close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент РФ 2334958

код для вставки
РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
RU
(19)
(11)
2 334 958
(13)
C2
(51) МПК
G01J 3/44
(2006.01)
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
(21), (22) За вка: 2005133864/28, 05.04.2004
(72) Автор(ы):
ПОПОНИН Владимир (US)
(24) Дата начала отсчета срока действи патента:
05.04.2004
(73) Патентообладатель(и):
ИНТЕРНЭШНЛ ФРОНТЬЕР САЙЕНС
ОРГАНИЗЕЙШН (US)
R U
(30) Конвенционный приоритет:
04.04.2003 US 60/460,702
(43) Дата публикации за вки: 20.05.2007
(45) Опубликовано: 27.09.2008 Бюл. № 27
2 3 3 4 9 5 8
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: US 6002471 А, 14.12.1999. US 6441359
В1, 27.08.2002. US 5479024 А, 26.12.1995. RU
2000104843 А,10.03.2002.
(85) Дата перевода за вки PCT на национальную фазу:
07.11.2005
2 3 3 4 9 5 8
R U
(87) Публикаци PCT:
WO 2004/090505 (21.10.2004)
C 2
C 2
(86) За вка PCT:
US 2004/010544 (05.04.2004)
Адрес дл переписки:
123100, Москва, а/ 48, Юридическа фирма
"Жигачев и Христофоров", пат.пов.
А.А.Христофорову, рег.№ 509
(54) УСТРОЙСТВО И СПОСОБ ДЛЯ УЛУЧШЕННОГО НАНОСПЕКТРОСКОПИЧЕСКОГО
СКАНИРОВАНИЯ
(57) Реферат:
Изобретение относитс к аналитическим
методам. Аппарат включает субстрат, имеющий
плазмонно-резонансную поверхность, на которой
размещаетс образец, источник светового луча, и
линзовый узел, имеющий кончик и размещенную на
кончике нанолинзу, состо щую из одной или
нескольких плазмонно-резонансных частиц (PRP).
PRP расположены таким образом, чтобы создавать
моды электромагнитного зазора в ближней зоне в
пространстве между нанолинзой и прилегающим к
ней участком детектировани на поверхности
субстрата, при величине зазора между нанолинзой
и субстратом 30 нм или меньше. Фокусирующий
механизм в аппарате осуществл ет перемещение
линзового узла по направлению к поверхности
субстрата и от нее дл создани мод
электромагнитного
зазора,
усиливающих
спектральные
сигналы
комбинационного
рассе ни , генерируемые образцом на участке
детектировани . Аппарат и способ пригодны,
например, дл идентификации последовательно
расположенных оснований в одноцепочечной ДНК,
дл пр мого секвенировани ДНК. Технический
результат
возможность
осуществлени параллельного анализа множества образцов. 2 н. и
16 з.п. ф-лы, 8 ил.
Страница: 1
RU
C 2
C 2
2 3 3 4 9 5 8
2 3 3 4 9 5 8
R U
R U
Страница: 2
RUSSIAN FEDERATION
RU
(19)
(11)
2 334 958
(13)
C2
(51) Int. Cl.
G01J 3/44
(2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY,
PATENTS AND TRADEMARKS
(12)
ABSTRACT OF INVENTION
(21), (22) Application: 2005133864/28, 05.04.2004
(72) Inventor(s):
POPONIN Vladimir (US)
(24) Effective date for property rights: 05.04.2004
(73) Proprietor(s):
INTERNEhShNL FRONT'ER SAJENS
ORGANIZEJShN (US)
(30) Priority:
04.04.2003 US 60/460,702
R U
(43) Application published: 20.05.2007
(45) Date of publication: 27.09.2008 Bull. 27
2 3 3 4 9 5 8
(85) Commencement of national phase: 07.11.2005
(86) PCT application:
US 2004/010544 (05.04.2004)
(87) PCT publication:
WO 2004/090505 (21.10.2004)
2 3 3 4 9 5 8
R U
(54) DEVICE AND METHOD FOR IMPROVED NANOSPECTROSCOPIC SCANNING
(57) Abstract:
FIELD: physics.
SUBSTANCE: invention is related to analytical
method. Device includes substrate with plasmonresonance surface, on which sample is placed,
source of light beam, and lens unit that has tip
and nanolens installed on the tip, which consists
of one or several plasmon-resonance particles
(PRP). PRP are installed so that modes of
electromagnet clearance are created in near-field
region in the space between nanolens and
detection area on substrate surface adjacent to
it, with value of clearance between nanolens and
substrate of 30 nm or less. Focusing mechanism in
device executes displacement of lens beam in
direction to substrate surface and back for
creation of electromagnet clearance modes, which
amplify spectral signal of combination dispersion
that are generated by sample on detection area.
Device and method are suitable, for instance, for
identification
of
serially
installed
bases
in
single-stranded DNA, for direct sequencing of DNA.
EFFECT: provides possibility to to carry out
parallel analysis of multiple samples.
18 cl, 8 dwg
Страница: 3
EN
C 2
C 2
Mail address:
123100, Moskva, a/ja 48, Juridicheskaja firma
"Zhigachev i Khristoforov", pat.pov.
A.A.Khristoforovu, reg.№ 509
RU 2 334 958 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Область техники
Насто щее изобретение относитс к области наноспектроскопического сканировани , в
частности к способу и аппарату, способному спектроскопически идентифицировать
структуры отдельных молекул или отдельных химических групп на субстрате.
Литературные источники
Указанные ниже ссылки приведены как часть известного уровн техники и/или в
качестве источников методик, которые могут быть использованы в определенных аспектах
насто щего изобретени . Эти ссылки включены в насто щее изобретение.
G.R.Brewer, Electron-Beam Technology in Microelectronic Fabrication, Academic
Press, NY (1980).
David Ginger et al., "The evolution of Dip-Pen Nanolithography", Angew. Chem. Int.
Ed., v.43, p.30-45 (2004).
S.Hayashi, "Spectroscopy of Gap Modes in Meta Particle-Surface Systems,
"TpoicsAppl. Phys., 81:71-95 (2001).
I-K.Kneipp et al., "Ultrasensitive Chemical Analyses by Raman Spectroscopy", Chem.
Rev., 1999, vol.99, p.2957-2975, see p.271.
V.Matyushin, A et al., "Tuning the setup of sputter-coated multilayers in
nanocluster-based signal enhancing biochips for optimal performance in protein and
DNA-assays", J.Nanoscience and Nanotechnology, Volume 4, Number 1/2 (January/February
2004), pp.98-105 (2004).
D.McCamant, "Femtosecond Broadband Stimulated Raman: A new Approach for HighPerformance Vibrational Spectroscopy", Applied Spectroscopy, Vol.57, p.1317-1323, 2003.
S.C.Minne et al., "Automated parallel high-speed atomic force microscopy", Applied
Physics Letters, Vol.72, p.2340-2342, 1998.
S.C.Minne et al., "Bringing Scanning Probe Microscopy up to Speed", 173 p., Kluwer
Academic Publiishers, 1999.
C.M.Niemeyer, "Self-assembled nanostructures based on DNA: towards the development
of nanobiotechnology", Current Opinion in Chemical Biology, v.4, p.609-618, 2000.
J.P.Rabe. "Self-assembly of single rrmacromolecules at surfaces". Current Opinion
in Colloid and Interface Science. Vol.3, p.27-31, 1998.
F.Wolf et al., Review of Scientific Instruments, 1999, Vol.70, p.2751-2757, "Novel
Scanning Near-Field Optical Microscope (SNOM)/scanning confocal optical microscope
based on normal force distance regulation and bent etched fiber tips."
Y.Xia et al., Advanced Functional Materials, v.13, p.907-918, 2003 "Templateassisted Self-Assembly of Spherical Colloids into Complex and Controllable Structures"
H.Xu et al. Phys. Rev. E., v.62, p.4318, 2000.
F.Zenhausen, et al., "Scanning Interferometric Apertureless Microscopy: Optical
Imaging at 10 Angstrom Resolution", Aug.25, 1995, Science, Vol.269.
Известный уровень техники
Известны различные инструменты и способы исследовани поверхностных
характеристик и структуры на микро- и даже наноуровне. Сканирующа атомно-силова микроскопи (AFM) позвол ет получать изображение поверхностной топологии на
микроуровне путем перемещени кончика детектора, закрепленного на свободном конце
консоли над поверхностью или по поверхности анализируемого материала. Такой тип
микроскопа может работать путем пр мого физического контакта с поверхностью или, в
туннельном режиме, путем детектировани туннельного тока, когда кончик детектора
находитс на заданном рассто нии от поверхности. Этот тип устройств оказалс очень
полезным дл получени изображений поверхностной топографии, например дл детектровани дефектов на кристаллах интегральных схем, но не рассчитан и не может
быть использован дл детектировани конкретных химических соединений или химических
групп. Эта концепци была расширена в методе высокоскоростной AFM с параллельным
перемещением (например, Minne, 1998; 1999).
Метод сканирующего датчика был также адаптирован дл оптического детектировани Страница: 4
DE
RU 2 334 958 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
топографии поверхности. Патент США №6441359, например, описывает систему
оптического сканировани в ближней зоне, в которой оптика ближней зоны закреплена на
свободном конце консоли. Патент также раскрывает микротехнологии изготовлени матрицы таких оптических элементов дл системы оптического сканировани .
Рассто ние от кончика щупа до образца в аппарате контролируетс с помощью
оптической системы отклонени уровн , обеспечивающей близкое расположение кончика к
поверхности образца. Система способна достигать разрешени меньше длины волны за
счет сканировани с апертурой, имеющей размеры меньше длины волны, или путем
сканировани твердофазными иммерсионными линзами, расположенными очень близко к
образцу. Устройство не рассчитано и не может использоватьс дл детектировани индивидуальных химических молекул или групп вследствие очень низкого уровн сигнала,
который может быть получен при этом. Сканирующие оптические микроскопы ближнего
пол (SNOM) были предложены другими авторами (например, Wolf).
Одним из очень чувствительных методов химического анализа вл етс спектроскопи комбинационного рассе ни (рамановска спектроскопи ) с поверхностным усилением или
SERS (см., например, Kneipp). Кроме того, методика SERS использовалась в сканирующем
микроскопе высокого разрешени дл достижени высокого разрешени спектроскопической информации о поверхности образца, например, патент США
№6002471. Устройство включает небольшой провод щий элемент (плазменна резонансна частица, или PRP) на незакрепленном конце сканирующей консоли,
предназначенный дл усилени света, излучаемого вблизи датчика. Субстрат образца
состоит из стекла. Патент не раскрывает и не предполагает возможности использовани мод электромагнитного зазора дл увеличени спектроскопического разрешени , которое,
веро тно, позволило бы различать отдельные химические структуры, такие как основани ДНК, а также не содержит упоминаний о системе, способной осуществл ть параллельный
анализ множества образцов, например, выт нутых цепей ДНК.
Сущность изобретение
В одном аспекте изобретение включает аппарат дл идентификации химических групп в
образце, закрепленном на поверхности. Аппарат включает плазменный резонансный
субстрат, т.е. субстрат с зеркальной поверхностью, на котором крепитс образец,
источник светового луча, предпочтительно когерентного света, и линзовый узел, имеющий
кончик и нанолинзу, состо щую из одной или нескольких плазменных резонансных частиц
(PRP). PRP расположены на кончике и предназначены дл создани , при прохождении
светового луча через нанолинзу, мод ближнего пол электромагнитного зазора в
пространстве между нанолинзой и прилегающим к ней участком детектировани на
поверхности субстрата при величине зазора между нанолинзой и субстратом 40 нм или
меньше.
Фокусирующий механизм аппарата, такой как пьезоэлектрический привод, способен
перемещать линзовый узел в направлении к или от поверхности субстрата, при величине
зазора между ними менее 40 нм, дл создани мод электромагнитного зазора,
усиливающих спектральные сигналы комбинационного рассе ни , создаваемые образцом
на участке детектировани . Свет, излучаемый или рассеиваемый образцом на участке
детектировани , улавливаетс детектором, который преобразует улавливаемый свет в
характеристический спектр комбинационного рассе ни , позвол ющий идентифицировать
химическую группу образца на участке детектировани . Аппарат может включать механизм
линейного перемещени , такой как пьезоэлектрический привод, дл линейного
перемещени линзового узла относительно субстрата с целью позиционировани линзового узла над другими участками детектировани субстрата.
Нанолинза в узле предпочтительно включает по меньшей мере три указанных PRP,
расположенных симметрично вокруг центральной оси, перпендикул рной к плоскости
поверхности субстрата, причем максимальный размер каждого PRP не превышает 50-200
нм, а рассто ние между любой парой PRP существенно меньше длины волны светового
луча. PRP могут иметь сферическую или эллипсоидальную форму и быть ориентированы
Страница: 5
RU 2 334 958 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
таким образом, чтобы их большие оси пересекались с центральной осью. Источник света в
данном варианте исполнени может создавать луч циркул рно пол ризованного света,
предпочтительно когерентного света, плоскость пол ризации которого ориентирована
перпендикул рно к центральной оси.
Линзовый узел может включать консоль с кончиком на своем незакрепленном конце,
причем фокусирующий механизм функционально св зан с консолью.
Механизм предпочтительно позвол ет устанавливать нанолинзу в положение,
наход щеес на заданном рассто нии в интервале от 0,1 до 5 нм от поверхности
субстрата.
Дл использовани при секвенировании линейной цепи нуклеиновой кислоты путем
последовательного анализа оснований (химических групп) цепи нуклеиновой кислоты
субстрат включает молекул рные кор дл удерживани цепи нуклеиновой кислоты в
линейно выт нутом состо нии, и механизм линейного перемещени обеспечивает
перемещение линзового узла вдоль цепи дл последовательного анализа и идентификации
каждого основани в цепи. Дл одновременного анализа множества образцов,
представл ющих собой, по сути, нуклеиновые кислоты, аппарат предусматривает
множество линейно ориентированных консольно-линзовых агрегатов, перемещение
каждого из которых по направлению к поверхности субстрата и от нее может
индивидуально контролироватьс с помощью соответствующего фокусирующего
механизма, св занного с каждым линзовым узлом, которые перемещаютс в линейном
направлении как одно целое с помощью единого механизма линейного перемещени .
В другом аспекте способ включает способ идентификации химических групп в образце.
После закреплени образца на субстрате, имеющем плазмонно-резонансную зеркальную
поверхность, световой луч направл етс на образец через нанолинзу линзового узла
описанного выше типа дл создани мод ближней зоны электромагнитного зазора в
пространстве между нанолинзой и прилегающим к ней участком детектировани на
поверхности субстрата при величине зазора между нанолинзами и субстратом 40 нм или
меньше. Линзовый узел перемещаетс по направлению к поверхности субстрата или от
нее, причем рассто ние между нанолинзой и поверхностью субстрата составл ет менее 40
нм, дл создани мод электромагнитного зазора, усиливающих спектральные сигналы
комбинационного рассе ни , генерируемые образцом на участке детектировани . Свет,
излучаемый или рассеиваемый образцом на участке детектировани , улавливаетс детектором и преобразуетс в рамановский спектр, характерный дл анализируемой
химической группы, по которому может быть идентифицирована химическа группа на
участке детектировани .
Положение линзового узла может контролироватьс дл установки нанолинзы с
заданным значением величины зазора в интервале от 0,1 до 5 нм от поверхности
субстрата. Нанолинза может состо ть из по меньшей мере трех PRP, расположенных
симметрично вокруг центральной оси, перпендикул рной к плоскости поверхности
субстрата, причем кажда частица имеет размер наибольшей оси менее 50-200 нм, а
рассто ние между любой парой частиц существенно меньше длины волны светового луча.
Свет, направл емый на линзу, предпочтительно представл ет собой луч циркул рно
пол ризованного света, плоскость пол ризации которого ориентирована перпендикул рно
по отношению к центральной оси.
При использовании дл секвенировани линейной цепи нуклеиновой кислоты образец
может быть закреплен на поверхности субстрата путем линейного раст жени цепи и
фиксации противоположных конечных участков цепей на субстрате. Способ дополнительно
включает линейное перемещение линзового узла относительно образца на субстрате в
положение, при котором нанолинза расположена р дом с последовательно
расположенными химическими группами оснований в цепи. При использовании дл секвенировани множества образцов линейных цепей нуклеиновых кислот множество
цепей раст гивают и закрепл ют на субстрате в виде матрицы с параллельной
ориентацией. Множество таких линзовых узлов, например матрица консолей, затем
Страница: 6
RU 2 334 958 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
линейно перемещаетс относительно матрицы цепей ДНК дл установки св занных с ними
нанолинз в положение, прилегающее к последовательно расположенным химическим
группам оснований в каждой цепи.
Эти и другие объекты и отличительные признаки изобретени будут более пон тными
при прочтении приведенного далее подробного описани изобретени в сочетании с
прилагаемыми чертежами.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 изображает расположение компонентов в аппарате, сконструированном в
соответствии с одним вариантом исполнени изобретени ;
Фиг.2а иллюстрирует электромагнитные влени , создающие моды ближней зоны
электромагнитного зазора при направлении циркул рно пол ризованного светового луча на
нанолинзу, сконструированную в соответствии с одним вариантом исполнени изобретени , предусматривающим шестичастичную нанолинзу, а Фиг.2b изображает
нанолинзы, содержащие от 2 до 6 PRP;
Фиг.3а и 3b изображают виды в перспективе (3а) и в поперечном разрезе (3b)
концевого участка консоли со встроенной нанолинзой в соответствии с изобретением;
Фиг.4 изображает субстрат с матрицей выт нутых цепей ДНК, закрепленных на его
верхней поверхности;
Фиг.5а и 5b изображают в перспективе (5а) и в разрезе (5b) оптические влени ,
используемые в насто щем изобретении дл детектровани последовательно
расположенных индивидуальных оснований в выт нутом образце ДНК;
Фиг.6а, 6b и 6с показывают результаты численного моделировани серебр ной
нанолинзы в форме трехлучевой звезды. На Фиг.6а приведена частотна зависимость
амплитуды пол в центре нанолинзы, соответствующей плазмонному резонансу 2,45 эВ;
Фиг.6b показывает распределение пол вдоль оси y; и на Фиг.6 с приведено
топографическое изображение распределени пол на виде сверху;
Фиг.7а, 7b и 7с аналогичны Фиг.6а-6с соответственно, но показывают результаты
численного моделировани серебр ной нанолинзы в форме четырехлучевой звезды;
Фиг.8 изображает распределение пол в нанолинзе в форме четырехлучевой звезды
вдоль оси x с указанием максимума коэффициента усилени , равного 3000, около
поверхности PRP.
Детальное описание изобретени А. Определени Приведенные ниже термины имеют следующие значени , если не указано иное:
"Плазмонно-резонансный металл" включает любой металл, такой как золото, серебро
или алюминий, способный поддерживать поверхностные электромагнитные модыповерхностные плазменные пол ритоны (SPP), которые представл ют собой св занные
моды фотонов и плазмона.
"Химическа группа" в образце может включать субъединицы или фрагменты
субъединиц полимера, такие как основани нуклеиновой кислоты или группы химических
заместителей, такие как гидроксильные, аминовые, алкильные, кислотные или альдегидные
группы. Такие химические группы характеризуютс уникальными спектральными
сигнатурами или характеристиками усиленного комбинационного рассе ни .
"Моды зазора" относ тс к электромагнитным нормальным модам или
электромагнитным собственным модам, возбуждаемым внешним электромагнитным полем
в пространстве между двум или несколькими плазменными резонансными частицами,
когда плазменные резонансные частицы расположены возле (на рассто нии менее 40 нм)
поверхности металла, предпочтительно поверхности плазмонно-резонансного металла.
Примерами плазмонно-резонансных частиц вл ютс частицы серебра или золота,
максимальный размер которых находитс в интервале размеров от 5 до 200 нм.
"Спектр комбинационного рассе ни с усилением в зазоре" образца относитс к
спектральным характеристикам спектра комбинационного рассе ни образца, усиленным в
присутствии мод зазора вблизи образца.
Страница: 7
RU 2 334 958 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
В. Аппарат дл наноспектроскопического сканировани На Фиг.1 изображен аппарат, обозначенный в целом позицией 35, предназначенный дл идентификации химических групп в образце, закрепленном на поверхности. На фигуре
изображен столик сканировани 90, на котором размещен кристалл с ДНК 80, имеющий
множество выт нутых цепей ДНК, таких как цепи 82, закрепленных на поверхности
кристалла и расположенных параллельно друг другу. Способы фиксации выт нутых
полимерных цепей, таких как цепи ДНК, на поверхности кристалла будут описаны ниже.
В соответствии с важным признаком данного варианта исполнени поверхность
кристалла, на которую нанесен образец, имеет зеркальное покрытие из плазмоннорезонансного металла, например, серебра, золота или алюмини .
Цепи ДНК сканируютс с помощью столика сканировани 90, такого как столик с
пьезоэлектрическим или электромагнитным управлением перемещени ми. Столик с
электромагнитным управлением перемещени ми позвол ет сканировать участок размером
до дес тков сантиметров и более, что делает возможным сканирование кристалла с
отдельными молекулами с полным набором индивидуальных хромосом.
Световой луч, предпочтительно, когерентный и циркул рно пол ризованный,
генерируетс лазером 10. Лазер может включать два лазера дл осуществлени нелинейной спектроскопии комбинационного рассе ни , такой как CARS (когерентна антистоксовска спектроскопи комбинационного рассе ни ) и фемтосекундна индуцированна спектроскопи комбинационного рассе ни (D.McCamant). В типичной
лазерной системе используетс Ti-сапфировый перестраиваемый лазер с импульсным и
непрерывным режимами работы. Длину волны возбуждени светового луча,
предпочтительно, выбирают и настраивают так, чтобы она была близка к максимуму
спектрального пика в спектрах поглощени плазменного резонанса плазмоннорезонансного субстрата. При сканировании с использованием плазменной нанолинзы дл коррекции частоты необходимо принимать во внимание спектры поглощени плазменного
резонанса системы в целом (плазменна нанолинза + плазмонно-резонансный субстрат).
Важно отметить, что из-за наноскопического сближени плазменной нанолинзы с
поверхностью плазмонно-резонансного субстрата спектры плазмонного поглощени мен ютс .
Световой луч расшир етс с помощью расширител пучка или преобразуетс в
сканирующий луч в растре луча 20. Таким образом, единый световой луч раздел етс на
матрицу световых лучей, каждый из которых направлен на индивидуальную плазмоную
нанолинзу в матрице нанолинз 60. Каждый индивидуальный световой луч проходит через
расщепитель луча 30 и коллиматорную оптику 40 на микронную матрицу 50. Микронна матрица позвол ет осуществл ть индивидуальный цифровой контроль каждого
индивидуального светового луча, направленного на индивидуальные плазменные
нанолинзы, такие как линзы 62 в матрице 60, установленные на незакрепленных концах
консолей, таких как кронштейн 64, как будет подробнее описано ниже.
Как будет пон тно из дальнейшего описани , нанолинза мод плазмонного зазора,
раскрыта в насто щем изобретении, основана на способности локализованных плазмонов
(коллективных колебаний электронов), возбуждаемых внутри металлических наночастиц
внешней электромагнитной волной, усиливать электромагнитные пол в зоне ближнего
пол в непосредственной близости от поверхности плазмонного резонанса и локализовать
их в крайне малом пространстве, измер емом нанометрами. Такое нераспростран ющеес электромагнитное поле сконцентрировано в непосредственной близости (несколько
дес тков нанометров 30-40 нм) от поверхности наночастиц и называетс "ближним
электромагнитным полем" в отличие от распростран ющегос электромагнитного пол в
дальней зоне.
Как далее изображено на Фиг.1, световой луч, направл емый на каждую плазменную
нанолинзу в консольной матрице может модулироватьс с помощью изготовленного
методами микромеханической обработки блока зеркал 50, такого как производимый
фирмой Texas Instruments, Inc. (Dallas, Texas) под торговой маркой "Digital
Страница: 8
RU 2 334 958 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Micromirror Device". Эта система обеспечивает цифровое управление освещением каждой
индивидуальной плазменной нанолинзы и считывание сигнала, рассеиваемого каждой
плазменной нанолинзой. Эта система особенно удобна дл обеспечени цифрового
управлени высокоскоростным программируемым индивидуально адресуемым
многоканальным импульсным освещением и улавливанием рассе нного сигнала,
имеющего решающее значение дл реализации сверхбыстрого пр мого секвенировани ДНК с пр мым преобразованием в цифровую форму информации о последовательности
дл хранени в машинной пам ти.
Рассто ние между плазменной нанолинзой и образцом ДНК поддерживаетс с помощью
системы наклона консоли с обратной св зью. Такие системы управлени хорошо известны
и описаны дл атомно-силовых микроскопов, например, в патенте США №5883705, или
сканирующих оптических микроскопов ближнего пол , например, в патенте США
№5354985, которые включены в данное описание. Один из способов индивидуального
приведени в действие и управлени каждой консолью в матрице 60 в процессе
сканировани использует пьезорезисторное управление с обратной св зью, как подробнее
раскрыто в патенте США №6441359, который также включен в данное описание.
Рассто ние между каждой плазменной нанолинзой и соответствующим образцом ДНК,
предпочтительно, поддерживаетс на уровне от 0,1 нм до нескольких нанометров с целью
обеспечени оптимального усилени пол и его локализации в зазоре между нанолинзой, и
образцом ДНК, и поверхностью субстрата за счет возбуждени мод ближнего пол электромагнитного зазора, как изображено на Фиг.2, и 6а, и 6b. С изменением зазора
между каждой нанолинзой и поверхностью субстрата, на которой закреплен образец,
локализаци и интенсивность мод электромагнитного зазора также мен етс . Поэтому
путем изменени рассто ни между нанолинзой и образцом ДНК (или поверхности
субстрата) можно управл ть формой и локализацией мод электромагнитного зазора с
целью достижени максимального сигнала рассе нного света (считывание) и
максимального пространственного разрешени . Благодар оптимизации этих мод зазора
можно достичь уровн разрешени , позвол ющего распознавать индивидуальные
основани в цепи ДНК, иммобилизованной на поверхности субстрата. В зависимости от
уровн раст жени цепи ДНК на микрокристалле требовани к пространственному
разрешению могут мен тьс дл разных оснований и дл разных цепей. Однако величина
рассто ни находитс в интервале значений от нескольких нанометров до менее чем 1
нанометра.
В варианте исполнени , изображенном на Фиг.1, рассе нный при отражении свет от
каждой плазменной нанолинзы, взаимодействующий с индивидуальными основани ми
ДНК, направл етс назад через матрицу микролинз 50, коллиматорную оптику 40 и
расщепитель луча 30 на приемный конец плоского волоконно-оптического кабел 100.
Следует понимать, однако, что изобретение не ограничено собиранием рассе нного при
отражении света. В других вариантах исполнени изобретени геометри освещени и
собирани может отличатьс от геометрии рассе ни при отражении, и в этом случае
оптические системы освещени и собирани могут быть разделены.
Рассе нный световой сигнал по плоскому волоконно-оптическому кабелю 100
направл етс на щель монохроматора многоканального спектрального анализатора 110.
Дл исключени падающего света используютс узкополосные режекторные фильтры.
Дифракционна решетка 120 расщепл ет рассе нный световой луч на группу
монохроматических световых лучей, которые преобразуютс в индивидуальные спектры
комбинационного рассе ни . Спектры, полученные на детекторной матрице 130, затем
преобразуютс в цифровую форму и передаютс в компьютер 140, где они
обрабатываютс дл получени информации о последовательности образца ДНК на
микрокристалле.
Друга пригодна оптическа схема, не изображенна тут, использует
интерферометрический способ детектировани , такой как раскрытый ранее (например,
F.Zenhausen).
Страница: 9
RU 2 334 958 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
С.Работа нанолинзы и ее изготовление
Данный раздел описывает детально строение нанолинзы, предназначенной дл размещени в непосредственной близости от гладкой металлической поверхности
субстрата образца, дл получени локализованных мод зазора при освещении линзы
световым лучом, например когерентным и/или циркул рно пол ризованным световым
лучом. Эти моды могут быть использованы дл пр мого оптического сканировани молекул, расположенных в пространстве между нанолинзами зеркальной поверхности
субстрата, с высоким пространственным разрешением дл достижени субнанометрового
разрешени и с усилением сигнала, позвол ющим осуществить детектирование
спектральной сигнатуры отдельной малой молекулы, такой как индивидуальные основани цепей ДНК.
Наиболее обща схема нанолинзы включает одну, а предпочтительно множество
(например, 2-6) металлических наночастиц, имеющих заданную форму и заданную
геометрию взаимного расположени частиц. Предпочтительной геометрией частиц
вл етс симметричное расположение частиц вокруг центральной оси, как будет показано
ниже, хот предусматриваютс также другие геометрии, такие как неупор доченный
фрактал. Наночастицы, образующие линзу, могут иметь разную форму и размеры и
расположены на нанометровом рассто нии друг от друга. Однако наибольший размер
каждой наночастицы и системы в целом не превышает длины волны светового излучени .
Предпочтительными вл ютс наночастицы в диапазоне размеров 5-200 нм, например, 2050 нм.
На Фиг.2 представлено детализированное перспективное изображение части консоли
160 с закрепленной на ее свободном (дальнем) конце шестичастичной нанолинзой 180.
Видно, что циркул рно пол ризованный световой луч 190 от лазерного источника
направл етс через конфокальную линзовую оптику 50 на нанолинзу 180. Нанолинза
установлена на держателе 170, сформированном из прозрачного диэлектрического
материала, который в одном варианте исполнени может быть свободным концом консоли
160, используемой дл регулировани рассто ни между нанолинзой и образцом в
устройстве сканировани проб. Нанолинза расположена в непосредственной близости от
металлической зеркальной поверхности 200 субстрата образца. Поскольку свет в дальней
зоне, направленный с помощью конфокальной оптики, может быть сфокусирован в п тно,
имеющее размер около 1 микрона или немного меньше, определ емый пределами
дифракционной оптики, а диаметр нанолинзы (диаметр описанной окружности частиц
нанолинзы 182), предпочтительно, имеет величину в интервале 50-200 нм, это означает,
что он меньше длины волны светового излучени . Как также видно на фигуре, освещаемое
поле (окружность, обозначенна пунктирной линией 350) обычно больше площади
нанолинзы.
Однако можно создать нанолинзу диаметром 0,5-1,0 микрон, так чтобы она совпадала по
размеру с фокальным п тном. В этом случае нанолинза будет работать как наноантенна,
котора будет концентрировать электромагнитную энергию в центре нанолинзы путем
возбуждени локализованного плазмона.
В варианте исполнени , изображенном на Фиг.2а, плазменна нанолинза 185 имеет
звездообразную структуру, состо щую из шести металлических наночастиц, таких как
частицы 182, где кажда частица имеет форму выт нутого сфероида с большим
эксцентриситетом (предпочтительно, более 5) или цилиндрического наностержн с
полусферическими концами, или металлической нанопроволоки. Эта геометри частиц
показана также позицией 185 на Фиг.2b вместе с конфигураци ми частиц нанолинз 195,
205, 215 и 225 дл линз, состо щих из п ти, четырех, трех и двух частиц соответственно.
Как было отмечено выше, освещение каждой нанолинзы осуществл етс ,
предпочтительно, лазерным лучом или некогерентными электромагнитными волнами с
циркул рной пол ризацией. Максимальное усиление электромагнитного пол ,
обозначенное позицией 200 на Фиг.2а, достигаетс в центральной части линзы возле оси
нанолинзы. Эта область имеет диаметр несколько нм или меньше. Как показывают
Страница: 10
RU 2 334 958 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
результаты численного моделировани , описанные ниже со ссылками на Фиг.6а-6с, 7а-7с и
8, в центре нанолинзы может быть достигнут коэффициент усилени пол до 1500-3000.
Этот коэффициент усилени значительно превышает величину усилени , достижимую в
конфигураци х, состо щих из сферических наночастиц, и при других формах наночастиц,
известных из уровн техники. Максимальное локальное усиление пол , полученное путем
численного моделировани и равное 300, было описано в литературе (Н.Xu).
Нанолинза по изобретению может быть изготовлена разными известными способами. В
общем, нанолинзу изготовл ют заедино с консолью с использованием известных способов
нанообработки на основе электроннолучевой литографии, или литографии с
фокусируемым ионным пучком (G.R.Brewer), или на основе литографии методом
сканирующей туннельной микроскопии. Другой способ изготовлени может быть основан на
методе матричной самосборки (Y.Xia). Дл создани схем плазменных нанолинз на
различных материалах подложки могут быть использованы альтернативные способы, такие
как нанолитографи методом погружного пера (dip-pen) (например, D.Ginger) или метод
самосборки на основе ДНК (например, С.М.Niemeyer). В одном варианте исполнени плазменна нанолинза может быть интегрирована в свободный конец консоли,
вл ющейс частью устройства сканировани пробы, и может одновременно выполн ть
функцию кончика консоли, регулирующего рассто ние между нанолинзой и образцом в
процессе сканировани в устройствах сканировани пробы, таких как атомно-силовой
микроскоп AFM или сканирующий оптический микроскоп ближней зоны SNOM. Один
возможный вариант исполнени плазменной нанолинзы, интегрированной в консоль
устройства спектроскопического сканировани пробы, представлен на Фиг.3.
Фиг.3 иллюстрирует, как плазменна нанолинза может быть интегрирована в свободный
конец консоли устройства спектроскопического сканировани пробы и может одновременно
выполн ть функции кончика консоли, контролирующего рассто ние между нанолинзой и
образцом в процессе сканировани образца. Консоль 160 изготовлена из композиционного
материала, имеющего участок непрозрачного материала 260 и оптически прозрачный
участок 170, образующий оптическое окно 250, позвол ющее падающему циркул рно
пол ризованному свету взаимодействовать с нанолинзой 180 и возбуждать эффективно
локализованные плазмы (LP) и моды зазора (GM).
D. Приготовление субстрата, содержащего образец
Субстрат или подложка в аппарате предназначены дл усилени электромагнитного
пол в непосредственной близости от поверхности и покрыты тонкой пленкой плазмоннорезонансного материала, такого как серебро, золото или алюминий. Толщина пленки
составл ет, предпочтительно, 25-200 нм, например 50 нм. Пригодный субстрат, например
стекл нные субстраты, могут быть покрыты металлической пленкой известными
способами, такими как методы вакуумного испарени или высокочастотного ионного
распылени . Примеры покрытий субстрата и способов их получени раскрыты в патенте
США №5611998 "Оптохимический датчик и способ его изготовлени " (Optochemical sensor
and method for production), включенном в данное описание, и в ссылке V.Matyushin,
также включенной в данное описание.
Цепи ДНК, имеющие длину, например, от 100 нанометров до 2,5 миллиметров,
помещают на субстрат, как показано позицией 82 на Фиг.1. Рассто ние между цеп ми
должно находитьс в интервале 200-300 микрон и должно соответствовать рассто нию
между соседними консол ми в матрице консолей.
Предпочтительным вл етс рассто ние, равное 250 микрон, которое соответствует
250-микронному шагу, вл ющемус стандартом в технологи х плоских волоконнооптических кабелей.
На Фиг.4 изображен типичный кристалл или субстрат 80, предназначенный дл использовани в аппарате и способе по изобретению. Тут изображены образцы ДНК,
полученные, например, из геномной ДНК в форме фрагментов одноцепочечной ДНК
длиной до 2,5 миллиметров (5 млн оснований). Цепи, такие как обозначенные позицией
210, помещают на поверхность предметного стекла, обладающего способностью к
Страница: 11
RU 2 334 958 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
плазмонно-резонансному оптическому усилению 80. Они размещаютс упор доченно с
возможностью адресации. Каждый конец цепи ДНК присоединен к комплементарному
олигонуклеотиду на правом/левом штрих-кодовом участке 220а и 220b. Рассто ние между
цеп ми должно находитьс в интервале 200-300 микрон и соответствовать рассто нию
между соседними консол ми в матрице консолей. Предпочтительным вл етс рассто ние
250 микрон, соответствующее шагу 250 микрон, совпадающему с шагом стандартных
плоских волоконно-оптических кабелей.
Способы выт гивани и ориентации образцов линейных полимеров, таких как ДНК, РНК,
нуклеиновые аналоги, полипептиды, линейные углеводороды и т.п., вл ютс известными.
Например, противоположные концы образца полимера, такого как ДНК, могут быть
ковалентно св заны с микросферами, такими как латексные или стекл нные бусины, и
бусинами затем манипулируют с помощью импульсно-лазерного молекул рного пинцета до
достижени требуемой степени раст жени , предпочтительно, с перет жкой. Этот подход
проиллюстрирован на Фиг.4, где изображены микросферы 290а, 290b, присоединенные к
противоположным концам цепи ДНК 210. Кажда сфера "захватываетс " лазерным лучем,
таким как лучи 300а, 300b, дл манипулировани сферами с целью выт гивани и
ориентации цепи при ее размещении на поверхности субстрата. После осуществлени такого размещени концевые участки цепи креп тс к субстрату путем гибридизации с
комплементарными олигонуклеотидами, присоединеными к субстрату на участке штрихкода. Способы захвата и манипулировани микросферами в лазерном луче описаны,
например, в патенте США №5620857 и в патентной за вке США №20040001371, которые
включены в данное описание.
В родственной методике концы полимерной цепи ковалентно св зываютс с магнитными
бусинами или с твердой подложкой и магнитной бусиной, и к бусине (бусинам)
прикладывают магнитное поле (пол ) до достижени требуемой степени раст жени и
ориентации цепи. В более общем случае противоположные концы цепи могут быть
присоединены к паре перемещающихс относительно друг друга опор, и опоры
устанавливаютс в положение, обеспечивающее требуемую степень раст жени и
ориентацию, как раскрыто, например, в патенте США №6342353, который включен в данное
описание.
Известны также способы раст жени зар женной полимерной цепи в линейную
конформацию методом электрофореза в узком микроканале.
После того как полимерные цепи будут выт нуты и ориентированы дл закреплени на
субстрате, молекулу образца фиксируют на субстрате любым из р да пригодных способов
фиксации. Как указывалось выше, субстрат может быть снабжен конечными участками
олигонуклеотидов, способными к гибридизации с последовательност ми концевых участков
образца цепи ДНК. В тех случа х, когда цепь выт нута путем манипулировани частицами,
ковалнтно св занными с концами цепи, субстрат может содержать химические группы или
магнитные структуры дл креплени частиц к субстрату, когда цепь находитс в
выт нутом состо нии. Одним из обычных способов химического присоединени дл поверхности золота вл етс использование тиольного реагента, ковалентно
присоединенного к концевым участкам цепи образца.
В общем, процедуры подготовки поверхности субстрата, на которой должны быть
закреплены молекулы ДНК, известны специалистам в области способов детектировании
гибридизации ДНК (см., например, J.P.Rabe).
Е. Способ сканировани и детектировани Как было указано выше, важной областью применени аппарата и способа по
изобретению вл етс секвенирование образцов нуклеиновых кислот, таких как
хромосомальные или полные геномные ДНК. В данном разделе описана работа
вышеупом нутого аппарата и способ по изобретению со ссылками на данное конкретное
применение, причем подразумеваетс , что такой пор док действий и способ будут
применимы к исследовани м химических групп в любом образце.
В своем самом простом варианте способ используетс дл анализа одной или
Страница: 12
RU 2 334 958 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
нескольких химических групп отдельной молекулы или группы подобных молекул,
локализованной на определенном участке детектировани на субстрате. В этом варианте
применени отдельна нанолинза, расположенна , например, на свободном конце консоли
перемещаетс по направлению к образцу, например, на рассто ние в интервале менее 1040 микрон до достижени максимального усилени отличительной характеристики спектра
усиленного комбинационного рассе ни .
Альтернативно спектральные характеристики могут регистрироватьс при поочередном
перемещении нанолинзы к и от поверхности образца с получением спектра образца,
переменного во времени. Дл генерировани переменного во времени спектра могут быть
использованы, например, осцилл ции нанолинзы в интервале от 0,1 до 10 нм.
В более общем случае способ идентификации химических групп в образце по
изобретению включает стадии сначала креплени образца к субстрату, имеющему
зеркальную поверхность, на которой размещаетс образец и котора сформирована из
плазмонно-резонансного металла. Световой луч направл ют на нанолинзу описанного
выше типа дл создани мод электромагнитного зазора в ближней зоне в пространстве
между нанолинзой и прилегающим к ней участком детектировани на поверхности
субстрата при величине зазора между нанолинзами и субстратом 30 нм или меньше.
Линзовый узел затем перемещают в направлении к или от поверхности субстрата при
рассто нии между нанолинзой и поверхностью субстрата менее 40 нм дл создани мод
электромагнитного зазора, усиливающих сигналы комбинационного рассе ни ,
генерируемые образцом на участке детектировани . Свет, излучаемый или рассеиваемый
образцом на участке детектировани , улавливаетс детектором и преобразуетс в спектр
комбинационного рассе ни с усилением в зазоре, позвол ющий идентифицировать
химическую группу на участке детектировани .
В тех случа х, когда образец содержит множество групп, расположенных в продольном
направлении на линейном участке образца молекулы, как в случае идентификации
последовательных групп оснований образца нуклеиновой кислоты, вышеописанна процедура примен етс последовательно к каждому основанию по мере перемещени нанолинзы относительно субстрата.
Такое перемещение может осуществл тьс посредством передвижени консоли
относительно неподвижного субстрата или передвижени столика субстрата относительно
неподвижной нанолинзы. После установки нанолинзы в каждое следующее положение она
затем перемещаетс по направлению к образцу или от него дл нахождени оптимального
рассто ни детектировани или дл генерировани измен ющегос во времени спектра,
как описано выше. Взаимное расположение линзы и оснований образца может
поддерживатьс с помощью одной из различных методик приведени . Например,
"контрольна " нанолинза может отслеживать детектируемые основани в закрепленном на
субстрате образце ДНК с известной последовательностью. Благодар отслеживанию этой
последовательности одновременно с проведением анализа одного или нескольких
образцов с неизвестными последовательност ми аппарат может подтвердить, что
относительное перемещение линзы и субстрата обеспечивает сохранение взаимного
расположени образца и последовательных оснований ДНК. Альтернативно одна из
консолей аппарата может быть щупом сканирующего атомно-силового микроскопа дл детектровани перемещени щупа относительно каждого сновани в контрольной цепи
ДНК в процессе перемещени матрицы консольных устройств вдоль цепей ДНК.
В более распространенном способе применени множество линейных образцов цепей,
например цепей ДНК, размещаетс на едином субстрате дл одновременного считывани множеством нанолинз, как обозначено позицией 82 в аппарате на Фиг.1. Фиг.5а и 5b
иллюстрируют данную операцию применительно к считыванию множества выт нутых
ориентированных цепей ДНК, таких как цепь 210, нанесенна на субстрат 310. Хот на
фигурах изображен один линзовый узел, состо щий из консоли 160 с установленной на ее
свободном конце нанолинзой 180, следует понимать, что аппарат включает матрицу
линзовых узлов по одному на каждую из цепей, расположенных с определенной
Страница: 13
RU 2 334 958 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
ориентацией на субстрате.
При перемещении группы линзовых узлов вдоль субстрата положение каждого
линзового узла регулируетс по вертикали (по направлению к субстрату) с целью
оптимизации спектрального сигнала. Как видно на Фиг.5b, такое вертикальное
перемещение позвол ет эффективно разместить моды зазора, создаваемые путем
концентрировани электромагнитных мод, в ближней зоне между линзой, сформированной
из PRP, таких как обозначенные позицией 185, и плазмонно-резонансной поверхностью,
обозначенной позицией 310.
Спектры усиленного комбинационного рассе ни химических групп (оснований) каждой
цепи последовательно регистрируютс с помощью многоканального рамановского
спектрографа и оцифровываютс с помощью двумерной интегральной матрицы ПЗС
(ICCD) с цифровой записью. Сигнал, поступающий от рамановского спектрометра,
сохран етс в пам ти компьютера дл дальнейшего анализа. Конечные результаты
получают в форме последовательность нуклеотидных оснований А, Т, G, С. В ходе
процедуры сканировани нанолинзовый щуп осуществл ет детектировани каждого
основани (А, Т, G, С) в цепи ДНК как спектроскопически, так и топографически.
Спектры SERS регистрируютс последовательно дл каждого основани , что позвол ет
идентифицировать каждое отдельное основание (А, Т, G, С) в цепи ДНК по его уникальной
сигнатуре усиленного спектра, характерной дл данного основани , обеспечива возможность пр мого поэлементного (de novo) секвенировани индивидуальных
фрагментов молекулы ДНК. Известно, что спектроскопи SERS А, Т, G и С, проведенна на
плазмонно-резонансном субстрате, дает различающиес спектры, позвол ющие
идентифицировать разные основани . Насто щее изобретение позвол ет
идентифицировать индивидуальные основани ДНК за счет фокусировани пол возбуждени в узком зазоре между линзой и субстратом и использовани усилени сигналов комбинационного рассе ни в зазоре, что дает возможность производить пр мое
последовательное определение оснований ДНК.
Число консолей с волоконно-оптическими кончиками, которые могут быть использованы
в матрице, в принципе неограничено, однако дл однопроходного секвенировани самой
большой хромосомы человека (хромосома человека №1, содержаща примерно 263
миллиона оснований) аппарат должен иметь примерно 100 линзовых узлов, каждый из
которых осуществл ет считывание фрагмента размером примерно 2,5-3,0 млн оснований.
Принима врем замера, равным 0,01 с, получаем, что аппарат завершит определение
последовательности этой хромосомы менее чем за примерно 10 часов сканировани . При
практическом использовании такого устройства возможно использовать параллельно до
нескольких сотен каналов в матрице (по 1 цепи ДНК на канал) при скорости проведени замера от 0,01 до 1 секунды на основание.
В более широком смысле способ идентификации химических групп в образце по
изобретению включает стадии сначала креплени образца к субстрату, имеющему
зеркальную поверхность, на которой размещаетс образец, сформированную из
плазмонно-резонансного металла. Световой луч направл етс на нанолинзу описанного
выше типа дл создани мод электромагнитного зазора в ближней зоне в пространстве
между нанолинзой и прилегающим к ней участком детектировани на поверхности
субстрата при величине зазора между нанолинзой и субстратом 4 нм или меньше.
Линзовый узел затем перемещаетс по направлению к поверхности субстрата или от нее,
при величине рассто ни между нанолинзой и поверхностью субстрата менее 40 нм, дл создани мод электромагнитного зазора, усиливающих спектральные сигналы
комбинационного рассе ни , генерируемые образцом на участке детектировани . Свет,
излучаемый или рассеиваемый образцом на участке детектировани , улавливаетс детектором и преобразуетс в спектр комбинационного рассе ни с усилением в зазоре,
позвол ющий идентифицировать химическую группу на участке детектировани .
Степень усилени спектров комбинационного рассе ни , достижимую в соответствии с
насто щим изобретением, можно оценить с помощью Фиг.6-8. На этих фигурах
Страница: 14
RU 2 334 958 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
напр женность электромагнитного пол Е рассчитывали путем моделировани системы и
решени уравнений Максвелла в приближении ближней зоны методом интегрального
приближени .
Фиг.6а показывает изменение Е в виде функции, эВ, дл линзы, состо щей из трех
частиц. Распределение пол в центральной области линзы изображено на Фиг.6с. Фиг.6b
изображает график зависимости напр женности пол вдоль оси у на Фиг.6с по линии х=0.
Видно, что степень усилени напр женности пол достигает максимума, равного примерно
1400 (усиление по сравнению с падающим светом), в точке y=0,5 р дом с верхней
частицей на Фиг.6с.
Аналогичный набор графиков приведен на Фиг.7а-7с, но в этом случае линза
сконструирована из четырех симметричных частиц, как видно по диаграмме распределени пол на Фиг.7с. Фиг.7b изображает симметричное распределение Е вдоль линии x, равной
нулю, при изменении координаты y от дна до потолка. При построении графика вдоль
диагональной линии между точками -1, -1 и +1, +1 получаем график, представленный на
Фиг.8 и имеющий коэффициент усилени , равный почти 3000, в точках, расположенных
между частицами на некотором рассто нии от центра.
Согласно преобладающему мнению усиление комбинационного рассе ни имеет
электромагнитный механизм, причем сигнал комбинационного рассе ни пропорционален
Е 4 (M.Moskovits, Rev. Mod. Phys., v.57, p.783, 1985), где Е обозначает локальное
усиление пол в области молекулы. В случае коэффициента усилени пол , равного 500,
усиление сигнала комбинационного рассе ни составит 500 4=6,25Ч10 10, что намного
превышает значени , описанные в литературе. Дл достижени такого усилени молекула
образца должна находитьс в центре нанолинзы, состо щей из нескольких частиц. Однако,
если молекула находитс также р дом с плазмонно-резонансной поверхностью,
коэффициент усилени пол может достигать значени 3000, что соответствует усилению
сигнала комбинационного рассе ни до 8,1Ч10 15, позвол ющему детектировать химические
группы отдельной молекулы.
Хот изобретение было описано по отношению к конкретным вариантам исполнени и
област м применени , следует понимать, что могут быть сделаны различные изменени и
модификации, не выход щие за пределы изобретени .
Формула изобретени 1. Аппарат дл идентификации химических групп в образце, закрепленном на
поверхности, включающий субстрат, имеющий зеркальную поверхность, на которой
размещаетс образец, сформированную из плазмонно-резонансного металла, источник
светового луча, линзовый узел, имеющий кончик и нанолинзу, состо щую из одной или
нескольких плазмонно-резонансных частиц, размещенных на кончике и расположенных на
нем таким образом, чтобы создавать, при направлении светового луча через нанолинзу,
моды электромагнитного зазора ближней зоны в пространстве между нанолинзой и
прилегающим к ней участком детектировани на поверхности субстрата, в зазоре между
нанолинзой и субстратом, равном 40 нм или меньше, фокусирующий механизм дл перемещени линзового узла по направлению к поверхности субстрата и от нее, при
величине зазора менее 40 нм, дл создани мод электромагнитного зазора, усиливающих
спектральные сигналы комбинационного рассе ни , генерируемые образцом на участке
детектировани ; детектор дл улавливани света, излучаемого или рассеиваемого
образцом на участке детектировани , и дл преобразовани прин того света в спектр
комбинационного рассе ни с усилением в зазоре, позвол ющий идентифицировать
химическую группу на участке детектировани , и механизм линейного перемещени дл линейного перемещени линзового узла по отношению к указанному субстрату, дл позиционировани линзового узла над разными участками детектировани субстрата.
2. Аппарат по п.1, в котором нанолинза в указанном узле включает по меньшей мере
три указанные плазмонно-резонансные частицы, расположенные симметрично вокруг
центральной оси, перпендикул рной к плоскости поверхности субстрата, причем кажда Страница: 15
CL
RU 2 334 958 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
частица имеет размер менее 200 нм по наибольшей оси, и рассто ние между любой парой
частиц существенно меньше длины волны светового луча.
3. Аппарат по п.2, в котором указанные частицы имеют сферическую форму.
4. Аппарат по п.2, в котором указанные частицы имеют эллипсоидальную форму и
ориентированы таким образом, чтобы их большие оси пересекались с указанной
центральной осью.
5. Аппарат по п.2, в котором указанный источник света создает луч циркул рно
пол ризованного света, плоскость пол ризации которого перпендикул рна к указанной
центральной оси.
6. Аппарат по п.1, в котором указанный линзовый узел включает консоль, имеющую
кончик на своем незакрепленном конце.
7. Аппарат по п.6, в котором указанный фокусирующий механизм включает
пьезоэлектрический привод, функционально св занный с указанной консолью.
8. Аппарат по п.7, в котором указанный фокусирующий механизм осуществл ет
перемещение указанной нанолинзы на заданное рассто ние в интервале от 0,1 до 5 нм от
поверхности субстрата.
9. Аппарат по п.1, в котором указанный механизм линейного перемещени включает
пьезоэлектронный привод.
10. Аппарат по п.1, предназначенный дл использовани при секвенировании линейной
цепи нуклеиновой кислоты путем анализа химических групп оснований цепи нуклеиновой
кислоты, в котором субстрат включает молекул рные кор дл удерживани цепи
нуклеиновой кислоты в линейно выт нутом состо нии, а механизм линейного перемещени осуществл ет перемещение линзового узла вдоль цепи дл проведени последовательного анализа и идентификации каждого основани цепи.
11. Аппарат по п.10, предназначенный дл одновременного проведени анализа
множества по сути линейных образцов, который включает множество линейно
ориентированных консольно-линзовых агрегатов, положение каждого из которых в
направлении к поверхности субстрата и от нее может индивидуально контролироватьс с
помощью соответствующего фокусирующего механизма, св занного с каждым линзовым
узлом, и которые перемещаютс как одно целое единым механизмом линейного
перемещени .
12. Аппарат по п.11, предназначенный дл использовани при секвенировании
множества линейных цепей нуклеиновой кислоты путем проведени анализа химических
групп оснований цепи нуклеиновых кислот, в котором субстрат включает молекул рные
кор дл удерживани каждой цепи нуклеиновой кислоты в линейно выт нутом состо нии,
и механизм линейного перемещени осуществл ет перемещение линзового узла вдоль
цепей дл проведени последовательного анализа и идентификации каждого основани цепей.
13. Способ идентификации химических групп в образце, включающий крепление образца
к субстрату, имеющему зеркальную поверхность, на которой размещаетс образец,
сформированную из плазмонно-резонансного металла, направление светового луча на
нанолинзу в линзовом узле, имеющем кончик и нанолинзу, расположенную на кончике и
состо щую из одной или нескольких плазмонно-резонансных частиц, размещенных на
кончике таким образом, чтобы создавать моды электромагнитного зазора в ближней зоне в
пространстве между нанолинзой и прилегающим к ней участком детектировани на
поверхности субстрата, при величине зазора между нанолинзой и субстратом 30 нм или
меньше, перемещение линзового узла по направлению к поверхности субстрата или от нее,
при рассто нии между нанолинзой и поверхностью субстрата менее 30 нм, дл создани мод электромагнитного зазора, усиливающих спектральные сигналы комбинационного
рассе ни , генерируемые образцом на участке детектировани ; улавливание света,
излучаемого или рассеиваемого образцом на участке детектировани , и преобразование
прин того света в спектр комбинационного рассе ни с усилением в зазоре, позвол ющий
идентифицировать химическую группу на участке детектировани .
Страница: 16
RU 2 334 958 C2
5
10
15
20
14. Способ по п.13, в котором указанное перемещение осуществл етс с целью
установки указанной нанолинзы с заданной величиной зазора в интервале от 0,1 до 5 нм
от поверхности субстрата.
15. Способ по п.13, в котором указанное направление включает направление светового
луча на нанолинзу, состо щую из по меньшей мере трех указанных плазмоннорезонансных частиц, расположенных симметрично вокруг центральной оси,
перпендикул рной к плоскости поверхности субстрата, причем кажда частица имеет
размер менее 200 нм по своей наибольшей оси, и рассто ние между любой парой частиц
существенно меньше длины волны светового луча.
16. Способ по п.15, в котором указанное направление включает направление на
указанную линзу луча циркул рно пол ризованного света, плоскость пол ризации которого
перпендикул рна к указанной центральной оси.
17. Способ по п.15, предназначенный дл использовани при секвенировании линейной
цепи нуклеиновой кислоты, в котором указанное крепление включает раст жение цепи в
линейном направлении и фиксацию противоположных концевых участков цепей на
указанном субстрате, и который дополнительно включает линейное перемещение
линзового узла относительно образца на субстрате дл установки нанолинзы в положение,
прилегающее к последовательно расположенным химическим группам оснований в цепи.
18. Способ по п.17, предназначенный дл использовани при секвенировании
множества образцов линейных цепей нуклеиновых кислот, в котором указанное крепление
включает фиксацию образцов в виде множества параллельных цепей, и указанное
линейное перемещение включает линейное перемещение линзового узла относительно
образцов на субстрате, дл установки нанолинзы в положение, прилегающее к
последовательно расположенным химическим группам оснований в каждой из цепей.
25
30
35
40
45
50
Страница: 17
RU 2 334 958 C2
Страница: 18
DR
RU 2 334 958 C2
Страница: 19
RU 2 334 958 C2
Страница: 20
RU 2 334 958 C2
Страница: 21
имо принимать во внимание спектры поглощени плазменного
резонанса системы в целом (плазменна нанолинза + плазмонно-резонансный субстрат).
Важно отметить, что из-за наноскопического сближени плазменной нанолинзы с
поверхностью плазмонно-резонансного субстрата спектры плазмонного поглощени мен ютс .
Световой луч расшир етс с помощью расширител пучка или преобразуетс в
сканирующий луч в растре луча 20. Таким образом, единый световой луч раздел етс на
матрицу световых лучей, каждый из которых направлен на индивидуальную плазмоную
нанолинзу в матрице нанолинз 60. Каждый индивидуальный световой луч проходит через
расщепитель луча 30 и коллиматорную оптику 40 на микронную матрицу 50. Микронна матрица позвол ет осуществл ть индивидуальный цифровой контроль каждого
индивидуального светового луча, направленного на индивидуальные плазменные
нанолинзы, такие как линзы 62 в матрице 60, установленные на незакрепленных концах
консолей, таких как кронштейн 64, как будет подробнее описано ниже.
Как будет пон тно из дальнейшего описани , нанолинза мод плазмонного зазора,
раскрыта в насто щем изобретении, основана на способности локализованных плазмонов
(коллективных колебаний электронов), возбуждаемых внутри металлических наночастиц
внешней электромагнитной волной, усиливать электромагнитные пол в зоне ближнего
пол в непосредственной близости от поверхности плазмонного резонанса и локализовать
их в крайне малом пространстве, измер емом нанометрами. Такое нераспростран ющеес электромагнитное поле сконцентрировано в непосредственной близости (несколько
дес тков нанометров 30-40 нм) от поверхности наночастиц и называетс "ближним
электромагнитным полем" в отличие от распростран ющегос электромагнитного пол в
дальней зоне.
Как далее изображено на Фиг.1, световой луч, направл емый на каждую плазменную
нанолинзу в консольной матрице может модулироватьс с помощью изготовленного
методами микромеханической обработки блока зеркал 50, такого как производимый
фирмой Texas Instruments, Inc. (Dallas, Texas) под торговой маркой "Digital
Страница: 8
RU 2 334 958 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Micromirror Device". Эта система обеспечивает цифровое управление освещением каждой
индивидуальной плазменной нанолинзы и считывание сигнала, рассеиваемого каждой
плазменной нанолинзой. Эта система особенно удобна дл обеспечени цифрового
управлени высокоскоростным программируемым индивидуально адресуемым
многоканальным импульсным освещением и улавливанием рассе нного сигнала,
имеющего решающее значение дл реализации сверхбыстрого пр мого секвенировани ДНК с пр мым преобразованием в цифровую форму информации о последовательности
дл хранени в машинной пам ти.
Рассто ние между плазменной нанолинзой и образцом ДНК поддерживаетс с помощью
системы наклона консоли с обратной св зью. Такие системы управлени хорошо известны
и описаны дл атомно-силовых микроскопов, например, в патенте США №5883705, или
сканирующих оптических микроскопов ближнего пол , например, в патенте США
№5354985, которые включены в данное описание. Один из способов индивидуального
приведени в действие и управлени каждой консолью в матрице 60 в процессе
сканировани использует пьезорезисторное управление с обратной св зью, как подробнее
раскрыто в патенте США №6441359, который также включен в данное описание.
Рассто ние между каждой плазменной нанолинзой и соответствующим образцом ДНК,
предпочтительно, поддерживаетс на уровне от 0,1 нм до нескольких нанометров с целью
обеспечени оптимального усилени пол и его локализации в зазоре между нанолинзой, и
образцом ДНК, и поверхностью субстрата за счет возбуждени мод ближнего пол электромагнитного зазора, как изображено на Фиг.2, и 6а, и 6b. С изменением зазора
между каждой нанолинзой и поверхностью субстрата, на которой закреплен образец,
локализаци и интенсивность мод электромагнитного зазора также мен етс . Поэтому
путем изменени рассто ни между нанолинзой и образцом ДНК (или поверхности
субстрата) можно управл ть формой и локализацией мод электромагнитного зазора с
целью достижени максимального сигнала рассе нного света (считывание) и
максимального пространственного разрешени . Благодар оптимизации этих мод зазора
можно достичь уровн разрешени , позвол ющего распознавать индивидуальные
основани в цепи ДНК, иммобилизованной на поверхности субстрата. В зависимости от
уровн раст жени цепи ДНК на микрокристалле требовани к пространственному
разрешению могут мен тьс дл разных оснований и дл разных цепей. Однако величина
рассто ни находитс в интервале значений от нескольких нанометров до менее чем 1
нанометра.
В варианте исполнени , изображенном на Фиг.1, рассе нный при отражении свет от
каждой плазменной нанолинзы, взаимодействующий с индивидуальными основани ми
ДНК, направл етс назад через матрицу микролинз 50, коллиматорную оптику 40 и
расщепитель луча 30 на приемный конец плоского волоконно-оптического кабел 100.
Следует понимать, однако, что изобретение не ограничено собиранием рассе нного при
отражении света. В других вариантах исполнени изобретени геометри освещени и
собирани может отличатьс от геометрии рассе ни при отражении, и в этом случае
оптические системы освещени и собирани могут быть разделены.
Рассе нный световой сигнал по плоскому волоконно-оптическому кабелю 100
направл етс на щель монохроматора многоканального спектрального анализатора 110.
Дл исключени падающего света используютс узкополосные режекторные фильтры.
Дифракционна решетка 120 расщепл ет рассе нный световой луч на группу
монохроматических световых лучей, которые преобразуютс в индивидуальные спектры
комбинационного рассе ни . Спектры, полученные на детекторной матрице 130, затем
преобразуютс в цифровую форму и передаютс в компьютер 140, где они
обрабатываютс дл получени информации о последовательности образца ДНК на
микрокристалле.
Друга пригодна оптическа схема, не изображенна тут, использует
интерферометрический способ детектировани , такой как раскрытый ранее (например,
F.Zenhausen).
Страница: 9
RU 2 334 958 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
С.Работа нанолинзы и ее изготовление
Данный раздел описывает детально строение нанолинзы, предназначенной дл размещени в непосредственной близости от гладкой металлической поверхности
субстрата образца, дл получени локализованных мод зазора при освещении линзы
световым лучом, например когерентным и/или циркул рно пол ризованным световым
лучом. Эти моды могут быть использованы дл пр мого оптического сканировани молекул, расположенных в пространстве между нанолинзами зеркальной поверхности
субстрата, с высоким пространственным разрешением дл достижени субнанометрового
разрешени и с усилением сигнала, позвол ющим осуществить детектирование
спектральной сигнатуры отдельной малой молекулы, такой как индивидуальные основани цепей ДНК.
Наиболее обща схема нанолинзы включает одну, а предпочтительно множество
(например, 2-6) металлических наночастиц, имеющих заданную форму и заданную
геометрию взаимного расположени частиц. Предпочтительной геометрией частиц
вл етс симметричное расположение частиц вокруг центральной оси, как будет показано
ниже, хот предусматриваютс также другие геометрии, такие как неупор доченный
фрактал. Наночастицы, образующие линзу, могут иметь разную форму и размеры и
расположены на нанометровом рассто нии друг от друга. Однако наибольший размер
каждой наночастицы и системы в целом не превышает длины волны светового излучени .
Предпочтительными вл ютс наночастицы в диапазоне размеров 5-200 нм, например, 2050 нм.
На Фиг.2 представлено детализированное перспективное изображение части консоли
160 с закрепленной на ее свободном (дальнем) конце шестичастичной нанолинзой 180.
Видно, что циркул рно пол ризованный световой луч 190 от лазерного источника
направл етс через конфокальную линзовую оптику 50 на нанолинзу 180. Нанолинза
установлена на держателе 170, сформированном из прозрачного диэлектрического
материала, который в одном варианте исполнени может быть свободным концом консоли
160, используемой дл регулировани рассто ни между нанолинзой и образцом в
устройстве сканировани проб. Нанолинза расположена в непосредственной близости от
металлической зеркальной поверхности 200 субстрата образца. Поскольку свет в дальней
зоне, направленный с помощью конфокальной оптики, может быть сфокусирован в п тно,
имеющее размер около 1 микрона или немного меньше, определ емый пределами
дифракционной оптики, а диаметр нанолинзы (диаметр описанной окружности частиц
нанолинзы 182), предпочтительно, имеет величину в интервале 50-200 нм, это означает,
что он меньше длины волны светового излучени . Как также видно на фигуре, освещаемое
поле (окружность, обозначенна пунктирной линией 350) обычно больше площади
нанолинзы.
Однако можно создать нанолинзу диаметром 0,5-1,0 микрон, так чтобы она совпадала по
размеру с фокальным п тном. В этом случае нанолинза будет работать как наноантенна,
котора будет концентрировать электромагнитную энергию в центре нанолинзы путем
возбуждени локализованного плазмона.
В варианте исполнени , изображенном на Фиг.2а, плазменна нанолинза 185 имеет
звездообразную структуру, состо щую из шести металлических наночастиц, таких как
частицы 182, где кажда частица имеет форму выт нутого сфероида с большим
эксцентриситетом (предпочтительно, более 5) или цилиндрического наностержн с
полусферическими концами, или металлической нанопроволоки. Эта геометри частиц
показана также позицией 185 на Фиг.2b вместе с конфигураци ми частиц нанолинз 195,
205, 215 и 225 дл линз, состо щих из п ти, четырех, трех и двух частиц соответственно.
Как было отмечено выше, освещение каждой нанолинзы осуществл етс ,
предпочтительно, лазерным лучом или некогерентными электромагнитными волнами с
циркул рной пол ризацией. Максимальное усиление электромагнитного пол ,
обозначенное позицией 200 на Фиг.2а, достигаетс в центральной части линзы возле оси
нанолинзы. Эта область имеет диаметр несколько нм или меньше. Как показывают
Страница: 10
RU 2 334 958 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
результаты численного моделировани , описанные ниже со ссылками на Фиг.6а-6с, 7а-7с и
8, в центре нанолинзы может быть достигнут коэффициент усилени пол до 1500-3000.
Этот коэффициент усилени значительно превышает величину усилени , достижимую в
конфигураци х, состо щих из сферических наночастиц, и при других формах наночастиц,
известных из уровн техники. Максимальное локальное усиление пол , полученное путем
численного моделировани и равное 300, было описано в литературе (Н.Xu).
Нанолинза по изобретению может быть изготовлена разными известными способами. В
общем, нанолинзу изготовл ют заедино с консолью с использованием известных способов
нанообработки на основе электроннолучевой литографии, или литографии с
фокусируемым ионным пучком (G.R.Brewer), или на основе литографии методом
сканирующей туннельной микроскопии. Другой способ изготовлени может быть основан на
методе матричной самосборки (Y.Xia). Дл создани схем плазменных нанолинз на
различных материалах подложки могут быть использованы альтернативные способы, такие
как нанолитографи методом погружного пера (dip-pen) (например, D.Ginger) или метод
самосборки на основе ДНК (например, С.М.Niemeyer). В одном варианте исполнени плазменна нанолинза может быть интегрирована в свободный конец консоли,
вл ющейс частью устройства сканировани пробы, и может одновременно выполн ть
функцию кончика консоли, регулирующего рассто ние между нанолинзой и образцом в
процессе сканировани в устройствах сканировани пробы, таких как атомно-силовой
микроскоп AFM или сканирующий оптический микроскоп ближней зоны SNOM. Один
возможный вариант исполнени плазменной нанолинзы, интегрированной в консоль
устройства спектроскопического сканировани пробы, представлен на Фиг.3.
Фиг.3 иллюстрирует, как плазменна нанолинза может быть интегрирована в свободный
конец консоли устройства спектроскопического сканировани пробы и может одновременно
выполн ть функции кончика консоли, контролирующего рассто ние между нанолинзой и
образцом в процессе сканировани образца. Консоль 160 изготовлена из композиционного
материала, имеющего участок непрозрачного материала 260 и оптически прозрачный
участок 170, образующий оптическое окно 250, позвол ющее падающему циркул рно
пол ризованному свету взаимодействовать с нанолинзой 180 и возбуждать эффективно
локализованные плазмы (LP) и моды зазора (GM).
D. Приготовление субстрата, содержащего образец
Субстрат или подложка в аппарате предназначены дл усилени электромагнитного
пол в непосредственной близости от поверхности и покрыты тонкой пленкой плазмоннорезонансного материала, такого как серебро, золото или алюминий. Толщина пленки
составл ет, предпочтительно, 25-200 нм, например 50 нм. Пригодный субстрат, например
стекл нные субстраты, могут быть покрыты металлической пленкой известными
способами, такими как методы вакуумного испарени или высокочастотного ионного
распылени . Примеры покрытий субстрата и способов их получени раскрыты в патенте
США №5611998 "Оптохимический датчик и способ его изготовлени " (Optochemical sensor
and method for production), включенном в данное описание, и в ссылке V.Matyushin,
также включенной в данное описание.
Цепи ДНК, имеющие длину, например, от 100 нанометров до 2,5 миллиметров,
помещают на субстрат, как показано позицией 82 на Фиг.1. Рассто ние между цеп ми
должно находитьс в интервале 200-300 микрон и должно соответствовать рассто нию
между соседними консол ми в матрице консолей.
Предпочтительным вл етс рассто ние, равное 250 микрон, которое соответствует
250-микронному шагу, вл ющемус стандартом в технологи х плоских волоконнооптических кабелей.
На Фиг.4 изображен типичный кристалл или субстрат 80, предназначенный дл использовани в аппарате и способе по изобретению. Тут изображены образцы ДНК,
полученные, например, из геномной ДНК в форме фрагментов одноцепочечной ДНК
длиной до 2,5 миллиметров (5 млн оснований). Цепи, такие как обозначенные позицией
210, помещают на поверхность предметного стекла, обладающего способностью к
Страница: 11
RU 2 334 958 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
плазмонно-резонансному оптическому усилению 80. Они размещаютс упор доченно с
возможностью адресации. Каждый конец цепи ДНК присоединен к комплементарному
олигонуклеотиду на правом/левом штрих-кодовом участке 220а и 220b. Рассто ние между
цеп ми должно находитьс в интервале 200-300 микрон и соответствовать рассто нию
между соседними консол ми в матрице консолей. Предпочтительным вл етс рассто ние
250 микрон, соответствующее шагу 250 микрон, совпадающему с шагом стандартных
плоских волоконно-оптических кабелей.
Способы выт гивани и ориентации образцов линейных полимеров, таких как ДНК, РНК,
нуклеиновые аналоги, полипептиды, линейные углеводороды и т.п., вл ютс известными.
Например, противоположные концы образца полимера, такого как ДНК, могут быть
ковалентно св заны с микросферами, такими как латексные или стекл нные бусины, и
бусинами затем манипулируют с помощью импульсно-лазерного молекул рного пинцета до
достижени требуемой степени раст жени , предпочтительно, с перет жкой. Этот подход
проиллюстрирован на Фиг.4, где изображены микросферы 290а, 290b, присоединенные к
противоположным концам цепи ДНК 210. Кажда сфера "захватываетс " лазерным лучем,
таким как лучи 300а, 300b, дл манипулировани сферами с целью выт гивани и
ориентации цепи при ее размещении на поверхности субстрата. После осуществлени такого размещени концевые участки цепи креп тс к субстрату путем гибридизации с
комплементарными олигонуклеотидами, присоединеными к субстрату на участке штрихкода. Способы захвата и манипулировани микросферами в лазерном луче описаны,
например, в патенте США №5620857 и в патентной за вке США №20040001371, которые
включены в данное описание.
В родственной методике концы полимерной цепи ковалентно св зываютс с магнитными
бусинами или с твердой подложкой и магнитной бусиной, и к бусине (бусинам)
прикладывают магнитное поле (пол ) до достижени требуемой степени раст жени и
ориентации цепи. В более общем случае противоположные концы цепи могут быть
присоединены к паре перемещающихс относительно друг друга опор, и опоры
устанавливаютс в п
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
564 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа