close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент РФ 2335297

код для вставки
РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
RU
(19)
(11)
2 335 297
(13)
C2
(51) МПК
A61K
A61K
A61K
A61K
A61P
A61P
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
(12)
39/00
39/395
41/00
51/10
35/00
37/06
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
(21), (22) За вка: 2005124281/15, 31.12.2003
(72) Автор(ы):
ГОЛДЕНБЕРГ Дэвид М. (US),
ХАНСЕН Ханс (US)
(24) Дата начала отсчета срока действи патента:
31.12.2003
(73) Патентообладатель(и):
ИММУНОМЕДИКС, ИНК. (US)
R U
(30) Конвенционный приоритет:
31.12.2002 US 60/437,145
(43) Дата публикации за вки: 27.01.2006
(45) Опубликовано: 10.10.2008 Бюл. № 28
2 3 3 5 2 9 7
2 3 3 5 2 9 7
R U
(85) Дата перевода за вки PCT на национальную фазу:
01.08.2005
C 2
C 2
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: WO 98/42378 А, 01.10.1998. WO 01/97855
А, 27.12.2001. WO 01/97858 А, 27.12.2001. WO
02/22212 A2, 21.03.2002. RU 2174409 C2,
10.10.2001. GOLDENBERG DAVID M, Journal of
Nuclear Medicine, 05.2002, т.43, №5, с.693713, ХР009028820, ISSN: 0161-5505, PMID:
11994535. PRESS O W, Cancer J Sci Am., NEW
YORK, NY, US, 07.1998, т.4, № SUPPL 2, с.S19S26, (см. прод.)
(86) За вка PCT:
GB 03/05700 (31.12.2003)
(87) Публикаци PCT:
WO 2004/058298 (15.07.2004)
Адрес дл переписки:
129010, Москва, ул. Б.Спасска , 25, стр.3,
ООО "Юридическа фирма Городисский и
Партнеры", пат.пов. Е.Е.Назиной, рег. № 517
(54) ИММУНОТЕРАПИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ В-КЛЕТОК И АУТОИММУННЫХ
ЗАБОЛЕВАНИЙ С ПРИМЕНЕНИЕМ КОНЪЮГИРОВАННЫХ И НЕКОНЪЮГИРОВАННЫХ
АНТИТЕЛ, КОМБИНАЦИЙ АНТИТЕЛ И СЛИТЫХ БЕЛКОВ
(57) Реферат:
Изобретение относитс к области медицины, а
именно к иммунотерапии. Предложено применение
(i)
конъюгированного
анти-CD74-антитела
и
неконъюгированного анти-СD20-антитела, слитого
с анти-СD20-антителом белка, который содержит
антиген-св зывающую молекулу, в которой св заны
два или более сегментов одинаковых или
различных
одноцепочечных
антител
или
фрагментов антител с одинаковой или различной
специфичностью,
или
фрагмент
анти-СD20антитела, либо (ii) конъюгированного анти-СD20антитела
и
неконъюгированного
анти-СD74антитела, слитого с анти-СD74-антителом белка,
который
содержит
продуцируемую
рекомбинантным путем антиген-св зывающую
молекулу, в которой св заны два или более
сегментов
одинаковых
или
различных
одноцепочечных антител или фрагментов антител
с одинаковой или различной специфичностью, или
Страница: 1
RU
фрагмент анти-СD74-антитела, в производстве
лекарственного средства дл лечени у
млекопитающего злокачественного заболевани ,
св занного с В-клетками, заболевани , св занного
с Т-клетками, или аутоиммунного заболевани .
Сочетание анти-СD74- и анти-CD-20-антител, как
за влено в насто щем изобретении, обеспечивает
повышение эффективности иммунотерапии без
побочных токсических эффектов. 38 з.п. ф-лы.
(56) (продолжение):
ХР000929567, ISSN: 1081-4442, PMID: 9672771. PARK J W et al., J Control Release., 06.07.2001, т.74, №13, с.95-113, PMID: 11489487. OCHAKOVSKAYA R. et al., din Cancer Res. 2001 Jun; 7(6): 1505-10, найдено
в PubMed, PMID: 11410483. Ong GL et al., Clin Cancer Res. 2001 Jan; 7(1): 192-201, найдено в PubMed,
PMID: 11205908.
R U
R U
2 3 3 5 2 9 7
C 2
C 2
2 3 3 5 2 9 7
Страница: 2
RUSSIAN FEDERATION
(19)
RU
(11)
2 335 297
(13)
C2
(51) Int. Cl.
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY,
PATENTS AND TRADEMARKS
(12)
A61K
A61K
A61K
A61K
A61P
A61P
39/00
39/395
41/00
51/10
35/00
37/06
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
ABSTRACT OF INVENTION
(21), (22) Application: 2005124281/15, 31.12.2003
(24) Effective date for property rights: 31.12.2003
(72) Inventor(s):
GOLDENBERG Dehvid M. (US),
KhANSEN Khans (US)
(30) Priority:
31.12.2002 US 60/437,145
(73) Proprietor(s):
IMMUNOMEDIKS, INK. (US)
R U
(43) Application published: 27.01.2006
(45) Date of publication: 10.10.2008 Bull. 28
2 3 3 5 2 9 7
(85) Commencement of national phase: 01.08.2005
(86) PCT application:
GB 03/05700 (31.12.2003)
(87) PCT publication:
WO 2004/058298 (15.07.2004)
(54) IMMUNOTHERAPY OF MALIGNANT DISEASES OF B-CELLS AND AUTOIMMUNE DISEASES
R U
2 3 3 5 2 9 7
WITH APPLICATION OF CONJUGATE AND NONCONJUGATE ANTIBODIES, COMBINATIONS OF
ANTIBODIES AND CONJOINT PROTEINS
(57) Abstract:
FIELD: medicine.
SUBSTANCE: invention is referred to medicine
area, namely, to an immunotherapy. Application
(i) of conjugate anti-CD74-antibodies and nonconjugate
anti-CD20-antibody
merged
with
a
protein anti-CD20-antibody which contains an
antigen-binding molecule with two or more
segments of identical or various one-chained
antibodies or fragments of antibodies are bound
to identical or various specificity, or an antiCD20-antibody fragment, or (ii) conjugate antiCD20-antibodies and
non-conjugate anti-CD74antibody merged with an anti-CD74-antibody of
fiber which contains a molecule produced by
recombinant antigen-binding with two or more
segments of identical or various one-chained
antibodies or fragments of antibodies are bound
to identical or various specificity, or an antiCD74-antibody fragment, in manufacture of a
medical product for treatment at the mammal
malignant disease bound to B-cells, the disease
bound to T-cells, or autoimmune disease is
offered. The combination of anti-CD74 - and antiCD-20 of-antibodies as it is declared in the
present
invention,
provides
increase
of
immunotherapy efficiency without collateral toxic
effects.
EFFECT: increase of immunotherapy efficiency
at treatment of malignant diseases without
collateral toxic effects.
39 cl, 4 ex
Страница: 3
EN
C 2
C 2
Mail address:
129010, Moskva, ul. B.Spasskaja, 25, str.3,
OOO "Juridicheskaja firma Gorodisskij i
Partnery", pat.pov. E.E.Nazinoj, reg. № 517
RU 2 335 297 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Область техники
Насто щее изобретение относитс к иммунотерапевтическому способу лечени злокачественных заболеваний, св занных с B-клетками, в частности к способу лечени агрессивных лимфом, которые не вл ютс лимфомами Ходжкина (неходжкинские
лимфомы). В частности, данное изобретение направлено на разработку способов лечени и диагностики заболеваний, св занных с B-клетками, заболеваний, св занных с Tклетками, или аутоиммунных заболеваний у млекопитающих путем введени млекопитающим терапевтических композиций, дл которых не осуществл етс предварительное введение дозы антитела, не меченного радиоактивной меткой.
Уровень техники
B-клеточные лимфомы экспрессируют поверхностные антигены, которые, как было
показано, вл ютс хорошими мишен ми дл терапии моноклональными антителами
(Mab). Антитела, либо примен емые сами по себе (простые антитела), либо в сочетании с
химиотерапией, могут быть конъюгированы с токсинами или с радионуклидами дл радиоиммунотерапии (RAIT). Антитело, меченное радиоактивной меткой, ввод т после
(Kaminski M.S. et al., J. Clin. Oncol. 19: 3918-3928, 2001) или совместно (Press O.W. et al.,
New Engl. J. Med. 329: 1219-24, 1993) с немеченым антителом дл улучшени распределени вводимой дозы. Большинство исследователей используют радиоактивно
меченное антитело мыши в сочетании с немеченым антителом, которое вл етс мышиным или химерным (гибридным). С точки зрени токсикологии считалось выгодным
метить радиоактивной меткой мышиное антитело из-за меньшего периода его
полувыведени по сравнению с химерным антителом. Моноклональное антитело с более
продолжительным периодом полувыведени дает более длительное врем пребывани радиоактивного иммуноконъюгата в крови и костном мозге и, веро тно, таким образом,
порождает большую токсичность. Поскольку антитело само по себе почти не вызывает
токсичности, немеченые антитела как мышиное, так и химерное, используют дл улучшени распределени дозы, как утверждаетс , за счет насыщающего антигена на
нормальных клетках и ткан х тела (cf. Kaminski, US Patent No. 5595721; Wiseman et
al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39: 181-194, 2001).
Применение моноклональных антител в целевой радиотерапии раковых заболеваний
(радиоиммунотерапи ; RAIT) привело к замечательным клиническим результатам в случае
гематологических заболеваний, таких как неходжкинска лимфома (NHL). В насто щее
врем в попытках минимизации системной токсичности циркулирующих радионуклидов и
активации опухолей к действию радиации провер ютс новые стратегии. Перва из
упом нутых задач решаетс за счет предварительного нацеливани , а втора путем
комбинированной терапии с использованием лекарственных средств дл повышени чувствительности к действию радиоактивного излучени . См. Govindan, S.V et al.,
Current Trends, Pharmaceutical Science and Technology Today 3: 90-98, 2000.
Противоопухолева активность RAIT имеет место в основном благодар сопутствующей
радиоактивности присоединенной к антителу радиоактивной метки, котора испускает
непрерывные, экспоненциально уменьшающиес порции излучени низкой интенсивности
при внесении дозы извне. Четыре продукта, содержащие радиоактивно меченные
антитела, были доведены до состо ни коммерческих препаратов дл применени в
радиоиммунотерапии NHL. Эти препараты включают в себ 131I-тозитумомаб
(Bexxar? ), 90Y-ибритумомаб тиуксетан (Zevalin? ), 90Y-эпратузумаб (hLL2) и 131I-Lym-1.
Более подробный обзор указанных продуктов см. Goldenberg D.M., Critical Reviews in
Oncology/Hematology 39: 195-201, 2001, и Goldenberg D.M., J. Nucl. Med. 43: 693-713, 2002.
Как Bexxar (Corixa Corp., Seattle, WA), так и Zevalin (IDEC-Y2B8; IDEC
Pharmaceuticals, San Diego, CA) вл ютс мышиными моноклональными антителами (Mab),
направленными против антигена CD20, который экспрессируетс на поверхности
нормальных и злокачественных B-лимфоцитов. Bexxar примен етс как мышиное
моноклональное антитело IgG2a с добавлением «холодного» (не содержащего
радиоактивных веществ) мышиного антитела, тогда как Zevalin содержит меченое мышиное
Страница: 4
DE
RU 2 335 297 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
антитело, а также добавленный к продукту холодный человеческий/мышиный химерный
ритуксимаб (Rituxan?, IDEC-Genentech). Дл улучшени нацеливани на опухоль оба
продукта предусматривают предварительную терапию дозированным холодным
антителом, котора включает в себ 1-ч вливание 450 мг немеченого антитела Bexxar и 46 ч вливание 450 мг ритуксимаба с Zevalin. Оба продукта вызывают более высокую и
более продолжительную ответную реакцию по сравнению с простыми антителами, но,
помимо этого, они обладают ограничивающей дозу токсичностью, преимущественно
миелотоксичностью. Zevalin был утвержден Управлением по контролю за продуктами
питани и лекарственными средствами (FDA) дл лечени рецидивирующей
низкоуровневой или измененной B-клеточной неходжкинской лимфомы. Радиоактивно
меченному анти-CD-20-моноклональному антителу должна предшествовать доза холодных
антител, чтобы оптимизировать локализацию на опухоли. Фактически в случае введени предварительной дозы характерные числа локализации дл поглощени Zevalin 111индий
отдельными участками опухоли падают с 78% до 15% (Wiseman et al., ibid).
Эпратузумаб ( 90Y-эпратузумаб) представл ет собой гуманизированное антитело IgG1,
направленное против анти-CD22-антигена. Антиген быстро интернализуетс при
св зывании антитела. Сообщалось, что простое антитело эффективно как при
фолликул рной, так и при значительной диффузной B-клеточной лимфоме (Leonard
J.P. et al., Epratuzumab (hLL2, anti-CD22 humanized monoclonal antibody) is an active
and well-tolerated therapy for refractory/relapsed diffuse large B-cell non-Hodgkin's
lymphoma (NHL), Blood (Suppl) 96:578a [abstr. 2482], 2000; Press O.W. et al., Immunotherapy
of Non-Hodgkin's Lymphomas, Hematology (Am. Soc. Hematol. Educ. Program), p. 221-40,
2001). Не ожидаетс , что эпратузумаб вызывает увеличение количества человеческих
антител против человеческих антител (HAHA), что делает его пригодным дл повторного
дозировани . Исходные мышиные антитела mLL2 помечены 131I, причем они эффективны
в отношении разнообразных подтипов B-клеточных лимфом (Linden O. et al. Clin.
Cancer Res. 5:3287s-3291s, 1999). После интернализации антитело, меченное 131I,
дегалогенируетс , и радионуклид выдел етс из клетки. Радиоактивные металлы, такие
как иттрий, удерживаютс в клетке при интернализации (Sharkey R.M., et al. Cancer
Immunol. Immunother. 44:179-88, 1997). Более короткий физический период
полураспада 90Y в определенной степени компенсирует более длинный период
полувыведени эпратузумаба и обеспечивает целесообразность их сочетани .
RAIT, как правило, назначают в виде единичного вливани . Однако у подхода,
св занного с разделением радиоиммунотерапии на несколько порций, существуют
теоретические преимущества, т.к. разделение улучшает ситуацию с неоднородностью
поглощенной дозы, как подчеркнуто в O'Donoghue J.A., Dosimetric Principles of Targeted
Radiotherapy, в Radioimmunotherapy of Cancer, A.R. Fritzberg (ed.), Marcel Dekker,
Inc., 1-20, New-York, Basel, 2000. Помимо этого, существуют экспериментальные данные,
подтверждающие, что терапевтический эффект может быть улучшен путем разделени большого однократного введени меченого антитела на р д более мелких введений
(Schlom J. et al. J. Natl. Cancer Inst. 82:763-71, 1990). Подходы, включающие в себ два
вливани , а также многократные вливани , были изучены клинически с использованием
мышиных антител (DeNardo G.L., et al. Cancer Biother. Radiopharm. 13:239-54, 1998; Vose
J.M., et al. J. Clin. Oncol. 18:1316-23, 2000).
Сообщалось о внутриопухолевой изменчивости в отношении экспрессии антигена CD22.
Было найдено, что в свежих образцах опухолей п ти пациентов 52-89% клеток лимфомы
содержат антиген дл анти-CD22-Mab HD6 (Press O.W. et al. Cancer Res. 49:4906-12,
1989). Одно из за вленных преимуществ радиоиммунотерапии с использованием
источников ?-излучени с широким диапазоном заключаетс в их способности убивать
антиген-отрицательные клетки опухоли, которые наход тс в непосредственной близости
от целевых клеток. Путем определени величины экспрессии антигена клетками опухоли
перед проведением терапии можно изучить клиническую актуальность данной концепции
Страница: 5
RU 2 335 297 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
при назначении радиоиммунотерапии с применением 90Y-меченного эпратузумаба против
CD22.
Дл подтверждени теоретических преимуществ разделени дозы на порции были
предприн ты исследовани и опубликованы экспериментальные данные,
свидетельствующие в пользу этого. Данные исследовани были направлены на изучение
осуществимости разделенной на порции радиоиммунотерапии с использованием
радиоактивно меченного гуманизированного антитела. Было найдено, что после
предварительного приема 100 мг гуманизированного Mab CD22, т.е. эпратузумаба,
меченного 111In дл дозиметрических целей, последующие разделенные на порции дозы
эпратузумаба, меченного 90Y, при величине каждой порции до 7,5 мКи/м 2, раз в неделю в
течение периода до 2-3 недель привод т к приемлемой и эффективной
радиоиммунотерапии (Linden et al., Cancer Biother Radiopharm 2002; 17:490 [abstract 47]
). Хот эти клинические исследовани и предполагают, что разделенна на порции
терапи радиоиммуноконъюгатов осуществима, однако не было проведено сравнение с
введением высокой однократной дозы радиоиммуноконъюгата с точки зрени безопасности
и эффективности. Поскольку перва «дозиметрическа » доза с 111In содержала 100 мг
антитела и кажда последующа инъекци также содержала дозу этого простого антитела,
то также было невозможно определить, не вызывают ли эти дозы, при общем количестве
эпратузумаба не менее 300 мг, эффект предварительного введени дозы, как
предполагалось в других цитированных исследовани х, включающих антитела CD20.
Следовательно, из данных исследований невозможно было пон ть, вл етс ли
необходимым дл подобной радиоиммунотерапии любое введение предварительной дозы,
в особенности с антителами CD22.
В насто щем изобретении в противоположность другим опубликованным исследовани м
и патенту Каминского (Патент Соединенных Штатов № 5595721), было обнаружено, что
есть возможность не примен ть введение предварительной дозы дл насыщени антигенных участков нормальных тканей и селезенки, как это делалось в предыдущей
технике. Конкретно описанное здесь изобретение показывает, что нет необходимости во
введении высокой предварительной дозы антитела, как это было прин то в предыдущем
уровне техники.
Сущность изобретени Соответственно, цель насто щего изобретени состоит в том, чтобы разработать
способы лечени заболеваний у млекопитающих путем введени терапевтической
композиции, дл которой не осуществл етс предварительное введение не меченного
радиоактивной меткой антитела, фрагмента или слитого белка.
Помимо этого, цель насто щего изобретени заключаетс в том, чтобы сделать
упом нутые выше композиции не только простыми и легкими дл применени , но к тому же
сделать так, чтобы они сами по себе оставались терапевтически активными и имели
сходную степень эффективности, не име в своем составе высоких доз простых антител,
воздействующих на опухоль.
Еще одной целью изобретени вл етс разработка способов, которые более
эффективны в лечении агрессивной неходжкинской лимфомы, в противоположность
предыдущей технике, котора давала результаты только дл неактивных форм лимфомы.
Эти и другие цели насто щего изобретени достигнуты в соответствии со способом
реализации насто щего изобретени путем предоставлени способа лечени заболевани у млекопитающих, включающего в себ одновременное или последовательное введение
млекопитающим терапевтической композиции, котора содержит фармацевтически
приемлемый носитель и, по меньшей мере, одно конъюгированное антитело или его
фрагмент, или слитый белок конъюгированного антитела или его фрагмент, и при этом не
осуществл етс введение предварительной дозы не меченных радиоактивной меткой
антитела, фрагмента или слитого белка. Неконъюгированное антитело, фрагмент или
слитый белок необ зательно добавл ют к конъюгированному антителу, фрагменту или
слитому белку в качестве поддерживающей терапии дл того, чтобы опухолевым клеткам
Страница: 6
RU 2 335 297 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
не удалось избежать роли мишени дл основной терапии.
В предпочтительном варианте осуществлени насто щее изобретение направлено на
способ лечени таких заболеваний, как злокачественные заболевани , св занные с Bклетками. Кроме этого упом нутый способ пригоден дл лечени аутоиммунных
заболеваний, а также злокачественных заболеваний, св занных с T-клетками.
В другом предпочтительном варианте осуществлени конъюгированные и
неконъюгированные антитела, фрагменты и слитые белки согласно изобретению могут
быть нацелены на антиген, выбранный из группы, состо щей из CD3, CD4, CD5, CD8,
CD11c, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD37, CD38, CD40,
CD40L, CD52, CD54, CD74, CD80, CD126, Ia, HMI.24, HLA-DR, тенасцина, MUC1 и
антигенов, ассоциированных с опухол ми B-клеток, включа антигены сосудистого
эндотели , такие как сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и плацентарный
фактор роста (PIGF). В смежных воплощени х конъюгированные и/или неконъюгированные
антитела, фрагменты или слитые белки согласно изобретению могут быть одинаковыми
или различными. Такие антитела могут быть также человеческими, мышиными, химерными,
приматизированными или гуманизированными. Более того, эти антитела, фрагменты или
слитые белки могут быть выбраны из группы, состо щей из интактных IgG, F(ab')2, F(ab)2,
Fab', Fab, scFvs, диантител, триантител или тетраантител и могут сочетатьс , по
меньшей мере, с одним терапевтическим средством.
В соответствии с другим аспектом насто щего изобретени , как описано выше,
предложен способ, согласно которому пациенты из числа млекопитающих, таких как
человек, а также домашние или сопутствующие человеку животные, подвергаютс лечению
одним или несколькими антителами, сопр женными с одним или несколькими
терапевтическими средствами, выбранными из группы, состо щей из лекарственного
средства, токсина, иммуномодул тора, хелатообразовател , соединений бора,
фотодинамического агента и радионуклидов.
В еще одном предпочтительном варианте осуществлени терапевтическа композици содержит слитый белок или упом нутое сочетание антител или антител с
иммуномодул торами. Объединенные антитела могут включать в себ антитела против
различных антигенов, а также антитела против различных эпитопов одного и того же
антигена.
Насто щее изобретение предполагает упом нутый выше способ, в котором
конъюгированное или неконъюгированное антитело представл ет собой моноклональное
антитело против CD22, которое ввод т млекопитающему парентерально при
предпочтительной дозировке 20-600 миллиграммов белка на дозу, более предпочтительно
20-150 миллиграммов белка на дозу и наиболее предпочтительно 20-100 миллиграммов
белка на дозу. Дополнительно млекопитающее может получать антитело против CD22 в
виде повторного парентерального введени предпочтительно 20-150 миллиграммов белка
на дозу и более предпочтительно 20-100 мг белка на дозу. Важно осознавать, что такие
дозы даютс в качестве действующих терапевтических доз, и не требуетс какого бы то
ни было введени предварительной дозы как с целью улучшени нацеливани на опухоль,
так и дл дозиметрических целей, как это делалось ранее, например, Juweid et al., Clin.
Cancer Res. 5:3292s-3303s, 1999 (где требовалась предварительна доза 50 мг CD22-Mab,
сопр женного с 111In или другим диагностическим изотопом). В этих исследовани х не
было предприн то попыток добитьс того, чтобы радиоиммуноконъюгат с различными
белковыми дозами антитела был эффективен непосредственно, без режима введени предварительной дозы.
В другом предпочтительном варианте осуществлени способ лечени заболевани млекопитающих включает в себ введение млекопитающему терапевтической композиции,
содержащей фармацевтически приемлемый носитель и полиспецифическое
поливалентное антитело, фрагмент или конъюгат слитого белка, который св зываетс , по
меньшей мере, с одним целевым антигеном, а также терапевтическое средство, причем не
осуществл етс предварительное введение дозы антитела, не меченного радиоактивной
Страница: 7
RU 2 335 297 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
меткой.
В еще одном предпочтительном варианте осуществлени способ лечени заболевани млекопитающих включает в себ (a) введение млекопитающему композиции, котора содержит полиспецифическое
поливалентное антитело, фрагмент или слитый белок, который св зываетс , по меньшей
мере, с одним целевым антигеном;
(b) необ зательно применение очищающего средства, чтобы дать возможность
композиции вывести из циркул ции нелокализованные антитела; и
(c) введение млекопитающему фармацевтически эффективного количества
терапевтического конъюгата, который св зываетс с полиспецифическим поливалентным
антителом, фрагментом или слитым белком
и при этом не осуществл етс предварительное введение дозы антитела, не меченного
радиоактивной меткой.
Прочие цели, отличительные особенности и преимущества насто щего изобретени станут сны из следующего подробного описани и приложенной формулы изобретени .
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществлени Если не указано иначе, употребление единственного числа означает «один или более».
1. Определени В следующем ниже описании используетс р д терминов, причем приведенные ниже
определени призваны облегчить понимание насто щего изобретени .
Термин неходжкинска лимфома (NHL) относитс к семейству заболеваний, которое
включает в себ лимфомы лимфатических узлов, селезенки, других органов и часто
костного мозга. Существует, по меньшей мере, 30 различных типов NHL. Два общих типа
представл ют собой фолликул рную лимфому (низкой степени или неактивную) и
агрессивную, диффузную, крупноклеточную лимфому (промежуточной или высокой
степени).
Термин антитело в рамках насто щего изобретени относитс к полноразмерной (т.е.
по вившейс естественным путем или образовавшейс в результате процесса
рекомбинации фрагмента нормального гена иммуноглобулина) молекуле иммуноглобулина
(например, антителу IgG) или к части молекулы иммуноглобулина, про вл ющей
иммуноглобулиновую активность, такой как фрагмент антитела.
Фрагмент антитела представл ет собой часть антитела, такую как F(ab')2, F(ab)2, Fab',
Fab, Fv, sFv и т.п. Независимо от структуры фрагмент антитела св зываетс с тем же
самым антигеном, который опознаетс интактным антителом. Например, фрагмент антиCD22-моноклонального антитела св зываетс с эпитопом CD22. Термин «фрагмент
антитела» включает в себ также любой синтетический белок или белок, полученный с
помощью генной инженерии, который действует как антитело при св зывании со
специфическим антигеном дл формировани комплекса. Например, фрагменты антитела
включают в себ выделенные фрагменты, состо щие из вариабельных областей, такие как
фрагменты «Fv», состо щие из вариабельных областей т желой и легкой цепей молекул
рекомбинантных одноцепочечных полипептидов, в которых т желые и легкие
вариабельные области св заны пептидным линкером («белки scFv»), а также минимальные
опознающие фрагменты, состо щие из остатков аминокислот, которые имитируют
гипервариабельную область.
Простое или холодное антитело в общем представл ет собой целостное антитело,
которое не сопр жено (не конъюгировано) с терапевтическим средством. Это происходит
потому, что Fc-часть молекулы антитела обеспечивает такие функции эффектора, как
св зывание комплемента и ADCC (зависима от антител клеточна цитотоксичность), т.е.
функции, запускающие механизмы, которые могут приводить к лизису клеток. Однако
возможно, что Fc-часть не потребуетс дл реализации терапевтической функции с
приведением в действие других механизмов, таких как апоптоз. Кроме этого простые
антитела представл ют собой антитела, не меченные радиоактивной меткой, которые
подразумевают как поликлональные, так и моноклональные антитела, а также
Страница: 8
RU 2 335 297 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
определенные рекомбинантные антитела, такие как приматизированные антитела,
химерные, гуманизированные или человеческие антитела.
Химерное антитело представл ет собой рекомбинантный белок, который содержит
вариабельные области, включа участки, определ ющие комплементарность (CDR)
антитела, характерного дл одного вида живых существ, предпочтительно антитела
грызунов, в то врем как константные области молекулы антитела вл ютс производными
соответствующих областей человеческого антитела. Дл применени в ветеринарии
константные области химерного антитела могут происходить из антител других видов
животных, таких как кошка или собака.
Гуманизированное антитело представл ет собой рекомбинантный белок, в котором CDR
из антитела одних видов, например, антитела грызунов, перенесено из т желой и легкой
вариабельных цепей антитела грызунов в т желые и легкие вариабельные области
человеческого антитела. Константные области молекулы антитела происход т из
константных областей человеческого антитела.
Человеческое антитело представл ет собой антитело, полученное из трансгенных
мышей, которые были «спроектированы», дл получени специфических антител человека
в качестве ответа на введение антигенов. В этой методике элементы расположени т желой и легкой цепей человека введены в линию мышей, полученную из линий
эмбриональных клеток, которые содержат целевое нарушение местоположений т желой и
легкой цепей. Трансгенные мыши могут синтезировать человеческие антитела,
специфичные дл человеческих антигенов, и эти мыши могут быть использованы дл получени гибридом, секретирующих человеческие антитела. Способы получени человеческих антител из трансгенных мышей описаны Green et al., Nature Genet. 7:13
(1994), Lonberg et al., Nature 368:856 (1994) и Taylor et al., Int. Immun. 6:579 (1994). Кроме
этого полностью человеческое антитело может быть сконструировано способами генной
или хромосомной трансфекции, а также с помощью технологии фагового диспле , причем
все эти способы известны в технике. См., например, McCafferty et al., Nature 348:552-553
(1990) дл ознакомлени с получением человеческих антител и их фрагментов in vitro из
набора вариабельных областей иммуноглобулина неиммунизированных доноров. В данной
методике гены вариабельных доменов антител клонируют в каркасе внутри либо
мажорного, либо минорного гена покровного белка нитевидного бактериофага, и вывод т
на поверхность частицы фага в виде функциональных фрагментов антител. Поскольку
нитевидные частицы содержат копию ДНК генома фага, состо щую из одной цепи, отбор,
основанный на функциональных свойствах антитела, также приводит к отбору гена,
кодирующего антитело, которое про вл ет те же свойства. Таким образом, фаг имитирует
некоторые из свойств B-клетки. Способ фагового диспле может быть реализован в
различных форматах, обзор этих форматов, см., например, Johnson and Chiswell, Current
Opinion in Structural Biology 3:5564-571 (1993).
Человеческие антитела также могут вырабатыватьс активированными B-клетками in
vitro. См. патенты Соединенных Штатов №№ 5567610 и 5229275, которые во всей полноте
включены в насто щую за вку с помощью ссылки.
Терапевтическое средство представл ет собой молекулу или атом, которые ввод т
отдельно, одновременно или последовательно с фрагментом антитела, или же
терапевтическое средство конъюгировано с фрагментом антитела, т.е. антителом или
фрагментом антитела, или субфрагментом антитела, причем терапевтическое средство
применимо дл лечени заболевани . Примеры терапевтических средств включают
антитела, фрагменты антител, лекарственные препараты, токсины, нуклеазы, гормоны,
иммуномодул торы, хелатообразователи, соединени бора, фотоактивные агенты или
красители и радиоактивные изотопы.
Иммуномодул тор представл ет собой терапевтическое средство в соответствии с
тем, как это определено в насто щем изобретении, которое своим присутствием измен ет,
подавл ет или стимулирует иммунную систему организма. Как правило, иммуномодул тор,
применимый в насто щем изобретении, такой как макрофаги, B-клетки и/или T-клетки,
Страница: 9
RU 2 335 297 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
стимулирует размножение иммунных клеток или становитс активным в последовательном
механизме иммунного ответа.
Иммуноконъюгат представл ет собой конъюгат антитела с терапевтическим или
диагностическим средством. Диагностическое средство может включать в себ радиоактивную или нерадиоактивную метку и контрастное средство (как например, дл создани изображений в магнитном резонансе, компьютерной томографии или
ультразвуковой технике), причем радиоактивна метка может быть изотопом, испускающим
гамма-, бета-, альфа-излучение, Аугеровские электроны или позитроны.
Вектор экспрессии представл ет собой молекулу ДНК, содержащую ген, который
экспрессируетс в клетке-хоз ине. Как правило, экспресси гена происходит под
управлением определенных регул торных элементов, включа конститутивные или
индуцируемые промоторы, тканеспецифические регул торные элементы и энхансеры. Про
такие гены говор т, что они вл ютс «функционально св занными» с регул торными
элементами.
Рекомбинантный хоз ин может быть любой прокариотической или эукариотической
клеткой, котора содержит либо вектор клонировани , либо вектор экспрессии. Помимо
этого, данный термин включает в себ такие прокариотические или эукариотические
клетки, а также трансгенных животных, которые были созданы с помощью генной
инженерии, с тем, чтобы в их хромосомах или геноме содержалс клонированный ген
(гены) хоз йской клетки или клеток клетки-хоз ина. Подход щие клетки-хоз ева
млекопитающих включают в себ клетки миеломы, такие как клетки SP2/0 и клетки NSO,
а также клетки ичника китайского хом чка (CHO), линии клеток гибридомы и другие
клетки-хоз ева млекопитающих, применимые дл экспрессировани антител. Дл экспрессировани Mab и других слитых белков частично применима человеческа лини клеток PER.C6, описанна в WO 0063403 A2, котора вырабатывает рекомбинантные белки
в количестве от 2 до 200 раз большем, чем обычные линии клеток млекопитающих, такие
как линии клеток CHO, COS, Vero, Hela, BHK и SP2. Специальные трансгенные животные с
измененной иммунной системой особенно применимы дл получени полностью
человеческих антител.
В рамках насто щего изобретени термин слитый белок антитела представл ет собой
рекомбинантно полученную св зывающую антиген молекулу, в которой соединены два или
несколько одинаковых или различных одноцепочечных антител или сегментов фрагментов
антител с одинаковой или различной специфичностью. Валентность слитого белка
показывает, каким количеством св зывающих плеч или участков по отношению к одному
антигену или эпитопу обладает слитый белок, т.е. вл етс ли он моновалентным,
бивалентным, трехвалентным или мультивалентным. Мультивалентность слитого белка,
вл ющегос антителом, означает, что он может иметь преимущество многократного
взаимодействи в процессе св зывани с антигеном, повыша , таким образом, авидность
св зывани с антигеном. Специфичность показывает, насколько большое число антигенов
или эпитопов способен св зать слитый белок, вл ющийс антителом, т.е. вл етс ли он
моноспецифическим, биспецифическим, триспецифическим, мультиспецифическим. При
использовании этих определений природное антитело, например IgG, вл етс бивалентным, т.к. оно имеет два св зывающих плеча, но моноспецифическим, т.к. оно
св зываетс с одним эпитопом. Моноспецифические мультивалентные белки сли ни имеют более чем один св зывающий участок дл эпитопа, но св зываютс только с одним
эпитопом, например диантитело с двум св зывающими участками, которые
взаимодействуют с одним и тем же антигеном. Белки сли ни могут включать в себ компонент одного антитела, мультивалентное или мультиспецифическое сочетание
компонентов различных антител или несколько копий одного и того же компонента
антитела. Слитый белок может дополнительно содержать антитело или фрагмент антитела
и терапевтическое средство. Примеры терапевтических средств, которые вл ютс подход щими дл слитых белков, включают в себ иммуномодул торы («слитый белок
антитело-иммуномодул тор») и токсины («слитый белок антитело-токсин»). Один
Страница: 10
RU 2 335 297 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
предпочтительный токсин включает в себ рибонуклеазу (РНКазу), предпочтительно
рекомбинантную РНКазу.
Мультиспецифическое антитело представл ет собой антитело, которое может
одновременно св зыватьс , по меньшей мере, с двум мишен ми, которые различаютс по
своей структуре, например, двум различными антигенами, двум различными эпитопами
на одном антигене, или с гаптеном и/или антигеном или эпитопом. Одинакова специфичность будет иметь место дл антигенов или эпитопов B-клеток, T-клеток,
миелоидных клеток, плазмацитов и мастоцитов. Еще одна специфичность могла бы
наблюдатьс на том же типе клеток дл других антигенов, таких как CD3, CD4, CD5, CD8,
CD11c, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD37, CD38, CD40,
CD40L, CD52, CD54, CD74, CD80, CD126, Ia, HMI.24, HLA-DR, тенасцин, MUC1 и антигены,
ассоциированные с опухол ми B-клеток, включа антигены сосудистого эндотели , такие
как VEGF и PIGF. Мультиспецифические, мультивалентные антитела представл ют собой
конструкции, которые содержат более чем один участок св зывани , причем участки
св зывани отличаютс по своей специфичности. Например, диантитело, в котором один
участок св зывани взаимодействует с одним антигеном, а другой участок - с другим
антигеном.
Биспецифическое антитело представл ет собой антитело, которое может св зыватьс одновременно с двум мишен ми, которые обладают различной структурой.
Биспецифические антитела (bsAb) и биспецифические фрагменты антител (bsFab) имеют,
по меньшей мере, одно плечо, которое специфически св зываетс , например, с антигеном
или эпитопом B-клетки, T-клетки, миелоидной клетки, плазмацита и мастоцита, и, по
меньшей мере, еще одно отличающеес плечо, которое специфически св зываетс с
направленным на мишень конъюгатом, который имеет в своем составе терапевтическое
или диагностическое средство. Разнообразные биспецифические белки сли ни можно
получить, примен молекул рную инженерию. В одной форме биспецифический белок
сли ни вл етс моновалентным, состо щим, например, из scFv с одним участком
св зывани дл одного антигена и фрагмента Fab с одним участком св зывани дл второго антигена. В другой форме биспецифический белок сли ни вл етс дивалентным,
состо щим, например, из IgG с участком св зывани дл одного антигена и двух scFv с
двум участками св зывани дл второго антигена.
Антитела, которые созданы наподобие собачьих или кошачьих, представл ют собой
рекомбинантные белки, в которых принадлежащие грызунам (или другим видам) области
моноклональных антител, определ ющие комплементарность, перенесены из т желых и
легких вариабельных цепей иммуноглобулина грызунов (или других видов) соответственно
в вариабельные области иммуноглобулина собак или кошек.
Антитела, которые созданы наподобие антител человекообразных приматов,
представл ют собой рекомбинантные белки, в которых области моноклонального антитела,
определ ющие комплементарность и принадлежащие приматам, отличным от человека
(например, обезь нам), были перенесены из т желых и легких вариабельных цепей
иммуноглобулина грызунов (или других видов) в вариабельные области иммуноглобулина
приматов, отличных от человека.
Домашние животные включают в себ крупных животных, таких как лошади, крупный
рогатый скот, овцы, козы, ламы, альпаки и свиньи, а также сопутствующих человеку
животных. В предпочтительном варианте осуществлени домашнее животное
представл ет собой лошадь.
Сопутствующие человеку животные включают в себ животных, которые содержатс в
качестве комнатных животных. В основном это собаки и кошки, хот к этой группе также
относ тс небольшие грызуны, такие как морские свинки, хом ки, крысы и хорьки, а
также приматы, такие как обезь ны. В предпочтительном варианте осуществлени сопутствующее животное представл ют собой собаку или кошку.
Термин «очищающее средство» относитс к антителу, которое заполн ет участки
св зывани целевого фрагмента, причем целевой фрагмент может представл ть собой
Страница: 11
RU 2 335 297 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
антитело, фрагмент антитела, св зывающийс с антигеном, или целевой фрагмент,
который не вл етс антителом. В более предпочтительном способе очищающее средство
представл ет собой моноклональное антитело, которое вл етс антиидиотипическим по
отношению к моноклональному антителу конъюгата, используемому на первой стадии, как
описано в за вке Соединенных Штатов Сер.№ 08/486166. В другом предпочтительном
варианте осуществлени очищающее средство замещено многочисленными остаткам??
углеводов, таких как галактоза, которые дают возможность быстро вывести очищающее
средство из циркул ции за счет асиалогликопротеиновых рецепторов в печени.
2. Получение моноклональных антител, включа химерные, гуманизированные и
человеческие антитела
Моноклональные антитела (Mab) вл ютс однородной попул цией антител к
отдельному антигену, причем антитела содержат только один тип участков, св зывающих
антиген, и св зываютс лишь с одним эпитопом на антигенной детерминанте.
Моноклональные антитела грызунов к отдельным антигенам могут быть получены
способами, известными специалистам в данной области. См., например, Kohler and
Milstein, Nature 256:495 (1975) и Coligan et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN
IMMUNOLOGY, VOL. 1, pages 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) [здесь и далее
«Coligan»]. Вкратце, моноклональные антитела могут быть получены путем инъекции
мышам состава, включающего в себ антиген, подтверждени наличи выработки антител
за счет вз ти образца сыворотки, удалени селезенки дл получени B-лимфоцитов,
объединени B-лимфоцитов с клетками миеломы дл получени гибридом, клонировани гибридом, отбора положительных клонов, которые вырабатывают антитела к антигену,
культивировани клонов, которые вырабатывают антитела к антигену, и выделени антител
из культур гибридомы.
Моноклональные антитела могут быть выделены из культур гибридомы и очищены с
помощью целого р да хорошо разработанных методик. Эти методики выделени включают
в себ аффинную хроматографию с протеин-А сефарозой, эксклюзионную хроматографию
с исключением по размеру и ионообменную хроматографию. См., например, Coligan на стр.
2.7.1-2.7.12 и стр. 2.9.1-2.9.3. См., также, Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G
(IgG)" в METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, pages 79-104 (The Humana Press,
Inc. 1992).
После первоначального по влени антител к иммуногену антитела можно секвенировать
и впоследствии получать их согласно рекомбинантным методикам. Гуманизаци и
химеризаци мышиных антител и фрагментов антител хорошо известны специалистам в
данной области. Например, гуманизированные моноклональные антитела получают,
перенос мышиные, определ ющие комплементарность области из т желой и легкой
вариабельных цепей мышиного иммуноглобулина в человеческие вариабельные области и
затем замеща человеческие остатки в област х каркаса мышиных эквивалентов.
Применение компонентов антител, полученных из гуманизированных моноклональных
антител, устран ет потенциальные проблемы, св занные с иммуногенностью мышиных
константных областей.
Общие методики клонировани вариабельных областей мышиного иммуноглобулина
описаны, например, в публикации Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833 (1989),
котора полностью включена в насто щую за вку посредством ссылки. Методики создани химерных антител хорошо известны специалистам в данной области. В качестве примера
Leung et al., Hybridoma 13:469 (1994) описывают получение химеры LL2 путем сочетани последовательностей ДНК, закодированных V?- и VH-доменами моноклонального антитела
LL2, т.е. антитела против CD22, с соответствующими человеческими област ми
константных регионов ? и IgG1. Кроме этого данна публикаци предоставл ет
последовательность нуклеотидов вариабельных областей легкой и т желой цепи LL2, т.е.
соответственно V? и VH. Методики получени гуманизированных Mab описаны, например
Jones et al., Nature 321:522 (1986), Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), Verhoeyen et
al., Science 239:1534 (1988), Carter et al., Proc. Natl Acad. Sci USA 89:4285 (1992),
Страница: 12
RU 2 335 297 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992) и Singer et al., J. Immun. 150:2844 (1993), причем
каждый из этих источников включен в насто щую за вку с помощью ссылки.
Химерное антитело представл ет собой рекомбинантный белок, который содержит
вариабельные области, включа CDR, полученные из антител одного вида животных, как
например, из антител грызунов, в то врем как остальна часть молекулы антитела, т.е.
константные области, получены из человеческих антител. Соответственно, химерное
моноклональное антитело также может быть гуманизировано заменой мышиной FR в
вариабельных област х химерного моноклонального антитела одной или несколькими
различными человеческими FR. Конкретно, мышиные CDR перенос т из т желой и легкой
вариабельных цепей мышиного иммуноглобулина в соответствующие вариабельные
области человеческого антитела. Поскольку простое перенесение мышиных CDR в
человеческие FR часто приводит к снижению или даже потере характерного дл антитела
сродства, дл сохранени исходного сродства мышиного антитела могут потребоватьс дополнительные изменени . Это может сопровождатьс заменой одного или многих
человеческих остатков в област х FR их мышиными аналогами дл получени антитела,
которое обладает хорошим сродством в отношении св зывани со своим эпитопом. См.,
например, Tempest et al., Biotechnology 9:266 (1991) и Verhoeyen et al., Science 239:1534
(1988). Сродство гуманизированных, химерных и человеческих Mab к конкретному эпитопу
может быть увеличено мутагенезом CDR с тем, чтобы более низка доза антитела могла
быть столь же эффективна, как и более высока доза с меньшим сродством Mab до
мутагенеза. См., например, WO0029584A1.
Другим способом получени антител согласно изобретению вл етс их выработка в
молоке трансгенного домашнего скота. См., например, Colman A., Biochem. Soc.
Symp., 63:141-147, 1998; патент Соединенных Штатов 5827690, причем оба источника
полностью включены в насто щую за вку с помощью ссылки. Получают две конструкции
ДНК, которые содержат, соответственно, сегменты ДНК, кодирующие сдвоенные т желые и
легкие цепи иммуноглобулина. Сегменты ДНК клонируют в вектор экспрессии, который
содержит промоторную последовательность, котора предпочтительно экспрессируетс в
эпителиальных клетках млекопитающих. Примеры включают в себ , не ограничива сь
перечисленным, промоторы из генов казеина кролика, коровы и овцы, коровий
ген ?-лактоглобулина, овечий ген ? -лактоглобулина и мышиный ген белка кислой
сыворотки. Предпочтительно включенный фрагмент фланкирован на его 3'-конце за счет
родственной последовательности генома из молочно-специфического гена. Это
обеспечивает полиаденилированный участок и транскрипт-стабилизирующие
последовательности. Кассеты экспрессии одновременно ввод т в пронуклеусы
оплодотворенных йцеклеток млекопитающих, которые затем имплантируют в матку
реципиентной женской особи и оставл ют дл вынашивани . После рождени потомство
отбирают по признаку наличи обоих трансгенов с помощью анализа по Саузерну. Дл того
чтобы антитело имелось в наличии, оба гена т желой и легкой цепи должны
экспрессироватьс одновременно в одной и той же клетке. Молоко трансгенных женских
особей анализируют на наличие и функциональность антитела или фрагмента антитела,
использу известные стандартные иммунологические методики. Антитела могут быть
выделены из молока с применением известных стандартных способов.
Полностью человеческие антитела согласно изобретению, т.е. человеческие анти-CD20Mab или другие человеческие антитела, такие как анти-CD19-, анти-CD22-, анти-CD21или анти-CD23-Mab дл комбинированной терапии с гуманизированными, химерными или
человеческими антителами против CD20, могут быть получены из трансгенных животных,
не вл ющихс человеком. См., например, Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156
(1997); патент Соединенных Штатов № 5633425, причем оба источника полностью
включены в насто щую за вку с помощью ссылки. Например, человеческое антитело
может быть восстановлено из трансгенной мыши, обладающей локусами человеческого
иммуноглобулина. Гуморальна иммунна система мыши гуманизируетс с помощью
инактивации эндогенных генов иммуноглобулина и введени локусов человеческого
Страница: 13
RU 2 335 297 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
иммуноглобулина. Локусы человеческого иммуноглобулина вл ютс чрезвычайно
сложными и содержат большое число отдельных сегментов, которые в общей сложности
занимают почти 0,2% генома человека. Чтобы убедитьс , что трансгенна мышь способна
вырабатывать соответствующий ассортимент антител, следует ввести в геном мыши
большие части человеческих локусов т желой и легкой цепи. Это совершаетс в
ступенчатом процессе, который начинаетс с формировани искусственных дрожжевых
хромосом (YAC), содержащих локусы либо т желой, либо легкой цепи человеческого
иммуноглобулина в эмбриональной конфигурации. Поскольку кажда вставка имеет объем
приблизительно 1 млн н., конструкци YAC требует гомологичной рекомбинации
перекрывающихс фрагментов локусов иммуноглобулина. Две YAC, одна из которых
содержитс в т желой цепи, а друга - в легкой цепи, отдельно ввод т в мышь путем
сли ни YAC-содержащих сферобластов дрожжей со стволовыми эмбриональными
клетками мыши. Затем клоны стволовых эмбриональных клеток мыши путем
микроинъекции ввод т в мышиные бластоциты. Полученных в итоге химерных мужских
особей мыши подвергают отбору в отношении их способности передавать YAC через их
зародышевые клетки и развод т с мышами, у которых наблюдаетс недостаток выработки
мышиных антител. Разведение двух трансгенных штаммов, один из которых содержит
человеческие локусы т желой цепи, а другой - человеческие локусы легкой цепи, создает
потомство, у которого вырабатываютс человеческие антитела в качестве ответа на
иммунизацию.
Дополнительные современные методы получени биспецифических Mab включают в
себ созданные рекомбинантные Mab, которые содержат дополнительные остатки
цистеина, с тем, чтобы они св зывались сильнее по сравнению с более обычными
изотипами иммуноглобулина. См., например, FitzGerald et al., Protein Eng. 10(10): 12211225, 1997. Другой подход состоит в том, чтобы создать рекомбинантные слитые белки, в
которых соединены два или более различных одноцепочечных антитела или сегментов
фрагмента антитела с необходимой двойной специфичностью. См., например, Coloma et
al., Nature Biotech. 15:159-163, 1997. Большое количество биспецифических слитых белков
может быть получено при использовании молекул рной инженерии. В одной форме
биспецифический слитый белок вл етс моновалентным, состо щим, например, из scFv с
одним участком св зывани дл одного антигена и фрагмента Fab с одним участком
св зывани дл второго антигена. В другой форме биспецифический слитый белок
вл етс дивалентным, состо щим, например, из IgG с двум участками св зывани дл одного антигена и двух scFv с двум участками св зывани дл второго антигена.
Биспецифические слитые белки, которые св зывают два или более различных
одноцепочечных антитела или фрагмента антител, получают подобным же образом.
Рекомбинантные способы могут быть использованы дл получени большого количества
слитых белков. Например, слитый белок, содержащий фрагмент Fab, может быть получен
из гуманизированного моноклонального антитела против CD20 и scFv, который получен из
мышиного анти-diDTPA. Гибкий линкер, такой как GGGS, св зывает scFv с константной
областью т желой цепи антитела против CD20. С другой стороны, scFv может быть св зан
с константной областью легкой цепи еще одного гуманизированного антитела. Подход щие
линкерные последовательности, необходимые дл внутрикаркасного присоединени т желой цепи Fd к scFv, ввод т в VL- и VK-домены с помощью реакций PCR. Кодирующий
scFv фрагмент ДНК затем встраивают в стадийный вектор, содержащий
последовательность ДНК, котора кодирует CH1-домен. Итоговую конструкцию scFv-CH1
вырезают и встраивают в вектор, содержащий последовательность ДНК, кодирующую VHобласть антитела против CD20. Итоговый вектор может быть использован дл трансфицировани подход щей клетки-хоз ина, такой как клетка млекопитающего, дл экспрессии биспецифического слитого белка.
Примеры подобных бивалентных и биспецифических антител могут быть найдены в
за вках на патент Соединенных Штатов 60/399707, поданной 1 августа 2002 г, 60/360229,
поданной 1 марта 2002 г, 60/388314, поданной 14 июн 2002 г и 10/116116, поданной 5
Страница: 14
RU 2 335 297 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
апрел 2002 г, причем все за вки включены в насто щую за вку с помощью ссылки.
3. Получение фрагментов антител
Фрагменты антител, которые распознают конкретные эпитопы, могут быть получены по
известным методикам. Фрагменты антител представл ют собой св зывающие антигены
части антител, такие как F(ab')2, Fab', Fab, Fv, sFv и т.п. Другие фрагменты антител
включают в себ , не ограничива сь перечисленным, фрагменты F(ab)'2, которые могут
быть получены путем расщеплени молекулы антитела пепсином, а также фрагменты Fab',
которые можно получить за счет восстановлени дисульфидных мостиков фрагментов
F(ab)'2. Альтернативно могут быть созданы библиотеки экспрессии, экспрессирующие Fab'
(Huse et al., 1989, Science 246:1274-1281), чтобы иметь возможность быстрой и легкой
идентификации моноклональных фрагментов Fab' с желаемой специфичностью.
Насто щее изобретение охватывает антитела и фрагменты антител.
Молекулы Fv с одной цепью (scFv) содержат VL-домен и VH-домен. VL- и VH-домены
объедин ютс дл образовани целевого участка св зывани . Два этих домена
дополнительно ковалентно св заны пептидным линкером (L). Молекула scFv обозначаетс либо как VL-L-VH, если VL-домен вл етс N-терминальной частью молекулы scFv, либо
как VH-L-VL, если VH-домен представл ет собой N-терминальную часть молекулы scFv.
Способы получени молекул scFv и разработки подход щих пептидных линкеров описаны в
патенте Соединенных Штатов № 4704692, патенте Соединенных Штатов № 4946778, см.
также R.Raag и M.Whitlow, "Single Chain Fvs." FASEB 9:73-80 (1995) и R.E. Bird and B.W.
Walker, Single Chain Antibody Variable Regions, TIBTECH 9:132-137 (1991). Данные
источники включены в насто щую за вку с помощью ссылки.
Фрагмент антитела может быть получен протеолитическим гидролизом полноразмерных
антител или путем экспрессии в E.Coli или другом хоз ине ДНК, кодирующей фрагмент.
Фрагмент антитела может быть получен путем расщеплени полноразмерных антител
пепсином или папаином с помощью общеприн тых способов. Например, фрагмент
антитела может быть получен ферментативным расщеплением антитела с помощью
пепсина с образованием фрагмента 5S, который обозначают F(ab')2. Этот фрагмент за
счет расщеплени дисульфидных св зей может быть расщеплен далее с образованием
моновалентного фрагмента 3.5S Fab' с помощью реагента, восстанавливающего тиоловую
группу, и необ зательно блокирующей группы дл сульфогидрильных групп. С другой
стороны, ферментативное расщепление с использованием папаина непосредственно
приводит к образованию двух моновалентных фрагментов Fab и фрагмента Fc. Эти
способы описаны, например Goldenberg, патенты Соединенных Штатов №№ 4036945 и
4331647, причем указанные патенты полностью включены в насто щую за вку с помощью
ссылки. См., также Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89:230 (1960); Porter, Biochem.
J. 73:119 (1959), Edelman et al., в METHODS IN ENZYMOLOGY, Volume 1, p. 422 (Academic
Press 1967) и Coligan на стр. 2.8.1-2.8.10 и 2.10.-2.10.4.
Друга форма фрагментов антител представл ет собой пептид, который кодирует
одиночную область, определ ющую комплементарность (CDR). CDR представл ет собой
сегмент вариабельной области антитела, комплементарный по структуре эпитопу, с
которым св зываетс антитело, причем CDR вл етс более изменчивым, чем остальна часть вариабельной области. Соответственно, CDR часто называют гипервариабельной
областью. Вариабельна область включает в себ три CDR. Пептиды CDR могут быть
получены путем конструировани генов, которые кодируют CDR представл ющего интерес
антитела. Такие гены получают, например, использу полимеразную цепную реакцию дл синтеза вариабельной области из РНК клеток, которые вырабатывают антитело. См.,
например, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106 (1991);
Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies", in MONOCLONAL
ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et
al. (eds.), pages 166-179 (Cambridge University Press 1995); and Ward et al., "Genetic
Manipulation and Expression of Antibodies", in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND
APPLICATIONS, Birch et al., (eds.), pages 137-185 (Wiley-Liss, Inc. 1995).
Страница: 15
RU 2 335 297 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Помимо этого, могут быть использованы другие способы расщеплени антител, как,
например, отделение т желых цепей с образованием моновалентных фрагментов легкихт желых цепей, дальнейшее расщепление фрагментов или другие ферментативные,
химические или генетические методики, в той степени, в которой полученные фрагменты
сохран ют способность к св зыванию с антигеном, который распознаетс целым
антителом.
4. Мультиспецифические и мультивалентные антитела
Описанные в насто щей за вке антитела, имеющие одинаковые специфичности, а также
другие антитела, имеющие отличающиес специфичности, также могут быть получены в
виде мультиспецифических антител (содержащих, по меньшей мере, один участок
св зывани с эпитопом или антигеном CD20 и, по меньшей мере, один участок св зывани с другим эпитопом на CD20 или другим антигеном) и мультивалентных антител
(содержащих многочисленные участки св зывани с одним и тем же эпитопом или
антигеном).
Насто щее изобретение относитс к биспецифическому антителу или фрагменту
антитела, которые обладают, по меньшей мере, одной областью св зывани , котора специфически св зываетс с маркером целевой клетки, и, по меньшей мере, еще одной
областью св зывани , котора специфически св зываетс с нацеливаемым конъюгатом.
Нацеливаемый конъюгат содержит определенную долю носител , который содержит или
несет, по меньшей мере, один эпитоп, распознаваемый, по меньшей мере, одной областью
св зывани биспецифического антитела или фрагмента антитела.
Как указано выше, дл получени биспецифических антител или фрагментов антител
может быть использовано большое количество рекомбинантных методик.
В насто щем изобретении также рассматриваютс мультивалентные антитела. Такой
св зывающий мишень мультивалентный белок создан путем соединени первого и второго
полипептидов. Первый полипептид содержит первую одноцепочечную молекулу Fv,
ковалентно св занную с первой подобной иммуноглобулину областью, котора предпочтительно представл ет собой участок вариабельной области легкой цепи
иммуноглобулина. Второй полипептид содержит вторую одноцепочечную молекулу Fv,
ковалентно св занную со второй подобной иммуноглобулину областью, котора предпочтительно представл ет собой участок вариабельной области т желой цепи
иммуноглобулина. Как перва , так и втора одноцепочечна молекула Fv образуют целевой
участок св зывани , причем перва и втора подобные иммуноглобулину области
объедин ютс с образованием третьего участка, св зывающего мишень.
Одноцепочечна молекула Fv, имеюща конфигурацию VL-L-VH, в которой L
представл ет собой линкер, может объедин тьс с другой одноцепочечной молекулой Fv,
имеющей конфигурацию VH-L-VL, с образованием бивалентного димера. В этом случае VLдомен первой молекулы scFv и VH-домен второй молекулы scFv объедин ютс с
образованием одного участка, св зывающего мишень, в то врем как VH-домен первой
молекулы scFv и VL-домен второй молекулы scFv объедин ютс с образованием другого
св зывающего мишень участка.
Другой вариант осуществлени насто щего изобретени представл ет собой
биспецифический, трехвалентный нацеливающий белок, содержащий две разнородные,
нековалентно соединенные полипептидные цепи, которые образуют три участка
св зывани , два из которых имеют сродство к одной мишени, а третий имеет сродство к
гаптену, который может быть получен и присоединен к носителю дл образовани диагностического и/или терапевтического средства. Св зывающий белок предпочтительно
имеет два одинаковых св зывающих антигенных участка, а также отличающийс св зывающий антигенный участок. Биспецифические трехвалентные нацеливающие
агенты имеют два различных scFv, причем один scFv содержит два VH-домена из одного
антитела, св занных коротким линкером с VL-доменом другого антитела, и второй scFv
содержит два VL-домена из первого антитела, соединенных коротким линкером
с VH-доменом другого антитела. Способы получени мультивалентных,
Страница: 16
RU 2 335 297 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
мультиспецифических агентов из VH- и VL-доменов обеспечивают то, что отдельные цепи,
синтезированные из плазмидной ДНК в организме хоз ина, состо т целиком из VH-доменов
(VH-цепи) или целиком из VL-доменов (VL-цепи) таким образом, чтобы любой
мультивалентный и мультиспецифический агент мог быть получен с помощью
нековалентной ассоциации одной VH-цепи с одной VL-цепью. Например, при формировании
трехвалентного, триспецифического агента VH-цепь будет состо ть из последовательности
аминокислот трех VH-доменов, каждый из которых соответствует антителу с отличающейс специфичностью, соединенных пептидными линкерами переменной длины, а также
из VL-цепи, котора будет состо ть из комплементарных VL-доменов, соединенных
пептидными линкерами, которые подобны линкерам, использованным дл VH-цепи.
Поскольку VH- и VL-домены антител соединены антипараллельно, в предпочтительном
способе согласно изобретению VL-домены в VL-цепи расположены в пор дке,
обратном VH-доменам в VH-цепи.
5. Диантитела, триантитела и тетраантитела
Антитела согласно изобретению также могут быть использованы дл получени функциональных биспецифических одноцепочечных антител (bscAb), которые также
называют диантителами и которые могут быть выработаны в клетках млекопитающих с
использованием рекомбинантных методик. См., например, включенную в насто щее
изобретение ссылку Mack et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92:7021-7025, 1995. Например, bscAb
получают путем объединени через глицин-сериновый линкер двух одноцепочечных
фрагментов Fv, примен рекомбинантные методики. V-домены легкой цепи (VL) и
т желой цепи (VH) двух интересующих антител выдел ют, использу стандартные способы
PCR. Молекулы ДНК, комплементарные VL и VH, которые получены из каждой гибридомы,
затем соедин ют дл образовани одноцепочечного фрагмента в двухстадийном синтезе
PCR. Перва стади PCR вводит линкер (Gly4-Ser1)3, а втора стади соедин ет
ампликоны VL и VH. Каждую из одноцепочечных молекул затем клонируют в бактериальный
вектор экспрессии. После амплификации одну из одноцепочечных молекул отдел ют и
субклонируют в другой вектор, содержащий вторую интересующую одноцепочечную
молекулу. Итоговый фрагмент bscAb субклонируют в эукариотический вектор экспрессии.
Функциональную экспрессию белка можно осуществить трансфицированием вектора в
клетки ичника китайского хом чка. Биспецифические слитые белки получают сходным
образом. Биспецифические одноцепочечные антитела и биспецифические слитые белки
включены в рамки насто щего изобретени .
Например, гуманизированное, химерное или человеческое моноклональное антитело
против CD22 может быть использовано дл получени антиген-специфических диантител,
триантител и тетраантител. Моноспецифические диантитела, триантитела и тетраантитела
селективно св зываютс с нацеленными антигенами и, поскольку возрастает число
участков св зывани в молекуле, увеличиваетс сродство к целевой клетке и наблюдаетс более продолжительное врем пребывани в желаемом местоположении. В случае
диантител используют содержащий две цепи полипептид VH гуманизированного CD22-Mab,
присоединенный к полипептиду VK гуманизированного CD22-Mab линкером из п ти
аминокислотных остатков. Кажда цепь образует одну половину гуманизированного CD22диантитела. В случае триантител используют содержащий три цепи полипептид VH
гуманизированного CD22-Mab, присоединенный к
полипептиду VK гуманизированного CD22-Mab без линкера. При этом кажда цепь образует
одну треть hCD22-триантитела.
Предпочтительное применение биспецифических диантител, описанных в насто щей
за вке, заключаетс в предварительном нацеливании CD22-положительных опухолей дл последующей целевой доставки диагностических или терапевтических средств. Эти
диантитела селективно св зываютс с целевыми антигенами, обеспечива увеличенное
сродство и более продолжительное врем пребывани в желательном местоположении.
Кроме того, диантитела, св занные с неантигеном, быстро вывод тс из организма, и
воздействие на нормальные ткани сводитс к минимуму. Диагностические и
Страница: 17
RU 2 335 297 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
терапевтические средства могут включать в себ изотопы, лекарственные препараты,
токсины, цитокины, гормоны, факторы роста, конъюгаты, радионуклиды и металлы.
Например, металлический гадолиний используют дл ЯМР-томографии. Примерами
радионуклидов
вл ютс 225Ac, 18F, 68Ga, 67Ga, 90Y, 86Y, 111In, 131I, 125I, 123I, 99mTc, 94mTc, 186Re, 188Re, 177Lu,
62
Cu, 64Cu, 67Cu, 212Bi, 213Bi, 32P, 11C, 13N, 15O, 76Br и 211At. Прочие радионуклиды также
подход т в качестве диагностических и терапевтических средств, в особенности
радионуклиды в энергетическом диапазоне от 60 до 4000 кэВ.
Кроме этого совсем недавно по вилось сообщение о тетравалентном тандемном
диантителе (названном тандабом) с двойной специфичностью (Cochlovius et al., Cancer
Research (2000) 60:4336-4341). Биспецифический тандаб вл етс димером, состо щим из
двух идентичных полипептидов, причем каждый из них содержит четыре вариабельных
области двух различных антител (VH1, VL1, VH2, VL2), соединенных в такой ориентации,
котора облегчает при самоассоциации образование двух потенциальных участков
св зывани дл каждой из двух различных специфичностей.
6. Конъюгированные мультивалентные и мультиспецифические антитела
Другой вариант осуществлени насто щего изобретени представл ет собой
конъюгированное мультивалентное антитело. Дополнительные аминокислотные остатки
могут быть добавлены к N- или C-концевым част м первого или второго полипептида.
Дополнительные аминокислотные остатки могут содержать пептидный маркер, сигнальный
пептид, цитокин, энзим (например, энзим, активирующий пролекарство), гормон,
пептидный токсин, такой как экзотоксин pseudomonas, пептидное лекарство,
цитотоксический белок или другие функциональные белки. В рамках насто щего
изобретени функциональный белок представл ет собой белок, который обладает
биологической функцией.
В одном варианте осуществлени лекарства, токсины, радиоактивные соединени ,
энзимы, гормоны, цитотоксические белки, хелаты, цитокины и другие функциональные
агенты могут быть конъюгированы со св зывающимс с мишенью мультивалентным
белком, предпочтительно путем ковалентного присоединени к боковым цеп м
аминокислотных остатков мультивалентного св зывающегос с мишенью белка, например,
к амино, карбоксильной, фенильной, тиоловой или гидрокси-группам. С этой целью могут
быть использованы различные общеприн тые линкеры, например диизоцианаты,
диизотиоцианаты, эфиры бис(гидроксисукцинимида), карбодиимиды, эфиры имида
малеиновой кислоты и гидроксисукцинимида, глутаральдегид и т.п. Конъюгаци агентов с
мультивалентным белком предпочтительно не оказывает значительного вли ни на
специфичность св зывани белка или его сродство к мишени. В рамках насто щего
изобретени под функциональным агентом подразумеваетс агент, имеющий
биологическую функцию. Предпочтительным функциональным агентом вл етс цитотоксический агент.
В других вариантах осуществлени направл ема биспецифическим антителом
доставка терапевтических средств или полимерных пролекарств к мишен м in vivo может
быть объединена с доставкой радионуклидов с помощью биспецифического антитела,
причем таким способом достигаетс сочетание химиотерапии и радиоиммунотерапии.
Каждый из видов терапии может быть св зан с нацеливаемым конъюгатом и назначен в
одно и то же врем , или же радионуклид может быть назначен в качестве составной части
первого нацеливаемого конъюгата, а лекарство назначено на более поздней стадии в
качестве составной части второго нацеливаемого конъюгата.
В другом варианте осуществлени цитотоксический агент может быть конъюгирован с
полимерным носителем, и полимерный носитель впоследствии может быть конъюгирован с
мультивалентным св зывающим мишень белком. Подробнее о данном способе см. Ryser et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:3867-3870 (1978), патенты Соединенных Штатов №№
4699784 и 4046722, причем данные источники включены в насто щее изобретение с
помощью ссылки. Конъюгаци предпочтительно не вли ет на специфичность св зывани Страница: 18
RU 2 335 297 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
или сродство мультивалентного св зывающего белка.
7. Применение приматизированных, гуманизированных, химерных и человеческих
антител дл лечени и диагностики
Приматизированные, гуманизированные, химерные и человеческие моноклональные
антитела, т.е. анти-CD20-Mab и прочие описанные здесь антитела, в соответствии с
насто щим изобретением подход т дл применени в терапевтических или
диагностических методиках. Соответственно, насто щее изобретение предлагает введение
приматизированных, гуманизированных, химерных и человеческих антител согласно
изобретению по отдельности, в виде простых антител или назначенных в качестве
мультимодальной терапии, временно соответствующих режиму дозировани , но не
конъюгированных с терапевтическим средством. Эффективность простых анти-CD20-Mab
может быть увеличена сочетанием простых антител с одним или несколькими другими
простыми антителами, т.е. Mab к специфическим антигенам, таким как CD4, CD5, CD8,
CD14, CD15, CD19, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46,
CD52, CD54, CD74, CD80, CD126, B7, Ia, HM1.24, тенасцин, MUC1 или HLA-DR, а также с
антиангиогенными антителами (например, антителами VEGF и PIGF), с одним или
несколькими иммуноконъюгатами анти-CD20 или антителами к этим перечисленным
антигенам, объединенными с терапевтическими средствами, которые включают в себ лекарства, токсины, иммуномодул торы, гормоны, терапевтические радионуклиды и т.д., с
одним или несколькими терапевтическими средствами, которые включают лекарства,
токсины, иммуномодул торы, гормоны, терапевтические радионуклиды и т.д., введенные
одновременно или последовательно с Mab или соответствующие предписанному режиму
дозировани . Предпочтительные антигены B-клеток включают в себ антигены,
эквивалентные человеческим антигенам CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD46, CD52,
CD74, CD80 и CD5. Предпочтительные антигены T-клеток включают в себ антигены,
эквивалентные человеческим антигенам CD4, CD8 и CD25 (рецептор IL-2). Эквивалент
антигена HLA-DR может использоватьс в лечении как B-клеточных, так и T-клеточных
расстройств. Особенно предпочтительными антигенами B-клеток вл ютс антигены,
эквивалентные человеческим антигенам CD19, CD21, CD22, CD23, CD74, CD80 и HLA-DR.
Особенно предпочтительными антигенами T-клеток вл ютс антигены, эквивалентные
человеческим антигенам CD4, CD8 и CD25. CD46 представл ет собой антиген на
поверхности раковых клеток, который блокирует комплемент-зависимый лизис (CDC).
Дополнительно насто щее изобретение предлагает введение иммуноконъюгата дл терапевтического применени при B-клеточных лимфомах, а также других заболевани х и
расстройствах. Иммуноконъюгат, как описано в насто щем изобретении, представл ет
собой молекулу, содержащую компонент антитела и терапевтическое средство, включа пептид, который может нести терапевтическое средство. Иммуноконъюгат сохран ет
иммунологическую активность вход щего в него антитела, т.е. фрагмент антитела после
конъюгации обладает приблизительно той же или слегка пониженной способностью
св зывать родственный антиген, как и до конъюгации.
Помимо этого, насто щее изобретение предлагает введение иммуноконъюгата дл терапевтического применени при миелоидных лейкеми х, в случае которых мишен ми
вл ютс CD33, CD45, CD66, а также другие антигены, ассоциированные с гранулоцитами.
Большое количество терапевтических средств может быть с успехом конъюгировано с
антителами согласно изобретению. Перечисленные здесь терапевтические средства
представл ют собой такие средства, которые также применимы дл отдельного введени с
простыми антителами, как это описано выше. Терапевтические средства включают в себ ,
например, химиотерапевтические лекарственные препараты, такие как алкалоиды
барвинка, антрациклины, эпидофилотоксины, таксаны, антиметаболиты, алкилирующие
средства, антибиотики, ингибиторы Cox-2, антимитотические и апоптотические средства,
в особенности доксорубицин, метотрексат, таксол, CPT-11, камптотеканы, а также других
представителей перечисленных и прочих классов противораковых средств и т.п. Другие
лекарственные средства противораковой химиотерапии, применимые дл получени Страница: 19
RU 2 335 297 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
иммуноконъюгатов и слитых белков, включают в себ азотистые иприты, алкилсульфонаты,
нитрозомочевины, триазены, аналоги фолиевой кислоты, ингибиторы COX-2, аналоги
пиримидина, аналоги пурина, координационные комплексные соединени платины,
включа оксалиплатин, гормоны и т.п. Подход щие химиотерапевтические средства
описаны в REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19 th Ed. (Mack Publishing Co.,
1995) и в GOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS,
7 th Ed. (MacMillan Publishing Co., 1985), а также в переработанных издани х указанных
публикаций. Другие подход щие химиотерапевтические средства, такие как
экспериментальные лекарственные препараты, известны специалистам в данной области.
Дополнительно может быть конъюгирован хелатообразователь, такой как DTPA, DOTA,
TETA или NOTA или подход щий пептид, к которому присоединена обнаруживаема метка,
или цитотоксическое средство, такое как т желый металл или радионуклид. Например,
терапевтически применимый иммуноконъюгат может быть получен путем объединени фотоактивного агента или красител с композитным антителом. Дл обнаружени и
лечени больных участков с помощью направлени на эти участки подход щего света
примен лись флуоресцентные композиции, такие как флуорохром и другие хромогены или
чувствительные к видимому свету красители, такие как порфирины. Подобный подход в
терапии был назван фотооблучением, фототерапией или фотодинамической терапией
(Jori et al. (eds.), PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES (Libreria
Progetto 1985); van den Bergh, Chem. Britain 22:430 (1986)). Кроме того, дл осуществлени фототерапии моноклональные антитела были соединены с
фотоактивированными красител ми. Mew et al., J. Immunol. 130:1473 (1983); idem., Cancer
Res. 45:4380 (1985); Oseroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8744 (1986); idem.,
Photochem. Photobiol. 46:83 (1987); Hasan et al., Prog. Clin. Biol. Res. 288:471 (1989);
Tatsuta et al., Lasers Surg. Med. 9:422 (1989); Pelegrin et al., Cancer 67:2529 (1991). Однако
в эти более ранние исследовани не входило применение способов эндоскопической
терапии, в особенности с применением фрагментов или субфрагментов антител. Таким
образом, насто щее изобретение подразумевает терапевтическое применение
иммуноконъюгатов, содержащих фотоактивный агент или красители.
Токсин, такой как экзотоксин Pseudomonas, также может входить в комплекс или
представл ть собой терапевтически активную часть слитого белка, вл ющегос антителом дл анти-CD20 согласно изобретению. Прочие токсины, включа рицин, абрин,
рибонуклеазу (РНКазу), ДНКазу I, энтеротоксин-A стафилококков, антивирусный белок
фитолакки, гелонин, дифтерийный токсин, экзотоксин Pseudomonas и эндотоксин
Pseudomonas, соответствующим образом используют дл получении подобных конъюгатов
или других слитых белков. См., например, Pastan et al., Cell 47:641 (1986) и
Goldenberg, CA - A Cancer Journal for Clinicians 44:43 (1994). Другие токсины, которые
подход т дл применени в насто щем изобретении, известны специалистам в данной
области и раскрыты в патенте Соединенных Штатов № 6077499, который полностью
включен в насто щую за вку с помощью ссылки.
Иммуномодул тор, такой как цитокин, также может быть конъюгирован или может
вл тьс терапевтически активной частью слитого белка, или же его можно вводить
вместе с гуманизированным анти-CD20 или остальными антителами лимфомы согласно
изобретению. Подход щие дл насто щего изобретени цитокины включают в себ , не
ограничива сь перечисленным, интерфероны и интерлейкины, как описано ниже.
8. Получение иммуноконъюгатов
Любое из антител или антител, вл ющихс слитыми белками согласно изобретению,
может быть конъюгировано с одним или несколькими терапевтическими средствами. Как
правило, к каждому антителу или фрагменту антитела присоединено одно терапевтическое
средство, но к тому же самому антителу или фрагменту антитела может быть
присоединено более чем одно терапевтическое средство. Слитый белок, представл ющий
собой антитело согласно изобретению, содержит два или несколько антител или их
фрагментов, причем каждое из антител, составл ющих данный слитый белок, может
Страница: 20
RU 2 335 297 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
содержать терапевтическое средство. Дополнительно одно антитело или несколько
антител из числа вход щих в состав слитого белка, представл ющего собой антитело,
могут иметь более чем одно присоединенное терапевтическое средство. Более того,
терапевтические средства не должны быть одинаковыми, но они могут представл ть собой
различающиес терапевтические средства. Например, к одному и тому же слитому белку
можно присоединить лекарственный препарат и радиоактивный изотоп. В частности, IgG
может содержать радиоактивную метку 131I и быть прикрепленным к лекарственному
препарату. Атом 131I может быть включен в тирозин из состава IgG, и лекарство может
быть присоединено к эпсилон-аминогруппе лизина из состава IgG. Терапевтическ??е
средства также могут быть прикреплены к восстановленным группам SH и к углеводной
части цепей.
Биспецифические антитела согласно изобретению применимы в методиках
предварительного нацеливани и обеспечивают предпочтительный путь дл доставки двух
терапевтических средств пациенту. За вка на изобретение Соединенных Штатов серийный
номер 09/382186 раскрывает способ предварительного нацеливани при использовании
биспецифического антитела, в котором биспецифическое антитело мечено 125I и
доставл етс пациенту с последующим введением дивалентного пептида,
меченного 99mTc. Такой способ доставки приводит к отличным соотношени м 125I и 99mTc в
опухолевых/нормальных ткан х, демонстриру , таким образом, применимость двух
диагностических радиоактивных изотопов. Дл того чтобы пометить антитела и антитела,
вл ющиес слитыми белками, может быть использовано любое сочетание известных
терапевтических средств. Специфичность св зывани компонента антитела конъюгата
Mab, эффективность терапевтического средства или диагностического средства, а также
эффекторную активность Fc-части антитела можно определить стандартным
тестированием конъюгатов.
Терапевтическое средство может быть присоединено к шарнирной области
восстановленного компонента антитела с помощью образовани дисульфидной св зи. В
качестве альтернативы такие пептиды могут быть прикреплены к компоненту антитела с
применением гетеробифункционального кросс-линкера, такого как N-сукцинил 3-(2пиридилдитио)пропионат (SPDP). Yu et al., Int. J. Cancer 56:244 (1994). Общие методики
формировани такого рода конъюгатов хорошо известны в технике. См., например, Wong,
CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING (CRC Press, 1991);
Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods", in MONOCLONAL
ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al. (eds.), pages 187-230 (WileyLiss, Inc., 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic PeptideDerived Antibodies", in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND
CLINICAL APPLICATION, Ritter et al. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press,
1995). С другой стороны, терапевтическое средство может быть конъюгировано через
углеводный фрагмент в Fc-области антитела. Углеводна группа может быть использована
дл повышени заполнени тем же пептидом, который св зан с тиоловой группой, или же
углеводный фрагмент может быть использован дл св зывани отличающегос пептида.
Способы присоединени пептидов к компонентам антител через углеводные фрагменты
антител хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Shih et al.,
Int. J. Cancer 41:832 (1988); Shih et al., Int. J. Cancer 46: 1101 (1990); и Shih et al., патент
Соединенных Штатов № 5057313, причем все перечисленные источники полностью
включены в данную за вку при помощи ссылки. Общий способ включает в себ взаимодействие компонента антитела, содержащего окисленный углеводный фрагмент с
несущим полимером, который имеет, по меньшей мере, одну свободную амино-функцию и
который заполнен большим количеством пептидов. Эти реакции первоначально привод т к
св зыванию за счет образовани основани Шиффа (имина), причем иминна св зь может
быть стабилизирована восстановлением во вторичный амин с образованием конечного
конъюгата.
Область Fc отсутствует в том случае, если антитело, использованное в качестве
Страница: 21
RU 2 335 297 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
составной части иммуноконъюгата, представл ет собой фрагмент антитела. Однако
имеетс возможность ввести углеводный фрагмент в вариабельную область легкой цепи
полноразмерного антитела или фрагмента антитела. См., например, Leung et al., J.
Immunol. 154: 5919 (1995); Hansen et al., патент Соединенных Штатов № 5443953 (1995),
Leung et al., патент Соединенных Штатов № 6254868, причем все перечисленные источники
полностью включены в насто щую за вку с помощью ссылки. Созданный углеводный
фрагмент используют дл прикреплени терапевтического или диагностического средства.
9. Фармацевтически приемлемые носители
Приматизированные, гуманизированные, химерные или человеческие меченные
радиоактивной меткой антитела дл доставки пациенту должны представл ть собой
отдельно вз тые Mab, иммуноконъюгаты, слитые белки, или же они могут содержать один
или несколько фармацевтически приемлемых носителей, один или несколько
дополнительных ингредиентов или какое-либо сочетание перечисленного.
Рецептура антитела, представл ющего собой иммуноконъюгат согласно изобретению,
может быть составлена в соответствии с известными способами дл получени пригодных
с фармацевтической точки зрени композиций, с помощью которых иммуноконъюгат или
простое антитело включают в состав смеси с фармацевтически приемлемым носителем.
Стерильный буферный солевой раствор на основе фосфатов представл ет собой один из
примеров подход щего с фармацевтической точки зрени носител . Другие подход щие
носители хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Ansel et al.,
PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS 5 th Edition (Lea &
Febiger 1990) и Gennaro (ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18 th Edition
(Mack Publishing Company 1990), а также переработанные издани указанных источников.
Иммуноконъюгат или простое антитело согласно изобретению могут входить в состав
дл парентерального применени , такой как состав дл внутривенного введени путем,
например, инъекции болюсов или непрерывного вливани . Составы дл инъекции могут
быть реализованы в виде лекарственных форм разового дозировани , например, в виде
ампул или упаковок, содержащих несколько доз, с добавленным консервантом. Составы
могут принимать такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии на водной или
масл ной основе, а также могут содержать сотавообразующие средства, такие как
суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства. С другой стороны,
действующее начало может быть представлено в форме порошка дл смешивани перед
применением с подход щим носителем, например стерильной апирогенной водой.
Дл регулировани продолжительности воздействи терапевтического конъюгата или
простого антитела могут примен тьс дополнительные фармацевтические способы.
Препараты с регулируемым выделением могут быть получены при использовании
полимеров дл образовани комплексов или адсорбции иммуноконъюгата или простого
антитела. Например, биосовместимые полимеры включают в себ матрицы из поли(этиленсо-винилацетата) и матрицы из полиангидридного сополимера димера стеариновой
кислоты и себациновой кислоты. Sherwood et al., Bio/Technology 10:1446 (1992). Скорость
выделени иммуноконъюгата или антитела из такой матрицы зависит от молекул рной
массы иммуноконъюгата или антитела, количества иммуноконъюгата или антитела в
матрице и размера диспергированных частиц. Saltzman et al., Biophys. J. 55:163 (1989);
Sherwood et al., supra. Другие твердые лекарственные формы описаны в Ansel et al.,
PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5 th Edition (Lea &
Febiger 1990) и Gennaro (ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18 th Edition
(Mack Publishing Company, 1990), а также переработанных издани х указанных источников.
Иммуноконъюгаты, слитые белки, вл ющиес антителами, или простые антитела также
могут вводитьс млекопитающим подкожно или другими парентеральными пут ми. Более
того, введение может осуществл тьс путем длительного вливани или путем
однократного или многократного введени болюсов. В целом дозировка вводимого
человеку иммуноконъюгата, слитого белка или простого антитела будет зависеть от таких
факторов, как возраст пациента, вес, рост, пол, общее состо ние здоровь и истори Страница: 22
RU 2 335 297 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
предшествующих заболеваний. Как правило, желательно обеспечить реципиента такой
дозой иммуноконъюгата, слитого белка, вл ющегос антителом, или простого антитела,
котора находитс в диапазоне приблизительно от 1 до 20 мг/кг на одно внутривенное
вливание, хот при соответствующих обсто тельствах также могут вводитьс более низкие
или более высокие дозы. Данна доза может при необходимости даватьс повторно,
например, раз в неделю в течение 4-10 недель, предпочтительно раз в неделю в течение
8 недель, и более предпочтительно раз в неделю в течение 4 недель. Дозы могут
даватьс менее часто, как например, раз в две недели в течение нескольких мес цев.
Дозы могут вводитьс различными парентеральными пут ми с соответствующим
изменением величины дозы и схемы введени .
Дл терапевтических целей иммуноконъюгаты, слитые белки или простые антитела
ввод т млекопитающим в терапевтически эффективном количестве. Подход щим
пациентом согласно изобретению, как правило, вл етс человек, хот предполагаютс также пациенты животного происхождени . Говор т, что препарат антитела введен в
«терапевтически эффективном количестве», если введенное количество вл етс физиологически значимым. Средство вл етс физиологически значимым, если его
присутствие приводит к обнаруживаемым изменени м в физиологии млекопитающегореципиента. В частности, препарат антитела согласно изобретению вл етс физиологически значимым, если его присутствие вызывает противоопухолевую реакцию
или см гчает признаки или симптомы состо ни при аутоиммунном заболевании.
Физиологически значимым результатом может быть также возбуждение гуморального и/или
клеточного иммунного ответа у млекопитающего-реципиента.
10. Способы лечени Насто щее изобретение предлагает применение антител согласно изобретению в
качестве первичной композиции дл лечени заболеваний, таких как злокачественные
заболевани , св занные с B-клетками, злокачественные заболевани , св занные с Tклетками, или лимфомы другого типа. Кроме этого насто щее изобретение также
применимо дл лечени аутоиммунных заболеваний. В частности, описанные в насто щем
изобретении композиции особенно применимы дл лечени различных аутоиммунных
заболеваний, а также в лотекущих форм B-клеточных лимфом, агрессивных форм Bклеточных лимфом, хронических лимфатических лейкемий, острых лимфатических
лейкемий и макроглобулинемии Вальденстрема, множественной миеломы. Кроме этого
могут подвергатьс лечению T-клеточные заболевани , такие как T-клеточна лейкеми или грибовидный микоз. Например, компоненты и иммуноконъюгаты
гуманизированного антитела против CD22 могут примен тьс дл лечени как
в лотекущих, так и агрессивных форм неходжкинской лимфомы. Аутоиммунное
заболевание выбрано из группы, состо щей из острой идиопатической
тромбоцитопенической пурпуры, хронической идиопатической тромбоцитопенической
пурпуры, дерматомиозита, хореи Сиденгама, миастении gravis, системной красной
волчанки, волчаночного нефрита, ревматического полиартрита, полигландул рных
синдромов, буллезного пемфигоида, сахарного диабета, болезни Шенлейн-Геноха, постстрептококкового нефрита, эритрита, синдрома Така су, болезни Аддисона, ревматоидного
артрита, множественного склероза, саркоидоза, звенного колита, множественной
эритемы, нефропатии IgA, узелкового полиартрита, анкилозирующего спондилита,
синдрома Гудпасчера, тромбоангиита, синдрома Шегрена, первичного билиарного цирроза,
тиреоидита Хасимото, тиреотоксикоза, склеродермии, активного хронического гепатита,
полимиозита/дерматомиозита, полихондрии, pamphigus vulgaris, гранулематоза Вегенера,
мембранной нефропатии, бокового амиотрофического склероза, сухотки спинного мозга,
височного артрита/полимиалгии, злокачественной анемии, быстро прогрессирующего
гломерулонефрита, псориаза и фиброзирующего альвеолита.
Лечебные композиции содержат, по меньшей мере, одно гуманизированное, химерное
или человеческое моноклональное антитело, которое присутствует само по себе или в
сочетании с другими антителами, такими как другие гуманизированные, химерные или
Страница: 23
RU 2 335 297 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
человеческие антитела, терапевтические средства или иммуномодул торы. В частности,
также предполагаетс комбинированна терапи с применением полностью человеческих
антител, причем она производитс описанными выше способами.
Конъюгированные антитела к одному и тому же или к отличному эпитопу или антигену
могут быть также объединены с одним или несколькими антителами согласно изобретению.
Например, гуманизированное, химерное или человеческое конъюгированное антитело
против CD22 может быть объединено с другим приматизированным, гуманизированным,
химерным или человеческим конъюгированным антителом против CD22, причем
приматизированное, гуманизированное, химерное или человеческое конъюгированное
антитело против CD22 может быть объединено с иммуноконъюгатом анти-CD22. С другой
стороны, как описано выше, подобные разнообразные сочетани могут быть осуществлены
с различными антителами, св занными с лимфомой. Слитый белок приматизированного,
гуманизированного, химерного или человеческого антитела против CD22 и токсин или
иммуномодул тор, или слитый белок, по меньшей мере, двух различных B-клеточных
антител (например, mAb CD20 и CD22) также могут быть использованы в насто щем
изобретении. Как уже было описано выше, может быть сконструировано большое
количество отличающихс сочетаний антител, нацеленных, по меньшей мере, на два
различных антигена, которые св заны с B-клетками или другими лимфомами или
аутоиммунными расстройствами, либо частично конъюгированных с терапевтическим
средством или иммуномодул тором, либо только в сочетании с другими терапевтическими
средствами, такими как цитотоксические лекарственные препараты или радиаци .
В рамках насто щего изобретени термин «иммуномодул тор» включает в себ цитокины, факторы роста стволовых клеток, лимфотоксины, такие как факторы некроза
опухолей (TNF), и гемопоэтические факторы, такие как интерлейкины (например,
интерлейкин-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12 и IL-18), колониестимулирующие
факторы (например, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) и
колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF)), интерфероны
(например, интерфероны -?, -? и -?), фактор роста стволовых клеток, обозначенный
«фактор S1», эритропоэтин и тромбопоэтин. Примеры подход щих иммуномодул торных
фрагментов включают в себ IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, интерферон-?, TNF-? и т.п. С
другой стороны, пациенты могут получать конъюгированные антитела против CD20 и
отдельно вводимый цитокин, который может вводитьс до, одновременно или после
введени простых или конъюгированных антител против CD20. Как обсуждалось выше,
антитело против CD22 также может быть конъюгировано с иммуномодул тором. Кроме
этого иммуномодул тор может быть конъюгирован с гибридным антителом или
фрагментами гибридного антитела или с субфрагментами (одноцепочечными
св зывающими белками или sFv'), состо щими из одного или нескольких антител или
субфрагментов, св зывающих различные антигены.
Мультимодальные способы лечени согласно изобретению дополнительно включают в
себ иммунотерапию конъюгированными антителами против CD22, котора дополнена
введением антител против CD20, CD19, CD21, CD74, CD80, CD23, CD46 или HLA-DR
(включа инвариантную цепь) в форме слитых белков или в качестве иммуноконъюгатов.
Эти антитела включают в себ поликлональные, моноклональные, приматизированные,
химерные, человеческие или гуманизированные антитела, которые распознают, по
меньшей мере, один эпитоп на своих антигенных детерминантах. Антитела против CD19 и
против CD22 известны специалистам в данной области. См., например, Ghetie et al.,
Cancer Res. 48: 2610 (1988); Hekman et al., Cancer Immunol. Immunother. 32:364 (1991);
Longo, Curr. Opin. Oncol. 8:353 (1996) и патенты Соединенных Штатов №№ 5798554 и
6187287, полностью включенные в насто щую за вку с помощью ссылки.
В другой форме мультимодальной терапии пациенты получают конъюгированные
антитела и/или иммуноконъюгаты в сочетании со стандартной противораковой
химиотерапией. Например, «CVB» (1,5 г/м 2 циклофосфамида, 200-400 мг/м 2 этопозида и
150-200 мг/м 2 кармустина) представл ет собой способ, примен емый дл лечени Страница: 24
RU 2 335 297 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
неходжкинской лимфомы. Patti et al., Eur. J. Haematol. 51:18 (1993). Другие подход щие
сочетани химиотерапевтических способов лечени хорошо известны специалистам в
данной области. См., например, Freedman et al., "Non-Hodgkin's Lymphomas", в CANCER
MEDICINE, VOLUME 2, 3rd Edition, Holland et al., (eds.), pages 2028-2068 (Lea & Febiger
1993). В качестве иллюстрации первое поколение химиотерапевтических способов лечени неходжкинской лимфомы (NHL) промежуточной степени включает в себ C-MOPP
(циклофосфамид, винкристин, прокарбазин и преднизон) и CHOP (циклофосфамид,
доксорубицин, винкристин и преднизон). Примен емый химиотерапевтический способ
лечени второго поколени представл ет собой m-BACOD (метотрексат, блеомицин,
доксорубицин, циклофосфамид, винкристин, дексаметазон и лейковорин), в то врем как
соответствующий способ лечени третьего поколени представл ет собой MACOP-B
(метотрексат, доксорубицин, циклофосфамид, винкристин, преднизон, блеомицин и
лейковорин). Дополнительно применимые лекарственные средства включают в себ фенилбутират и бростатин-1. В предпочтительной мультимодальной терапии совместно с
антителом, иммуноконъюгатом или слитым белком согласно изобретению ввод тс как
химиотерапевтические препараты, так и цитокины. Цитокины, химиотерапевтические
препараты и антитела или иммуноконъюгаты могут вводитьс в любом пор дке или вместе.
Радионуклиды, пригодные в качестве терапевтических средств, которые в основном
распадаютс с излучением бета-частиц, включают в себ , не ограничива сь
перечисленным, Ac-225, P-32, P-33, Sc-47, Fe-59, Cu-64, Cu-67, Se-75, As-77, Sr-89, Y90, Mo-99, Rh-105, Pd-109, Ag-111, I-125, I-131, Pr-142, Pr-143, Pm-149, Sm-153, Tb161, Ho-166, Er-169, Lu-177, Re-186, Re-188, Re-189, Ir-194, Au-198, Au-199, Pb-211,
Pb-212 и Bi-213. Максимальные энергии распада применимых нуклидов, излучающих бетачастицы, предпочтительно наход тс в диапазоне 20-5000 кэВ, более предпочтительно
100-4000 кэВ и наиболее предпочтительно 500-2500 кэВ.
Радионуклиды, пригодные в качестве терапевтических средств, которые в основном
распадаютс с испусканием Аугеровских частиц, включают в себ , не ограничива сь
перечисленным, Co-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109, In-111, Sb-119, I-125,
Ho-161, Os-189m и Ir-192. Максимальна энерги распада этих радионуклидов
предпочтительно менее 1000 кэВ, более предпочтительно менее 100 кэВ и наиболее
предпочтительно менее 70 кэВ.
Радионуклиды, пригодные в качестве терапевтических средств, которые в основном
распадаютс с испусканием альфа-частиц, включают в себ , не ограничива сь
перечисленным, Dy-152, At-211, Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-211, Ac-225, Fr221, At-217, Bi-213 и Fm-255. Энергии распада применимых радионуклидов, излучающих
альфа-частицы, предпочтительно составл ют 2000-9000 кэВ, более предпочтительно 30008000 кэВ и наиболее предпочтительно 4000-7000 кэВ.
Радионуклиды, применимые в терапии, основанной на процессе захвата нейтронов,
включают в себ , не ограничива сь перечисленным, B-10, Gd-157 и U-235.
Варианты осуществлени данного изобретени могут быть дополнительно
проиллюстрированы с помощью примеров, которые подробно показывают различные
аспекты изобретени . Эти примеры иллюстрируют конкретные элементы изобретени и не
призваны ограничивать область действи изобретени .
ПРИМЕРЫ
Антитела
Эпратузумаб представл ет собой гуманизированное антитело LL2, причем он был
разработан Immunomedics Inc., Morris Plains, NJ. Процесс гуманизации замещает около
95% мышиной последовательности Ig на человеческую последовательность IgG1.
Эпратузумаб интернализуетс при св зывании с B-эпитопом антигена CD22 (Stein, R. et
al., Cancer Immunol. Immunother. 37(5):293-8, 1993), который соответствует третьей
области Ig (Kehrl J.H. B6 CD22 Workshop Panel Report в Leukocyte Typing V. White Cell
Differentiation Antigens., S.F. Schlossman (ed.), Oxford University Press, p. 523-5,
1995). Интернализаци in vitro наблюдалась после п ти минут, и повторна экспресси 50%
Страница: 25
RU 2 335 297 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
антигена, как сообщалось, имела место через 5 часов (Shih L.B. et al. Int J Cancer 56 (4):
538-45, 1994).
Гуманизированное антитело против CD20, hA20, было разработано Immunomedics Inc.,
Morris Plains, NJ. Это Mab св зываетс с CD20 и, в противоположность химерному Mab
против CD20, т.е. ритуксимабу, оно представл ет собой Mab с трансплантированной CDR,
котора содержит меньше мышиного белка, чем химерна форма. Mab hA20 имеет
константные области IgG1 (каппа) и такие же человеческие каркасные V-области, как
эпратузумаб, т.е. гуманизированное Mab CD22. Гены CDR-трансплантированных VHи V?-цепей hA20 были включены в плазмидный вектор pdHL2, т.е. систему экспрессии на
основе DHFR, пригодную дл амплификации, и трансфицированы в линию клеток мышиной
миеломы Sp2/0 дл получени клонов, вырабатывающих hA20. Исследование строени молекулы показывает, что в област х CDR hA20 сходно с ритуксимабом, за исключением
различи в одной аминокислоте в области VH. Однако благодар включению более
человеческих конструкций присутствуют различи в област х каркаса VH и V? hA20.
Антитело hA20, по-видимому, конкурирует с ритуксимабом за св зывание с различными
клетками лимфомы и имеет сходную с ритуксимабом константу диссоциации, а также
аналогичное действие in vivo и in vitro против линий клеток лимфомы человека,
экспрессирующих CD20.
Терапи неходжкинской лимфомы (NHL)
Пациентом вл етс мужчина 66 лет с IV стадией диффузной крупноклеточной NHL,
повторно заболевший после 3 курсов химиотерапии, которые были проведены в
предшествующие два года. Ему ввод т дозу, состо щую из двух инъекций 90Y-DOTAэпратузумаба (меченого в соответствии с Govinden, см. ссылку выше), разделенных
сроком в одну неделю, содержащих 7,5 мКи/м 2 90Y и введенных путем внутривенного
вливани вместе с общей дозой белкового антитела 30 мг в каждой инъекции. Спуст шесть недель оказалось, что его шейные лимфатические узлы и имевшеес у него
увеличение селезенки заметно уменьшились, пациенту стало легче в отношении
про влени симптомов болезни, и он вернулс к работе в течение полного рабочего дн .
Поскольку полной ремиссии не было достигнуто, ему была назначена продолжительна терапи , включающа в себ сочетание эпратузумаба (360 мг/м 2) и hA20 (250 мг/м 2),
которые ввод т раз в две недели, всего 4 вливани , после чего курс комбинированной
терапии с помощью антител повтор ют спуст 12 недель. Через три мес ца после
завершени второго курса лечени с помощью сочетани простых антител CD22 и CD20 у
пациента не обнаружили признаков заболевани в ходе радиологического исследовани или биопсии костного мозга, и, таким образом, считаетс , что он полностью излечен.
При следующем обследовании спуст 3 мес ца он по-прежнему находитс в состо нии
полной ремиссии в отношении своего заболевани .
Терапи T-клеточной лейкемии
Пациенту со стойкой Т-клеточной лейкемией, подвергшемус предварительной
химиотерапии, провод т вливание 50 мг гуманизированного Mab против CD25,
конъюгированного с 20 мКи/м 2 90Y-DOTA, через неделю после которой осуществл ют
вливание CD25 Mab (гуманизированное анти-TAC-антитело) в количестве 200 мг/м 2.
Спуст четыре недели анализ крови пациента и биопси костного мозга показали
частичную ремиссию заболевани .
Терапи рефракционного ревматоидного артрита
Пациент с т желым прогрессирующим ревматоидным артритом, затрагивающим
большое количество суставов, но в особенности колени, и в насто щее врем проход щий
курс химиотерапии, подвергаетс лечению однократным вливанием смеси
гуманизированных Mab CD4 и CD20 в общем количестве 50 мг, которые мечены 90Y при
дозе 10 мКи/м 2. Спуст две недели ему ввод т дозу простых гуманизированных антител,
состо щую из 100 мг антител CD4 и 250 мг антител CD20, причем это введение повтор ют
еще раз спуст две недели. Спуст 4 недели пациент почувствовал облегчение артрита,
Страница: 26
RU 2 335 297 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
особенно в отношении колен, стал лучше ходить и даже подниматьс по лестницам, как
было отмечено его врачом, почти без сопутствующего воспалени . Через три мес ца
повтор ют описанный курс терапии, включающий одно вливание смеси антител, меченных
радиоактивной меткой, с последующими двум вливани ми простых антител CD4 и CD20,
причем состо ние здоровь пациента повторно оценивают через 6 недель. Врач отметил
заметное улучшение, так что пациент ощущает только минимальную боль и значительно
лучшую подвижность конечностей.
Хот в предыдущем тексте осуществл лись ссылки на отдельные предпочтительные
варианты осуществлени насто щего изобретени , следует понимать, что изобретение не
ограничиваетс этими ссылками. Специалисту в данной области пон тно, что в описанное
изобретение могут быть внесены многочисленные модификации, и предполагаетс , что
подобные модификации наход тс в рамках насто щего изобретени , которые определены
следующими вариантами осуществлени .
Все публикации, за вки на патенты и патенты, цитированные в насто щем описании,
полностью включены в за вку с помощью ссылок.
Формула изобретени 1. Применение терапевтической комбинации антител, содержащей либо (i)
конъюгированное анти-CD74-антитело и неконъюгированное анти-CD20-антитело, слитый с
анти-CD20-антителом белок, который содержит продуцируемую рекомбинантным путем
антиген-св зывающую молекулу, в которой св заны два или более сегментов одинаковых
или различных одноцепочечных антител или фрагментов антител с одинаковой или
различной специфичностью, или фрагмент анти-CD20-антитела, либо (ii) конъюгированное
анти-CD20-антитело и неконъюгированное анти-CD74-антитело, слитый с анти-CD74антителом белок, который содержит продуцируемую рекомбинантным путем антигенсв зывающую молекулу, в которой св заны два или более сегментов одинаковых или
различных одноцепочечных антител или фрагментов антител с одинаковой или различной
специфичностью, или фрагмент анти-CD74-антитела, в производстве лекарственного
средства дл применени при лечении у млекопитающего злокачественного заболевани ,
св занного с В-клетками, заболевани , св занного с Т-клетками, или аутоиммунного
заболевани .
2. Применение по п.1, согласно которому антитела в указанной комбинации ввод т
указанному млекопитающему одновременно.
3. Применение по п.1, согласно которому антитела в указанной комбинации ввод т
указанному млекопитающему последовательно.
4. Применение по п.1, согласно которому конъюгированное анти-CD20-антитело, слитый
с анти-CD20-антителом белок или фрагмент анти-CD20-антитела вл етс гуманизированным антителом А20 (hA20), слитым белком или фрагментом антитела.
5. Применение по п.1, согласно которому неконъюгированное анти-CD20-антитело,
слитый с анти-CD20-антителом белок или фрагмент анти-CD20-антитела вл етс гуманизированным антителом А20 (hA20), слитым белком или фрагментом антитела.
6. Применение по п.1, согласно которому указанное неконъюгированное антитело,
слитый с антителом белок или фрагмент антитела ввод т после указанного
конъюгированного антитела, слитого с антителом белка или фрагмента антитела.
7. Применение по п.1, согласно которому указанное конъюгированное и
неконъюгированное антитело, слитый с антителом белок или фрагмент антитела вл етс человеческим, химерным или гуманизированным антителом, слитым с антителом белком
или фрагментом антитела.
8. Применение по п.1, согласно которому указанное конъюгированное антитело, слитый
с антителом белок или фрагмент антитела конъюгирован с терапевтическим средством,
выбранным из группы, состо щей из лекарственного препарата, токсина,
иммуномодул тора, хелатообразовател , соединений бора, фотоактивного агента и
радионуклида.
Страница: 27
CL
RU 2 335 297 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
9. Применение по п.1, согласно которому лекарственное средство используетс дл лечени св занного с В-клетками заболевани , выбранного из группы, состо щей из Вклеточной лимфомы, острой В-клеточной лимфоцитарной лейкемии, хронической Вклеточной лимфоцитарной лейкемии или множественной миеломы.
10. Применение по п.1, согласно которому указанный слитый с конъюгированным
антителом белок или фрагмент антитела конъюгирован с 90Y-DOTA.
11. Применение по п.1, согласно которому св занное с В-клетками заболевание
представл ет собой неходжкинскую лимфому (NHL).
12. Применение по п.1, согласно которому конъюгированное или неконъюгированное
антитело, слитый белок или фрагмент антитела выбран из группы, состо щей из F(ab')2,
F(ab)2, Fab', Fab, Fv, sFv или scFv.
13. Применение по п.1, согласно которому указанное конъюгированное антитело
конъюгировано с лекарственным средством, которое обладает фармацевтическими
свойствами, выбранными из группы, состо щей из антимитотических, алкилирующих,
антиметаболических, антиангиогенных, апоптотических, алкалоидных и антибиотических
свойств, а также их сочетаний.
14. Применение по п.13, согласно которому указанное лекарственное средство выбрано
из группы, состо щей из азотистого иприта, этиленимина, алкилсульфоната,
нитрозомочевины, триазена, аналога фолиевой кислоты, антрациклина, таксана,
ингибитора СОХ-2, аналога пиримидина, аналога пурина, антибиотика, энзима,
эпиподофилотоксина, координационного комплекса платины, алкалоида барвинка,
замещенной мочевины, производного метилгидразина, средства, подавл ющего активность
коры надпочечников, эндостатина, таксола, камптотецина, доксорубицина и их сочетаний.
15. Применение по п.13, согласно которому указанное лекарственное средство выбрано
из группы, состо щей из циклофосфамида, этопозида, винкристина, прокарбазина,
преднизона, кармустина, доксорубицина, метотрексата, блеомицина, дексаметазона,
фенилбутирата, бриостатина-1 и лейковорина.
16. Применение по п.1, согласно которому указанное конъюгированное антитело
конъюгировано с токсином, выбранным из группы, состо щей из рицина, абрина, альфатоксина, сапорина, рибонуклеазы (РНКазы), ДНКазы I, энтеротоксина А стафилококков,
антивирусного белка фитолакки, гелонина, дифтерийного токсина, экзотоксина
Pseudomonas и эндотоксина Pseudomonas.
17. Применение по п.1, согласно которому указанное конъюгированное антитело
конъюгировано с иммуномодул тором, выбранным из группы, состо щей из цитокина,
фактора роста стволовых клеток, лимфотоксина, гематопоэтического фактора роста,
колониестимулирующего фактора (CSF), интерферона (INF), эритропоэтина,
тромбопоэтина и их сочетани .
18. Применение по п.17, согласно которому указанный иммуномодул тор состоит в
основном из IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, G-CSF, GM-CSF, интерферона-?, -?, -?,
THF-? и фактора S1.
19. Применение по п.1, согласно которому указанное конъюгированное антитело
конъюгировано с радионуклидом.
20. Применение по п.19, согласно которому указанное конъюгированное антитело
конъюгировано с хелатобразующим соединением, выбранным из группы, состо щей из
DTPA, DOTA, ТЕТА или NOTA.
21. Применение по п.1, согласно которому указанное конъюгированное антитело
конъюгировано с терапевтическим средством, выбранным из группы, состо щей из
фактора некроза опухоли, гематопоэтического фактора роста, колониестимулирующего
фактора, интерферона и фактора роста стволовых клеток.
22. Применение по п.19, согласно которому указанный радионуклид в основном
распадаетс с излучением бета-частиц и выбран из группы, состо щей из Р-32, Р-33, Sc47, Fe-59, Cu-64, Cu-67, Se-75, As-77, Sr-89, Y-90, Mo-99, Rh-105, Pd-109, Ag-111, I125, I-131, Pr-142, Pr-143, Pm-149, Sm-153, Tb-161, Ho-166, Er-169, Lu-177, Re-186,
Страница: 28
RU 2 335 297 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Re-188, Re-189, Ir-194, Au-198, Au-199, Pb-211, Pb-212 и Bi-213.
23. Применение по п.19, согласно которому указанный радионуклид в основном
распадаетс с испусканием частиц Аугера и выбран из группы, состо щей из Со-58, Ga67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109, In-111, Sb-119, I-125, Ho-161, Os-189m Ir-192.
24. Применение по п.19, согласно которому указанный радионуклид в основном
распадаетс с испусканием альфа-частиц и выбран из группы, состо щей из Ac-225, Dy152, At-211, Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-211, Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213 и Fm-255.
25. Применение по п.19, согласно которому указанное терапевтическое средство
используетс в фотодинамической терапиии и способах нейтронного захвата.
26. Применение по п.25, согласно которому в указанной фотодинамической терапии
примен ютс комплексы металлов, которые выбраны из группы, состо щей из цинка,
алюмини , галли , лютеци и паллади .
27. Применение по п.9, согласно которому указанна В-клеточна лимфома
представл ет собой в лотекущую форму В-клеточной лимфомы или агрессивную форму Вклеточной лимфомы.
28. Применение по п.1, согласно которому содержание целевого антигена на больной
ткани превышает содержание целевого антигена на нормальной ткани в соотношении
более чем 1,6:1.
29. Применение по п.1, согласно которому содержание целевого антигена на больной
ткани превышает содержание целевого антигена на нормальной ткани в соотношении 5:1.
30. Применение по п.1, согласно которому указанное неконъюгированное антитело,
слитый с антителом белок или фрагмент антитела ввод т до введени указанного
конъюгированного антитела, слитого с антителом белка или фрагмента антитела.
31. Применение по п.1, согласно которому лекарственное средство используетс дл лечени заболевани , св занного с Т-клетками.
32. Применение по п.1, согласно которому лекарственное средство используетс дл лечени злокачественного заболевани , св занного с Т-клетками.
33. Применение по п.32, согласно которому св занное с Т-клетками злокачественное
заболевание вл етс Т-клеточной лимфомой или лейкемией.
34. Применение по п.1, согласно которому лекарственное средство используетс дл лечени аутоиммунного заболевани .
35. Применение по п.1, согласно которому аутоиммунное заболевание выбрано из
группы, состо щей из острой идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, хронической
идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, дерматомиозита, хореи Сиденгама,
миастении gravis, системной красной волчанки, волчаночного нефрита, ревматического
полиартрита, полигландул рных синдромов, буллезного пемфигоида, сахарного диабета,
болезни Шенлейн-Геноха, постстрептококкового нефрита, узелковой эритемы, синдрома
Така су, болезни Аддисона, ревматоидного артрита, множественного склероза,
саркоидоза, звенного колита, множественной эритемы, нефропатии IgA, узелкового
полиартериита, анкилозирующего спондилита, синдрома Гудпасчера, облитерирующего
тромбангиита, синдрома Шегрена, первичного билиарного цирроза, тиреоидита Хасимото,
тиреотоксикоза, склеродермии, активного хронического гепатита,
полимиозита/дерматомиозита, полихондрии, обыкновенной пузырчатки, гранулематоза
Вегенера, мембранной нефропатии, бокового амиотрофического склероза, сухотки
спинного мозга, височного артериита/полимиалгии, злокачественной анемии, быстро
прогрессирующего гломерулонефрита, псориаза и фиброзирующего альвеолита.
36. Применение по п.1, согласно которому конъюгированное анти-CD20-антитело,
слитый с анти-CD20-антителом белок или фрагмент анти-CD20-антитела вл етс химерным анти-CD20-антителом, слитым белком или фрагментом антитела.
37. Применение по п.1, согласно которому неконъюгированное анти-CD20-антитело,
слитый с анти-CD20-антителом белок или фрагмент анти-CD20-антитела вл етс химерным анти-CD20-антителом, слитым белком или фрагментом антитела.
38. Применение по п.1, согласно которому конъюгированное анти-CD20-антитело,
Страница: 29
RU 2 335 297 C2
5
слитый с анти-CD20-антителом белок или фрагмент анти-CD20-антитела вл етс человеческим или гуманизированным анти-CD20-антителом, слитым белком или
фрагментом антитела.
39. Применение по п.1, согласно которому неконъюгированное анти-CD20-антитело,
слитый с анти-CD20-антителом белок или фрагмент анти-CD20-антитела вл етс человеческим или гуманизированным анти-CD20-антителом, слитым белком или
фрагментом антитела.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Страница: 30
?тивной частью слитого белка, или же его можно вводить
вместе с гуманизированным анти-CD20 или остальными антителами лимфомы согласно
изобретению. Подход щие дл насто щего изобретени цитокины включают в себ , не
ограничива сь перечисленным, интерфероны и интерлейкины, как описано ниже.
8. Получение иммуноконъюгатов
Любое из антител или антител, вл ющихс слитыми белками согласно изобретению,
может быть конъюгировано с одним или несколькими терапевтическими средствами. Как
правило, к каждому антителу или фрагменту антитела присоединено одно терапевтическое
средство, но к тому же самому антителу или фрагменту антитела может быть
присоединено более чем одно терапевтическое средство. Слитый белок, представл ющий
собой антитело согласно изобретению, содержит два или несколько антител или их
фрагментов, причем каждое из антител, составл ющих данный слитый белок, может
Страница: 20
RU 2 335 297 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
содержать терапевтическое средство. Дополнительно одно антитело или несколько
антител из числа вход щих в состав слитого белка, представл ющего собой антитело,
могут иметь более чем одно присоединенное терапевтическое средство. Более того,
терапевтические средства не должны быть одинаковыми, но они могут представл ть собой
различающиес терапевтические средства. Например, к одному и тому же слитому белку
можно присоединить лекарственный препарат и радиоактивный изотоп. В частности, IgG
может содержать радиоактивную метку 131I и быть прикрепленным к лекарственному
препарату. Атом 131I может быть включен в тирозин из состава IgG, и лекарство может
быть присоединено к эпсилон-аминогруппе лизина из состава IgG. Терапевтическ?
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
253 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа