close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

новый фермент, образующий пептид, микроорганизм, продуцирующий данный фермент, и способ синтеза дипептида с их применением

код для вставки
РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
RU
(19)
(11)
2 300 565
(13)
C2
(51) МПК
C12N
C12N
C12N
C12P
C12R
9/18
9/48
1/21
21/02
1/01
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
(21), (22) За вка: 2005105321/13, 25.07.2003
(72) Автор(ы):
ЕКОЗЕКИ Кензо (JP),
СУЗУКИ Соноко (JP),
ХАРА Сейити (JP),
КАТАЯМА Сатоси (JP)
(24) Дата начала отсчета срока действи патента:
25.07.2003
(73) Патентообладатель(и):
АДЗИНОМОТО КО., ИНК. (JP)
(43) Дата публикации за вки: 10.08.2005
R U
(30) Конвенционный приоритет:
26.07.2002 JP 2002-218956
(45) Опубликовано: 10.06.2007 Бюл. № 16
2 3 0 0 5 6 5
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: WO 90/01555 A1, 22.02.1990. WO
9426882, 24.11.1994. RU 2096455 C1, 20.11.1997.
(85) Дата перевода за вки PCT на национальную фазу:
28.02.2005
2 3 0 0 5 6 5
R U
(87) Публикаци PCT:
WO 2004/022733 (18.03.2004)
C 2
C 2
(86) За вка PCT:
JP 03/09467 (25.07.2003)
Адрес дл переписки:
129010, Москва, ул. Б.Спасска , 25, стр.3,
ООО "Юридическа фирма Городисский и
Партнеры", пат.пов. Е.Е.Назиной, рег. № 517
(54) НОВЫЙ ФЕРМЕНТ, ОБРАЗУЮЩИЙ ПЕПТИД, МИКРООРГАНИЗМ, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ
ДАННЫЙ ФЕРМЕНТ, И СПОСОБ СИНТЕЗА ДИПЕПТИДА С ИХ ПРИМЕНЕНИЕМ
(57) Реферат:
Изобретение относитс к биотехнологии и
представл ет
собой
фермент,
который
катализирует реакцию образовани пептида из
карбоксильного
компонента
и
аминного
компонента. Данное изобретение относитс также к
штаммам микроорганизма рода Empedobacter и
рода Sphingobacterium, которые продуцируют
данный фермент, и к способу получени дипептидов из карбоксильного компонента и
аминного компонента с использованием фермента.
Данное изобретение позвол ет легко, недорого и с
высоким выходом образовывать пептид без
проведени сложного способа синтеза. 5 н. и 6
з.п. ф-лы, 18 табл., 3 ил.
Страница: 1
RU
RUSSIAN FEDERATION
RU
(19)
(11)
2 300 565
(13)
C2
(51) Int. Cl.
C12N
C12N
C12N
C12P
C12R
9/18
9/48
1/21
21/02
1/01
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY,
PATENTS AND TRADEMARKS
(12)
ABSTRACT OF INVENTION
(21), (22) Application: 2005105321/13, 25.07.2003
(72) Inventor(s):
EKOZEKI Kenzo (JP),
SUZUKI Sonoko (JP),
KhARA Sejiti (JP),
KATAJaMA Satosi (JP)
(24) Effective date for property rights: 25.07.2003
(30) Priority:
26.07.2002 JP 2002-218956
(45) Date of publication: 10.06.2007 Bull. 16
2 3 0 0 5 6 5
(85) Commencement of national phase: 28.02.2005
(86) PCT application:
JP 03/09467 (25.07.2003)
(87) PCT publication:
WO 2004/022733 (18.03.2004)
(57) Abstract:
FIELD: biotechnology, biochemistry.
SUBSTANCE: invention represents enzyme that
catalyzes reaction for formation of peptide from
carboxyl component and amine component. Also,
invention relates to strains of microorganism
Empedobacter and genus Sphingobacterium that
produce this enzyme, and to a method for
preparing dipeptides from carboxyl component and
amine component using this enzyme. Invention
provides synthesis of peptide without carrying
out the complex method of synthesis.
EFFECT: improved and easy method of synthesis,
reduced cost, high yield of peptide.
11 cl, 18 tbl, 27 ex
R U
2 3 0 0 5 6 5
(54) NOVEL ENZYME-FORMING PEPTIDE, MICROORGANISM PRODUCING THIS ENZYME AND
METHOD FOR SYNTHESIS OF DIPEPTIDE WITH THEIR USING
Страница: 2
C 2
C 2
Mail address:
129010, Moskva, ul. B.Spasskaja, 25, str.3,
OOO "Juridicheskaja firma Gorodisskij i
Partnery", pat.pov. E.E.Nazinoj, reg. № 517
EN
R U
(73) Proprietor(s):
ADZINOMOTO KO., INK. (JP)
(43) Application published: 10.08.2005
RU 2 300 565 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Данное изобретение относитс к новому ферменту, который может легко, недорого и с
высоким выходом образовывать пептид без проведени сложного способа синтеза. Более
конкретно данное изобретение относитс к новому ферменту, который катализирует
реакцию образовани пептида из карбоксильного компонента и аминного компонента, к
микроорганизму, который продуцирует данный фермент, и к способу получени дипептида
с использованием фермента или микроорганизма.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Пептиды используют в области фармацевтических средств, пищевых продуктов и других
различных област х. Например, поскольку L-аланил-L-глутамин имеет более высокую
стабильность и растворимость в воде, чем L-глутамин, он широко используетс в
качестве компонента инфузионных жидкостей и бессывороточных сред.
Способы химического синтеза, которые известны в качестве способов получени пептидов, не всегда вл ютс простыми. Известные примеры таких способов включают
способ, в котором используют N-бензилоксикарбонилаланин (в дальнейшем, "Z-аланин") и
защищенный L-глутамин (смотри Bull. Chem. Soc. Jpn., 34, 739 (1961), Bull. Chem. Soc.
Jpn., 35, 1966 (1962)), способ, в котором используют Z-аланин и защищенный
сложный -метиловый эфир L-глутаминовой кислоты (смотри Bull. Chem. Soc. Jpn., 37, 200
(1964)), способ, в котором используют сложный эфир Z-аланина и незащищенную
глутаминовую кислоту (смотри выложенную публикацию за вки на выдачу патента Японии
No. H1-96194), способ, который заключаетс в синтезе производного N-(2замещенного)пропионилглутамина в качестве промежуточного продукта из 2-замещенного
пропионилгалогенида в качестве исходного вещества (смотри выложенную публикацию
за вки на выдачу патента No. H6-234715).
Однако поскольку все указанные способы требуют введени и удалени защитных групп
или применени оптически активных промежуточных продуктов, их считают недостаточно
удовлетворительными с точки зрени их преимуществ при промышленном применении.
С другой стороны, широко известные примеры типичных способов получени пептидов с
использованием ферментов состо т из реакции конденсации, в которой используют Nзащищенный и C-незащищенный карбоксильный компонент и N-незащищенный, Cзащищенный аминный компонент (в дальнейшем, "реакци 1"), и реакции замещени , в
которой используют N-защищенный, C-защищенный карбоксильный компонент и Nнезащищенный, C-защищенный аминный компонент (в дальнейшем "реакци 2").
Примером реакции 1 вл етс способ получени сложного метилового эфира Zаспартилфенилаланина из Z-аспарагиновой кислоты и сложного метилового эфира
фенилаланина (смотри выложенную публикацию за вки на выдачу патента Японии No.
S53-92729), в то врем как примером реакции 2 вл етс способ получени амида
ацетилфенилаланиллейцина из сложного этилового эфира ацетилфенилаланина и амида
лейцина (смотри Biochemical J., 163, 531 (1977)). Сообщалось очень немного примеров
исследовани способов, в которых используют N-незащищенный, C-защищенный
карбоксильный компонент. Пример реакции замещени , в которой используют Nнезащищенный, C-защищенный карбоксильный компонент и N-незащищенный, Cзащищенный аминный компонент (в дальнейшем, "реакци 3") описан в международной
публикации патента WO 90/01555. Например, может быть указан способ получени амида
аргиниллейцина из сложного этилового эфира аргинина и амида лейцина. Примеры
реакций замещени , в которых используют N-незащищенный, C-защищенный
карбоксильный компонент и N-незащищенный, C-незащищенный аминный компонент (в
дальнейшем "реакци 4") описаны в публикаци х Европейских патентов EP 278787A1 и EP
359399B1. Например, можно указать способ получени тирозинилаланина из сложного
этилового эфира тирозина и аланина.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Наиболее дешевый способ получени среди указанных выше способов с
использованием реакций 1-4, конечно, относитс к классу реакции 4, в которую
Страница: 3
DE
RU 2 300 565 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
вовлечено наименьшее количество защитных групп.
Однако пример реакции 4 предшествующего уровн техники (публикаци Европейского
патента EP 278787A1) имел следующие основные проблемы:
(1) очень низка скорость образовани пептида,
(2) низкий выход образовани пептида,
(3) пептиды, которые могут быть получены, ограничены пептидами, которые содержат
аминокислоты со сравнительно высокой гидрофобностью,
(4) количество добавл емого фермента очень высокое, и
(5) требуютс сравнительно дорогосто щие препараты карбоксипептидазы, полученные
из плесневых грибов, дрожжей или растений. В случае реакции 4 не существует ни одного
известного способа, в котором используют фермент, полученный из бактерий или других
дрожжей, отличных от дрожжей рода Saccharomyces, и не существует известного способа
получени аланилглутамина и других пептидов, которые вл ютс высоко гидрофильными.
Принима во внимание данный уровень техники, существует необходимость в разработке
промышленно недорогого способа получени указанных пептидов.
Целью данного изобретени вл етс новый фермент, который легко, недорого и с
высоким выходом образует пептид без проведени сложного способа синтеза. Более
конкретно целью данного изобретени вл етс новый фермент, который катализирует
реакцию образовани пептида из карбоксильного компонента и аминного компонента,
микроорганизм, который продуцирует данный фермент, и способ недорогого получени пептида с использованием фермента или микроорганизма.
Авторы данного изобретени обнаружили новый фермент, который эффективно
образует пептид, из вновь открытых бактерий, относ щихс к роду Empedobacter, и так
далее, и осуществили данное изобретение.
Данное изобретение представл ет собой изобретение, которое описано ниже:
[1] Фермент, полученный из микроорганизма, относ щегос к роду, выбранному из рода
Empedobacter и рода Sphingobacterium, обладающий способностью образовывать пептид из
карбоксильного компонента и аминного компонента.
[2] Фермент, обладающий способностью образовывать пептид из карбоксильного
компонента и аминного компонента и способностью образовывать L-аланил-L-глутамин со
скоростью образовани 0,03 мМ/мин или выше в реакции образовани дипептида при
услови х (i)-(iv):
(i) карбоксильным компонентом вл етс гидрохлорид сложного метилового эфира Lаланина в количестве 100 мМ;
(ii) аминным компонентом вл етс L-глутамин в количестве 200 мМ;
(iii) pH равно 9,0; и
(iv) количество добавл емого гомогенно очищенного фермента составл ет менее 0,61
мг/мл в расчете на белок.
[3] Фермент по [1] или [2], в котором карбоксильный компонент в качестве субстрата
включает как сложный эфир аминокислоты, так и амид аминокислоты.
[4] Фермент по любому из [1]-[3], в котором любое из аминокислоты, C-защищенной
аминокислоты и амина можно использовать в качестве субстрата в случае аминного
компонента.
[5] Фермент по любому из [1]-[4], в котором фермент обладает способностью
образовывать пептид в диапазоне pH от 6,5 до 10,5.
[6] Фермент по любому из [1]-[5], в котором фермент обладает способностью
образовывать пептид в диапазоне температур от 0 до 60°C.
[7] Фермент по любому из [1]-[6], в котором фермент не ингибируетс ингибитором
серинового фермента, фенилметилсульфонилфторидом, но ингибируетс паранитрофенил-пара'-гуанидинбензоатом.
[8] Фермент по любому из [1]-[7], в котором фермент имеет молекул рную массу,
определенную посредством SDS-гель-электрофореза, составл ющую примерно 75
килодальтон, и молекул рную массу, определенную посредством хроматографии на основе
Страница: 4
RU 2 300 565 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
гель-фильтрации, составл ющую примерно 150 килодальтон.
[9] Микроорганизм, который продуцирует фермент по любому из [1]-[8].
[10] Микроорганизм по [9], в котором микроорганизм представл ет собой Empedobacter
brevis, штамм FERM BP-8113 (Депозитарный институт: независима административна корпораци , National Institute for Advanced Industrial Science and Technology,
International Patent Organism Depositary, адрес депозитарного института: Chuo Dai-6,
1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, дата передачи международного
депозита: 8 июл 2002) или Sphingobacterium sp., штамм FERM BP-8124 (депозитарный
институт: независима административна корпораци , National Institute for Advanced
Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, адрес
депозитарного института: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken,
Japan, дата передачи международного депозита: 22 июл 2002).
[11] Способ получени дипептида, включающий в себ образование дипептида из
карбоксильного компонента и аминного компонента с использованием фермента по
любому из [1]-[8] или вещества, содержащего фермент.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фиг. 1 вл етс диаграммой, показывающей оптимум pH фермента согласно данному
изобретению;
Фиг. 2 вл етс диаграммой, показывающей оптимум температуры фермента согласно
данному изобретению; и
Фиг. 3 вл етс диаграммой, показывающей временной ход образовани L-аланил-Lглутамина из сложного метилового эфира L-аланина и L-глутамина.
НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способы осуществлени данного изобретени объ сн ютс подробно в следующем
пор дке
(1) микроорганизм, продуцирующий фермент согласно данному изобретению,
(2) культивирование микроорганизма,
(3) очистка фермента,
(4) свойства фермента, и
(5) способ синтеза дипептида.
(1) Микроорганизм, продуцирующий фермент согласно данному изобретению
Фермент согласно данному изобретению может представл ть собой любой фермент,
который обладает способностью образовывать пептид из карбоксильного компонента и
аминного компонента, и не существует особого ограничени организмов, которые
продуцируют такой фермент. В данном описании карбоксильный компонент относитс к
компоненту, который обеспечивает карбонильный сайт (CO) в пептидной св зи (-CONH-),
тогда как аминный компонент относитс к компоненту, который обеспечивает амино-сайт
(NH) в пептидной св зи. Кроме того, в данном описании термин "пептид", используемый
отдельно, относитс к полимеру, имеющему по меньшей мере одну пептидную св зь, если
не оговорено особо. Кроме того, термин "дипептид" в данном описании относитс к
пептиду, имеющему одну пептидную св зь.
Примеры микроорганизмов, которые продуцируют фермент согласно данному
изобретению, включают бактерии, относ щиес к роду Empedobacter и так далее,
конкретные примеры которых включают Empedobacter brevis, штамм ATCC 14234 (штамм
FERM P-18545), и Sphingobacterium sp., штамм FERM BP-8124. Empedobacter brevis, штамм
ATCC 14234 (штамм FERM P-18545, штамм FERM BP-8113), и Sphingobacterium sp., штамм
FERM BP-8124 вл ютс микроорганизмами, которые были отобраны авторами данного
изобретени в результате поиска микроорганизмов, которые продуцируют пептид из
карбоксильного компонента и аминного компонента с высоким выходом. Микроорганизмы,
обладающие бактериологическими свойствами, сходными со свойствами Empedobacter
brevis, штамм ATCC 14234 (штамм FERM P-18545) или Sphingobacterium sp., штамм FERM
BP-8124 также вл ютс микроорганизмами, которые продуцируют фермент согласно
данному изобретению.
Страница: 5
RU 2 300 565 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Empedobacter brevis, штамм ATCC 14234 (штамм FERM P-18545), депонировали в
международном депозитарии патентуемых организмов в National Institute for Advanced
Industrial Science and Technology (Central 6, 1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki
Prefecture, Japan) 1 окт бр 2001, и ему присвоен номер депозита FERM P-18545.
Контроль данного организма затем передан дл депонировани по услови м
Будапештского договора в международный депозитарий патентуемых организмов в National
Institute for Advanced Industrial Science and Technology 8 июл 2002, и ему был
присвоен номер депозита FERM BP-8113 (обозначение микроорганизма: Empedobacter
brevis, штамм AJ 13933).
Sphingobacterium sp., штамм AJ 110003, депонировали в международном депозитарии
патентуемых организмов в National Institute for Advanced Industrial Science and
Technology 22 июл 2002, и ему присвоен номер депозита FERM BP-8124. Следует
отметить, что штамм AJ 110003 идентифицировали как вышеуказанный Sphingobacterium
sp. посредством экспериментов по идентификации, описанных ниже. Штамм FERM BP-8124
(Депозитарный институт: независима административна корпораци , National Institute
for Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism
Depositary, адрес депозитарного института: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukubashi, Ibaraki-ken, Japan, дата международного депозита: 22 июл 2002) вл етс грамотрицательной палочкой (0,7-0,8 х 1,5-2,0 микрометра (мкм)), котора не образует
спор и вл етс неподвижной. Ее колонии вл ютс круглыми с совершенно ровной
границей, содержат мало выступающих частей и имеют блест щую светло-желтую окраску.
Организм растет при 30°C и вл етс позитивным по каталазе, позитивным по оксидазе и
негативным в случае OF-теста (глюкоза) и идентифицирован как бактери , относ ща с к
роду Sphingobacterium на основании указанных свойств. Кроме того, на основании
свойств, состо щих в том, что микроорганизм вл етс негативным в отношении
восстановлени нитратов, негативным в отношении продукции индола, негативным в
отношении продукции кислоты из глюкозы, негативным по аргининдигидролазе, позитивным
по уреазе, позитивным по гидролизу эскулина, негативным по гидролизу желатина,
позитивным по Я-галактозидазе, позитивным в отношении ассимил ции глюкозы,
негативным в отношении ассимил ции L-арабинозы, позитивным в отношении ассимил ции
D-маннозы, негативным в отношении ассимил ции D-маннита, позитивным в отношении
ассимил ции N-ацетил-D-глюкозамина, позитивным в отношении ассимил ции мальтозы,
негативным в отношении ассимил ции глюконата кали , негативным по н-каприновой
кислоте, негативным в отношении ассимил ции адипиновой кислоты, негативным в
отношении ассимил ции DL- блочной кислоты, негативным в отношении ассимил ции
цитрата натри , негативным в отношении ассимил ции фенилацетата и позитивным по
цитохромоксидазе, определили, что он обладает свойствами, сходными со свойствами
Sphingobacterium multivorum или Sphingobacterium spiritivorum. Кроме того, в
результате анализа гомологии последовательности оснований гена 16S рРНК, несмотр на
то, что наиболее высока степень гомологии про вл лась со Sphingobacterium multivorum
(98,8%), не было штамма, с которым бы микроорганизм совпадал полностью. Поэтому
данный бактериальный штамм идентифицирован как Sphingobacterium sp.
Фермент согласно данному изобретению можно получить посредством выделени и
очистки из указанных выше клеток Empedobacter brevis или Sphingobacterium sp. Кроме
того, фермент согласно данному изобретению, а также микроорганизмы, которые
продуцируют фермент, также можно получить с помощью способов генной инженерии на
основании выделенного фермента. А именно, фермент и микроорганизм согласно данному
изобретению можно получить выделением ДНК, котора кодирует фермент согласно
данному изобретению, на основании выделенного и очищенного фермента с последующей
экспрессией ДНК посредством введени ДНК в подход щего хоз ина. Кроме того, фермент,
обладающий способностью образовывать пептид из карбоксильного компонента и
аминного компонента, также можно получить из других микроорганизмов, получа зонд,
основанный на полинуклеотиде, и т.д., который кодирует фермент согласно данному
Страница: 6
RU 2 300 565 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
изобретению, полученный из Empedobacter brevis. Различные способы рекомбинации генов
описаны в Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press (1989) и других
публикаци х.
(2) Культивирование микроорганизмов
Чтобы получить культивируемые клетки микроорганизмов, имеющие фермент,
используемый в данном изобретении, достаточно культивировать и выращивать
микроорганизмы в подход щей среде. Не существует особых ограничений среды,
используемой дл данной цели, при условии, что она обеспечивает возможность роста
микроорганизма. Указанной средой может быть обычна среда, содержаща обычные
источники углерода, источники азота, источники фосфора, источники серы,
неорганические ионы и источники органических питательных веществ, которые
необходимы.
Например, можно использовать любой источник углерода при условии, что
микроорганизм может его утилизировать. Конкретные примеры источника углерода,
которые можно использовать, включают сахара, такие как глюкоза, фруктоза, мальтоза и
амилоза, спирты, такие как сорбит, этанол и глицерин, органические кислоты, такие как
фумарова кислота, лимонна кислота, уксусна кислота и пропионова кислота, и их
соли, углеводороды, такие как парафин, а также их смеси.
Примеры источников азота, которые можно использовать, включают аммонийные соли
неорганических кислот, такие как сульфат аммони и хлорид аммони , аммонийные соли
органических кислот, такие как фумарат аммони и цитрат аммони , нитраты, такие как
нитрат натри и нитрат кали , органические азотсодержащие соединени , такие как
пептоны, дрожжевой экстракт, м сной экстракт и кукурузный экстракт, а также их смеси.
Кроме того, обычные источники питательных веществ, используемые в средах, такие как
неорганические соли, соли микроэлементов металлов и витамины, также можно
соответствующим образом смешивать и использовать.
Не существует особых ограничений условий культивировани , и культивирование
можно, например, осуществл ть в течение примерно от 12 до 48 часов, надлежащим
образом контролиру pH и температуру в пределах pH от 5 до 8, и в диапазоне
температур от 15 до 40°C, соответственно, в аэробных услови х.
(3) Очистка фермента
Способ выделени и очистки образующего пептид фермента из Empedobacter brevis
объ сн етс в виде примера очистки фермента согласно данному изобретению. Сначала
получают экстракт клеток микроорганизмов, например, из клеток микроорганизмов
Empedobacter brevis, штамм FERM BP-8113 (Депозитарный институт: независима административна корпораци , National Institute for Advanced Industrial Science and
Technology, International Patent Organism Depositary, Адрес депозитарного института:
Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan, дата передачи
международного депозита: 8 июл 2002), и тому подобных разрушением клеток с
использованием физического способа, такого как разрушение ультразвуком или
ферментативным способом с использованием фермента, раствор ющего клеточную
стенку, и удалени нерастворимой фракции разделением на основе центрифугировани и
т.д.
Фермент, образующий пептид, затем можно очистить из клеточного экстракта,
полученного описанным выше способом, комбиниру обычные способы очистки белков,
такие как анионообменна хроматографи , катионообменна хроматографи или
хроматографи на основе гель-фильтрации.
Примером носител дл использовани в анионообменной хроматографии вл етс Qсефароза HP (производства Amersham). Фермент извлекают в неадсорбируемой фракции в
услови х pH 8,5, обеспечива возможность прохождени клеточного экстракта,
содержащего фермент, через колонку, заполненную носителем.
Примером носител дл использовани в катионообменной хроматографии вл етс MonoS HR (производства Amersham). После адсорбции фермента на носителе (в колонке),
Страница: 7
RU 2 300 565 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
посредством обеспечени возможности прохождени клеточного экстракта, содержащего
фермент, через колонку, заполненную носителем, и затем промывки колонки, фермент
элюируют буферным раствором, имеющим высокую концентрацию соли. При этом
концентрацию соли можно последовательно увеличивать или градиентно увеличивать.
Например, в случае использовани MonoS HR фермент, адсорбированный на носителе,
элюируют при концентрации NaCl примерно от 0,2 до 0,5 М.
Фермент, очищенный описанным выше образом, затем можно дополнительно очистить
до гомогенности хроматографией на основе гель-фильтрации и т.д. Примером носител дл использовани в хроматографии на основе гель-фильтрации вл етс Sephadex 200pg
(производства Amersham).
Фракцию, котора содержит данный фермент, в ходе указанной выше процедуры
очистки можно подтвердить анализом активности в образовании пептида каждой фракции
согласно способу, описанному далее.
(4) Свойства фермента согласно данному изобретению
Хот фермент согласно данному изобретению вл етс ферментом, который обладает
способностью образовывать пептид из карбоксильного компонента и аминного компонента,
ниже будет дано по снение предпочтительного типа фермента согласно данному
изобретению с точки зрени его свойств.
Фермент, обладающий описанными ниже возможност ми, дл которого в качестве
показател используетс скорость образовани дипептида, вл етс предпочтительным
типом фермента согласно данному изобретению. А именно предпочтительным типом
фермента согласно данному изобретению вл етс фермент, который обладает
способностью образовывать пептид из карбоксильного компонента и аминного компонента
и способностью обеспечивать скорость образовани L-аланил-L-глутамина, равную
предпочтительно 0,03 мМ/мин или выше, более предпочтительно 0,3 мМ/мин или выше и
особенно предпочтительно 1,0 мМ/мин или выше в реакции образовани дипептида в
услови х (i)-(iv), описанных ниже. Услови реакции образовани дипептида представл ют
собой следующие услови :
(i) Карбоксильным компонентом вл етс гидрохлорид сложного метилового эфира Lаланина (100 миллимоль (мМ));
(ii) Аминным компонентом вл етс L-глутамин (200 мМ);
(iii) Значение pH равно 9,0; и
(iv) Количество добавл емого гомогенно очищенного фермента составл ет менее 0,61
мг/мл в расчете на количество белка.
Вышеуказанное количество добавл емого фермента показывает конечное количество
добавленного фермента, которое добавл ют в систему реакции, и желательно добавление
фермента в количестве 0,01 мг/мл или более и предпочтительно 0,02 мг/мл или более в
расчете на количество белка. Термин "количество белка" относитс к значению,
измеренному колориметрическим способом с применением Кумасси бриллиантового
синего, использу раствор CBB дл анализа белка (производства Nakarai) и бычий
сывороточный альбумин в качестве стандартного вещества.
Вышеуказанна скорость образовани намного превосходит обычную скорость
образовани в случае образовани пептида с использованием фермента, и фермент
согласно данному изобретению обладает способностью катализировать образование
пептида с очень высокой скоростью.
В качестве конкретного примера способа анализа активности фермента активность
фермента можно анализировать, обеспечива возможность взаимодействи фермента в
растворе боратного буфера, содержащего сложный эфир аминокислоты и амин в качестве
субстратов, с последующим количественным определением полученного в результате
пептида. В качестве более конкретного примера ферменту дают возможность
взаимодействовать в течение нескольких минут при 25°C, использу 100 мМ раствор
боратного буфера (pH 9,0), содержащий 100 мМ сложного метилового эфира L-аланина и
200 мМ L-глутамина.
Страница: 8
RU 2 300 565 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Единицу активности фермента, используемую в данном изобретении, определ ют так,
что 1 единица (U) представл ет собой количество фермента, которое образует 1
микромоль пептида за 1 минуту в услови х взаимодействи при 25°C с использованием 100
мМ раствора боратного буфера (pH 9,0), содержащего 100 мМ сложного метилового эфира
L-аланина и 200 мМ L-глутамина.
Кроме того, предпочтительным типом фермента согласно данному изобретению
вл етс фермент, обладающий свойством, благодар которому в качестве субстрата в
виде карбоксильного компонента можно использовать как сложный эфир аминокислоты, так
и амид аминокислоты. Слова "в качестве субстрата можно использовать как сложный эфир
аминокислоты, так и амид аминокислоты" означают, что по меньшей мере один тип
сложного эфира аминокислоты и по меньшей мере один тип амида аминокислоты можно
использовать в качестве субстрата. Кроме того, одним предпочтительным типом фермента
согласно данному изобретению вл етс фермент, который обладает свойством,
благодар которому в качестве субстрата в виде аминного компонента можно использовать
любой компонент: аминокислоту, C-защищенную аминокислоту и амин. Слова "в качестве
субстрата можно использовать аминокислоту, C-защищенную аминокислоту и амин"
означают, что по меньшей мере один тип аминокислоты, по меньшей мере один тип Cзащищенной аминокислоты и по меньшей мере один тип амина можно использовать в
качестве субстрата. В результате обладани широким диапазоном субстратной
специфичности в отношении карбоксильного компонента или аминокомпонента, фермент
согласно данному изобретению вл етс предпочтительным в том смысле, что можно
выбрать широкий круг исходных веществ, что в свою очередь имеет преимущества с точки
зрени стоимости и производственного оборудовани в случае промышленного
производства.
Конкретные примеры карбоксильных компонентов включают сложные эфиры Lаминокислот, сложные эфиры D-аминокислот, амиды L-аминокислот и амиды Dаминокислот. Кроме того, сложные эфиры аминокислот включают не только сложные
эфиры аминокислот, соответствующие встречающимс в природе аминокислотам, но также
сложные эфиры аминокислот, соответствующие не встречающимс в природе
аминокислотам или их производным. Кроме того, сложные эфиры аминокислот включают
сложные эфиры a-аминокислот, а также сложные эфиры Я-, - и -аминокислот и тому
подобное, которые имеют разные участки св зывани аминогрупп. Типичные примеры
сложных эфиров аминокислот включают метиловые сложные эфиры, этиловые сложные
эфиры, н-пропиловые сложные эфиры, изопропиловые сложные эфиры, н-бутиловые
сложные эфиры, изобутиловые сложные эфиры и трет-бутиловые сложные эфиры
аминокислот и т.д.
Конкретные примеры аминных компонентов включают L-аминокислоты, C-защищенные
L-аминокислоты, D-аминокислоты, C-защищенные D-аминокислоты и амины. Кроме того,
примеры аминов включают не только встречающиес в природе амины, но также не
встречающиес в природе амины или их производные. Кроме того, примеры аминокислот
включают не только встречающиес в природе аминокислоты, но также не встречающиес в природе аминокислоты или их производные. Они включают a-аминокислоты, а также Я-, и
-аминокислоты и тому подобное, которые имеют разные участки св зывани аминогрупп.
Кроме того, в другом аспекте одним предпочтительным типом фермента согласно
данному изобретению вл етс фермент, у которого диапазон значений pH, в пределах
которого может быть катализирована реакци образовани пептида, составл ет от 6,5 до
10,5. Способность фермента согласно данному изобретению катализировать данную
реакцию в широком диапазоне pH предпочтительна по той причине, что она позвол ет
гибко приспосабливать промышленное производство, которое может быть подвержено
вли нию различных ограничений. Однако в существующем в насто щее врем производстве пептида предпочтительно использовать фермент, дополнительно довед значение pH до оптимального, соответствующего полученному ферменту с тем, чтобы
максимизировать каталитическую эффективность фермента.
Страница: 9
RU 2 300 565 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Кроме того, другой отличительный аспект предпочтительного типа фермента согласно
данному изобретению заключаетс в том, что он вл етс ферментом, дл которого
диапазон температуры, на прот жении которого фермент способен катализировать
реакцию образовани пептида, находитс в пределах от 0 до 60°C. Так как фермент
согласно данному изобретению способен катализировать реакцию в широком диапазоне
температур, он вл етс предпочтительным по той причине, что он позвол ет гибко
приспосабливать промышленное производство, которое может быть подвержено вли нию
различных ограничений. Однако в существующем в насто щее врем производстве
пептидов предпочтительно использовать фермент, дополнительно довед температуру до
оптимальной, соответствующей полученному ферменту, с тем чтобы максимизировать
каталитическую эффективность фермента.
(5) Способ синтеза дипептида
Способ получени дипептида согласно данному изобретению заключаетс в синтезе
дипептида посредством обеспечени возможности дл фермента, обладающего
способностью образовывать пептид из карбоксильного компонента и аминного компонента,
или вещества, которое содержит данный фермент, действовать на карбоксильный
компонент и аминный компонент.
В случае способа, обеспечивающего возможность фермента, используемого в данном
изобретении, или вещества, содержащего фермент, действовать на карбоксильный
компонент и аминный компонент, достаточно, чтобы фермент или вещество, содержащее
фермент, карбоксильный компонент и аминный компонент, были смешаны. Более
конкретно можно использовать способ, при котором фермент или содержащее фермент
вещество добавл ют к раствору, содержащему карбоксильный компонент и аминный
компонент, и дают возможность взаимодействовать, или, в случае использовани микроорганизма, который продуцирует фермент, можно использовать способ, при котором
микроорганизм, который продуцирует фермент, культивируют, фермент, присутствующий в
микроорганизме или бульоне дл культивировани микроорганизмов, продуцируетс и
накапливаетс , и затем к культуральному бульону добавл ют карбоксильный компонент и
аминный компонент. Затем синтезированный дипептид можно собрать разработанными
способами и очистить при необходимости.
Термин "вещество, содержащее фермент" относитс к веществу, которое содержит
фермент, и примеры конкретных форм вещества включают культуру микроорганизмов,
которые продуцируют фермент, клетки микроорганизмов, выделенные из культуры, и
продукт обработки клеток микроорганизмов. Культура микроорганизмов относитс к
культуре, котора получена путем культивировани микроорганизмов, и более конкретно к
смеси клеток микроорганизмов, среды, используемой дл культивировани микроорганизмов, и веществ, продуцируемых культивируемыми микроорганизмами и тому
подобного. Кроме того, клетки микроорганизмов можно промыть и использовать в форме
промытых клеток микроорганизмов. Кроме того, продукт обработки клеток микроорганизмов
включает измельченные, лизированные или высушенные вымораживанием клетки
микроорганизмов, а также включает неочищенный фермент, извлеченный путем обработки
клеток микроорганизмов, и т.д., а также очищенный фермент, полученный очисткой
неочищенного фермента. Частично очищенный фермент, полученный различными видами
способов очистки, можно использовать в качестве очищенного фермента или можно
использовать иммобилизованный фермент, который был иммобилизован способами
ковалентного св зывани , адсорбции или включени . Кроме того, поскольку некоторые
микроорганизмы частично лизируютс во врем культивировани в зависимости от
используемых микроорганизмов, в таких случа х также можно использовать надосадок
культуры в качестве вещества, содержащего фермент.
Кроме того, не только дикие штаммы, но также генетически рекомбинантные штаммы
можно использовать в качестве микроорганизмов, которые содержат фермент.
Микроорганизмы не ограничены интактными клетками, но лучше также можно использовать
обработанные ацетоном клетки микроорганизмов, высушенные вымораживанием клетки
Страница: 10
RU 2 300 565 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
микроорганизмов или другие обработанные клетки микроорганизмов. Также можно
использовать иммобилизованные клетки микроорганизмов, иммобилизованные способами
ковалентного св зывани , адсорбции, включени или другими способами, а также
обработанные иммобилизованные клетки микроорганизмов.
Следует отметить, что в случае использовани культур, культивируемых клеток
микроорганизмов или продукта обработки клеток микроорганизмов, имеетс много случаев,
при которых существует фермент, который не принимает участи в образовании пептидов,
а расщепл ет образованные пептиды, и в таких случа х весьма предпочтительно
добавл ть ингибитор металлопротеаз, такой как этилендиаминтетрауксусную кислоту
(EDTA), в зависимости от случа . Добавл емое количество находитс в пределах от 0,1
мМ до 300 мМ и предпочтительно от 1 мМ до 100 мМ.
Количество используемого фермента или содержащего фермент вещества должно
представл ть собой количество, при котором про вл етс целевой эффект (в дальнейшем
"эффективное количество"). Хот специалист в данной области легко может определить
такое эффективное количество посредством простого предварительного
экспериментировани , в случае использовани фермента его используемое количество,
например, составл ет примерно от 0,01 до 100 единиц (U), тогда как в случае
использовани промытых клеток микроорганизмов его используемое количество
составл ет примерно от 1 до 500 г/л.
Можно использовать любой карбоксильный компонент при условии, что он способен
образовывать пептид при конденсации с другим субстратом в форме аминного компонента.
Примеры карбоксильных компонентов включают сложные эфиры L-аминокислот, сложные
эфиры D-аминокислот, амиды L-аминокислот и амиды D-аминокислот. Примеры сложных
эфиров аминокислот включают не только сложные эфиры аминокислот, соответствующие
встречающимс в природе аминокислотам, но также сложные эфиры аминокислот,
соответствующие не встречающимс в природе аминокислотам или их производным.
Кроме того, примеры сложных эфиров аминокислот включают сложные эфиры aаминокислот, а также сложные эфиры Я-, - и -аминокислот и тому подобное, которые
имеют разные участки св зывани аминогрупп. Типичные примеры сложных эфиров
аминокислот включают метиловые сложные эфиры, этиловые сложные эфиры, нпропиловые сложные эфиры, изопропиловые сложные эфиры, н-бутиловые сложные
эфиры, изобутиловые сложные эфиры и трет-бутиловые сложные эфиры аминокислот.
Можно использовать любой аминный компонент при условии, что он способен
образовывать пептид при конденсации с другим субстратом в форме карбоксильного
компонента. Примеры аминных компонентов включают L-аминокислоты, C-защищенные Lаминокислоты, D-аминокислоты, C-защищенные D-аминокислоты и амины. Кроме того,
примеры аминов включают не только встречающиес в природе амины, но также не
встречающиес в природе амины или их производные. Примеры аминокислот включают не
только встречающиес в природе аминокислоты, но также не встречающиес в природе
аминокислоты или их производные. Они включают a-аминокислоты, а также Я-, и -аминокислоты и тому подобное, которые имеют разные участки св зывани аминогрупп.
Хот концентрации карбоксильного компонента и аминн??го компонента, служащих в
качестве исходных веществ, составл ют от 1 мМ до 10 М, и предпочтительно от 0,05 моль
(М) до 2 М, соответственно, имеют место случаи, при которых предпочтительно добавл ть
аминный компонент в количестве, равном или превышающем количество карбоксильного
компонента. Кроме того, в случае субстратов, которые ингибируют реакцию при высоких
концентраци х, их количество необходимо довести до концентрации, котора не приводит
к ингибированию, и благополучно добавл ть во врем реакции.
Температура реакции, котора позвол ет образовывать пептид, составл ет от 0 до 60°C
и предпочтительно от 5 до 40°C. Значение pH реакционной смеси, которое позвол ет
образовывать пептид, составл ет от 6,5 до 10,5 и предпочтительно от 7,0 до 10,0.
ПРИМЕРЫ
Хот нижеследующее дает более подробное объ снение данного изобретени с
Страница: 11
RU 2 300 565 C2
5
10
15
20
25
30
помощью примеров, данное изобретение не ограничено указанными примерами. Кроме
подтверждени окрашиванием нингидрином тонкослойных хроматограмм (качественных)
осуществл ли количественные определени посредством последующей
высокоэффективной жидкостной хроматографии, чтобы проанализировать продукты.
Колонка: InertsiL ODS-2 (производства GL Science, Inc.), элюат: водный фосфатный
раствор, содержащий 5,0 мМ 1-октансульфонат натри (pH 2,1):метанол=100:15-50, расход:
1,0 мл/мин, регистраци : 210 нанометров (нм).
Пример 1. Культивирование микроорганизмов (Empedobacter brevis, штамм FERM BP8113)
50 мл среды (pH 6,2), содержащей 5 грамм (г) глюкозы, 5 г сульфата аммони , 1 г
однозамещенного фосфата кали , 3 г двухзамещенного фосфата кали , 0,5 г сульфата
магни , 10 г дрожжевого экстракта и 10 г пептона в 1 литре (л) переносили в колбу
Сакагучи объемом 500 мл и стерилизовали при 115°C в течение 15 минут. Затем в данную
среду инокулировали одну полную петлю культурального бульона Empedobacter brevis,
штамм FERM BP-8113 (Депозитарный институт: независима административна корпораци , National Institute for Advanced Industrial Science and Technology,
International Patent Organism Depositary, адрес депозитарного института: Chuo Dai-6,
1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, дата передачи международного
депозита: 8 июл 2002), который культивировали при 30°C в течение 16 часов в такой же
среде, с последующим культивированием на качалке при 30°C в течение 16 часов и 120
качани х/мин.
Пример 2. Получение пептида с использованием клеток микроорганизмов
Клетки микроорганизмов собирали центрифугированием (10000 оборотов в минуту
(об/мин), 15 минут) культурального бульона, полученного в примере 1, с последующим
суспендированием до концентрации 100 г/л в 100 мМ боратном буфере (pH 9,0),
содержащем 10 мМ EDTA. После добавлени соответственно 1 мл полученной суспензии к
1 мл 100 мМ боратного буфера (pH 9,0), содержащего 10 мМ EDTA, 200 мМ указанного
ниже карбоксильного компонента и 400 мМ аминокислоты из указанных далее аминокислот
до конечного объема 2 мл, реакцию осуществл ли при 18°C в течение 2 часов. Пептиды,
которые были образованы в результате данной реакции, показаны в таблице 1.
Таблица 1
Карбоксильный Аминный Полученный (мМ) Карбоксильный Аминный Полученный (мМ)
компонент
компонент пептид
компонент
компонент пептид
L-Leu
35
40
45
50
L-Ala-OMe
L-Ala-L-Leu 38,2
Gly-OMe
L-His
L-Gly-L-His 22,1
L-Met
L-Ala-L-Met 68,3
L-Ser-OMe
L-Ser
L-Ser-L-Ser 29,0
L-Phe
L-Ala-L-Phe 62,4
L-Val-OMe
L-Met
L-Val-L-Met 10,5
L-Ser
L-Ala-L-Ser 51,3
L-Met-OMe
L-Phe
L-Met-L-Phe 28,5
L-His
L-Ala-L-His 52,1
L-Thr-OMe
L-Leu
L-Thr-L-Leu 23,0
L-Arg
L-Ala-L-Arg 72,1
L-Ile-OMe
L-Met
L-Ile-L-Met
L-Gln
L-Ala-L-Gln 68,0
8,3
В случае всех карбоксильных компонентов использовали гидрохлоридные соли.
Пример 3. Очистка фермента
После разделени центрифугированием процедуру проводили на льду или при 4°C.
Empedobacter brevis, штамм FERM BP-8113 (Депозитарный институт: независима административна корпораци , National Institute for Advanced Industrial Science and
Technology, International Patent Organism Depositary, адрес депозитарного института:
Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, дата передачи
международного депозита: 8 июл 2002), культивировали таким же образом, как в примере
1, и клетки микроорганизмов собирали разделением с помощью центрифугировани (10000
об/мин, 15 минут). После промывки 16 г клеток микроорганизмов 50 мМ трис-HCl-буфером
(pH 8,0) их суспендировали в 40 миллилитрах (мл) такого же буфера и подвергали
разрушающей ультразвуковой обработке в течение 45 минут при 195 ватт. Затем
полученную при ультразвуковом разрушении жидкость центрифугировали (10000 об/мин,
Страница: 12
RU 2 300 565 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
30 минут), чтобы удалить фрагменты разрушенных клеток и получить жидкий надосадок
после ультразвукового разрушени . Данный жидкий надосадок после ультразвукового
разрушени диализовали в течение ночи против 50 мМ трис-HCl-буфера (pH 8,0) с
последующим удалением нерастворимой фракции ультрацентрифугированием (50000
об/мин, 30 минут), чтобы получить растворимую фракцию в форме надосадочной жидкости.
Полученную в результате растворимую фракцию наносили на колонку с Q-сефарозой HP
(производства Amersham), предварительно уравновешенную трис-HCl-буфером (pH 8,0), и
активную фракцию собирали из неадсорбированной фракции. Полученную активную
фракцию диализовали в течение ночи против 50 мМ ацетатного буфера (pH 4,5) с
последующим удалением нерастворимой фракции разделением с помощью
центрифугировани (10000 об/мин, 30 минут), получа диализованную фракцию в форме
надосадочной жидкости. Затем диализованную фракцию наносили на колонку Mono S
(производства Amersham), предварительно уравновешенную 50 мМ ацетатным буфером
(pH 4,5), элюиру фермент линейным градиентом концентраций такого же буфера,
содержащего от 0 до 1 М NaCl. Фракцию, котора имела наименьший уровень
загр зн ющего белка среди активных фракций, наносили на колонку Superdex 200pg
(производства Amersham), предварительно уравновешенную 50 мМ ацетатным буфером
(pH 4,5), содержащим 1 М NaCl, и осуществл ли гель-фильтрацию, позвол такому же
буферу (pH 4,5), содержащему 1 М NaCl, протекать через колонку, получа раствор
активной фракции. На основании экспериментальных результатов электрофореза
подтвердили, что в результате осуществлени указанных процедур образующий пептид
фермент согласно данному изобретению был однородно очищен. Степень извлечени фермента в указанном выше способе очистки составл ла 12,2%, и степень очистки
составл ла 707 раз.
Пример 4. Измерение молекул рной массы фермента
SDS-гель-электрофорез
0,3 микрограмма (мкг) очищенной фракции фермента, полученной способом примера 3,
наносили на полиакриламидный гель дл электрофореза. 0,3% (масс./об.) триса, 1,44%
(масс./об.) глицина и 0,1% (масс./об.) лаурилсульфата натри использовали дл буферного раствора дл электрофореза, в качестве полиакриламидного гел использовали
гель, имеющий концентрационный градиент по концентрации гел от 10 до 20% (Multigel
10-20, производства Daiichi Pure Chemicals), и маркеры молекул рной массы Pharmacia
использовали в качестве маркеров молекул рной массы. После завершени электрофореза гель красили Кумасси бриллиантовым синим R-250 и равномерную полосу
регистрировали в положении молекул рной массы примерно 75 килодальтон (кДа).
Гель-фильтраци Фракцию очищенного фермента, полученную способом примера 3, наносили на колонку
Superdex 200pg (производства Amersham), предварительно уравновешенную 50 мМ
ацетатным буфером (pH 4,5), содержащим 1 М NaCl, и проводили гель-фильтрацию,
позвол такому же буферу (pH 4,5), содержащему 1 М NaCl, протекать через колонку,
чтобы измерить молекул рную массу. Маркеры молекул рной массы Pharmacia
использовали в качестве стандартных белков, имеющих известные молекул рные массы,
чтобы получить калибровочную кривую. В результате, молекул рна масса фермента
составила примерно 150 кДа.
На основании результатов SDS-гель-электрофореза и гель-фильтрации предположили,
что фермент вл етс гомодимером, имеющим молекул рную массу примерно 75 кДа.
Пример 5. Оптимум pH фермента
Вли ние pH исследовали в реакции, в которой образовывалс L-аланил-L-глутамин из
гидрохлорида сложного метилового эфира L-аланина и L-глутамина. В качестве буферов
использовали ацетатный буфер (pH от 3,9 до 5,4), MES-буфер (pH от 5,4 до 6,4),
фосфатный буфер (pH от 6,0 до 7,9), боратный буфер (pH от 7,8 до 9,3), CAPS-буфер (pH
от 9,3 до 10,7) и K2HPO4-NaOH-буфер (pH от 10,8 до 11,6). 1 микролитр (мкл) фермента из
фракции Mono S, полученного в примере 3, (примерно 180 U/мл) добавл ли к 100 мкл
Страница: 13
RU 2 300 565 C2
5
10
15
20
25
30
каждого из буферов (100 мМ), содержащего 100 мМ сложного метилового эфира L-аланина,
200 мМ L-глутамина и 10 мМ EDTA, и давали возможность взаимодействовать при 18°C в
течение 5 минут, чтобы измерить вли ние pH на реакцию. Результаты, основанные на том,
что за 100% принимали значение в случае использовани боратного буфера (pH 9,3),
показаны на фиг. 1. В результате, оптимум pH дл фермента составл л от 8 до 9,5.
Пример 6. Оптимум температуры фермента
Вли ние температуры исследовали на реакции, в которой L-аланил-L-глутамин
образовывалс из гидрохлорида сложного метилового эфира L-аланина и L-глутамина.
Аликвоту, объемом 1 мкл такой же фракции фермента, которую использовали в примере 5,
добавл ли к 100 мкл 100 мМ боратного буфера (pH 9,0), содержащего 100 мМ сложного
метилового эфира L-аланина, 200 мМ L-глутамина и 10 мМ EDTA, и давали возможность
взаимодействовать в течение 5 минут при каждой температуре, чтобы измерить вли ние
температуры на реакцию. Результаты, основанные на том, что за 100% принимали
значение активности при 34°C, показаны на фиг. 2. В результате, оптимальна температура дл фермента составл ла от 30 до 40°C.
Пример 7. Ингибиторы фермента
Вли ние ингибиторов на образование L-аланил-L-глутамина исследовали, использу в
качестве субстратов гидрохлорид сложного метилового эфира L-аланина и L-глутамина.
Аликвоту, объемом 2 мкл такой же фракции фермента, которую использовали в примере 5,
добавл ли к 50 мкл 100 мМ боратного буфера (pH 9,0), содержащего каждый из
ингибиторов фермента, показанных в таблице 2, в концентрации 10 мМ, и давали
возможность взаимодействовать при 25°C в течение 5 минут. Обратите внимание, что
орто-фенантролин, фенилметилсульфонилфторид и пара-нитрофенил-пара'гуанидинбензоат раствор ли в метаноле до концентрации 50 мМ перед использованием.
Активность фермента при каждом из условий указана в виде относительной активности в
случае, когда за 100 прин то значение образовани L-аланил-L-глутамина в отсутствие
ингибитора фермента. Полученные результаты показаны в таблице 2. В результате, среди
тестированных ингибиторов сериновых ферментов фермент не ингибировалс фенилметилсульфонилфторидом, но ингибировалс пара-нитрофенил-пара'гуанидинбензоатом.
Таблица 2
Ингибитор фермента
Относительна активность образовани L-Ala-L-Gln (%)
None
100
Ингибитор металлофермента
EDTA
орто-фенантролин
96
96
Ингибитор
N-этилмалеимид
110
SH-фермента
Монойодацетат
101
Фенилметилсульфонилфторид
115
4-(2-аминоэтил)бензолсульфонилфторид
75
Пара-нитрофенил-пара ,гуанидинбензоат
0,1
35
Ингибитор серинового
фермента
40
45
50
Пример 8. Образование L-аланил-L-глутамина из сложного метилового эфира L-аланина
и L-глутамина
Аликвоту, объемом 3 мкл такой же фракции фермента, которую использовали в примере
5, добавл ли к 100 мкл 100 мМ боратного буфера (pH 9,0), содержащего 100 мМ
гидрохлорида сложного метилового эфира L-аланина, 200 мМ L-глутамина и 10 мМ EDTA, и
давали возможность взаимодействовать при 18°C. В результате, как показано на фиг. 3,
образовывалось 83 мМ L-аланил-L-глутамина (L-Ala-L-Gln) в случае партии с добавлением
фермента, и концентраци побочного продукта L-Ala-L-Ala-L-Gln составл ла 1,3 мМ. С
другой стороны, почти никакого образовани L-Ala-L-Gln не наблюдалось в партии без
добавлени фермента, и концентраци фермента составл ла только примерно 0,07 мМ
после взаимодействи в течение 120 минут.
Пример 9. Вли ние концентрации L-глутамина на образование L-аланил-L-глутамина
Страница: 14
RU 2 300 565 C2
5
Аликвоту, объемом 1 мкл такой же фракции фермента, которую использовали в примере
5, добавл ли к 100 мкл 100 мМ боратного буфера (pH 9,0), содержащего 100 мМ
гидрохлорида сложного метилового эфира L-аланина, L-глутамин в концентраци х,
показанных в таблице 3, и 10 мМ EDTA, и давали возможность взаимодействовать при
18°C в течение 2 часов. Полученные результаты показаны в таблице 3.
Таблица 3
Гидрохлорид сложного
L-глутамин (мМ) L-Ala-L-Gln
метилового эфира L-аланина (мМ)
(мМ)
100
10
15
20
100
68,2
110
72,1
120
73,3
130
75,1
150
75,5
200
82,0
Пример 10. Субстратна специфичность фермента (1)
Специфичность по отношению к сложному эфиру исследовали в случае использовани сложного эфира L-аминокислоты в качестве карбоксильного компонента. Аликвоту,
объемом 2 мкл такой же фракции фермента, которую использовали в примере 5,
добавл ли к 100 мкл 100 мМ боратного буфера (pH 9,0), содержащего карбоксильные
компоненты, указанные в таблице 4, в концентрации 100 мМ, 200 мМ L-глутамина и 10 мМ
EDTA, и давали возможность взаимодействовать при 25°C в течение 2 часов. Количества
L-Ala-L-Gln, образованного в данной реакции, показаны в таблице 4 (в таблице 4 HCl
означает гидрохлорид).
Таблица 4
25
30
35
40
Карбоксильный компонент
Продуцируемый L-Ala-L-Gln (мМ)
Сложный метиловый эфир L-аланина HCl
84,3
Сложный этиловый эфир L-аланина ?HCl
91,5
Сложный изопропиловый эфир L-аланина ?HCl
78,9
Сложный трет-бутиловый эфир L-аланина ?HCl
7,5
Пример 11. Субстратна специфичность фермента (2)
Образование пептида исследовали в случае использовани сложного метилового эфира
L-аланина в качестве карбоксильного компонента и использу различные L-аминокислоты в
качестве аминного компонента. Аликвоту, объемом 2 мкл такой же фракции фермента,
которую использовали в примере 5, добавл ли к 100 мкл 100 мМ боратного буфера (pH
9,0), содержащего 100 мМ гидрохлорида сложного метилового эфира L-аланина, Lаминокислоты, показанные в таблице 5, в концентрации 150 мМ и 10 мМ EDTA, и давали
возможность взаимодействовать при 25°C в течение 3 часов. Количества каждого из
пептидов, образованных в данной реакции, показаны в таблице 5. Обратите внимание, что
знак "+" указывает такие пептиды, образование которых было подтверждено, но которые
нельз было количественно измерить из-за отсутстви стандарта, тогда как "следы"
указывает следовое количество.
Таблица 5
Аминный Продуцируемый Аминный
компонент пептид (мМ)
компонент
Gly
45
50
L-Ala
L-Ala-Gly
Продуцируемый
пептид (мМ)
13,7
L-Asn
L-Ala-L-Asn
65,5
L-Ala-L-Ala 25,4
L-Gln
L-Ala-L-Gln
79,3
17,6
L-Val
L-Ala-L-Val 20,8
L-Tyr
L-Ala-L-Tyr
L-Leu
L-Ala-L-Leu 45,3
L-CySH
L-Ala-L-CySH
+
L-Ile
L-Ala-L-Ile 33,9
L-Lys
L-Ala-L-Lys
71,8
L-Met
L-Ala-L-Met 83,3
L-Arg
L-Ala-L-Arg
88,0
L-Phe
L-Ala-L-Phe 74,4
L-His
L-Ala-L-His
66,9
L-Trp
L-Ala-L-Trp 53,9
L-Asp
L-Ala-L-Asp
2,1
L-Ser
L-Ala-L-Ser 62,5
L-Glu
L-Ala-L-Glu
42,9
L-The
L-Ala-L-Thr 53,9
L-Pro
L-Ala-L-Pro следы
Страница: 15
RU 2 300 565 C2
5
10
Пример 12. Субстратна специфичность фермента (3)
Образование пептида исследовали в случае использовани различных типов сложных
метиловых эфиров L-аминокислот в качестве карбоксильного компонента и использовани L-глутамина в качестве аминного компонента. Аликвоту, объемом 2 мкл такой же фракции
фермента, которую использовали в примере 5, добавл ли к 100 мкл 100 мМ боратного
буфера (pH 9,0), содержащего гидрохлориды сложных метиловых эфиров L-аминокислот
(AA-OMe?HCl), показанные в таблице 6, в концентрации 100 мМ, 150 мМ L-глутамина и 10
мМ EDTA, и давали возможность взаимодействовать при 25°C в течение 3 часов.
Количества каждого из пептидов, образованных в данной реакции, показаны в таблице 6.
Обратите внимание, что знак "+" указывает такие пептиды, образование которых было
подтверждено, но которые нельз было количественно измерить из-за отсутстви стандарта, тогда как "следы" указывает следовое количество. Кроме того, в реакционную
систему добавл ли Твин-80 до конечной концентрации 0,1% в случае использовани L-TrpOMe и L-Tyr-OMe.
15
Таблица 6
Карбоксильный Продуцируемый пептид Карбоксильный Продуцируемый пептид
компонент
(мМ)
компонент
(мМ)
20
25
30
35
40
Gly-OMe
Gly-L-Gln
54,7
L-Tyr-OMe
L-Tyr-L-Gln
L-Ala-OMe
L-Ala-L-Gln
74,6
CySH-OMe
L-CySH-L-Gln
+
L-Val-OMe
L-Val-L-Gln
15,4
L-Lys-OMe
L-Lys-L-Gln
+
L-Leu-OMe
L-Leu-L-Gln
+
L-Arg-OMe
L-Arg-L-Gln
7,1
L-Ile-OMe
L-Ile-L-Gln
8,4
L-His-OMe
L-His-L-Gln
+
L-Met-OMe
L-Met-L-Gln
12,0
L-Asp-?-OMe
?-L-Asp-L-Gln
следы
L-Phe-OMe
L-Phe-L-Gln
0,9
L-Asp-? -OMe
? -L-Asp-L-Gln
следы
L-Trp-OMe
L-Trp-L-Gln
+
L-Glu-?-OMe
?-L-Glu-L-Gln
+
L-Ser-OMe
L-Ser-L-Gln
24,0
L-Glu-y-OMe
y-L-Glu-L-Gln
+
L-Pro-OMe
L-Pro-L-Gln
2,2
L-Thr-OMe
L-Thr-L-Gln
81,9
L-Asn-OMe
L-Asn-L-Gln
+
L-Gln-OMe
L-Gln-L-Gln
0,3
3,4
В случае всех карбоксильных компонентов использовали гидрохлоридные соли.
Пример 13. Субстратна специфичность фермента (4)
Образование пептида исследовали в случае использовани различных сложных
метиловых эфиров L-аминокислот в качестве карбоксильного компонента и различных Lаминокислот в качестве аминного компонента. Аликвоту, объемом 2 мкл такой же фракции
фермента, которую использовали в примере 5, добавл ли к 100 мкл 100 мМ боратного
буфера (pH 9,0), содержащего гидрохлориды сложных метиловых эфиров L-аминокислот
(AA-OMe?HCl), показанные в таблице 7, в концентрации 100 мМ, L-аминокислоты,
показанные в таблице 7, в концентрации 150 мМ и 10 мМ EDTA, и давали возможность
взаимодействовать при 25°C в течение 3 часов. Образованные количества каждого из
пептидов, образованных в данной реакции, показаны в таблице 7. Обратите внимание, что
"следы" указывает следовое количество. Кроме того, в реакционную систему добавл ли
Твин-80 до конечной концентрации 0,1% в случае использовани L-Trp-OMe. Обратите
внимание, что знак "+" указывает такие пептиды, образование которых было
подтверждено, но которые нельз было количественно измерить из-за отсутстви стандарта.
45
50
Страница: 16
RU 2 300 565 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
В случае всех карбоксильных компонентов использовали гидрохлоридные соли.
Пример 14. Субстратна специфичность фермента (5)
Образование пептида исследовали в случае использовани L- или D-форм различных
сложных метиловых эфиров аминокислот в качестве карбоксильного компонента и L- или
D-форм различных аминокислот в качестве аминного компонента. 2 мкл такой же фракции
фермента, которую использовали в примере 5, добавл ли к 100 мкл 100 мМ боратного
буфера (pH 9,0), содержащего различные гидрохлориды сложных метиловых эфиров
аминокислот (AA-OMe?HCl), показанные в таблице 8, в концентрации 100 мМ, различные
аминокислоты, показанные в таблице 8, в концентрации 150 мМ и 10 мМ EDTA, и давали
возможность взаимодействовать при 25°C в течение 3 часов. Количества каждого из
пептидов, образованных в данной реакции, показаны в таблице 8. (Обратите внимание,
что "следы" указывает следовое количество).
Таблица 8
Карбоксильный Аминный Продуцируемый пептид (мМ)
компонент
компонент
D-Ala-OMe
L-Gln
D-Ala-OMe
50
D-Thr-OMe
D-Ala-L-Gln
69,3
D-Ala-L-Ser
20,3
D-Thr-Ser
1,0
D-Ser-L-Ser
3,3
D-Val-OMe
D-Val-L-Ser
0,6
D-Met-OMe
D-Met-L-Ser
5,1
L-Ala-D-Gln
0,3
D-Ser-OMe
L-Ala-OMe
L-Ser
D-Gln
Страница: 17
RU 2 300 565 C2
L-Ala-OMe
L-Ala-D-Ser
L-Thr-OMe
L-The-D-Ser
6,9
L-Ser-D-Ser
16,2
L-Val-OMe
L-Val-D-Ser
1,4
L-Met-OMe
L-Met-D-Ser
1,9
D-Ala-D-Gln
следы
D-Ala-D-Ser
0,2
L-Ser-OMe
5
D-Ala-OMe
D-Ser
D-Gln
D-Ala-OMe
D-Thr-OMe
D-Ser-OMe
10
15
20
D-Ser
5,4
D-Thr-D-Ser
1,1
D-Ser-D-Ser
2,5
D-Val-OMe
D-Val-D-Ser
0,5
D-Met-OMe
D-Met-D-Ser
2,7
В случае всех карбоксильных компонентов использовали гидрохлоридные соли.
Пример 15. Субстратна специфичность фермента (6)
Образование пептида исследовали, использу различные амиды L-аминокислот в
качестве карбоксильного компонента и различные L-аминокислоты в качестве аминного
компонента. Аликвоту, объемом 2 мкл такой же фракции фермента, которую использовали
в примере 5, добавл ли к 100 мкл 100 мМ боратного буфера (pH 9,0), содержащего соли
амидов L-аминокислот (AA-NH2?HCl), показанные в таблице 9, в концентрации 100 мМ, Lаминокислоты, показанные в таблице 9, в концентрации 150 мМ и 10 мМ EDTA, и давали
возможность взаимодействовать при 25°C в течение 3 часов. Количества каждого из
пептидов, образованных в данной реакции, показаны в таблице 9.
Таблица 9
Карбоксильный Аминный Продуцируемый (мМ)
компонент
компонент пептид
25
30
35
40
L-Phe-NH2
L-Gln
L-Phe-L-Gln
0,2
L-Phe-NH2
L-Ser
L-Phe-L-Ser
0,6
7,6
L-Ala-NH2
L-Gln
L-Ala-L-Gln
L-Ala-NH2
L-Met
L-Ala-L-Met
3,4
L-Ala-NH2
L-His
L-Ala-L-His
3,9
L-Thr-NH2
L-Gln
L-Thr-L-Gln
0,3
Пример 16. Субстратна специфичность фермента (7)
Образование пептида исследовали в случае использовани различных сложных
метиловых эфиров L-аланина в качестве карбоксильного компонента и C-защищенных Lаминокислот в качестве аминного компонента. Аликвоту, объемом 2 мкл такой же фракции
фермента, которую использовали в примере 5, добавл ли к 100 мкл 100 мМ боратного
буфера (pH 9,0), содержащего сложный метиловый эфир L-аланина (Ala-OMe?HCl),
показанный в таблице 10, в концентрации 100 мМ, гидрохлориды амидов L-аминокислот,
показанные в таблице 10, в концентрации 150 мМ и 10 мМ EDTA, и давали возможность
взаимодействовать при 25°C в течение 3 часов. Количества каждого из пептидов,
образованных в данной реакции, показаны в таблице 10.
Таблица 10
Карбоксильный Аминный Продуцируемый (мМ)
компонент
компонент компонент
Gly-NH2
L-Ala-OMe
45
50
L-Ala-Gly-NH 2
7,4
L-Ala-NH2 L-Ala-L-Ala-NH2 8,3
L-Phe-NH2 L-Ala-L-Phe-NH2 12,2
Пример 17. Субстратна специфичность фермента (8)
Образование пептида исследовали в случае использовани различных сложных
метиловых эфиров аминокислот в качестве карбоксильного компонента и метиламина в
качестве аминного компонента. Аликвоту, объемом 2 мкл такой же фракции фермента,
которую использовали в примере 5, добавл ли к 100 мкл 100 мМ боратного буфера (pH
9,0), содержащего гидрохлорид сложного метилового эфира аминокислоты (AA-OMe?HCl),
показанный в таблице 11, в концентрации 100 мМ, метиламин, показанный в таблице 11, в
Страница: 18
RU 2 300 565 C2
концентрации 150 мМ и 10 мМ EDTA, и давали возможность взаимодействовать при 25°C
в течение 3 часов. Количества каждого из пептидов, образованных в данной реакции,
показаны в таблице 11.
Таблица 11
5
Карбоксильный Аминный Продуцируемый пептид (мМ)
компонент
компонент
Gly-OMe
L-Thr-OMe
Gly-метиламин
Метиламин
L-Ala-OMe
10
15
L-Thr-метиламин
0,2
L-Ala-метиламин
0,3
Пример 18. Субстратна специфичность фермента (9)
Образование пептида исследовали в случае использовани сложного эфира Яаминокислоты в качестве карбоксильного компонента или Я-аминокислоты в качестве
аминного компонента. Аликвоту, объемом 2 мкл такой же фракции фермента, которую
использовали в примере 5, добавл ли к 100 мкл 100 мМ боратного буфера (pH 9,0),
содержащего карбоксильные компоненты, показанные в таблице 12, в концентрации 100
мМ, аминные компоненты, показанные в таблице 12, в концентрации 150 мМ и 10 мМ
EDTA, и давали возможность взаимодействовать при 25°C в течение 3 часов. Количества
каждого из пептидов, образованных в данной реакции, показаны в таблице 12. Обратите
внимание, что "следы" указывает следовое количество.
Таблица 12
20
Карбоксильный
компонент
25
30
1,1
Аминный
компонент
Продуцируемый
пептид
(мМ)
Gly-OMe
? -Ala
Gly-? -Ala
2,2
Gly-OMe
? -Phe
Gly-? -Phe
0,4
L-Ala-OMe
? -Ala
Ala-? -Ala
7,7
L-Ala-OMe
? -Phe
Ala-? -Phe
1,4
L-Thr-OMe
? -Ala
Thr-? -Ala
3,2
L-Thr-OMe
? -Phe
Thr-? -Phe
1,4
? -Ala-OMe
L-?-Ala
? -Ala-L-?-Ala
следы
? -Ala-OMe
? -Ala
?-Ala-? -Ala
0,2
B-Ala-OMe
L-Gln
? -Ala-L-Gln
0,6
B-Ala-OMe
L-Ser
? -Ala-L-Ser
3,2
В случае всех карбоксильных компонентов использовали гидрохлоридные соли.
35
40
45
50
Пример 19. Субстратна специфичность фермента (10)
Образование олигопептида исследовали в случае использовани сложного эфира Lаминокислоты в качестве карбоксильного компонента и пептида в качестве аминного
компонента. Аликвоту, объемом 2 мкл такой же фракции фермента, которую использовали
в примере 5, добавл ли к 100 мкл 100 мМ боратного буфера (pH 9,0), содержащего
карбоксильные компоненты, показанные в таблице 13, в концентрации 100 мМ, аминные
компоненты, показанные в таблице 13, в концентрации 150 мМ и 10 мМ EDTA, и давали
возможность взаимодействовать при 25°C в течение 3 часов. Количества каждого из
пептидов, образованных в данной реакции, показаны в таблице 13. В результате, было
сно показано, что данный фермент может образовывать не только дипептид, но также
длинноцепочечные пептиды при использовании пептида в качестве аминного компонента.
Как было показано в приведенных выше примерах 9-19, определено, что данный
фермент, полученный из Empedobacter brevis, штамм FERM P BP-8113 (Депозитарный
институт: независима административна корпораци , National Institute for Advanced
Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, адрес
депозитарного института: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken,
Japan, дата передачи международного депозита: 8 июл 2002) обладает очень широкой
субстратной специфичностью.
Страница: 19
RU 2 300 565 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Пример 20. Сравнение способности катализировать образование пептидов с
известными ферментами
Способность данного фермента образовывать пептид сравнивали со способностью
известных ферментов. Карбоксипептидазу Y, описанную в EP 278787A1, и тиоловые
эндопептидазы (фицин, папаин, бромелаин и химопапаин), описанные в EP 359399B1,
использовали в качестве известных ферментов, и их использовали в форме очищенных
ферментов производства Sigma. Фермент, очищенный до однородности в примере 3,
использовали в качестве источника фермента согласно данному изобретению. Указанные
ферменты добавл ли в реакционную систему в количествах, показанных в таблице 14 в
расчете на белок. Реакцию проводили, добавл фермент к 100 мкл боратного буфера (pH
9,0), содержащего 100 мМ гидрохлорида сложного метилового эфира L-аланина и 200 мМ
L-глутамина и дава возможность взаимодействовать при 25°C. Кроме того, фермент,
растворенный в 10 мМ ацетатном буфере (pH 5,0), содержащем 1 мМ EDTA, использовали
в случае карбоксипептидазы, тогда как фермент, растворенный в 10 мМ ацетатном буфере
(pH 5,0), содержащем 2 мМ EDTA, 0,1 М KCl и 5 мМ дитиотреитола, использовали в случае
тиоловой эндопептидазы. Отношени скоростей образовани L-аланил-L-глутамина
указанными ферментами показаны в таблице 14.
В результате, образование очень малого количества L-аланил-L-глутамина наблюдали
Страница: 20
RU 2 300 565 C2
5
10
15
даже в отсутствие фермента, тогда как небольшое увеличение скорости образовани наблюдали в партии, в которой добавл ли карбоксипептидазу или тиоловую
эндопептидазу, по сравнению с партией, в которую не добавл ли фермента. Напротив,
очень высока скорость образовани L-аланил-L-глутамина наблюдалась в партии, в
которую добавл ли данный фермент, и указанна скорость образовани была примерно в
5000-100000 раз более высокой, чем в случае карбоксипептидазы Y и тиоловой
эндопептидазы. Как описано выше, было подтверждено, что данный фермент обладает
очень высокой скоростью образовани пептида в отличие от любого фермента
предшествующего уровн техники. Кроме того, так как в отличие от фермента согласно
данному изобретению, вл ющегос димером, имеющим молекул рную массу примерно
75000, сообщалось, что молекул рна масса карбоксипептидазы Y составл ет примерно
61000, тогда как сообщалось, что молекул рна масса тиоловой эндопептидазы составл ет
примерно от 23000 до 36000, то скорость образовани L-аланил-L-глутамина на
молекул рную массу даже еще выше в случае фермента согласно данному изобретению,
чем на единичную массу, указанную в примерах.
Таблица 14
Фермент
20
25
30
35
40
45
50
Количество добавленного фермента Скорость образоОтношение
(мг белка/мл)
вани L-Ala-L-Gln (мМ/мин) скорости
образовани L-Ala-L-Gln
на единицу
массы
фермента
Без фермента
0
0,0006
Карбоксипептидаза Y
0,61
0,0257
0,0191
Фицин
2,60
0,0096
0,0017
Папаин
2,30
0,0106
0,0021
Бромелаин
2,80
0,0062
0,0010
Химопапаин
3,60
0,0100
0,0013
Фермент согласно
данному изобретению
0,02
4,4000
100,0
Пример 21. Получение L-аланил-L-глутамина с использованием клеток микроорганизмов
Sphingobacterium sp.
50 мл среды (pH 7,0), содержащей 5 г глюкозы, 5 г сульфата аммони , 1 г
однозамещенного фосфата кали , 3 г двухзамещенного фосфата кали , 0,5 г сульфата
магни , 10 г дрожжевого экстракта и 10 г пептона в 1 л переносили в колбу Сакагучи
объемом 500 мл и стерилизовали при 115°C в течение 15 минут дл культивировани Sphingobacterium sp., штамм FERM BP-8124 (депозитарный институт: независима административна корпораци , National Institute for Advanced Industrial Science and
Technology, International Patent Organism Depositary, адрес депозитарного института:
Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, дата международного
депозита: 22 июл 2002). Затем в среду инокулировали одну полную петлю
Sphingobacterium sp., штамм FERM BP-8124 (депозитарный институт: независима административна корпораци , National Institute for Advanced Industrial Science and
Technology, International Patent Organism Depositary, адрес депозитарного института:
Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, дата международного
депозита: 22 июл 2002), культивируемого при 30°C в течение 24 часов на косой агаровой
среде (агар: 20 г/л, pH 7,0), содержащей 5 г глюкозы, 10 г дрожжевого экстракта, 10 г
пептона и 5 г NaCl в 1 л, с последующим культивированием на качалке при 30°C в течение
20 часов и 120 качани х/минуту. Затем аликвоту данного культурального бульона объемом
1 мл добавл ли к указанной выше среде (50 мл/колбу Сакагучи объемом 500 мл) и
культивировали при 30°C в течение 18 часов. После завершени культивировани клетки
микроорганизмов отдел ли от культурального бульона центрифугированием и
суспендировали в 0,1 М боратном буфере (pH 9,0), содержащем 10 мМ EDTA, до 100 г/л в
расчете на влажные клетки микроорганизмов. Затем аликвоту объемом 0,1 мл 100 мМ
боратного буфера (pH 9,0), содержащего 10 мМ EDTA, 200 мМ гидрохлорида сложного
Страница: 21
RU 2 300 565 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
метилового эфира L-аланина и 400 мМ L-глутамина, добавл ли к 0,1 мл указанной
суспензии клеток микроорганизмов и после доведени до конечного объема 0,2 мл давали
возможность взаимодействовать при 25°C в течение 120 минут. Количество образованного
за это врем L-аланил-L-глутамина составл ло 62 мМ.
Пример 22. Очистка фермента из Sphingobacterium sp.
Следующую процедуру после разделени центрифугированием осуществл ли либо на
льду, либо при 4°C. Sphingobacterium sp., штамм FERM BP-8124 (депозитарный институт:
независима административна корпораци , National Institute for Advanced Industrial
Science and Technology, International Patent Organism Depositary, адрес депозитарного
института: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, дата
международного депозита: 22 июл 2002) культивировали таким же образом, как в примере
21, и клетки микроорганизмов собирали, отдел с помощью центрифугировани (10000
об/мин, 15 минут). После промывки 2 г клеток микроорганизмов 20 мМ трис-HCl-буфером
(pH 7,6) их суспендировали в 8 мл такого же буфера и подвергали разрушению
ультразвуком в течение 45 минут при 195 Вт. Затем полученную после разрушени ультразвуком жидкость центрифугировали (10000 об/мин, 30 минут), чтобы удалить
фрагменты разрушенных клеток и получить жидкий надосадок после ультразвукового
разрушени . Указанный жидкий надосадок после ультразвукового разрушени диализовали
в течение ночи против 20 мМ трис-HCl-буфера (pH 7,6) с последующим удалением
нерастворимой фракции ультрацентрифугированием (50000 об/мин, 30 минут), получа растворимую фракцию в форме надосадочной жидкости. Полученную в результате
растворимую фракцию наносили на колонку с Q-сефарозой HP (производства Amersham),
предварительно уравновешенную трис-HCl-буфером (pH 7,6), и собирали активную
фракцию из неадсорбированной фракции. Указанную активную фракцию диализовали в
течение ночи против 20 мМ ацетатного буфера (pH 5,0) с последующим удалением
нерастворимой фракции разделением с помощью центрифугировани (10000 об/мин, 30
минут), получа диализованную фракцию в форме надосадочной жидкости. Затем
полученную диализованную фракцию наносили на колонку с SP-сефарозой HP
(производства Amersham), предварительно уравновешенную 20 мМ ацетатным буфером
(pH 5,0), чтобы получить активную фракцию, в которой фермент элюировали линейным
градиентом концентраций такого же буфера, содержащего от 0 до 1 М NaCl.
Пример 23. Получение L-аланил-L-глутамина с использованием фракции фермента
Аликвоту, объемом 10 мкл фракции с SP-сефарозы HP (примерно 27 U/мл), очищенной в
примере 22, добавл ли к 90 мкл 111 мМ боратного буфера (pH 9,0), содержащего 111 мМ
гидрохлорида сложного метилового эфира L-аланина, 222 мМ L-глутамина и 11 мМ EDTA, и
давали возможность взаимодействовать при 25°C в течение 120 минут. В результате, в
партии с добавлением фермента образовалось 73 мМ L-аланил-L-глутамина. С другой
стороны, почти никакого образовани L-Ala-L-Glu не наблюдалось в партии без
добавлени фермента, и образованное количество составл ло только примерно 0,07 мМ
после взаимодействи в течение 120 минут.
Пример 24. Субстратна специфичность фермента (11)
Исследовали субстратную специфичность фермента, полученного из Sphingobacterium
sp., штамм FERM BP-8124 (Депозитарный институт: независима административна корпораци , National Institute for Advanced Industrial Science and Technology,
International Patent Organism Depositary, адрес депозитарного института: Chuo Dai-6,
1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, дата международного депозита:
22 июл 2002). 100 мкл 100 мМ боратного буфера (pH 9,0), содержащего различные
карбоксильные компоненты в конечной концентрации 100 мМ и различные аминные
компоненты в конечной концентрации 150 мМ, показанные в таблицах с 15-1 по 15-4,
фракцию фермента с SP-сефарозы HP, очищенную в примере 22 (добавление 0,33
единицы в реакционную жидкость) и 10 мМ EDTA, давали возможность взаимодействовать
при 25°C в течение 1,5 часа. Количества каждого из пептидов, образованных в данной
реакции, показаны в таблице 15. Обратите внимание, что знак "+" указывает такие
Страница: 22
RU 2 300 565 C2
5
пептиды, образование которых было подтверждено, но которые нельз было
количественно измерить из-за отсутстви стандарта, тогда как "следы" указывает
следовое количество. Кроме того, в реакционную систему добавл ли Твин-80 до конечной
концентрации 0,1% в случае использовани L-Trp-OMe. Кроме того, в случае всех
карбоксильных компонентов использовали гидрохлориды.
Таблица 15-1
Карбоксильный Аминный Продуцируемый пептид (мМ)
компонент
компонент
10
L-Ala-OMe
15
20
25
D-Ala-OMe
Gly
L-Ala-Gly
11,1
L-Ala
L-Ala-L-Ala
13,1
L-Val
L-Ala-L-Val
10,9
L-Leu
L-Ala-L-Leu
33,0
L-Ile
L-Ala-L-Ile
24,7
L-Met
L-Ala-L-Met
86,9
L-Pro
L-Ala-L-Pro
1,5
L-Phe
L-Ala-L-Phe
69,5
L-Trp
L-Ala-L-Trp
46,0
L-Thr
L-Ala-L-Thr
47,3
L-Asn
L-Ala-L-Asn
52,3
L-Tyr
L-Ala-L-Tyr
11,1
L-CySH
L-Ala-L-CySH
+
L-Lys
L-Ala-L-Lys
71,2
L-Arg
L-Ala-L-Arg
72,2
L-His
L-Ala-L-His
73,6
L-Asp
L-Ala-L-Asp
2,3
L-Glu
L-Ala-L-Glu
39,1
43,8
L-Ser
L-Ala-L-Ser
D-Ser
L-Ala-D-Ser
3,3
L-Ser
D-Ala-L-Ser
24,1
D-Ser
D-Ala-D-Ser
5,5
Таблица 15-2
30
Карбоксильный Аминный Продуцируемый пептид (мМ)
компонент
компонент
L-Thr-OMe
L-Thr-Gln
36,1
Gly-OMe
Gly-L-Gln
61,1
L-Ser-L-Gln
12,9
L-Ser-OMe
35
40
L-Val-OMe
L-Gln
L-Val-L-Gln
8,2
L-Met-OMe
L-Met-L-Gln
32,6
L-Ile-OMe
L-Ile-L-Gln
6,4
L-Arg-OMe
L-Arg-Gln
17,2
L-Tyr-OMe
L-Tyr-L-Gln
0,6
L-Pro-OMe
L-Pro-L-Gln
1,8
L-Phe-OMe
L-Phe-L-Gln
0,8
L-Gln-OMe
L-Gln-L-Gln
0,1
Asp-?-OMe
?-L-Asp-L-Gln
0,05
Таблица 15-3
45
Карбоксильный Аминный Продуцируемый пептид (мМ)
компонент
компонент
L-Thr-OMe
50
Gly-OMe
Gly
L-Thr-Gly
0,4
L-Ala
L-Thr-L-Ala
5,8
L-Val
L-Thr-L-Val
1,3
L-Leu
L-Thr-L-Leu
15,3
L-Met
L-Thr-L-Met
28,9
L-Arg
Gly-L-Arg
17,9
L-Phe
Gly-L-Phe
20,0
L-His
Gly-L-His
36,2
L-Lys
Gly-L-Lys
48,2
Страница: 23
RU 2 300 565 C2
L-Ser-OMe
5
L-Val-OMe
L-Met-OMe
10
L-Ile-OMe
L-Arg-OMe
15
L-Ser
Gly-L-Ser
L-Ser
L-Ser-L-Ser
53,8
9,9
L-Met
L-Ser-L-Met
7,6
L-Phe
L-Ser-L-Phe
4,3
L-Ser
L-Val-L-Ser
31,9
L-Met
L-Val-L-Met
6,8
L-Phe
L-Val-L-Phe
1,0
L-Ser
L-Met-L-Ser
25,3
L-Met
L-Met-L-Met
28,4
L-Phe
L-Met-L-Phe
8,9
L-Ser
L-Ile-L-Ser
17,3
L-Met
L-Ile-L-Met
5,1
L-Phe
L-Ile-L-Phe
1,5
L-Ser
L-Arg-L-Ser
2,2
L-Met
L-Arg-L-Met
следы
L-Phe
L-Arg-L-Phe
следы
Таблица 15-4
Карбоксильный
компонент
Аминный
компонент
L-Ala-OMe
20
Продуцируемый пептид
(мМ)
Амид Gly
Амид L-Ala-Gly
15,1
Амид L-Ala
Амид L-Ala-L-Ala
9,2
Амид L-Phe
Амид L-Ala-Phe
27,1
L-Ala-Метиламин
0,6
Метиламин
L-The-Метиламин
0,3
L-Ala-OMe
L-Thr-OMe
Gly-OMe
25
Амид L-Ala
Gly-метиламин
1,0
L-Gln
L-Ala-L-Gln
0,3
L-Met
L-Ala-L-Met
следы
L-His
L-Ala-L-His
следы
В случае всех амидов аминокислот использовали гидрохлоридные соли
30
35
40
Пример 25. Субстратна специфичность фермента (12)
Субстратную специфичность по отношению к образованию олигопептидов исследовали
дл фермента, полученного из Sphingobacterium sp., штамм FERM BP-8124 (Депозитарный
институт: независима административна корпораци , National Institute for Advanced
Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, адрес
депозитарного института: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken,
Japan, дата международного депозита: 22 июл 2002). Аликвоту, объемом 100 мкл 100 мМ
боратного буфера (pH 9,0), содержащего различные карбоксильные компоненты в конечной
концентрации 100 мМ и различные аминные компоненты в конечной концентрации 150 мМ,
показанные в таблице 16, фракцию фермента с SP-сефарозы HP, очищенную в примере 22
(добавление 0,33 единицы в реакционную жидкость) и 10 мМ EDTA, давали возможность
взаимодействовать в течение 1,5 часа при 25°C. Количества каждого из олигопептидов,
образованных в данной реакции, показаны в таблице 16. Кроме того, в случае всех
карбоксильных компонентов использовали гидрохлориды.
Таблица 16
Карбоксильный Аминный компонент
компонент
45
L-Ala-OMe
Продуцируемый пептид
(мМ)
L-Ala
L-Ala-L-Ala
25,6
L-Ala-L-Ala
L-Ala-L-Ala-L-Ala
41,1
L-Ala-L-Ala-L-Ala
L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala
30,1
L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala 22,8
Gly-Gly
50
L-Ala-Gly-Gly
33,7
Gly-Ala
L-Ala-Gly-L-Ala
35,7
L-His-L-Ala
L-Ala-L-His-L-Ala
58,0
L-Phe-Gly
L-Ala-L-Phe-Gly
34,0
L-Leu-L-Ala
L-Leu-L-Leu-L-Ala
40,7
L-Phe-L-Ala
L-Ala-L-Phe-L-Ala
24,8
Страница: 24
RU 2 300 565 C2
5
L-Thr-OMe
Gly-Gly
L-Thr-Gly-Gly
8,4
Gly-OMe
L-Ala-L-Tyr
Gly-L-Ala-L-Tyr
0,6
Пример 26. Субстратна специфичность фермента (13)
Субстратную специфичность дополнительно анализировали, использу такую же
фракцию фермента, которую использовали в примере 5.
Таблица 17
10
15
Карбоксильный
компонент
(мМ)
H-Ala-OMe
50 мМ
H-p-F-Phe-OH
50 мМ
H-Ala-OMe
40 мМ
H-Cl-F-Phe-OH
40 мМ
H-Ala-OMe
40 мМ
H-p-NO2-Phe-OH
40 мМ
H-Ala-p-NO2-Phe-OH 27,5 мМ
H-Ala-OMe
100 мМ
H-t-Leu-OH
150 мМ
25
40
45
50
(мМ)
Врем реакции
(час)
H-Ala-p-F-Phe-OH
21,9 мМ
3
0H-Ala-Cl-F-Phe-OH
20,8 мМ
3
H-Ala-t-Leu-OH
0,4 мМ
3
3
20 мМ
H-2-Nal-OH
20 мМ
H-Ala-2-Nal-OH
+
3
100 мМ
H-Gln-OH
150 мМ
H-p-F-Phe-H-Gln-OH
следы
3
H-Cl-F-Phe-OMe
25 мМ
H-Gln-OH
50 мМ
H-Cl-F-Phe-H-Gln-OH
следы
3
H-p-NO2-Phe-OMe 40 мМ
H-Gln-OH
40 мМ H-p-NO2-Phe-H-Gln-OH 1,1 мМ
3
H-Gln-OH
150 мМ
H-t-Leu-H-Gln-OH
следы
3
3
100 мМ
H-2-Nal-OMe
40 мМ
H-Gln-OH
40 мМ
H-2-Nal-H-Gln-OH
следы
H-Aib-OMe
100 мМ
H-Gln-OH
150 мМ
H-Aib-H-Gln-OH
18,8 мМ
3
H-N-Me-Ala-OMe 100 мМ
H-Gln-OH
150 мМ H-N-Me-Ala-H-Gln-OH
0,5 мМ
3
3
H-Aib-OMe
100 мМ
H-Phe-OH
150 мМ
H-Aib-Phe-OH
17,2 мМ
H-CHA-Ome
40 мМ
H-Phe-OH
40 мМ
H-CHA-Phe-OH
+
3
H-N-Me-Ala-OMe 100 мМ
H-Phe-OH
150 мМ
H-N-Me-Ala-Phe-OH
следы
3
H-Ala-OMe
100 мМ
H-Ser(tBu)-OH
150 мМ
H-Ala-Ser(tBu)-OH
48,8 мМ
2
H-Ser(tBu)-OMe
100 мМ
H-Gln-OH
150 мМ
H-Ser(tBu)-Gln-OH
следы
2
H-Ala-OMe
100 мМ
H-Asp(OtBu)-OH
150 мМ
H-Ala-Asp(OtBu)-OH
62,6 мМ
2
H-Gln-OH
150 мМ
H-Asp(OtBu)-Gln-OH
0,9 мМ
2
H-Lys(Boc)-OH
150 мМ
H-Ala-Lys(Boc)-OH
51,0 мМ
2
H-Gln-OH
150 мМ
H-Lys(Boc)-Gln-OH
+
2
H-Asp(OtBu)-OMe 100 мМ
100 мМ
H-Lys(Boc)-OMe 100 мМ
35
Продуцируемый
пептид
H-Ala-OMe
H-Ala-OMe
30
(мМ)
H-p-F-Phe-OMe
H-t-Leu-OMe
20
Аминн??й компонент
100 мкл реакционных растворов, состо щих из 100 мМ боратного буфера (pH 9,0),
содержащего каждый из карбоксильных компонентов и аминных компонентов в конечных
концентраци х, показанных в таблице 17, фермент (добавление 0,1 единицы в
реакционный раствор) и 10 мМ EDTA, давали возможность взаимодействовать при 25°C в
течение периодов времени реакции, показанных в таблице 17. Количества каждого из
пептидов, образованных в реакци х, показаны в таблице 17. Обратите внимание, что знак
"+" указывает такие пептиды, образование которых было подтверждено, но которые нельз было количественно измерить из-за отсутстви стандарта, тогда как "следы" указывает
следовое количество.
Сокращени H-Ala-OMe: гидрохлорид сложного метилового эфира L-аланина
H-p-F-Phe-OMe: гидрохлорид сложного метилового эфира пара-фтор-L-фенилаланина
H-Cl-F-Phe-OMe: гидрохлорид сложного метилового эфира пара-хлор-L-фенилаланина
H-p-NO2-Phe-OMe: гидрохлорид сложного метилового эфира пара-нитро-Lфенилаланина
H-t-Leu-OMe: гидрохлорид сложного метилового эфира трет-L-лейцина
H-2-Nal-OMe: гидрохлорид сложного метилового эфира 3-(2-нафтил)-L-аланина
H-Aib-OMe: гидрохлорид сложного метилового эфира a-аминоизомасл ной кислоты
H-N-Me-Ala-OMe: гидрохлорид сложного метилового эфира N-метил-L-аланина
H-CHA-OMe: гидрохлорид сложного метилового эфира Я-циклогексил-L-аланина
H-Ser(tBu)-OMe: гидрохлорид сложного метилового эфира O-трет-бутил-L-серина
H-Asp(OtBu)-OMe: гидрохлорид сложного a-метилового эфира Я-трет-бутилового эфира
L-аспарагиновой кислоты
H-Lys(Boc)-OMe: гидрохлорид сложного метилового эфира N-e-трет-бутоксикарбонил-Lлизина
H-p-F-Phe-OH: пара-фтор-L-фенилаланин
Страница: 25
RU 2 300 565 C2
5
10
15
20
H-Cl-F-Phe-OH: пара-хлор-L-фенилаланин
H-p-NO2-Phe-OH: пара-нитро-L-фенилаланин
H-t-Leu-OH: трет-L-лейцин
H-2-Nal-OH: 3-(2-нафтил)-L-аланин
H-Gln-OH: L-глутамин
H-Phe-OH: L-фенилаланин
H-Ser(tBu)-OH: O-трет-бутил-L-серин
H-Asp(OtBu)-OH: Я-трет-бутиловый эфир L-аспарагиновой кислоты
H-Lys(Boc)-OH: N-e-трет-бутоксикарбонил-L-лизин
Пример 27. Субстратна специфичность фермента (14)
Субстратную специфичность по отношению к образованию олигопептидов
анализировали, использу такую же фракцию фермента, как в примере 26. 100 мкл
реакционных растворов, состо щих из 100 мМ боратного буфера (pH 9,0), содержащего
каждый из карбоксильных компонентов и аминных компонентов в конечных концентраци х,
показанных в таблице 18, фермент (количества единиц, добавленных в реакционный
раствор, описаны в таблице 18) и 10 мМ EDTA, давали возможность взаимодействовать
при 25°C в течение 3 часов. Количества каждого из олигопептидов, образованных в
реакци х, показаны в таблице 18. (Обратите внимание, что знак "+" указывает такие
пептиды, образование которых было подтверждено, но которые нельз было
количественно измерить из-за отсутстви стандарта, тогда как "следы" указывает
следовое количество). Следует отметить, что в случае всех карбоксильных компонентов
использовали гидрохлориды.
Таблица 18
25
30
35
40
45
50
Карбоксильный Аминный компонент Количест-во фер- Продуцируемый пептид
компонент
мента
(единицы)
Gly-OMe
L-Phe-L-Met
1,0
Gly-Phe-Met
L-Ala-OMe
L-Phe-L-Met
0,2
L-Ala-L-Phe-L-Met
+
L-Tyr-OMe
Gly-Gly-L-Phe-Met
1,0
L-Tyr-Gly-Gly-L-Phe-L-Met
2,7
L-Ala-OMe
Gly-Gly-L-Phe-L-Met
0,2
L-Ala-Gly-Gly-L-Phe-Met
+
Gly-OMe
Gly-L-Phe
0,1
Gly-L-Phe
17,3
L-Ala-OMe
Gly-L-Phe
0,1
L-Ala-Gly-L-Phe
+
D-Ala-OMe
Gly-L-Phe
0,1
D-Ala-Gly-L-Phe
следы
13,3
Промышленна применимость
В данном изобретении предлагаетс новый фермент, с помощью которого можно легко,
недорого и с высоким выходом образовывать пептид, уменьшить необходимость
применени сложных способов синтеза, таких как введение и удаление защитных групп.
Применение фермента согласно данному изобретению делает возможным эффективное
промышленное получение пептидов.
Формула изобретени 1. Фермент, полученный из микроорганизма, относ щегос к роду, выбранному из рода
Empedobacter и рода Sphingobacterium, и обладающий способностью образовывать пептид
из карбоксильного компонента и аминного компонента, где указанный фермент способен
утилизировать в качестве субстрата карбоксильный компонент как в форме сложного
эфира аминокислоты, так и амида аминокислоты.
2. Фермент, обладающий способностью образовывать пептид из карбоксильного
компонента и аминного компонента и способностью образовывать L-аланил-L-глутамин со
скоростью образовани 0,03 мМ/мин или выше в реакции образовани дипептида при
услови х (i)-(v):
(i) карбоксильным компонентом вл етс гидрохлорид сложного метилового эфира Lаланина в количестве 100 мМ;
(ii) аминным компонентом вл етс L-глутамин в количестве 200 мМ;
(iii) pH равно 9,0;
Страница: 26
CL
(мМ)
RU 2 300 565 C2
5
10
15
20
(iv) количество добавл емого гомогенно очищенного фермента составл ет менее 0,61
мг/мл в расчете на белок; и
(v) температура реакции равна 25°С.
3. Фермент по п.2, в котором карбоксильный компонент в качестве субстрата включает
как сложный эфир аминокислоты, так и амид аминокислоты.
4. Фермент по п.1 или 2, в котором аминный компонент в качестве субстрата включает
любое из аминокислоты, С-защищенной аминокислоты и амина.
5. Фермент по п.1 или 2, в котором фермент обладает способностью образовывать
пептид в диапазоне рН от 6,5 до 10,5.
6. Фермент по п.1 или 2, в котором фермент обладает способностью образовывать
пептид в диапазоне температур от 0 до 60°С.
7. Фермент по п.1 или 2, в котором фермент не ингибируетс ингибитором серинового
фермента, фенилметилсульфонилфторидом, но ингибируетс пара-нитрофенил-пара'гуанидинобензоатом.
8. Фермент по п.1 или 2, в котором фермент имеет молекул рную массу, определенную
посредством SDS-гель-электрофореза, составл ющую примерно 75 килодальтон, и
молекул рную массу, определенную посредством хроматографии на основе гельфильтрации, составл ющую примерно 150 килодальтон.
9. Штамм Empedobacter brevis FERM ВР-8113, продуцирующий фермент по п.1 или 2.
10. Штамм Sphingobacterium sp.FERM BP-8124, продуцирующий фермент по п.1 или 2.
11. Способ получени дипептида, включающий в себ образование дипептида из
карбоксильного компонента и аминного компонента с использованием фермента по п.1 или
2 или вещества, содержащего указанный фермент.
25
30
35
40
45
50
Страница: 27
RU 2 300 565 C2
Страница: 28
DR
RU 2 300 565 C2
Страница: 29
фермента в указанном выше способе очистки составл ла 12,2%, и степень очистки
составл ла 707 раз.
Пример 4. Измерение молекул рной массы фермента
SDS-гель-электрофорез
0,3 микрограмма (мкг) очищенной фракции фермента, полученной способом примера 3,
наносили на полиакриламидный гель дл электрофореза. 0,3% (масс./об.) триса, 1,44%
(масс./об.) глицина и 0,1% (масс./об.) лаурилсульфата натри использовали дл буферного раствора дл электрофореза, в качестве полиакриламидного гел использовали
гель, имеющий концентрационный градиент по концентрации гел от 10 до 20% (Multigel
10-20, производства Daiichi Pure Chemicals), и маркеры молекул рной массы Pharmacia
использовали в качестве маркеров молекул рной массы. После завершени электрофореза гель красили Кумасси бриллиантовым синим R-250 и равномерную полосу
регистрировали в положении молекул рной массы примерно 75 килодальтон (кДа).
Гель-фильтраци Фракцию очищенного фермента, полученную способом примера 3, наносили на колонку
Superdex 200pg (производства Amersham), предварительно уравновешенную 50 мМ
ацетатным буфером (pH 4,5), содержащим 1 М NaCl, и проводили гель-фильтрацию,
позвол такому же буферу (pH 4,5), содержащему 1 М NaCl, протекать через колонку,
чтобы измерить молекул рную массу. Маркеры молекул рной массы Pharmacia
использовали в качестве стандартных белков, имеющих известные молекул рные массы,
чтобы получить калибровочную кривую. В результате, молекул рна масса фермента
составила примерно 150 кДа.
На основании результатов SDS-гель-электрофореза и гель-фильтрации предположили,
что фермент вл етс гомодимером, имеющим молекул рную массу примерно 75 кДа.
Пример 5. Оптимум pH фермента
Вли ние pH исследовали в реакции, в которой образовывалс L-аланил-L-глутамин из
гидрохлорида сложного метилового эфира L-аланина и L-глутамина. В качестве буферов
использовали ацетатный буфер (pH от 3,9 до 5,4), MES-буфер (pH от 5,4 до 6,4),
фосфатный буфер (pH от 6,0 до 7,9), боратный буфер (pH от 7,8 до 9,3), CAPS-буфер (pH
от 9,3 до 10,7) и K2HPO4-NaOH-буфер (pH от 10,8 до 11,6). 1 микролитр (мкл) фермента из
фракции Mono S, полученного в примере 3, (примерно 180 U/мл) добавл ли к 100 мкл
Страница: 13
RU 2 300 565 C2
5
10
15
20
25
30
каждого из буферов (100 мМ), содержащего 100 мМ сложного метилового эфира L-аланина,
200 мМ L-глутамина и 10 мМ EDTA, и давали возможность взаимодействовать при 18°C в
течение 5 минут, чтобы измерить вли ние pH на реакцию. Результаты, основанные на том,
что за 100% принимали значение в случае использовани боратного буфера (pH 9,3),
показаны на фиг. 1. В результате, оптимум pH дл фермента составл л от 8 до 9,5.
Пример 6. Оптимум температуры фермента
Вли ние температуры исследовали на реакции, в которой L-аланил-L-глутамин
образовывалс из гидрохлорида сложного метилового эфира L-аланина и L-глутамина.
Аликвоту, объемом 1 мкл такой же фракции фермента, которую использовали в примере 5,
добавл ли к 100 мкл 100 мМ боратного буфера (pH 9,0), содержащего 100 мМ сложного
метилового эфира L-аланина, 200 мМ L-глутамина и 10 мМ EDTA, и давали возможность
взаимодействовать в течение 5 минут при каждой температуре, чтобы измерить вли ние
температуры на реакцию. Результаты, основанные на том, что за 100% принимали
значение активности при 34°C, показаны на фиг. 2. В результате, оптимальна температура дл фермента составл ла от 30 до 40°C.
Пример 7. Ингибиторы фермента
Вли ние ингибиторов на образование L-аланил-L-глутамина исследовали, использу в
качестве субстратов гидрохлорид сложного метилового эфира L-аланина и L-глутамина.
Аликвоту, объемом 2 мкл такой же фракции фермента, которую использовали в примере 5,
добавл ли к 50 мкл 100 мМ боратного буфера (pH 9,0), содержащего каждый из
ингибиторов фермента, показанных в таблице 2, в концентрации 10 мМ, и давали
возможность взаимодействовать при 25°C в течение 5 минут. Обратите внимание, что
орто-фенантролин, фенилметилсульфонилфторид и пара-нитрофенил-пара'гуанидинбензоат раствор ли в метаноле до концентрации 50 мМ перед использованием.
Активность фермента при каждом из условий указана в виде относительной активности в
случае, когда за 100 прин то значение образовани L-аланил-L-глутамина в отсутствие
ингибитора фермента. Полученные результаты показаны в таблице 2. В результате, среди
тестированных ингибиторов сериновых ферментов фермент не ингибировалс фенилметилсульфонилфторидом, но ингибировалс пара-нитрофенил-пара'гуанидинбензоатом.
Таблица 2
Ингибитор фермента
Относительна активность образовани L-Ala-L-Gln (%)
None
100
Ингибитор металлофермента
EDTA
орто-фенантролин
96
96
Ингибитор
N-этилмалеимид
110
SH-фермента
Монойодацетат
101
Фенилметилсульфонилфторид
115
4-(2-аминоэтил)бензолсульфонилфторид
75
Пара-нитрофенил-пара ,гуанидинбензоат
0,1
35
Ингибитор серинового
фермента
40
45
50
Пример 8. Образование L-аланил-L-глутамина из сложного метилового эфира L-аланина
и L-глутамина
Аликвоту, объемом 3 мкл такой же фракции фермента, которую использовали в примере
5, добавл ли к 100 мкл 100 мМ боратного буфера (pH 9,0), содержащего 100 мМ
гидрохлорида сложного метилового эфира L-аланина, 200 мМ L-глутамина и 10 мМ EDTA, и
давали возможность взаимодействовать при 18°C. В результате, как показано на фиг. 3,
образовывалось 83 мМ L-аланил-L-глутамина (L-Ala-L-Gln) в случае партии с добавлением
фермента, и концентраци побочного продукта L-Ala-L-Ala-L-Gln составл ла 1,3 мМ. С
другой стороны, почти никакого образовани L-Ala-L-Gln не наблюдалось в партии без
добавлени фермента, и концентраци фермента составл ла только примерно 0,07 мМ
после взаимодействи в течение 120 минут.
Пример 9. Вли ние концентрации L-глутамина на образование L-аланил-L-глутамина
Страница: 14
RU 2 300 565 C2
5
Аликвоту, объемом 1 мкл такой же фракции фермента, которую использовали в примере
5, добавл ли к 100 мкл 100 мМ боратного буфера (pH 9,0), содержащего 100 мМ
гидрохлорида сложного метилового эфира L-аланина, L-глутамин в концентраци х,
показанных в таблице 3, и 10 мМ EDTA, и давали возможность взаимодействовать при
18°C в течение 2 часов. Полученные результаты показаны в таблице 3.
Таблица 3
Гидрохлорид сложного
L-глутамин (мМ) L-Ala-L-Gln
метилового эфира L-аланина (мМ)
(мМ)
100
10
15
20
100
68,2
110
72,1
120
73,3
130
75,1
150
75,5
200
82,0
Пример 10. Субстратна специфичность фермента (1)
Специфичность по отношению к сложному эфиру исследовали в случае использовани сложного эфира L-аминокислоты в качестве карбоксильного компонента. Аликвоту,
объемом 2 мкл такой же фракции фермента, которую использовали в примере 5,
добавл ли к 100 мкл 100 мМ боратного буфера (pH 9,0), содержащего карбоксильные
компоненты, указанные в таблице 4, в концентрации 100 мМ, 200 мМ L-глутамина и 10 мМ
EDTA, и давали возможность взаимодействовать при 25°C в течение 2 часов. Количества
L-Ala-L-Gln, образованного в данной реакции, показаны в таблице 4 (в таблице 4 HCl
означает гидрохлорид).
Таблица 4
25
30
35
40
Карбоксильный компонент
Продуцируемый L-Ala-L-Gln (мМ)
Сложный метиловый эфир L-аланина HCl
84,3
Сложный этиловый эфир L-аланина ?HCl
91,5
Сложный изопропиловый эфир L-аланина ?HCl
78,9
Сложный трет-бутиловый эфир L-аланина ?HCl
7,5
Пример 11. Субстратна специфичность фермента (2)
Образование пептида исследовали в случае использовани сложного метилового эфира
L-аланина в качестве карбоксильного компонента и использу различные L-аминокислоты в
качестве аминного компонента. Аликвоту, объемом 2 мкл такой же фракции фермента,
которую использовали в примере 5, добавл ли к 100 мкл 100 мМ боратного буфера (pH
9,0), содержащего 100 мМ гидрохлорида сложного метилового эфира L-аланина, Lаминокислоты, показанные в таблице 5, в концентрации 150 мМ и 10 мМ EDTA, и давали
возможность взаимодействовать при 25°C в течение 3 часов. Количества каждого из
пептидов, образованных в данной реакции, показаны в таблице 5. Обратите внимание, что
знак "+" указывает такие пептиды, образование которых было подтверждено, но которые
нельз было количественно измерить из-за отсутстви стандарта, тогда как "следы"
указывает следовое количество.
Таблица 5
Аминный Продуцируемый Аминный
компонент пептид (мМ)
компонент
Gly
45
50
L-Ala
L-Ala-Gly
Продуцируемый
пептид (мМ)
13,7
L-Asn
L-Ala-L-Asn
65,5
L-Ala-L-Ala 25,4
L-Gln
L-Ala-L-Gln
79,3
17,6
L-Val
L-Ala-L-Val 20,8
L-Tyr
L-Ala-L-Tyr
L-Leu
L-Ala-L-Leu 45,3
L-CySH
L-Ala-L-CySH
+
L-Ile
L-Ala-L-Ile 33,9
L-Lys
L-Ala-L-Lys
71,8
L-Met
L-Ala-L-Met 83,3
L-Arg
L-Ala-L-Arg
88,0
L-Phe
L-Ala-L-Phe 74,4
L-His
L-Ala-L-His
66,9
L-Trp
L-Ala-L-Trp 53,9
L-Asp
L-Ala-L-Asp
2,1
L-Ser
L-Ala-L-Ser 62,5
L-Glu
L-Ala-L-Glu
42,9
L-The
L-Ala-L-Thr 53,9
L-Pro
L-Ala-L-Pro следы
Страница: 15
RU 2 300 565 C2
5
10
Пример 12. Субстратна специфичность фермента (3)
Образование пептида исследовали в случае использовани различных типов сложных
метиловых эфиров L-аминокислот в качестве карбоксильного компонента и использовани L-глутамина в качестве аминного компонента. Аликвоту, объемом 2 мкл такой же фракции
фермента, которую использовали в примере 5, добавл ли к 100 мкл 100 мМ боратного
буфера (pH 9,0), содержащего гидрохлориды сложных метиловых эфиров L-аминокислот
(AA-OMe?HCl), показанные в таблице 6, в концентрации 100 мМ, 150 мМ L-глутамина и 10
мМ EDTA, и давали возможность взаимодействовать при 25°C в течение 3 часов.
Количества каждого из пептидов, образованных в данной реакции, показаны в таблице 6.
Обратите внимание, что знак "+" указывает такие пептиды, образование которых было
подтверждено, но которые нельз было количественно измерить из-за отсутстви стандарта, тогда как "следы" указывает следовое количество. Кроме того, в реакционную
систему добавл ли Твин-80 до конечной концентрации 0,1% в случае использовани L-TrpOMe и L-Tyr-OMe.
15
Таблица 6
Карбоксильный Продуцируемый пептид Карбоксильный Продуцируемый пептид
компонент
(мМ)
компонент
(мМ)
20
25
30
35
40
Gly-OMe
Gly-L-Gln
54,7
L-Tyr-OMe
L-Tyr-L-Gln
L-Ala-OMe
L-Ala-L-Gln
74,6
CySH-OMe
L-CySH-L-Gln
+
L-Val-OMe
L-Val-L-Gln
15,4
L-Lys-OMe
L-Lys-L-Gln
+
L-Leu-OMe
L-Leu-L-Gln
+
L-Arg-OMe
L-Arg-L-Gln
7,1
L-Ile-OMe
L-Ile-L-Gln
8,4
L-His-OMe
L-His-L-Gln
+
L-Met-OMe
L-Met-L-Gln
12,0
L-Asp-?-OMe
?-L-Asp-L-Gln
следы
L-Phe-OMe
L-Phe-L-Gln
0,9
L-Asp-? -OMe
? -L-Asp-L-Gln
следы
L-Trp-OMe
L-Trp-L-Gln
+
L-Glu-?-OMe
?-L-Glu-L-Gln
+
L-Ser-OMe
L-Ser-L-Gln
24,0
L-Glu-y-OMe
y-L-Glu-L-Gln
+
L-Pro-OMe
L-Pro-L-Gln
2,2
L-Thr-OMe
L-Thr-L-Gln
81,9
L-Asn-OMe
L-Asn-L-Gln
+
L-Gln-OMe
L-Gln-L-Gln
0,3
3,4
В случае всех карбоксильных компонентов использовали гидрохлоридные соли.
Пример 13. Субстратна специфичность фермента (4)
Образование пептида исследовали в случае использовани различных сложных
метиловых эфиров L-аминокислот в качестве карбоксильного компонента и различных Lаминокислот в качестве аминного компонента. Аликвоту, объемом 2 мкл такой же фракции
фермента, которую использовали в примере 5, добавл ли к 100 мкл 100 мМ боратного
буфера (pH 9,0), содержащего гидрохлориды сложных метиловых эфиров L-аминокислот
(AA-OMe?HCl), показанные в таблице 7, в концентрации 100 мМ, L-аминокислоты,
показанные в таблице 7, в концентрации 150 мМ и 10 мМ EDTA, и давали возможность
взаимодействовать при 25°C в течение 3 часов. Образованные количества каждого из
пептидов, образованных в данной реакции, показаны в таблице 7. Обратите внимание, что
"следы" указывает следовое количество. Кроме того, в реакционную систему добавл ли
Твин-80 до конечной концентрации 0,1% в случае использовани L-Trp-OMe. Обратите
внимание, что знак "+" указывает такие пептиды, образование которых было
подтверждено, но которые нельз было количественно измерить из-за отсутстви стандарта.
45
50
Страница: 16
RU 2 300 565 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
В случае всех карбоксильных компонентов использовали гидрохлоридные соли.
Пример 14. Субстратна специфичность фермента (5)
Образование пептида исследовали в случае использовани L- или D-форм различных
сложных метиловых эфиров аминокислот в качестве карбоксильного компонента и L- или
D-форм различных аминокислот в качестве аминного компонента. 2 мкл такой же фракции
фермента, которую использовали в примере 5, добавл ли к 100 мкл 100 мМ боратного
буфера (pH 9,0), содержащего различные гидрохлориды сложных метиловых эфиров
аминокислот (AA-OMe?HCl), показанные в таблице 8, в концентрации 100 мМ, различные
аминокислоты, показанные в таблице 8, в концентрации 150 мМ и 10 мМ EDTA, и давали
возможность взаимодействовать при 25°C в течение 3 часов. Количества каждого из
пептидов, образованных в данной реакции, показаны в таблице 8. (Обратите внимание,
что "следы" указывает следовое количество).
Таблица 8
Карбоксильный Аминный Продуцируемый пептид (мМ)
компонент
компонент
D-Ala-OMe
L-Gln
D-Ala-OMe
50
D-Thr-OMe
D-Ala-L-Gln
69,3
D-Ala-L-Ser
20,3
D-Thr-Ser
1,0
D-Ser-L-Ser
3,3
D-Val-OMe
D-Val-L-Ser
0,6
D-Met-OMe
D-Met-L-Ser
5,1
L-Ala-D-Gln
0,3
D-Ser-OMe
L-Ala-OMe
L-Ser
D-Gln
Страница: 17
RU 2 300 565 C2
L-Ala-OMe
L-Ala-D-Ser
L-Thr-OMe
L-The-D-Ser
6,9
L-Ser-D-Ser
16,2
L-Val-OMe
L-Val-D-Ser
1,4
L-Met-OMe
L-Met-D-Ser
1,9
D-Ala-D-Gln
следы
D-Ala-D-Ser
0,2
L-Ser-OMe
5
D-Ala-OMe
D-Ser
D-Gln
D-Ala-OMe
D-Thr-OMe
D-Ser-OMe
10
15
20
D-Ser
5,4
D-Thr-D-Ser
1,1
D-Ser-D-Ser
2,5
D-Val-OMe
D-Val-D-Ser
0,5
D-Met-OMe
D-Met-D-Ser
2,7
В случае всех карбоксильных компонентов использовали гидрохлоридные соли.
Пример 15. Субстратна специфичность фермента (6)
Образование пептида исследовали, использу различные амиды L-аминокислот в
качестве карбоксильного компонента и различные L-аминокислоты в качестве аминного
компонента. Аликвоту, объемом 2 мкл такой же фракции фермента, которую использовали
в примере 5, добавл ли к 100 мкл 100 мМ боратного буфера (pH 9,0), содержащего соли
амидов L-аминокислот (AA-NH2?HCl), показанные в таблице 9, в концентрации 100 мМ, Lаминокислоты, показанные в таблице 9, в концентрации 150 мМ и 10 мМ EDTA, и давали
возможность взаимодействовать при 25°C в течение 3 часов. Количества каждого из
пептидов, образованных в данной реакции, показаны в таблице 9.
Таблица 9
Карбоксильный Аминный Продуцируемый (мМ)
компонент
компонент пептид
25
30
35
40
L-Phe-NH2
L-Gln
L-Phe-L-Gln
0,2
L-Phe-NH2
L-Ser
L-Phe-L-Ser
0,6
7,6
L-Ala-NH2
L-Gln
L-Ala-L-Gln
L-Ala-NH2
L-Met
L-Ala-L-Met
3,4
L-Ala-NH2
L-His
L-Ala-L-His
3,9
L-Thr-NH2
L-Gln
L-Thr-L-Gln
0,3
Пример 16. Субстратна специфичность фермента (7)
Образование пептида исследовали в случае использовани различных сложных
метиловых эфиров L-аланина в качестве карбоксильного компонента и C-защищенных Lаминокислот в качестве аминного компонента. Аликвоту, объемом 2 мкл такой же фракции
фермента, которую использовали в примере 5, добавл ли к 100 мкл 100 мМ боратного
буфера (pH 9,0), содержащего сложный метиловый эфир L-аланина (Ala-OMe?HCl),
показанный в таблице 10, в концентрации 100 мМ, гидрохлориды амидов L-аминокислот,
показанные в таблице 10, в концентрации 150 мМ и 10 мМ EDTA, и давали возможность
взаимодействовать при 25°C в течение 3 часов. Количества каждого из пептидов,
образованных в данной реакции, показаны в таблице 10.
Таблица 10
Карбоксильный Аминный Продуцируемый (мМ)
компонент
компонент компонент
Gly-NH2
L-Ala-OMe
45
50
L-Ala-Gly-NH 2
7,4
L-Ala-NH2 L-Ala-L-Ala-NH2 8,3
L-Phe-NH2 L-Ala-L-Phe-NH2 12,2
Пример 17. Субстратна специфичность фермента (8)
Образование пептида исследовали в случае использовани различных сложных
метиловых эфиров аминокислот в качестве карбоксильного компонента и метиламина в
качестве аминного компонента. Аликвоту, объемом 2 мкл такой же фракции фермента,
которую использовали в примере 5, добавл ли к 100 мкл 100 мМ боратного буфера (pH
9,0), содержащего гидрохлорид сложного метилового эфира аминокислоты (AA-OMe?HCl),
показанный в таблице 11, в концентрации 100 мМ, метиламин, показанный в таблице 11, в
Страница: 18
RU 2 300 565 C2
концентрации 150 мМ и 10 мМ EDTA, и давали возможность взаимодействовать при 25°C
в течение 3 часов. Количества каждого из пептидов, образованных в данной реакции,
показаны в таблице 11.
Таблица 11
5
Карбоксильный Аминный Продуцируемый пептид (мМ)
компонент
компонент
Gly-OMe
L-Thr-OMe
Gly-метиламин
Метиламин
L-Ala-OMe
10
15
L-Thr-метиламин
0,2
L-Ala-метиламин
0,3
Пример 18. Субстратна специфичность фермента (9)
Образование пептида исследовали в случае использовани сложного эфира Яаминокислоты в качестве карбоксильного компонента или Я-аминокислоты в качестве
аминного компонента. Аликвоту, объемом 2 мкл такой же фракции фермента, которую
использовали в примере 5, добавл ли к 100 мкл 100 мМ боратного буфера (pH 9,0),
содержащего карбоксильные компоненты, показанные в таблице 12, в концентрации 100
мМ, аминные компоненты, показанные в таблице 12, в концентрации 150 мМ и 10 мМ
EDTA, и давали возможность взаимодействовать при 25°C в течение 3 часов. Количества
каждого из пептидов, образованных в данной реакции, показаны в таблице 12. Обратите
внимание, что "следы" указывает следовое количество.
Таблица 12
20
Карбоксильный
компонент
25
30
1,1
Аминный
компонент
Продуцируемый
пептид
(мМ)
Gly-OMe
? -Ala
Gly-? -Ala
2,2
Gly-OMe
? -Phe
Gly-? -Phe
0,4
L-Ala-OMe
? -Ala
Ala-? -Ala
7,7
L-Ala-OMe
? -Phe
Ala-? -Phe
1,4
L-Thr-OMe
? -Ala
Thr-? -Ala
3,2
L-Thr-OMe
? -Phe
Thr-? -Phe
1,4
? -Ala-OMe
L-?-Ala
? -Ala-L-?-Ala
следы
? -Ala-OMe
? -Ala
?-Ala-? -Ala
0,2
B-Ala-OMe
L-Gln
? -Ala-L-Gln
0,6
B-Ala-OMe
L-Ser
? -Ala-L-Ser
3,2
В случае всех карбоксильных компонентов использовали гидрохлоридные соли.
35
40
45
50
Пример 19. Субстратна специфичность фермента (10)
Образование олигопептида исследовали в случае использовани сложного эфира Lаминокислоты в качестве карбоксильного компонента и пептида в качестве аминного
компонента. Аликвоту, объемом 2 мкл такой же фракции фермента, которую использовали
в примере 5, добавл ли к 100 мкл 100 мМ боратного буфера (pH 9,0), содержащего
карбоксильные компоненты, показанные в таблице 13, в концентрации 100 мМ, аминные
компоненты, показанные в таблице 13, в концентрации 150 мМ и 10 мМ EDTA, и давали
возможность взаимодействовать при 25°C в течение 3 часов. Количества каждого из
пептидов, образованных в данной реакции, показаны в таблице 13. В результате, было
сно показано, что данный фермент может образовывать не только дипептид, но также
длинноцепочечные пептиды при использовании пептида в качестве аминного компонента.
Как было показано в приведенных выше примерах 9-19, определено, что данный
фермент, полученный из Empedobacter brevis, штамм FERM P BP-8113 (Депозитарный
институт: независима административна корпораци , National Institute for Advanced
Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, адрес
депозитарного института: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken,
Japan, дата передачи международного депозита: 8 июл 2002) обладает очень широкой
субстратной специфичностью.
Страница: 19
RU 2 300 565 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Пример 20. Сравнение способности катализировать образование пептидов с
известными ферментами
Способность данного фермента образовывать пептид сравнивали со способностью
известных ферментов. Карбоксипептидазу Y, описанную в EP 278787A1, и тиоловые
эндопептидазы (фицин, папаин, бромелаин и химопапаин), описанные в EP 359399B1,
использовали в качестве известных ферментов, и их использовали в форме очищенных
ферментов производства Sigma. Фермент, очищенный до однородности в примере 3,
использовали в качестве источника фермента согласно данному изобретению. Указанные
ферменты добавл ли в реакционную систему в количествах, показанных в таблице 14 в
расчете на белок. Реакцию проводили, добавл фермент к 100 мкл боратного буфера (pH
9,0), содержащего 100 мМ гидрохлорида сложного метилового эфира L-аланина и 200 мМ
L-глутамина и дава возможность взаимодействовать при 25°C. Кроме того, фермент,
растворенный в 10 мМ ацетатном буфере (pH 5,0), содержащем 1 мМ EDTA, использовали
в случае карбоксипептидазы, тогда как фермент, растворенный в 10 мМ ацетатном буфере
(pH 5,0), содержащем 2 мМ EDTA, 0,1 М KCl и 5 мМ дитиотреитола, использовали в случае
тиоловой эндопептидазы. Отношени скоростей образовани L-аланил-L-глутамина
указанными ферментами показаны в таблице 14.
В результате, образование очень малого количества L-аланил-L-глутамина наблюдали
Страница: 20
RU 2 300 565 C2
5
10
15
даже в отсутствие фермента, тогда как небольшое увеличение скорости образовани наблюдали в партии, в которой добавл ли карбоксипептидазу или тиоловую
эндопептидазу, по сравнению с партией, в которую не добавл ли фермента. Напротив,
очень высока скорость образовани L-аланил-L-глутамина наблюдалась в партии, в
которую добавл ли данный фермент, и указанна скорость образовани была примерно в
5000-100000 раз более высокой, чем в случае карбоксипептидазы Y и тиоловой
эндопептидазы. Как описано выше, было подтверждено, что данный фермент обладает
очень высокой скоростью образовани пептида в отличие от любого фермента
предшествующего уровн техники. Кроме того, так как в отличие от фермента согласно
данному изобретению, вл ющегос димером, имеющим молекул рную массу примерно
75000, сообщалось, что молекул рна масса карбоксипептидазы Y составл ет примерно
61000, тогда как сообщалось, что молекул рна масса тиоловой эндопептидазы составл ет
примерно от 23000 до 36000, то скорость образовани L-аланил-L-глутамина на
молекул рную массу даже еще выше в случае фермента согласно данному изобретению,
чем на единичную массу, указанную в примерах.
Таблица 14
Фермент
20
25
30
35
40
45
50
Количество добавленного фермента Скорость образоОтношение
(мг белка/мл)
вани L-Ala-L-Gln (мМ/мин) скорости
образовани L-Ala-L-Gln
на единицу
массы
фермента
Без фермента
0
0,0006
Карбоксипептидаза Y
0,61
0,0257
0,0191
Фицин
2,60
0,0096
0,0017
Папаин
2,30
0,0106
0,0021
Бромелаин
2,80
0,0062
0,0010
Химопапаин
3,60
0,0100
0,0013
Фермент согласно
данному изобретению
0,02
4,4000
100,0
Пример 21. Получение L-аланил-L-глутамина с использованием клеток микроорганизмов
Sphingobacterium sp.
50 мл среды (pH 7,0), содержащей 5 г глюкозы, 5 г сульфата аммони , 1 г
однозамещенного фосфата кали , 3 г двухзамещенного фосфата кали , 0,5 г сульфата
магни , 10 г дрожжевого экстракта и 10 г пептона в 1 л переносили в колбу Сакагучи
объемом 500 мл и стерилизовали при 115°C в течение 15 минут дл культивировани Sphingobacterium sp., штамм FERM BP-8124 (депозитарный институт: независима административна корпораци , National Institute for Advanced Industrial Science and
Technology, International Patent Organism Depositary, адрес депозитарного института:
Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, дата международного
депозита: 22 июл 2002). Затем в среду инокулировали одну полную петлю
Sphingobacterium sp., штамм FERM BP-8124 (депозитарный институт: независима административна корпораци , National Institute for Advanced Industrial Science and
Technology, International Patent Organism Depositary, адрес депозитарного института:
Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, дата международного
депозита: 22 июл 2002), культивируемого при 30°C в течение 24 часов на косой агаровой
среде (агар: 20 г/л, pH 7,0), содержащей 5 г глюкозы, 10 г дрожжевого экстракта, 10 г
пептона и 5 г NaCl в 1 л, с последующим культивированием на качалке при 30°C в течение
20 часов и 120 качани х/минуту. Затем аликвоту данного культурального бульона объемом
1 мл добавл ли к указанной выше среде (50 мл/колбу Сакагучи объемом 500 мл) и
культивировали при 30°C в течение 18 часов. После завершени культивировани клетки
микроорганизмов отдел ли от культурального бульона центрифугированием и
суспендировали в 0,1 М боратном буфере (pH 9,0), содержащем 10 мМ EDTA, до 100 г/л в
расчете на влажные клетки микроорганизмов. Затем аликвоту объемом 0,1 мл 100 мМ
боратного буфера (pH 9,0), содержащего 10 мМ EDTA, 200 мМ гидрохлорида сложного
Страница: 21
RU 2 300 565 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
метилового эфира L-аланина и 400 мМ L-глутамина, добавл ли к 0,1 мл указанной
суспензии клеток микроорганизмов и после доведени до конечного объема 0,2 мл давали
возможность взаимодействовать при 25°C в течение 120 минут. Количество образованного
за это врем L-аланил-L-глутамина составл ло 62 мМ.
Пример 22. Очистка фермента из Sphingobacterium sp.
Следующую процедуру после разделени центрифугированием осуществл ли либо на
льду, либо при 4°C. Sphingobacterium sp., штамм FERM BP-8124 (депозитарный институт:
независима административна корпораци , National Institute for Advanced Industrial
Science and Technology, International Patent Organism Depositary, адрес депозитарного
института: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, дата
международного депозита: 22 июл 2002) культивировали таким же образом, как в примере
21, и клетки микроорганизмов собирали, отдел с помощью центрифугировани (10000
об/мин, 15 минут). После промывки 2 г клеток микроорганизмов 20 мМ трис-HCl-буфером
(pH 7,6) их суспендировали в 8 мл такого же буфера и подвергали разрушению
ультразвуком в течение 45 минут при 195 Вт. Затем полученную после разрушени ультразвуком жидкость центрифугировали (10000 об/мин, 30 минут), чтобы удалить
фрагменты разрушенных клеток и получить жидкий надосадок после ультразвукового
разрушени . Указанный жидкий надосадок после ультразвукового разрушени диализовали
в течение ночи против 20 мМ трис-HCl-буфера (pH 7,6) с последующим удалением
нерастворимой фракции ультрацентрифугированием (50000 об/мин, 30 минут), получа растворимую фракцию в форме надосадочной жидкости. Полученную в результате
растворимую фракцию наносили на колонку с Q-сефарозой HP (производства Amersham),
предварительно уравновешенную трис-HCl-буфером (pH 7,6), и собирали активную
фракцию из неадсорбированной фракции. Указанную активную фракцию диализовали в
течение ночи против 20 мМ ацетатного буфера (pH 5,0) с последующим удалением
нерастворимой фракции разделением с помощью центрифугировани (10000 об/мин, 30
минут), получа диализованную фракцию в форме надосадочной жидкости. Затем
полученную диализованную фракцию наносили на колонку с SP-сефарозой HP
(производства Amersham), предварительно уравновешенную 20 мМ ацетатным буфером
(pH 5,0), чтобы получить активную фракцию, в которой фермент элюировали линейным
градиентом концентраций такого же буфера, содержащего от 0 до 1 М NaCl.
Пример 23. Получение L-аланил-L-глутамина с использованием фракции фермента
Аликвоту, объемом 10 мкл фракции с SP-сефарозы HP (примерно 27 U/мл), очищенной в
примере 22, добавл ли к 90 мкл 111 мМ боратного буфера (pH 9,0), содержащего 111 мМ
гидрохлорида сложного метилового эфира L-аланина, 222 мМ L-глутамина и 11 мМ EDTA, и
давали возможность взаимодействовать при 25°C в течение 120 минут. В результате, в
партии с добавлением фермента образовалось 73 мМ L-аланил-L-глутамина. С другой
стороны, почти никакого образовани L-Ala-L-Glu не наблюдалось в партии без
добавлени фермента, и образованное количество составл ло только примерно 0,07 мМ
после взаимодействи в течение 120 минут.
Пример 24. Субстратна специфичность фермента (11)
Исследовали субстратную специфичность фермента, полученного из Sphingobacterium
sp., штамм FERM BP-8124 (Депозитарный институт: независима административна корпораци , National Institute for Advanced Industrial Science and Technology,
International Patent Organism Depositary, адрес депозитарного института: Chuo Dai-6,
1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, дата международного депозита:
22 июл 2002). 100 мкл 100 мМ боратного буфера (pH 9,0), содержащего различные
карбоксильные компоненты в конечной концентрации 100 мМ и различные аминные
компоненты в конечной концентрации 150 мМ, показанные в таблицах с 15-1 по 15-4,
фракцию фермента с SP-сефарозы HP, очищенную в примере 22 (добавление 0,33
единицы в реакционную жидкость) и 10 мМ EDTA, давали возможность взаимодействовать
при 25°C в течение 1,5 часа. Количества каждого из пептидов, образованных в данной
реакции, показаны в таблице 15. Обратите внимание, что знак "+" указывает такие
Страница: 22
RU 2 300 565 C2
5
пептиды, образование которых было подтверждено, но которые нельз было
количественно измерить из-за отсутстви стандарта, тогда как "следы" указывает
следовое количество. Кроме того, в реакционную систему добавл ли Твин-80 до конечной
концентрации 0,1% в случае использовани L-Trp-OMe. Кроме того, в случае всех
карбоксильных компонентов использовали гидрохлориды.
Таблица 15-1
Карбоксильный Аминный Продуцируемый пептид (мМ)
компонент
компонент
10
L-Ala-OMe
15
20
25
D-Ala-OMe
Gly
L-Ala-Gly
11,1
L-Ala
L-Ala-L-Ala
13,1
L-Val
L-Ala-L-Val
10,9
L-Leu
L-Ala-L-Leu
33,0
L-Ile
L-Ala-L-Ile
24,7
L-Met
L-Ala-L-Met
86,9
L-Pro
L-Ala-L-Pro
1,5
L-Phe
L-Ala-L-Phe
69,5
L-Trp
L-Ala-L-Trp
46,0
L-Thr
L-Ala-L-Thr
47,3
L-Asn
L-Ala-L-Asn
52,3
L-Tyr
L-Ala-L-Tyr
11,1
L-CySH
L-Ala-L-CySH
+
L-Lys
L-Ala-L-Lys
71,2
L-Arg
L-Ala-L-Arg
72,2
L-His
L-Ala-L-His
73,6
L-Asp
L-Ala-L-Asp
2,3
L-Glu
L-Ala-L-Glu
39,1
43,8
L-Ser
L-Ala-L-Ser
D-Ser
L-Ala-D-Ser
3,3
L-Ser
D-Ala-L-Ser
24,1
D-Ser
D-Ala-D-Ser
5,5
Таблица 15-2
30
Карбоксильный Аминный Продуцируемый пептид (мМ)
компонент
компонент
L-Thr-OMe
L-Thr-Gln
36,1
Gly-OMe
Gly-L-Gln
61,1
L-Ser-L-Gln
12,9
L-Ser-OMe
35
40
L-Val-OMe
L-Gln
L-Val-L-Gln
8,2
L-Met-OMe
L-Met-L-Gln
32,6
L-Ile-OMe
L-Ile-L-Gln
6,4
L-Arg-OMe
L-Arg-Gln
17,2
L-Tyr-OMe
L-Tyr-L-Gln
0,6
L-Pro-OMe
L-Pro-L-Gln
1,8
L-Phe-OMe
L-Phe-L-Gln
0,8
L-Gln-OMe
L-Gln-L-Gln
0,1
Asp-?-OMe
?-L-Asp-L-Gln
0,05
Таблица 15-3
45
Карбоксильный Аминный Продуцируемый пептид (мМ)
компонент
компонент
L-Thr-OMe
50
Gly-OMe
Gly
L-Thr-Gly
0,4
L-Ala
L-Thr-L-Ala
5,8
L-Val
L-Thr-L-Val
1,3
L-Leu
L-Thr-L-Leu
15,3
L-Met
L-Thr-L-Met
28,9
L-Arg
Gly-L-Arg
17,9
L-Phe
Gly-L-Phe
20,0
L-His
Gly-L-His
36,2
L-Lys
Gly-L-Lys
48,2
Страница: 23
RU 2 300 565 C2
L-Ser-OMe
5
L-Val-OMe
L-Met-OMe
10
L-Ile-OMe
L-Arg-OMe
15
L-Ser
Gly-L-Ser
L-Ser
L-Ser-L-Ser
53,8
9,9
L-Met
L-Ser-L-Met
7,6
L-Phe
L-Ser-L-Phe
4,3
L-Ser
L-Val-L-Ser
31,9
L-Met
L-Val-L-Met
6,8
L-Phe
L-Val-L-Phe
1,0
L-Ser
L-Met-L-Ser
25,3
L-Met
L-Met-L-Met
28,4
L-Phe
L-Met-L-Phe
8,9
L-Ser
L-Ile-L-Ser
17,3
L-Met
L-Ile-L-Met
5,1
L-Phe
L-Ile-L-Phe
1,5
L-Ser
L-Arg-L-Ser
2,2
L-Met
L-Arg-L-Met
следы
L-Phe
L-Arg-L-Phe
следы
Таблица 15-4
Карбоксильный
компонент
Аминный
компонент
L-Ala-OMe
20
Продуцируемый пептид
(мМ)
Амид Gly
Амид L-Ala-Gly
15,1
Амид L-Ala
Амид L-Ala-L-Ala
9,2
Амид L-Phe
Амид L-Ala-Phe
27,1
L-Ala-Метиламин
0,6
Метиламин
L-The-Метиламин
0,3
L-Ala-OMe
L-Thr-OMe
Gly-OMe
25
Амид L-Ala
Gly-метиламин
1,0
L-Gln
L-Ala-L-Gln
0,3
L-Met
L-Ala-L-Met
следы
L-His
L-Ala-L-His
следы
В случае всех амидов аминокислот использовали гидрохлоридные соли
30
35
40
Пример 25. Субстратна специфичность фермента (12)
Субстратную специфичность по отношению к образованию олигопептидов исследовали
дл фермента, полученного из Sphingobacterium sp., штамм FERM BP-8124 (Депозитарный
институт: независима административна корпораци , National Institute for Advanced
Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, адрес
депозитарного института: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken,
Japan, дата международного депозита: 22 июл 2002). Аликвоту, объемом 100 мкл 100 мМ
боратного буфера (pH 9,0), содержащего различные карбоксильные компоненты в конечной
концентрации 100 мМ и различные аминные компоненты в конечной концентрации 150 мМ,
показанные в таблице 16, фракцию фермента с SP-сефарозы HP, очищенную в примере 22
(добавление 0,33 единицы в реакционную жидкость) и 10 мМ EDTA, давали возможность
взаимодействовать в течение 1,5 часа при 25°C. Количества каждого из олигопептидов,
образованных в данной реакции, показаны в таблице 16. Кроме того, в случае всех
карбоксильных компонентов использовали гидрохлориды.
Таблица 16
Карбоксильный Аминный компонент
компонент
45
L-Ala-OMe
Продуцируемый пептид
(мМ)
L-Ala
L-Ala-L-Ala
25,6
L-Ala-L-Ala
L-Ala-L-Ala-L-Ala
41,1
L-Ala-L-Ala-L-Ala
L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala
30,1
L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala 22,8
Gly-Gly
50
L-Ala-Gly-Gly
33,7
Gly-Ala
L-Ala-Gly-L-Ala
35,7
L-His-L-Ala
L-Ala-L-His-L-Ala
58,0
L-Phe-Gly
L-Ala-L-Phe-Gly
34,0
L-Leu-L-Ala
L-Leu-L-Leu-L-Ala
40,7
L-Phe-L-Ala
L-Ala-L-Phe-L-Ala
24,8
Страница: 24
RU 2 300 565 C2
5
L-Thr-OMe
Gly-Gly
L-Thr-Gly-Gly
8,4
Gly-OMe
L-Ala-L-Tyr
Gly-L-Ala-L-Tyr
0,6
Пример 26. Субстратна специфичность фермента (13)
Субстратную специфичность дополнительно анализировали, использу такую же
фракцию фермента, которую использовали в примере 5.
Таблица 17
10
15
Карбоксильный
компонент
(мМ)
H-Ala-OMe
50 мМ
H-p-F-Phe-OH
50 мМ
H-Ala-OMe
40 мМ
H-Cl-F-Phe-OH
40 мМ
H-Ala-OMe
40 мМ
H-p-NO2-Phe-OH
40 мМ
H-Ala-p-NO2-Phe-OH 27,5 мМ
H-Ala-OMe
100 мМ
H-t-Leu-OH
150 мМ
25
40
45
50
(мМ)
Врем реакции
(час)
H-Ala-p-F-Phe-OH
21,9 мМ
3
0H-Ala-Cl-F-Phe-OH
20,8 мМ
3
H-Ala-t-Leu-OH
0,4 мМ
3
3
20 мМ
H-2-Nal-OH
20 мМ
H-Ala-2-Nal-OH
+
3
100 мМ
H-Gln-OH
150 мМ
H-p-F-Phe-H-Gln-OH
следы
3
H-Cl-F-Phe-OMe
25 мМ
H-Gln-OH
50 мМ
H-Cl-F-Phe-H-Gln-OH
следы
3
H-p-NO2-Phe-OMe 40 мМ
H-Gln-OH
40 мМ H-p-NO2-Phe-H-Gln-OH 1,1 мМ
3
H-Gln-OH
150 мМ
H-t-Leu-H-Gln-OH
следы
3
3
100 мМ
H-2-Nal-OMe
40 мМ
H-Gln-OH
40 мМ
H-2-Nal-H-Gln-OH
следы
H-Aib-OMe
100 мМ
H-Gln-OH
150 мМ
H-Aib-H-Gln-OH
18,8 мМ
3
H-N-Me-Ala-OMe 100 мМ
H-Gln-OH
150 мМ H-N-Me-Ala-H-Gln-OH
0,5 мМ
3
3
H-Aib-OMe
100 мМ
H-Phe-OH
150 мМ
H-Aib-Phe-OH
17,2 мМ
H-CHA-Ome
40 мМ
H-Phe-OH
40 мМ
H-CHA-Phe-OH
+
3
H-N-Me-Ala-OMe 100 мМ
H-Phe-OH
150 мМ
H-N-Me-Ala-Phe-OH
следы
3
H-Ala-OMe
100 мМ
H-Ser(tBu)-OH
150 мМ
H-Ala-Ser(tBu)-OH
48,8 мМ
2
H-Ser(tBu)-OMe
100 мМ
H-Gln-OH
150 мМ
H-Ser(tBu)-Gln-OH
следы
2
H-Ala-OMe
100 мМ
H-Asp(OtBu)-OH
150 мМ
H-Ala-Asp(OtBu)-OH
62,6 мМ
2
H-Gln-OH
150 мМ
H-Asp(OtBu)-Gln-OH
0,9 мМ
2
H-Lys(Boc)-OH
150 мМ
H-Ala-Lys(Boc)-OH
51,0 мМ
2
H-Gln-OH
150 мМ
H-Lys(Boc)-Gln-OH
+
2
H-Asp(OtBu)-OMe 100 мМ
100 мМ
H-Lys(Boc)-OMe 100 мМ
35
Продуцируемый
пептид
H-Ala-OMe
H-Ala-OMe
30
(мМ)
H-p-F-Phe-OMe
H-t-Leu-OMe
20
Аминн?
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
2
Размер файла
467 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа