ВКПМ АС-1641 может быть достигнута интенсивна деградаци при высоком содержании ее в объекте загр зненного субстрата, и он может
быть использован дл удалени нефт ных загр знений с поверхности почвы и водоемов.
40
Формула изобретени Штамм Rhodococcus globerulus H-42 ВКПМ AC-1641 дл разложени нефти и
нефтепродуктов.
45
50
Страница: 6
CL
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
3
Размер файла
111 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа