close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент РФ 2335538

код для вставки
РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
RU
(19)
(11)
2 335 538
(13)
C2
(51) МПК
C12N 5/06
C12N 5/08
(2006.01)
(2006.01)
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
(21), (22) За вка: 2006134630/13, 31.03.2004
(72) Автор(ы):
ДЕШПАНДЕ Маниша Шарадчандра (IN),
МОДЖАМДАР Манодж Виной (IN)
(24) Дата начала отсчета срока действи патента:
31.03.2004
(73) Патентообладатель(и):
РЕЛАЙАНС ЛАЙФ САЙЕНСИЗ ПВТ ЛТД (IN)
(43) Дата публикации за вки: 10.04.2008
R U
(45) Опубликовано: 10.10.2008 Бюл. № 28
2 3 3 5 5 3 8
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: Kim Hyun Woo et al. "An overview of
cartilage tissue engineering". Yonsei Medical
Journal, vol.41, no.6, 12-2000. RU 2095410
C1, 10.11.1997.
(85) Дата перевода за вки PCT на национальную фазу:
29.09.2006
(86) За вка PCT:
IN 2004/000086 (31.03.2004)
2 3 3 5 5 3 8
R U
Адрес дл переписки:
129010, Москва, ул. Б.Спасска , 25, стр.3,
ООО "Юридическа фирма Городисский и
Партнеры", пат.пов. Е.Е.Назиной, рег. № 517
C 2
C 2
(87) Публикаци PCT:
WO 2005/095585 (13.10.2005)
(54) ПОДОБНАЯ ТКАНИ ОРГАНИЗАЦИЯ КЛЕТОК И ПОДОБНЫЕ ТКАНИ МАКРОСКОПИЧЕСКИЕ
КОНСТРУКЦИИ, ПОЛУЧЕННЫЕ ПРИ ПОМОЩИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МАКРОМАССЫ КЛЕТОК, И
СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МАКРОМАССЫ
(57) Реферат:
Изобретение относитс к инженерии ткани.
Раскрыт способ получени живой организации
клеток подобной ткани, то есть культуры
макромассы,
включающей
трехмерные
конструкции, подобные ткани, без помощи каркаса
или чужеродного матрикса. В сосуд дл культивировани клетки высевают клетки с высокой
плотностью на единицу площади в диапазоне от
3,33Ч10 5 до 3Ч10 6 клеток на см 2. Описана
трехмерна подобна ткани организаци клеток,
полученна указанным
способом.
При
культивировании
макромассы
клетки
можно
получить клетки, организованные сами по себе в
подобные ткани формы без помощи матрикса, и
трехмерные макроскопические подобные ткани
конструкции. В данной работе подобна ткани
организаци и макроскопические подобные ткани
конструкции получены из фибробластов кожи,
остеогенных клеток, полученных из жировых
стромальных
клеток,
хондроцитов
и
из
остеобластов. При этом не используютс какойлибо каркас или чужеродный матрикс дл получени ткани или какие-либо другие средства
(кроме высокой плотности высевани клеток),
которые способствуют формированию ткани, ткани
имеют полностью клеточное происхождение.
Насто щее изобретение позвол ет упростить
способ получени заменителей ткани организма
человека. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 24 ил., 1 табл.
Страница: 1
RU
RUSSIAN FEDERATION
RU
(19)
(11)
2 335 538
(13)
C2
(51) Int. Cl.
C12N 5/06
C12N 5/08
(2006.01)
(2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY,
PATENTS AND TRADEMARKS
(12)
ABSTRACT OF INVENTION
(21), (22) Application: 2006134630/13, 31.03.2004
(72) Inventor(s):
DEShPANDE Manisha Sharadchandra (IN),
MODZhAMDAR Manodzh Vinoj (IN)
(24) Effective date for property rights: 31.03.2004
(43) Application published: 10.04.2008
(73) Proprietor(s):
RELAJANS LAJF SAJENSIZ PVT LTD (IN)
R U
(45) Date of publication: 10.10.2008 Bull. 28
(85) Commencement of national phase: 29.09.2006
(87) PCT publication:
WO 2005/095585 (13.10.2005)
Mail address:
129010, Moskva, ul. B.Spasskaja, 25, str.3,
OOO "Juridicheskaja firma Gorodisskij i
Partnery", pat.pov. E.E.Nazinoj, reg. № 517
2 3 3 5 5 3 8
R U
TO TISSUE OBTAINED BY MEANS OF CULTURE OF MACROMASS OF CELLS AND METHOD OF
MACROMASS CULTURE
(57) Abstract:
FIELD: medicine.
SUBSTANCE: method of obtaining the live
organization of cells of a similar tissue is
revealed, that is the macromass culture including
three-dimensional
designs
similar
to
tissue,
without the aid of a skeleton or a foreign
matrix. The cells are plated in a vessel for cell
culture with high density per unit area in a
range from 3.33Ч10 5 to 3Ч10 6 cells per cm 2. The
three-dimensional
organization
of
the
cells
received in the specified way similar to a tissue
is described. When cultivating cell macromasses
it is possible to receive the cells, organized in
forms similar tissues without the aid of a
matrix,
and
three-dimensional
macroscopical
structures similar to tissue. In the given work
the
organization
similar
to
a
tissue
and
macroscopical structures similar to tissue are
obtained
from
fibroblasts
of
a
skin,
the
osteogene cells received from fat stromal cells,
chondrocytes and from osteoblasts. Thus any
skeleton or a foreign matrix for obtaining of a
tissue or any other agents is not used (except
high density of cell plating) which promote
formation of a tissue, tissues have completely
cellular parentage.
EFFECT: present invention allows simplifying
the method of obtaining of substitutes of a human
body tissue.
13 cl, 24 dwg, 1 tbl
Страница: 2
EN
C 2
C 2
(54) ORGANIZATION OF CELLS SIMILAR TO TISSUE AND MACROSCOPICAL DESIGNS SIMILAR
2 3 3 5 5 3 8
(86) PCT application:
IN 2004/000086 (31.03.2004)
RU 2 335 538 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Насто щее изобретение относитс к инженерии ткани. Более точно, насто щее
изобретение относитс к созданию трехмерной подобной ткани организации клеток. Еще
более точно, насто щее изобретение относитс к получению трехмерных макроскопических
подобных ткани конструкций дл возможной имплантации в организм человека в качестве
терапии болезненных состо ний или состо ний при повреждении тканей.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Организм человека может быть поражен несколькими болезненными состо ни ми или
состо ни ми при повреждении тканей различных органов, дл которых терапевтический
подход заключаетс в замене поврежденных органов полученными извне или созданными
эквивалентами ткани. Например, ожоги или звы кожи можно лечить с применением
подход щих эквивалентов кожи, не соедин емые разрывы в сломанной кости можно было
бы лечить имплантацией подход щих заменителей кости и повреждение суставного хр ща
можно было бы восстановить подход щими имитирующими хр щ имплантатами.
Каждый год хирурги провод т хирургические операции дл лечени пациентов, которые
испытывают недостаточность органа или потерю ткани. Хирурги/терапевты могли бы
лечить таких пациентов, пересажива органы от одного человека к другому, осуществл восстановительную хирургию или использу механические устройства, такие как
искусственна почка, протез тазобедренного сустава или механических сердечных
клапанов. Хот такие подходы спасли множество жизней, они имеют ограничени .
Ограничение при трансплантации таких органов, как сердце, печень и почки заключаетс не в хирургической технике, а в недостаточной доступности органов донора.
Возможные виды легко доступных имплантатов представл ли собой
ксенотрансплантаты, полученные из животных, аллотрансплантаты, полученные от
человеческих доноров и аутотрансплантатов, полученных из здоровых органов самого
пациента. Дл ксенотрансплантатов существует проблема иммунологической
несовместимости и передачи зоонозных болезнетворных микроорганизмов, включающих
ретровирусы. Дл аллотрансплантатов существует проблема иммунного отторжени и
недостатка доноров. Дл аутотрансплантатов существует проблема нехватки необходимого
количества подход щей ткани и увеличени травмировани пациента.
Дл хирургического восстановлени , ткань можно перенести от одной части органа
пациента к другой части органа. Такие аутотрансплантаты (тканевые лоскуты пациента)
включают тканевые лоскуты кожи дл ожогов, тканевые лоскуты кровеносных сосудов дл хирургических операций сердечного шунтировани и тканевые лоскуты нервов дл восстановлени лица и рук. Недостатки использовани аутотрансплантатов также
включают потребность в многократных хирургических операци х и потере функции на
донорном участке. В дополнение, хирургическое восстановление часто охватывает
использование тканей тела в первоначально не предназначенных дл этого цел х и может
привести к долговременным осложнени м.
Как результат таких недостатков существующих терапевтических приемов, существует
необходимость в инженерии эквивалентов ткани и в том, чтобы по вилась в качестве
новой дисциплины наука инженерии ткани. Ее цели заключаютс в том, чтобы создать
ткани в культуре дл использовани не только в качестве модельных систем в
фундаментальных исследовани х, но и, что еще важнее, дл использовани в качестве
тканей дл замены поврежденных или пораженных болезнью органов организма. Хот ,
усили по получению биоискусственных тканей и органов дл лечени человека берут
начало, по меньшей мере, тридцать лет назад, такие усили приблизились к клиническому
успеху только в последние дес ть лет. Это стало возможным благодар значительному
прогрессу в молекул рной и клеточной биологии, в технологи х культивировани клеток и
в материаловедении.
Термин «инженери ткани» по вилс относительно недавно и более широко
используетс в последние п ть лет, чтобы описать междисциплинарную область, котора примен ет принципы инженерии и медико-биологических наук дл создани Страница: 3
DE
RU 2 335 538 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
биоискусственных тканей и органов.
Одной из основных стратегий прин тых дл создани выращенных в лабораторных
услови х тканей вл етс выращивание изолированных клеток на трехмерных матрицах
или каркасах (матриксах) в услови х, которые застав т клетки разрастатьс в
функциональную ткань. При имплантации така биоискусственна ткань должна стать
структурно и функционально интегрированной в организме. Матриксы можно изготовить из
природных материалов, таких как коллаген, или из синтетических полимеров, таких как
пластики. В конечном счете, материал каркаса должен биодеградировать в течение
времени и должен служить в качестве первоначальной трехмерной матрицы дл роста
ткани.
Поскольку клетки растут и дифференцируютс на каркасе, они будут продуцировать
различные белки, необходимые дл воссоздани ткани. Деградаци каркаса гарантирует,
что в организме останетс только природна ткань. Также существуют различные типы
биореакторов, включающих различные технологии дл задачи создани ткани из клеток.
Фактически кажда ткань в организме представл ет собой потенциальную цель дл биоинженерии, и развитие быстро происходит на множестве направлений. Дл кожи как
органа разработаны различные типы полученных при помощи инженерии реплантаций кожу повторно получали при помощи инженерии, использу несколько различных подходов
с разной степенью успеха.
В патенте США № 5489304 описан неклеточный трансплантат, который содержит
синтетический внешний слой, св занный с аналогичным дермальному слоем, полученным
из коллагена-хондроитинсульфата. Така реплантаци , которую первоначально помещают
на пораженный участок до использовани культивированного эпителиального
аутотрансплантата, обладает недостатком, которым вл етс отсутствие факторов роста,
важных дл заживлени ран на коже, или клеток, которые могут обеспечить продукцию
таких факторов.
В патенте США № 5460939 описан другой трансплантат, который вл етс клеточным. В
данном случае фибробласты растут на способном к биологическому рассасыванию
сополимере молочной кислоты/гликолевой кислоты, сцепленном в виде пласта. В данном
трансплантате каркасна решетка неприродного происхождени .
Eaglstein & Falanga (1997) описали трансплантат кожи, который включает дермальный
слой, содержащий фибробласты, растущие на бычьем коллагеновом матриксе. В данном
трансплантате внеклеточный матрикс предоставл етс клеткам извне, который, хот изготовлен из коллагена человека, но чужеродный компонент остаетс во врем применени трансплантата.
В патенте США № 5613982 описан трансплантат, в котором обрабатывают трупную кожу
человека дл того, чтобы удалить антигенные клеточные компоненты, получа иммунологически инертный кожный слой. Данный трансплантат имеет ограничение,
вл сь бесклеточным и в трудной доступности трупной кожи человека.
Во всех описанных выше примерах технологические требовани дл получени эквивалентов достаточно сложны и, следовательно, будут увеличивать стоимость
продукта. Были выращены клеточные пласты фибробластов с использованием аскорбата,
но дл образовани таких пластов необходимо приблизительно 35 дней (Michel et al.,
1999; L'Heureux et al., 1998).
Таким образом, существует необходимость в получении кожных эквивалентов,
материалы дл которых легко доступны, которые не содержат синтетический или
чужеродный природный матрикс, который мог бы вызывать воспалительную реакцию у
некоторых пациентов, которые имеют клеточную природу с тем, чтобы продуцировать
факторы роста и другие белки, которые можно получить за относительно более короткое
врем , и получение которых технологически несложно с тем, чтобы продукт был более
рентабельным.
Сфера де тельности, котора требует внимани в области продуктов, полученных при
помощи инженерии тканей, представл ет собой заменители кости дл пациентов, чьи
Страница: 4
RU 2 335 538 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
переломы не срастаютс , оставл несоединимые промежутки. Аутологична трансплантаци кости увеличивает травмирование пациента. Различные подходы
подвергали испытанию в инженерии кости (Service, 2000). Пробовали примен ть
биоматериалы, такие как коллагеновый матрикс, введенный с факторами роста, которые
запускают образование кости, но такие конструкции тер ли клеточный компонент, и
введение необходимого значительного количества факторов роста делает их очень
дорогосто щей альтернативой. Керамический или гидроксиапатитный матриксы, засе нные
мезенхимальными стволовыми клетками, представл ют собой другие подходы, но
использование таких каркасов, возможно, не идеально дл человеческого организма.
Таким образом, существует необходимость в рентабельных клеточных имплантатах,
которые бы вызвали заживление кости.
Друга сфера, котора требует внимани в области продуктов, полученных при помощи
инженерии тканей, представл ет собой восстановление хр ща. Известный факт, что
суставной хр щ обладает ограниченной возможностью полного восстановлени после
повреждени . Терапи на основе клеток при трансплантации аутологичных хондроцитов
показала хорошие клинические результаты (McPherson & Tubo, 2000), но в этом случае
остаетс достаточный объем дл усовершенствовани , поскольку, врем дл полного
восстановлени очень велико. Возможно, предварительно сформированна ткань, а не
суспензи клеток, дала бы лучшие результаты при трансплантации. Предварительно
сформированна ткань также имеет преимущество перед свободными клетками в
отношении хирургической имплантации. Поэтому, различные подходы подвергались
испытанию при создании подобной хр щу конструкции, использу клетки и каркас, но
создание идеального каркасного матрикса, который позволит клеткам в имплантате хорошо
имитировать естественный процесс формировани хр ща, остаетс сложной задачей
(Ilim & Han, 2000). Таким образом, существует необходимость в получении предварительно
сформированной ткани, котора могла бы эффективно начать восстановление хр ща при
имплантации в участок поражени и котора была бы экономична по затратам.
Подвод итоги, существует необходимость создани относительно недорогих живых
клеточных заменителей ткани в терапевтических цел х. Упом нутые ранее технологически
сложные биореакторы дл создани трехмерных тканей представл ют собой дорогие
методологии. Кроме того, вообще, всегда существует необходимость в создании
заменителей ткани новыми способами, которые при тестировании, как могло бы оказатьс ,
имеют лучшие параметры в одном или нескольких отношени х, чем существующие
заменители.
Принима во внимание насущную необходимость, авторы насто щего изобретени создали новые трехмерные макроскопические подобные ткани конструкции, которые
обладают возможностью дл использовани в качестве заменителей тканей в
человеческом организме. Нова особенность таких подобных ткани конструкций состоит в
том, что не требуетс никакого каркаса или чужеродного матрикса дл получени ткани,
т.е. можно сформировать ткани полностью клеточного происхождени . Кроме того, никаких
других средств, которые способствуют формированию ткани (кроме высокой плотности
засевани клеток), таких как индуцирующие формирование ткани химические вещества,
индуцирующие формирование ткани факторы роста, питательна среда со специальными
свойствами, чередующиес культуры, не примен ли дл формировани ткани. Не
существует никаких определенных сложных требований к среде дл формировани подобной ткани конструкции. Фактор, вызывающий формирование макроскопической
подобной ткани конструкции представл ет собой крупномасштабное культивирование
клеток при высокой степени засевани клеток на единицу площади или пространства.
Важный аспект в инженерии ткани заключаетс в том, как заставить клетки
объединитьс в ткань или трехмерную структуру. Насто щее изобретение предлагает
новый способ дл достижени этой цели.
ЦЕЛИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В свете вышеупом нутого, следовательно, цель насто щего изобретени состоит в том,
Страница: 5
RU 2 335 538 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
чтобы предложить новый способ объединени клеток в трехмерную подобную ткани
организацию и подобные ткани конструкции.
Также в свете вышеупом нутого, следовательно, цель насто щего изобретени состоит
в том, чтобы предложить трехмерные макроскопические подобные ткани конструкции дл возможной имплантации в организм человека в качестве терапии болезненных состо ний
или состо ний повреждени ткани.
Друга цель насто щего изобретени состоит в том, чтобы предложить
макроскопические подобные ткани конструкции, которые гистологически компетентны.
Термин «гистологическа компетентность» обозначает, что такие подобные ткани
конструкции можно легко секционировать без разрушени .
Еще одна цель насто щего изобретени состоит в том, чтобы предложить трехмерную
подобную ткани организацию клеток и экономичные по затратам предполагаемые
эквиваленты ткани, сформированные из клеток-фибробластов мезенхимального
происхождени (по меньшей мере), таких как полученный при помощи инженерии
предполагаемый эквивалент кожи, полученный из фибробластов кожи, предполагаемый
заменитель с подобными кости свойствами, сформированный из остеогенных клеток,
полученный из жировых стромальных клеток или из остеобластов и предполагаемый
заменитель дл восстановлени хр ща, сформированный из хондроцитов. Сопутствующа цель насто щего изобретени состоит в том, чтобы сно показать возможность
предоставлени также других тканей, которые можно получить из соответствующих типов
клеток способом по насто щему изобретению, если такие другие типы клеток обладают
свойствами, позвол ющими им претерпевать подобное ткани формирование массы при
культивировании макромассы, как определено в насто щем изобретении.
Еще одна цель насто щего изобретени состоит в том, чтобы предложить трехмерную
подобную ткани организацию клеток и макроскопические подобные ткани конструкции без
применени каркаса или чужеродного матрикса или сложного биореактора дл получени ткани.
Еще одна цель насто щего изобретени состоит в том, чтобы предложить трехмерную
подобную ткани организацию клеток и макроскопические подобные ткани конструкции без
применени каких-либо средств, которые способствуют формированию ткани, таких как
индуцирующие формирование ткани химические вещества, индуцирующие формирование
ткани факторы роста, питательна среда со специальными свойствами, чередующиес культуры и так далее.
Еще одна цель насто щего изобретени состоит в том, чтобы предложить трехмерную
подобную ткани организацию клеток и макроскопические подобные ткани конструкции
различных типов, полученных использованием высокой плотности засевани клеток на
единицу площади или пространства сосуда дл культивировани , без необходимости
наличи любого другого средства, которое способствует формированию ткани.
Еще одна цель насто щего изобретени состоит в том, чтобы предложить
макроскопические подобные ткани конструкции, которые обладают высокой степенью
плотности клеток в конечном виде.
Еще одна цель насто щего изобретени состоит в том, чтобы предложить подобную
ткани организацию клеток и макроскопические подобные ткани конструкции, которые можно
получить без необходимости в определенных компонентах сложных сред.
Еще одна цель насто щего изобретени состоит в том, чтобы предложить подобную
ткани организацию клеток и макроскопические подобные ткани конструкции, свойства
которых можно модулировать, чтобы включать необходимые свойства при помощи
подход щей замены/замен в среде дл роста и/или в образующей ткань среде.
Еще одна цель насто щего изобретени состоит в том, чтобы предложить подобную
ткани организацию клеток и макроскопические подобные ткани конструкции, которые можно
получить при культивировании макромассы на различных совместимых поверхност х роста
в зависимости от необходимости.
Еще одна цель насто щего изобретени состоит в том, чтобы предложить
Страница: 6
RU 2 335 538 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
макроскопические подобные ткани конструкции, которые можно масштабировать до
больших размеров при помощи простого воспроизведени с увеличением в двух
измерени х способа, используемого дл их получени , то есть, культивировани макромассы.
Друга цель данного изобретени состоит в том, чтобы создать трехмерную подобную
ткани организацию на микроскопическом уровне.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В насто щем изобретении предложен способ объединени клеток в трехмерную
подобную ткани организацию при помощи культивировани макромассы и новый способ
культивировани макромассы. Предложены макроскопические трехмерные подобные ткани
конструкции, которые гистологически компетентны, полученные при макромассовом
культивировании клеток. Насто щее изобретение относитс к инженерии ткани. Более
определенно, данное изобретение относитс к получению трехмерной подобной ткани
конструкции дл возможной имплантации в организм человека в качестве терапии
болезненных состо ний или состо ний при повреждении тканей. Данное изобретение
предлагает способ дл организации клеток в трехмерные подобные ткани формы и
описывает сами подобные ткани формы.
Получение ткани представл ет собой цель, важную дл реплантации поврежденных
тканей организма человека. Предпринимаютс усили дл того, чтобы исследовать и
закрепить способности клеток формировать ткани дл инженерии ткани.
Способ инженерии ткани клеточных трансплантатов включает следующие ниже две (2)
основные стадии:
i. подготовка клеток из подход щих источников. Дл подготовленных клеток может
потребоватьс подход ща предварительна обработка, така как дифференцирование в
необходимый тип клетки.
ii. создание ткани, с использованием подход щим образом обработанных клеток дл получени различных продуктов инженерии ткани.
Насто щее изобретение относитс к второй из данных стадий. Авторы изобретени разработали простой и эффективный способ дл получени трехмерной подобной ткани
организации клеток и формировани жизнеспособных, клеточных, предполагаемых
заменителей тканей.
Подобные ткани конструкции по насто щему изобретению обладают когезионной
прочностью, позвол ющей противосто ть физической манипул ции и переносу, как это
требовалось бы дл процедуры переноса их хирургическим путем в необходимый участок
организма из контейнера, содержащих их, при помощи соответствующих поддерживающих
устройств и устройств или инструментов дл переноса.
Существенный объем работы был проведен до насто щего времени при создании
заменителей ткани, которые представл ют собой заменители на основе каркаса - они
содержат каркас в качестве важного структурного и часто функционального компонента.
Такой каркас должен обладать свойствами биологической совместимости, способности к
биодеградации (так, чтобы в конечном счете в организме оставалась только природна ткань) и предоставлени окружающей среды, допускающей осуществление оптимальной
клеточной функции. Разработка каркасов, которые идеальны во всевозможных отношени х,
остаетс сложной задачей. Насто щее изобретение имеет преимущество в том, что оно
преодолевает необходимость внедрени каркаса, поскольку трехмерные подобные ткани
конструкции, полученные по насто щему изобретению, изготовлены без помощи каркаса.
Формирование гистологически компетентных подобных ткани конструкций макромассовым
способом по насто щему изобретению не требует наличи каркаса. Таким образом,
подобные ткани конструкции по насто щему изобретению также устран ют любые
неблагопри тные эффекты или недостатки, которые могли бы быть св заны с
использованием каркаса, который не идеален в каком-либо отношении. В насто щем
изобретении, внеклеточный матрикс синтезируетс непосредственно самими клетками, не
используютс никакие чужеродные компоненты матрикса. Формирование ткани
Страница: 7
RU 2 335 538 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
осуществл етс просто высеванием клеток при высокой степени плотности клеток на
единицу площади или пространства сосуда дл культивировани . Такой способ обозначили
как культивирование «макромассы», которое обозначают как систему культивировани трехмерного подобного ткани образовани или организации клеток, в которой клетки
высевают при высокой степени плотности на единицу площади или пространства сосуда
дл культивировани в диапазоне, охватывающем интервал около 10 6 клеток на см 2, и
нет никакой необходимости в наличии любых других средств, которые способствуют
формированию ткани. Более широкое определение культивировани макромассы
представл ет собой способ получени трехмерной подобной ткани организации,
макроскопической или микроскопической, из клеток посредством высевани клеток при
высокой степени плотности, привод щей к расположению клеток в непосредственной
близости при определенном благопри тном диапазоне высоких степеней плотности клеток
в трехмерном пространстве, которое благопри тствует когезивной интеграции клеток в
трехмерное подобное ткани состо ние, причем без необходимости в наличии любых других
средств, которые способствуют формированию ткани. Определенной высокой плотности
высевани клеток в благопри тном диапазоне необходимо достичь в пределах данного
пространства. В макромассовом диапазоне благопри тных высоких степеней плотности
высевани клеток, когда клетки расположены вместе в трехмерном пространстве, которое
зан то клетками на дне сосуда дл культивировани , они достигают состо ни непосредственной близости друг с другом, которое запускает или передает им сигнал о
переходе в режим формировани ткани, посредством которого они когезивно
интегрируютс . (Можно отметить, что макромассового диапазона плотности высевани клеток можно достичь в сосуде с плоским или закругленным дном). Результатом
использовани сосуда дл культивировани диаметром приблизительно 0,75 см или более
дл культивировани макромассы вл етс формирование макроскопических трехмерных
подобных ткани конструкций, где "макроскопические" обозначает, что размер ткани
составл ет, по меньшей мере, такой размер, что его можно легко визуально
рассматривать нормальным человеческим глазом без вспомогательных устройств.
Ранее известную систему культивировани ткани, культуру микромассы высокой
плотности использовали дл хондрогенной дифференцировки клеток, и объем такой
культуры был ограничен до составл ющих от 10 до 20 мкл п тен клеточной суспензии
(Yoon et al, 2000). Классически, мезенхимальные клетки конечностей, при
культивировании in vitro в качестве культуры микромассы, подвергаютс формированию
уплотнений или агрегатов предхр ща, которые присутствуют в качестве отдельных узлов,
покрывающие площадь микромассового п тна (Ahrens et al., 1977). Сформированные таким
образом клеточные узлы отделены друг от друга клетками, не сформированными в узлы
между ними, и клеточные узлы вл ютс микроскопическими. Большие, но все же
микроскопические сфероидальные структуры, в которых все клетки объединены дл формировани одного скоплени , получены с необходимостью наличи определенных
компонентов, добавленных к среде культивировани , таких как факторы роста, как далее
упом нуто в тексте. Тем не менее, подобные ткани массы, полученные авторами
насто щего изобретени , вл ютс макроскопическими (и сформированы без помощи
какого-либо определенного средства, которое способствует формированию ткани) и
таким образом обладают желательным качеством размера, необходимым, чтобы обладать
потенциалом в качестве заменителей ткани дл организма человека. В подобной ткани
организации макромассовой культуры по насто щему изобретению все клетки станов тс частью интегрированной подобной ткани организации, котора вл етс таким образом
целостной; нет никаких отдельных узлов. Ранее обнаружено, что микромассовым
культивированием мезенхимальные клетки предхр ща ноги привели к по влению узлового
паттерна (Downie & Newman, 1994). Хот мезенхимальные клетки предхр ща руки привели
к по влению паттерна пласта при культивировании микромассы; это произошло в
бессывороточной системе культивировани в отличие от системы культивировани макромассы по насто щему изобретению. Кроме того, мезенхимальные клетки предхр ща
Страница: 8
RU 2 335 538 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
ноги могли привести к по влению подобного пласту патерна, но это происходило после
обработки TGF? l в бессывороточной среде, оп ть же в отличие от макромассового
культивировани , где нет необходимости в определенных средствах, которые
способствуют формированию ткани при образовании подобного ткани пласта, и нет
необходимости в бессывороточных услови х.
До насто щего времени остаетс неисследованным вопрос, будет ли иметь место
межклеточна агрегаци , привод ща к образованию целостной подобной ткани массы
посредством культивировани при высокой степени плотности высевани клеток без
определенных средств, которые способствуют формированию ткани в среде. Тем не менее,
работа авторов насто щего изобретени относитс к данному вопросу, и насто щее
изобретение позвол ет ответить на него утвердительно.
Культуру с высокой плотностью клеток использовали дл инициации хондрогенеза с
формированием микроскопических отдельных узлов, но она пока не была оценена в
большем по размеру макроскопическом масштабе дл создани макроскопических тканей
дл реплантации в организм человека. И даже в микроскопическом масштабе, как
упом нуто выше, целостные агрегаты получали только при помощи определенных средств
в отличие от культивировани макромассы по насто щему изобретению.
Хот термин «макромасса» при первом воспри тии, как может показатьс , означает
простое расширение пон ти «микромассы», он фактически отличаетс в важном аспекте,
в том, что микромассу получали в качестве способа дл хондрогенной дифференцировки
клеток, и также он охватывает определенные сложные требовани к среде даже дл образовани микроскопического целостного сфероидального агрерата (как упом нуто
ниже), в то врем как макромасса представл ет собой способ получени трехмерной
подобной ткани организации клеток и макроскопических подобных ткани конструкций и без
определенных сложных требований к среде дл их образовани .
До насто щего времени предпринимались попытки создани клеточных агрегатов,
результатами которых были микроскопические массы, называемые сфероидами.
Сфероиды представл ют собой трехмерные клеточные структуры, которые получали из
гепатоцитов и других клеток при помощи разнообразных средств, которые способствуют
формированию подобных ткани структур, таких как не прилипающие чашки (Takezawa et
al., 1993), культивирование в центрифужной пробирке (Abu-Absi et al., 2002),
полимерные вещества наподобие эудрагита (Yamada et al., 1998), матригель (Lang et al,
2001), чашки Primaria (Hamamoto et al., 1998), покрытые поли-D-лизином чашки
(Hamamoto et al., 1998), протеогликановое покрытие (Shinji et al., 1988), поток среды
культивировани (Pollok et a.l, 1998), чередующиес культуры (Furukawa et al., 2001),
способ с жидким верхним слоем (Davies et al., 2002), факторы, увеличивающие
межклеточную адгезию, такие как инсулин, дексаметазон и фактор роста фибробластов
(Furukawa et al., 2001), поддерживающих агрегацию конъюгатов полимеров с пептидами
(Baldwin & Saltzman, 2001), биореактор со вращающимис стенками (Baldwin & Saltzman,
2001) и так далее. В отличие от данных сфероидов массы ткани, полученные по
насто щему изобретению, получены без помощи какого-либо такого средства, которое
способствует формированию подобных ткани структур. Упом нутые выше сфероиды
намного меньше, наход сь, главным образом, в микрометровом или субмиллиметровом
диапазоне. Так как можно получить макроскопические массы ткани при культивировании
макромассы, как описано в насто щем изобретении, данные массы ткани обладают вным
преимуществом перед сфероидами дл размещени в необходимых участках организма
человека.
Самый большой из сфероидов (приблизительно 1 мм в диаметре), который авторы
насто щего изобретени обнаружили в опубликованных литературных источниках, был
сформирован при высокоплотном культивировании кусочков ткани (Mackay et al., 1998).
Его формирование происходило в присутствии определенной бессывороточной среды,
содержащей TGF-? 3, дексаметазон, 2-фосфат аскорбата и добавки инсулин-трансферинселен, где также нет необходимости в определенной бессывороточной среде дл Страница: 9
RU 2 335 538 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
получени ткани культивированием макромассы. В предыдущем сообщении,
использующем культивирование кусочков ткани костного мозга, полученных из
мезенхимальных клеток-предшественников, обнаружили, что формирование
сфероидального агрегата не имело место в кусочках ткани, инкубированных с DMEM + 10%
FCS (Johnstone et al., 1998), в то врем как подобные ткани конструкции при
культивировании макромассы формируютс в DMEM + 10%-ый FCS. Сообщали об
образовании сфероида при культивировании микромассы мультипотентных
мезенхимальных клеток; здесь снова формирование сфероидального агрегата имело
место только после обработки микромассы TGF? 1 или экстрактом бычьей кости (Denker
et al., 1995). Микроскопические сфероиды клеток кости, как сообщали, формировались в
присутствии бессывороточной среды, содержащей TGF?1 (Kale et al., 2000; за вка на
патент США № 20020127711), и культивирование клеток в отсутствие сыворотки и в
присутствии TGF?1, как сообщают, существенно дл формировани сфероида клетки кости
в данном способе. В упом нутой выше работе, плотности клеточной культуры от примерно
1Ч10 3 клеток/см 2 до 1Ч10 6 клеток/см 2 были описаны как благопри тные дл формировани сфероида. В дополнение к другим характерным особенност м подобных ткани конструкций
по насто щему изобретению, которые отличают его от упом нутой выше работы, а именно,
будучи макроскопическими, не требующими отсутстви сыворотки и не требующими
присутстви TGF?1 дл формировани , благопри тные диапазоны плотности высевани клеток также отличаютс . В насто щем изобретении подобные ткани конструкции не имеют
место при плотности 1Ч10 5 клеток/см 2 или ниже, тогда как 1Ч10 3 клеток/см 2 в указанной
выше работе в 100 раз ниже. Получали клеточные агрегаты или узлы остеогенных
эмбриональных стволовых клеток (Buttery et al., 2001), но оп ть же, данные узлы были
микроскопическим и не формировались при культивировании клеток с высокой плотностью
высевани , как описано в насто щем изобретении. Массы ткани по насто щему
изобретению, которые можно получить при культивировании макромассы, когда
осуществл ют его в большом масштабе, вл ютс макроскопическими, следовательно,
размеры их намного больше, чем любые сфероиды, которые были получены, и не имеют
таких определенных сложных требований к среде дл формировани . Проста среда, така как DMEM + 10% FCS, достаточна дл формировани подобной ткани конструкции при
помощи культивировани макромассы. Ранее из хондрогенных клеток получали
когезионные закупоривающие массы клеток (патент США № 5723331), но дл этого строго
необходима переделанна лунка, имеюща поверхность, котора преп тствует
присоединению клеток и, таким образом, не допускает закреплени клеток, тогда как в
насто щем изобретении нет никакой необходимости в такой поверхности дл формировани подобной ткани конструкции.
В одном осуществлении данного изобретени подобный ткани пласт формируетс из
фибробластов кожи человека в качестве потенциального заменител кожи. Фибробласты
кожи могут иметь аллогенное происхождение, так как известно, что фибробласты кожи
человека вл ютс относительно неиммуногенными при передаче аллогенному реципиенту
(патент США № 5460939). Такой подобный ткани пласт обладает потенциалом, чтобы стать
кожным эквивалентом, материалы дл которого легко доступны, который не содержит
никакого синтетического или природного чужеродного матрикса, который мог бы вызвать
воспалительную реакцию у некоторых пациентов, который вл етс клеточным с тем,
чтобы он мог продуцировать факторы роста и другие белки, который можно получить в
относительно более короткое врем и получение которого технологически просто так, что
продукт более экономичен по затратам.
В другом осуществлении данного изобретени при культивировании макромассы
подобную ткани массу с подобными кости свойствами получают из остеогенных клеток,
полученных из жировых стромальных клеток, в качестве предполагаемого заместител ткани, который может обладать возможностью инициировать заживление небольших
несоединимых разрывов при переломах кости. Это может быть аутогенной терапией. Така подобна ткани масса может обладать возможностью представл ть собой экономичный по
Страница: 10
RU 2 335 538 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
затратам клеточный имплантат, лишенный чужеродного каркаса, который может
инициировать заживление небольших разрывов в кости. В данном изобретении подобную
ткани конструкцию также получали из остеобластов, полученных из кости.
В еще одном осуществлении изобретени , подобный ткани пласт получали из
хондроцитов человека в качестве предполагаемого имплантата, индуцирующего
восстановление хр ща у пациентов с повреждением хр ща сустава. Аутогенные
хондроциты можно использовать дл такой терапии ткани, поскольку хондроциты можно
получить из небольших биопсий хр ща. Такой подобный ткани пласт может обладать
потенциалом представл ть собой предварительно сформированную ткань, котора могла
бы эффективно начать восстановление хр ща при имплантации в участок поражени и
который также был бы экономичным по затратам.
В дополнительном осуществлении данного изобретени микроскопическую трехмерную
подобную ткани организацию получают при помощи культивировани макромасс в
желатиновом пористом материале.
В заключение, подобные ткани конструкции по насто щему изобретению, полученные
культивированием макромассы, могут обладать потенциалом представл ть собой
жизнеспособные, клеточные заменители ткани, которые не содержат каркаса и
чужеродного внеклеточного матрикса и которые технологически просто получить и,
следовательно, которые были бы экономичными по затратам. Подобные ткани конструкции
по насто щему изобретению, подробно описанные в качестве заменителей ткани в
терапевтических цел х, могли бы также найти другие области применени , такие как
тестирование лекарственных препаратов in vitro и тому подобное.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Предпочтительные осуществлени насто щего изобретени далее проиллюстрированы
в сопутствующих фигурах, как описано ниже.
ФИГ.1. Фотографии, демонстрирующие макроскопические подобные ткани конструкции,
сформированные при культивировании макромассы в чашках диаметром 3,5 см из (a)
фибробластов кожи, (b) жировых стромальных клеток, (c) хондроцитов, (d) остеобластов.
ФИГ.2. Процесс межклеточной адгезии, привод щий к формированию подобной ткани
конструкции, имеющей место при культивировании макромассы жировых стромальных
клеток (a) через один час после начала культивировани макромассы, (b) через шесть
часов после начала культивировани макромассы.
ФИГ.3. Гистологическое исследование тканевого пласта, сформированного при
культивировании макромассы фибробластов кожи (a) окрашивание гематоксилином и
эозином показывает трехмерную организацию, (b) окрашивание трихром по Массону
показывает синтез коллагена.
ФИГ 4. Гистологическое исследование подобной ткани конструкции, сформированной
при культивировании макромассы остеогенных клеток, полученных из жировых
стромальных клеток (a) окрашивание гематоксилином и эозином показывает трехмерную
организацию, (b) окрашивание трихром по Массону.
ФИГ.5. Гистологическое исследование подобной ткани конструкции, сформированной
при культивировании макромассы хондроцитов (a) окрашивание гематоксилином и эозином
показывает трехмерную организацию, (b) окрашивание трихром по Массону.
ФИГ.6. Иммунное окрашивание коллагена типа I гистологического среза подобной ткани
конструкции, полученной из фибробластов кожи, показывающее положительное
обнаружение коллагена типа I.
ФИГ.7. Клетки, повторно выращенные от отделенного пласта ткани, полученного из
фибробластов кожи при культивировании макромассы дл того, чтобы оценить их
жизнеспособность.
ФИГ.8. Анализ экспрессии генов тканевого пласта, полученного из фибробластов кожи
при культивировании макромассы, проанализированные при помощи PCR с обратной
транскриптазой. Продукты RT-PCR, соответствующие различным генам, которые, как
известно, важны дл процесса заживлени ран кожи, показаны в виде разделенных
Страница: 11
RU 2 335 538 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
электрофорезом в 2% агарозном геле (M) маркеров молекул рного веса ДНК, (1) коллагена
I типа, (2) синдекана 2, (3) танасцина-C, (4) васкул рного эндотелиального фактора
роста, (5) коллагена III типа, (6) фибронектина, (7) фактора роста кератиноцитов, (8)
трансформирующего фактора роста 1?.
ФИГ.9. Экспресси генов в подобной ткани конструкции, созданной из остеогенных
клеток, полученных из жировых стромальных клеток. Продукты RT-PCR показаны в виде
разделенных электрофорезом в 2% агарозном геле (M) маркеров молекул рного веса ДНК,
(1) коллагена типа I, (2) остеопонтина, (3) рецептора паратиреоидного гормона, (4)
формообразующего кость белка 2, (5) формообразующего кость белка 4, (6) рецептора
формообразующего кость белка IA, (7) рецептора формообразующего кость белка IB.
ФИГ.10. Экспресси генов в подобной ткани конструкции, созданной из хондроцитов.
Продукты RT-PCR показаны в виде разделенных электрофорезом в 2% агарозном геле (M)
маркеров молекул рного веса ДНК, (1) аггрекана, (2) коллагена типа II, (3) коллагена
типа X.
ФИГ.11. Гистологический анализ подобной ткани конструкции, созданной из остеогенных
клеток, полученных из жировых стромальных клеток в присутствии кондиционированной
остеогенной среды, показывающий (a) фокальное фактическое формирование кости в
подобной ткани конструкции (трихром по Массону) и (b) фокальное отложение кальци (Von Kossa), демонстрирующий, что свойства подобных ткани конструкций, полученных при
культивировании макромассы, можно модулировать при помощи изменений среды.
ФИГ.12. Гистологические срезы (окрашивание толуидином синим) подобных ткани
конструкций, созданных из хондроцитов в присутствии (a) DMEM + 10% FCS, (b)
хондрогенной среды, показывающие формирование специфичного дл хр ща
внеклеточного матрикса в (b), демонстрирующих, что свойства подобных ткани
конструкций, полученных при культивировании макромассы, можно модулировать при
помощи изменений среды.
ФИГ.13. Гистологический срез (окрашивание трихромом по Массону) сложного объекта,
состо щего из подобного ткани пласта, полученного из фибробластов кожи и гел коллаген + фибрин, демонстрирующий, что подобна ткани организаци клеток, полученна при культивировании макромассы, может представл ть собой компонент объекта.
ФИГ.14. Гистологический срез (окрашивание гематоксилином и эозином) культуры
макромассы в желатиновом пористом материале, показывающий сформированные
кластеры микроскопических трехмерных подобных ткани организаций.
Различные другие аспекты изобретени дополнительно подробно описаны в следующих
ниже разделах.
МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ
Авторами насто щего изобретени разъ снено, что по всему описанию данного
изобретени и в приложенной формуле изобретени , хот площадь сосуда дл культивировани упом нута в терминах диаметра круглого сосуда дл культивировани ,
описываемый фактически аспект включает сосуд дл культивировани любой формы,
причем его площадь представл ет собой ту же самую площадь, что и дл круглого сосуда
дл культивировани упом нутого диаметра. Также, культивирование макромассы можно
осуществить в сосуде дл культивировани с плоским или неплоским дном, хот работа,
представленна в насто щем описании, относитс к сосудам с плоским дном.
Выделение клеток, среда и культура
В насто щем изобретении фибробласты кожи человека выдел ли из биопсий кожи
человека. Дерму отдел ли от эпидермиса обработкой диспазой (Sigma, St. Louis, США).
Дерму крошили и расщепл ли с использованием 0,01% коллагеназы в смеси DMEM +
10% FCS в течение ночи и затем позвол ли клеткам прикрепитьс . Клетки культивировали
в DMEM + 10% FCS при 37°C в 5% CO2 и пересевали, использу раствор трипсин-ЭДТА.
Жировые стромальные клетки выдел ли из полученного при отсасывании жира материала
человека согласно протоколу, описанному Zuk et al. (2001). Данные клетки содержали в
DMEM + 10% FCS. Данные клетки вовлекали в остеогенное дифференцирование согласно
Страница: 12
RU 2 335 538 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
протоколу, описанному Zuk et al. (2001). Хондроциты выдел ли из фрагмента хр ща
человека, разруша хр щ и обрабатыва его коллагеназой перед инкубированием в
поддерживающей среде из DMEM + 10% FCS. Остеобласты выдел ли из кости человека
похожим способом и сохран ли в среде DMEM + 10% FCS, содержащей 50 мкг/мл
аскорбиновой кислоты. Кондиционированную остеогенную среду готовили, использу среду, в которой росли остеогенные жировые стромальные клетки, в качестве части
остеогенной среды дл тех же самых клеток в следующей пересе нной культуре.
Хондрогенную среду готовили согласно описанию Zuk et al. (2001).
Получение подобной ткани конструкции
Получение подобной ткани конструкции осуществл ли при помощи культивировани макромассы, которое представл ет собой новый способ по насто щему изобретению,
ранее описанный в насто щем описании изобретени .
Культивируемые клетки собирали, использу трипсин-ЭДТА. Их ресуспендировали в
подход щем объеме среды и высевали в чашки дл культивировани с диаметром лунки
3,5 см при плотности высевани приблизительно 10 6 клеток на см 2 или в макромассовом
подход щем диапазоне плотностей формирующих ткань клеток. Таким образом,
предпочтительно, приблизительно всего 10 7 клеток высевали в отдельную лунку
шестилуночного планшета (площадь 9,6 см 2) дл образовани отдельной ткани. Дл меньших или больших по размеру подобных ткани конструкций общее количество
высе нных клеток измен ли так, чтобы достичь плотности высевани , благопри тной дл подобной ткани организации.
Гистологический анализ
После формировани подобные ткани конструкции фиксировали и обрабатывали дл гистологического анализа. Окрашивание Von Kossa и окрашивание альциановым синим
осуществл ли на соответствующих конструкци х ткани по насто щему изобретению,
согласно способам, описанным Zuk и другими (2001) и Bancroft и другими (1994).
Окрашивание масл ным красным O осуществл ли способом, описанным Bancroft и другими
(1994). Окрашивание толуидином синим осуществл ли, как указано ниже - после
депарафинизации и гидратации срезов, их окрашивали в течение 1 минуты в 2% водном
растворе толуидина синего, затем промывали в воде в течение 2-3 мин. Срезы затем
дегидратировали в двух циклах 100% ацетоном, очищали в ксилоле и приготавливали
препарат дл исследовани .
Другие гистологические процедуры выполн ли в лаборатории гистопатологии в Sir
Hurkisondas Nurrotamdas Hospital & Research Centre, Мумбаи Инди .
Иммуногистохими Иммуноокрашивание коллагена типа I проводили на срезах залитой в парафин ткани,
использу козье антитело против коллагена типа I и систему окрашивани ABC Santa Cruz
Biotechnology, Санта-Круз, США.
Жизнеспособность клеток в сформированных подобных ткани конструкци х
Массы ткани по насто щему изобретению крошили, расщепл ли коллагеназой в
количестве 0,5 мг/мл в бессывороточной среде DMEM в течение 15 мин и высвобожденные
клетки повторно ресуспендировали в среде роста. Аликвоту окрашивали трипановым
синим. Клетки высевали в колбу дл культур, чтобы оценить жинзнеспособность.
Анализ экспрессии генов
Экспрессию генов в подобных ткани конструкци х, полученных из фибробластов кожи,
остеогенных жировых стромальных клеток и хондроцитов анализировали при PCR с
обратной транскриптазой. РНК экстрагировали из подобной ткани конструкции, использу тризол (Gibco-BRL, Гранд-Айленд, США). RT-PCR проводили, использу праймеры,
специфичные дл соответствующих генов, и систему Titan One-Tube RT-PCR (Roche,
Мангейм, Германи ).
Приготовление гел коллаген + фибрин
Дл приготовлени гел коллаген + фибрин смешивали 134 мкл коллагена типа I из
хвоста мыши rat tail collagen type (Sigma, Сент-Луис, США) в количестве 3,33 мг/мл в
Страница: 13
RU 2 335 538 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0,1 N уксусной кислоты, 8 мкл 4N NaOH, 165 мкл фибриногена в количестве 28,8 мг/мл в
1X DMEM и 210 мкл тромбина в количестве 1,48 мг/мл в 1,66X DMEM. Смеси давали
превратитьс в гель в течение 2 часов при 37°C.
Формирование ткани при культивировании макромассы в желатиновом пористом
материале
Используемый желатиновый пористый материал представл л собой AbGel (Sri Gopal
Krishna Labs. Pvt. Ltd, Мумбаи, Инди ).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Формирование трехмерной подобной ткани организации и макроскопических подобных
ткани конструкций
При культивировании макромассы формировали подобные ткани массы (ФИГ. 1) из
фибробластов кожи в присутствии DMEM + 10% FCS в форме пласта, который либо
самопроизвольно отдел лс от поверхности роста, либо при аккуратном очищении тупым
инструментом. Жировые стромальные клетки также формировали подобную ткани массу в
DMEM + 10%-ый FCS, котора была отрицательно в отношении липидов окрашена
масл ным красным О. Так как это имело место, то дл того чтобы получить возможно
применимую ткань из жировых стромальных клеток, их дифференцировали в остеогенные
клетки, которые после культивировани макромассы формировали схожий пласт, который
может сжиматьс в плотную массу после дополнительной инкубации после отсоединени .
Хондроциты, выделенные из хр ща человека, также формировали тканевой пласт при
культивировании макромассы в DMEM + 10% FCS. Остеобласты, выделенные из кости
человека, также формировали подобную ткани конструкцию при культивировании
макромассы в DMEM + 10% FCS, после промывани от поддерживающей среды,
содержащей аскорбиновую кислоту. Объединение клеток, по-видимому, играет важную
роль при таком формировании подобной ткани конструкции, как замечено при расширенном
формировании прироста из клеток и клеточной интеграции, показанной на ФИГ.2. Когда
культуру макромассы фибробластов кожи увеличивали в размере, высева клетки при
упом нутой плотности отбора в чашку Петри диаметром 8,5 см, получали намного больший
пласт. Таким образом, по-видимому, культуру макромассы можно непосредственно
увеличить в размере по площади, чтобы получить настолько большую ткань, насколько
необходимо. Фибробласты кожи также формировали пласт при культивировании
макромассы в бессывороточной среде DMEM, но врем формировани было больше, чем
дл DMEM, содержащей 10% FCS, в течение ночи по сравнению с 3-4 часами в среде,
содержащей сыворотку. В среде, содержащей сыворотку, врем формировани ткани из
фибробластов кожи, из жировых стромальных клеток и остеогенных клеток, полученных из
них, составл ло приблизительно 4 часа и из хондроцитов составл ло приблизительно 18
часов. Остеогенные клетки, полученные из жировых стромальных клеток, формировали
подобную ткани массу в остеогенной среде, а также и в DMEM + 10% FCS, после
промывани клеток дл удалени остеогенной среды, содержащей аскорбиновую кислоту.
Получение подобных ткани конструкций при культивировании макромассы успешно
проводили в сосудах дл культивировани диаметром от 0,75 см до 8,5 см. Можно
экстраполировать, что культивирование макромассы в сосудах дл культивировани с
диаметром меньшим, чем 0,75 см, и большим, чем 8,5 см, привело бы к формированию
меньших или больших подобных ткани конструкций, соответственно. Таким образом,
размеры трехмерных подобных ткани конструкций можно варьировать.
Хот такие подобные ткани конструкции представл ют собой не полностью
сформированные ткани, они могут оказатьс способными к стимулированию и участию в
процессе заживлени в организме, способом, аналогичным дл полученных данных, что
имплантаци даже стволовых клеток или частично дифференцированных клеток (которые
представл ют собой не полностью сформированную ткань, но наход тс в самом начале
формировани ткани), может привести к восстановлению и регенерации (Kaji & Leiden,
2001).
Было обнаружено, что вление формировани трехмерной подобной ткани массы при
Страница: 14
RU 2 335 538 C2
5
10
15
20
25
30
культивировании макромассы зависит от плотности высевани клеток. Дл того чтобы
исследовать, имело ли место формирование ткани при всех высоких плотност х или нет,
фибробласты кожи высевали в диапазоне различных плотностей клеток на единицу
площади. Обнаружено, что ощутимое формирование пласта имело место при примерно
3,33Ч10 5 клеток на см 2, в то врем как при плотности высевани 6,66Ч10 4 клеток на см 2 (в
п ть раз меньше) или ниже, пласт ткани не формировалс . Кроме того, формирование
пласта ткани происходило при плотности высевани 3Ч10 6 клеток на см 2, но не при 7Ч10 6
клеток на см 2 или выше; при последней плотности высевани клеток только образовались
кластеры на большом рассто нии друг от друга, но не формировалось когезивной массы
ткани. Таким образом, формирование пласта ткани имело место при 3,33Ч10 5 клеток на см 2
и при 3Ч10 6 клеток на см 2, так же как и при всех величинах плотности, лежащих между
данными двум проверенными показател ми. При проверенных величинах плотности выше
или ниже данного диапазона не происходило формирование ткани. Подобные
эксперименты были сделаны с нативными жировыми стромальными клетками и с
хондроцитами, и результаты приведены в таблице. Как и в случае с фибробластами кожи,
также существовала минимальна и максимальна плотность высевани дл формировани подобной ткани конструкции дл данных типов клеток, подобна плотности
дл фибробластов кожи. Такие данные указывают, что существует минимальна и
максимальна плотность высевани клеток на единицу площади дл формировани ткани
при культивировании макромассы. Диапазон высоких значений плотности клеток, при
которых происходит формирование ткани при культивировании макромассы, может
отличатьс дл других непроверенных типов клеток.
Более низкие плотности высевани клеток, используемые как показано в таблице,
приводили к более тонким подобным ткани конструкци м, то есть имеющим более мелкие
размеры в трех измерени х, в то врем как используемые более высокие плотности
высевани приводили к более толстым подобным ткани конструкци м, то есть имеющим
большие размеры в трех измерени х. Таким образом, размеры трехмерных подобных
ткани конструкций можно варьировать.
Зависимость образовани трехмерной подобной ткани конструкции от плотности высевани клеток
Общее количество клеток, помещен-ных на см 2 Фибробласты кожи Жировые стромальные клетки
-
-
-
6,0x10 4
-
-
-
1x10 5
35
40
45
50
Хондроциты
1,3x10 4
-
-
3,0x10 5
+
+
+/-(очень слабо)
7x10 5
+
+
+
1x10 6
+
+
3x10 6
+
+/-(менее когезивные)
+
7x10 6
-
-
-
10x10 6
-
-
-
+
Гистологи (фиг.3, 4, 5)
Окрашивание гематоксилином и эозином срезов различных подобных ткани конструкций
по насто щему изобретению показывает формирование трехмерной структурной
организации и внеклеточного матрикса. Окрашивание трихромом по Массону конструкций,
сформированных из фибробластов кожи, а также и нативных стромальных клеток и
остеогенных стромальных клеток показывало синтез коллагена. Иммуноокрашивание
коллагена типа I подобной ткани конструкции, полученной из фибробластов кожи,
инкубированных в течение 10 дней, показывало положительное окрашивание дл коллагена типа I (фиг.6). Таким образом, формирование внеклеточного матрикса, повидимому, имеет место при формировании подобной ткани конструкции при использовании
способа культивировани макромассы.
Выживаемость клеток в полученных подобных ткани конструкци х
Клетки, повторно выделенные из тканей, полученных из фибробластов кожи и
хондроцитов, обладали жизнеспособностью большей чем 98% по окрашиванию
Страница: 15
RU 2 335 538 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
трипановым синим; клетки из тканевой массы из жировых стромальных клеток составл ли
примерно 90% жизнеспособных. Выделенные клетки и агрегаты помещали в планшеты,
чтобы оценить повторный рост, и, как было обнаружено, они были жизнеспособны в каждом
случае, как показано на фиг. 7, демонстрирующей клеточный рост агрегатов отделенного
тканевого пласта фибробластов кожи.
Анализ экспрессии в подобных ткани конструкци х
Чтобы оценить, обладает ли пласт ткани, сформированный из фибробластов кожи,
потенциалом в качестве заменител кожи, анализировали экспрессию генов, которые, как
известно, играют важную роль в процессе заживлени раны кожи (фиг. 8). Коллаген I
типа, коллагена III типа, фактор роста кератиноцитов, TGF?1, фибронектин, васкул рный
эндотелиальный фактор роста, танасцин-C и синдекан-2, как обнаружили,
экспрессировались в пласте ткани, таким образом демонстриру , что данный подобный
ткани пласт, полученный из фибробластов кожи, обладает потенциалом в качестве
заменител кожи. Чтобы оценить, обладает ли подобна ткани конструкци , полученна из
жировых стромальных клеток, потенциалом в качестве заменител подобной кости ткани,
анализировали экспрессию специфичных дл кости генов. Подобна ткани конструкци , как
было обнаружено, экспрессировала коллаген I типа, остеопонтин, рецептор
паратиреоидного гормона, формообразующий кость белок 2, формообразующий кость
белок 4, рецепторы формообразующего кость белка IA, IB и II, таким образом
демонстриру подобные кости свойства (фиг.9), в дополнение к фокальной кальцификации
и фактическому формированию обломка кости, упом нутого ниже. Аналогичным образом
подобную ткани конструкцию, полученную из хондроцитов, оценивали в отношении ее
потенциала в качестве заменител ткани хр ща. Специфичные дл хр ща гены коллагена
II типа, аггрекана и коллагена X типа, как обнаружили, экспрессировались, таким
образом демонстриру подобные хр щу свойства (фиг.10), в дополнение к формированию
специфичного дл хр ща внеклеточного матрикса, как упом нуто ниже.
Модул ци свойств подобных ткани конструкций посредством трансформировани формирующей ткань среды
При культивировании макромассы возможно заранее подогнать свойства ткани,
полученной добавлением соответствующих компонентов среды или измен среду,
поскольку, насколько было проверено, формирование ткани не зависит от условий среды,
пока что-нибудь, что ингибирует организацию подобной ткани макромассы, не добав т в
среду. Данный факт очевиден из формировани пласта ткани фибробластами кожи как в
содержащий сыворотку, так и бессыворотчной среде, а также и из формировани ткани
жировых стромальных клеток как в DMEM + FCS, так и в остеогенной среде, котора содержит дексаметазон и ?-глицерофосфат. Таким образом, свойства формируемой ткани
можно модулировать дл того, чтобы придать необходимые свойства, измен формирующую ткань среду и/или питательную среду дл клеток. Например, как
представлено в данном изобретении, подобные кости свойства в виде фактического
формировани кости были индуцированы в ткани, полученной из жировых стромальных
клеток, при культивировании клеток и формировании подобной ткани конструкции в
кондиционированной остеогенной среде по сравнению с одной только остеогенной средой,
где не наблюдали никакого фактического формировани спикулы кости (фиг.11).
Окрашивание Von Kossa тканевой массы, полученной из остеогенных стромальных клеток в
присутствии кондиционированной остеогенной среды, показало фокальные области
кальцификации, демонстриру таким образом подобные кости свойства, тогда как
конструкци , полученна из остеогенных стромальных клеток в некондиционированной
остеогенной среде, не показало таких свойств.
Другой пример такой модул ции представл ет собой образование подобных ткани
конструкций из хондроцитов в присутствии DMEM + 10% FCS или в присутствии
хондрогенной среды, котора содержит 1% FCS и инсулин; и TGF? 1 в качестве
индуцирующего образование хр ща средства. Свойство наличи внеклеточного матрикса,
характеристичного дл фенотипа хр ща, получили в подобной ткани конструкции,
Страница: 16
RU 2 335 538 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
полученной в хондрогенной среде, в то врем как конструкции, полученные в DMEM + 10%
FCS, не обладали таким свойством. Это показано при окрашивании толуидином синим на
фиг.12. Таким образом, даже если остаетс тот факт, что формирование ткани при
культивировании макромассы не имеет определенных сложных требований к среде, такие
определенные компоненты можно использовать в среде дл того, чтобы модулировать
свойства формируемой ткани. Это также следует из упом нутых выше результатов, что
подобна ткани организаци и макроскопические подобные ткани конструкции можно
получить в присутствии различных сред культивировани , причем различные среды,
представленные здесь, представл ют собой примеры и не ограничивают насто щее
изобретение данными примерами.
Поверхность роста дл культуры макромассы
Подобные ткани пласты, сформированные из клеток, размещенных на пластмассовой
поверхности, имели тенденцию самопроизвольно отдел тьс и витьс или свертыватьс ,
что нежелательно, так как однажды скатанный пласт не выправл етс . Дл ткани,
создаваемой в качестве возможного заменител кожи, необходимо оставатьс пр мой. Дл этого культуру макромассы фибробластов кожи получали на фильтре Hybond-N (Amersham
Pharmacia Biotech, Бакингемшир, Великобритани ), помещенном в пластмассовую чашку. С
таким изменением пласт, который сформировалс , оставалс пр мым и прикрепленным к
фильтру, так что, в будущем, его можно было бы примен ть на пораженной коже со
стороны фильтра. Данный эксперимент демонстрирует, что возможно осуществить
формирование ткани при культивировании макромассы на различных совместимых
поверхност х дл роста. Таким образом, в этом случае, пласт, полученный при
культивировании макромассы, становитс компонентом предполагаемого имплантата,
который содержит нейлоновый фильтр, который служит поддерживающим слоем, и
необходимость в нем не вл етс необходимостью в качестве каркаса дл подобной ткани
организации клеток. Данный поддерживающий слой разработан не дл того, чтобы
интегрироватьс в организм нар ду с подобным коже пластом, и таким образом это не
каркас, который стал бы частью организма, а поддерживающее устройство дл манипул ций дл использовани подобного коже пласта. Такой поддерживающий слой был
бы удален после заживлени .
Подобна ткани конструкци в качестве компонента объекта
Дл того чтобы продемонстрировать, что подобную ткани конструкцию можно включить в
состав объекта, чтобы она стала компонентом или частью (большего) объекта,
фибробласты кожи высевали при культивировании макромассы, чтобы сформировать
подобный ткани пласт, и затем после удалени среды культивировани , его покрывали
гелевой смесью коллагена и фибрина. Затем позвол ли осуществитьс образованию гел .
Затем, гель можно было подн ть с подобным ткани пластом, прикрепленным к его одной
стороне. Гистологический срез данного состава, в котором подобна ткани конструкци вл етс компонентом, показан на фиг.13. Кроме гелей и пластов, другие матриксы,
такие как пористые материалы или мембраны также могут поддерживать подобные ткани
конструкции с одной стороны, прикрепл их. Таким образом, подобную ткани организацию
и макроскопические подобные ткани конструкции можно объедин ть с различными
объектами, например, пластом или мембраной, гелем, пористым материалом или другими
матриксами.
Микроскопическа трехмерна организаци при культивировании макромасс
Фибробласты кожи высевали на желатиновом пористом материале диаметром 3,5 см
при плотности высевани примерно 2,5 Ч 10 6 клеток на см 2 площади пористого материала
в DMEM + 10% FCS. Такое применение способа культивировани макромассы при высокой
плотности высевани клеток в отношении желатинового пористого материала привело к
формированию микроскопических групп трехмерных подобных ткани организаций в
пористом материале, как замечено при гистологической секции губки, показанной на
фиг.14. Таким образом, способ культивировани макромассы можно использовать дл того,
чтобы также получить трехмерную подобную ткани организацию клеток на
Страница: 17
RU 2 335 538 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
микроскопическом уровне, подобные ткани организации, станов щиес компонентом
целостной структуры.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Новизна насто щего изобретени состоит в том факте, что культивирование при
высокой плотности высевани клеток может привести к образованию целостной
трехмерной подобной ткани организации клеток без каких-либо определенных средств,
которые способствуют формированию ткани, чтобы инициировать такую организацию, и
можно увеличить ее по площади, чтобы получить макроскопические трехмерные подобные
ткани конструкции различных типов, кроме того в других важных характеристиках, таких
как тот факт, что каркасный материал не используетс или что нет необходимости в
наличии определенных средств, которые способствуют формированию ткани/сложного
состава среды, как подробно описано в данном описании. Авторы насто щего изобретени вл ютс первыми, кто сообщил, что целостную трехмерную подобную ткани организацию
клеток и макроскопические трехмерные подобные ткани конструкции различных типов
можно получить при одном только культивировании при высокой плотности высевани клеток.
Возможно, что другие мезодермальные клетки или клетки эндодермального или
эктодермального происхождени могут также сформировать такую подобную ткани
организацию при культивировании макромассы. Следовательно, подобна ткани
организаци и макроскопические подобные ткани конструкции, полученные при
культивировании макромассы любого типа клеток млекопитающих, если они возможны,
наход тс в объеме данного изобретени , причем определ юща характеристика состоит в
подобной ткани организации, достигнутой способом культивировани макромассы.
Тогда как макроскопические подобные ткани конструкции представл ют собой
предпочтительное осуществление данного изобретени , очевидно, что культура макромасы
в меньшем масштабе, который составл ет по площади культуры сколько-нибудь меньше,
чем диаметр приблизительно 0,75 см, привела бы к меньшим подобным ткани
организаци м, уменьшающимс в размере до микроскопических размеров, поскольку
масштаб культуры макромассы уменьшен. Микроскопическа подобна ткани организаци при культивировании макромассы с высокой плотностью высевани клеток в упом нутой
выше форме или в другой форме, такой как желатиновый пористый материал, описанный
ранее, также находитс , таким образом в объеме данного изобретени . Аналогично,
подобные ткани конструкции можно получить при культивировании макромассы в сосудах
дл культивировани , с диаметром большим чем 8,5 см.
Таким образом, в предшествующем описании описаны определенные осуществлени данного изобретени : представлены примеры, в отношении аспектов использовани различных типов клеток, использовани альтернативной поверхности дл роста,
использовани изменений в среде, чтобы модулировать свойства формируемой ткани,
увеличени объемов формировани ткани, размеров сосудов дл культивировани ,
диапазона высоких значений плотности клеток при формировании ткани и получени предполагаемого имплантата, ткань которого, полученна при культивировании
макромассы, вл етс частью целого. Хот , сно показаны только описанные
осуществлени , они служат только в качестве примера или иллюстрации и не ограничивают
изобретение.
Следует понимать, что можно сделать различные модификации или замены по данному
изобретению, которые будут находитьс в рамках насто щего изобретени . Например, как
предполагают авторы изобретени , одна така модификаци представл ла бы собой
захват или инкапсул цию масс ткани, полученных при культивировании макромассы, в
подход щий гель или матрикс, или друга така модификаци представл ла бы собой
конструкцию, в которой множество подобных ткани масс или пластов присоедин ютс или
прикрепл ютс друг к другу при помощи некоторых средств. В таких конструкци х,
подобна ткани конструкци , полученна при культивировании макромассы, в этом случае
была бы компонентом целого заменител . Упом нутое выше представл ет собой другие
Страница: 18
RU 2 335 538 C2
5
10
15
20
способы, чем способы, представленные в результатах, которыми подобна ткани
организаци и конструкции, полученные при культивировании макромассы, могут вл тьс компонентом объекта. Как демонстрируетс в результатах, даже когда сохран етс , что
подобна ткани организаци клеток при культивировании макромассы не требует наличи никакого каркаса и также гистологически компетентные подобные ткани конструкции,
полученные без помощи каркаса, каркас можно приложить дл культивировани макромассы, например, в качестве альтернативной поверхности дл роста, такой, что
каркас становитс частью целостного заменител . Таким образом, трехмерна подобна ткани организаци и гистологически компетентные подобные ткани конструкции данного
изобретени можно создать без каркаса, но можно их комбинировать с подход щим
каркасом, если это придает благопри тные свойства или преимущества относительно
одной только подобной ткани конструкции. Другие модификации представл ли бы собой
использование других типов клеток, которые обладают свойством формировать подобную
ткани массу при культивировании макромассы, использование другой совместимой
поверхности дл роста, чем описанные поверхности, другие изменени среды дл модул ции и другие размеры при увеличении масштаба и так далее. Следовательно,
данное описание насто щего изобретени не предназначено дл того, чтобы ограничить
данное изобретение точными иллюстративными описанными осуществлени ми.
УПОМЯНУТЫЕ ССЫЛКИ
ПАТЕНТНЫЕ ДОКУМЕНТЫ США
5489304
Февраль 1996
5460939
Окт брь 1995 Hansbrough и другие
5613982
Март 1997
20020127711 Сент брь 2002
5723331
Март 1998
Orgill и другие
Goldstein
Kale и другие
Tubo и другие
25
30
35
40
45
50
ДРУГИЕ ССЫЛКИ
Abu-Absi SF, Friend JR, Hansen LK, Hu W (2002) Structural polarity and functional
bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids. Experimental Cell Research 274, 56-67.
Ahrens PB, Solursh M, Reiter RS (1977) Stage-related capacity for limb
chondrogenesis in cell culture. Developmental Biology 60, 69-82.
Baldwin SP, Saltzman WM (2001) Aggregation enhances catecholamine secretion in
cultured cells. Tissue Engineering 7(2) 179-190.
Bancroft JD, Cook HC (1994) Manual of Histological Techniques and their Diagnostic
Application, Churchill Livingstone, Edinburgh, UK.
Buttery LDK, Bourne S, Xynos JD, Wood H, Hughes FJ, Hughes SPF, Episkopou V, Polak
JM (2001) Differentiation of osteoblasts and in vitro bone formation from murine embryonic
stem cells. Tissue Engineering 7(1) 89-99.
Davies CdeL, Berk DA, Pluen A, Jain RK (2002) Comparison of IgG diffusion and
extracellular matrix composition in rhabdomyosarcomas grown in mice versus in vitro as
spheroids reveals the role of host stromal cells. British Journal of Cancer 86, 1639-1644.
Denker AE, Nicoll SB, Tuan RS (1995) Formation of cartilage-like spheroids by
micromass cultures of murine C3H10T1/2 cells upon treatment with transforming growth
factor-beta 1. Differentiation 59(1) 25-34.
Downie SA, Newman SA (1994) Morphogenetic differences between fore and hind limb
precartilage mesenchyme: Relation to mechanisms of skeletal pattern formation.
Developmental Biology 162, 195-208.
Eaglstein WH, Falanga V (1997) Tissue engineering and the development of Apligraf®, a
human skin equivalent. Clinical Therapeutics 19(5) 894-905.
Furukawa KS, Ushida T, Sakai Y, Suzuki M, Tanaka J, Tateishi T (2001) Formation of
human fibroblast aggregates (spheroids) by rotational culture. Cell Transplantation 10, 441-445.
Hamamoto R, Yamada K, Kamihira M, Iijima S (1998) Differentiation and proliferation
of primary rat hepatocytes cultured as spheroids. Journal of Biochemistry 124, 972-979.
Johnstone B, Hering TM, Caplan AI, Goldberg VM, Yoo JU (1998) In vitro chondrogenesis of
Страница: 19
RU 2 335 538 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. Experimental Cell Research 238, 265-272.
Kaji EH, Leiden JM (2001) Gene and stem cell therapies. Journal of the American
Medical Association 285(5) 545-550.
Kale S, Biermann S, Edwards C, Tarnowski C, Morris M, Long MW (2000) Threedimensional cellular development is essential for ex vivo formation of human bone.
Nature Biotechnology 18, 954-958.
Kim HW, Han CD (2000) An overview of cartilage tissue engineering. Yonsei Medical
Journal 41(6) 766-773.
Lang SH, Stark M, Collins A, Paul AB, Stower MJ, Maitland NJ (2001) Experimental
prostate epithelial morphogenesis in response to stroma and three-dimensional
Matrigel culture. Cell Growth & Differentiation 12, 631-640.
L'Heureux N, Pвquet S, Labbe R, Germain L, Auger FA (1998) A completely biological
tissue-engineered human blood vessel. FASEB Journal 12, 47-56.
Mackay AM, Beck SC, Murphy JM, Barry FP, Chichester CO, Pittenger MF (1998)
Chondrogenic differentiation of cultured human mesenchymal stem cells from marrow.
Tissue Engineering 4(4) 415-428.
McPherson JM, Tubo R (2000) Articular cartilage injury. In Principles of Tissue
Engineering, 2 nd Edition, Academic Press, San Diego, USA, p. 697-709.
Michel M, L'Heureux N, Pouliot R, Xu W, Auger FA, Germain L (1999) Characterization
of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair. In vitro Cellular & Developmental
Biology - Animal 35, 318-326.
Pollok JM, Kluth D, Cusick RA, Lee H, Utsunomiya H, Ma PX, Langer R, Broelsch CE,
Vacanti JP (1998) Formation of spheroidal aggregates of hepatocytes on biodegradable
polymers under continuous flow bioreactor conditions. Journal of Pediatric Surgery 8, 195-199.
Service RF (2000) Tissue engineers build new bone. Science 289, 1498-1500.
Shinji T, Koide N, Tsuji T (1988) Glycosaminoglycans partially substitute for
proteoglycans in spheroid formation of adult rat hepatocytes in primary culture. Cell Structure &
Function 13, 179-188.
Takezawa T, Mori Y, Yonaha T, Yoshizato К (1993) Characterization of morphology and
cellular metabolism during the spheroid formation by fibroblasts. Experimental Cell
Research 208, 430-441.
Yamada K, Kamihira M, Hamamoto R, Iijima S (1998) Efficient induction of hepatocyte
spheroids in a suspension culture using a water-soluble synthetic polymer as an
artificial matrix. Journal of Biochemistry 123, 1017-1023.
Yoon Y, Oh C, Kim D, Lee Y, Park J, Huh T, Kang S, Chun J (2000) Epidermal growth
factor negatively regulates chondrogenesis of mesenchymal cells by modulating the
protein kinase C-?, Erk-1, and p38 МАРК signaling pathways. Journal of Biological
Chemistry 275(16) 12353-12359.
Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz HP,
Hedrick MH (2001) Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cellbased therapies. Tissue Engineering 7(2) 211-228.
Формула изобретени 1. Способ получени живой организации клеток, подобной ткани, то есть культуры
макромассы, включающей трехмерные конструкции подобные ткани, без помощи каркаса
или чужеродного матрикса, предусматривающий:
систему культивировани , в которой клетки высевают с высокой плотностью на единицу
площади сосуда дл культивировани в диапазоне от 3,33Ч10 5 до 3Ч10 6 клеток на см 2,
привод щей к возникновению трехмерного подобного ткани формировани , или
организации клеток, без помощи любых средств, способствующих образованию ткани,
включающих индуцирующие формирование ткани химические вещества, индуцирующие
формирование ткани факторы роста, подложку, отличную от немодифицированного
пластика дл культуры ткани, чередующиес культуры; и
Страница: 20
CL
RU 2 335 538 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
получение конструкций, подобных ткани, где клетки представл ют собой
мезодермальные клетки.
2. Способ по п.1, в котором клетки выбраны из клеток фибробластов, включа фибробласты кожи, остеобластов, жировых стромальных клеток, остеогенных клеток,
полученных из жировых стромальных клеток, и хондроцитов.
3. Способ по п.2, в котором клетки фибробластов получены из ткани кожи человека,
хондроциты получены из ткани хр ща человека, остеобласты получены из ткани кости
человека и жировые стромальные клетки получены из материала липосакции человека.
4. Способ по п.1, предусматривающий:
образование подобного ткани пласта из клеток, включающих клетки фибробластов
человека мезенхимального происхождени , и подобный ткани пласт не содержит
синтетического или природного чужеродного матрикса и вл етс клеточным, так что он
способен продуцировать факторы роста и другие белки.
5. Подобна ткани организаци клеток, полученна способом по любому из пп.1-4, где
все высе нные клетки объединены в единую подобную ткани организацию без каких-либо
отдельных узелков.
6. Подобна ткани организаци клеток по п.5, включающа макроскопические
трехмерные конструкции дл использовани в качестве заменителей ткани дл имплантации, дл заживлени ран, в качестве моделей in vitro дл проверки
лекарственных средств и тому подобного, полученные из клеток фибробластов
мезенхимального происхождени , включающа :
предполагаемый эквивалент кожи, полученный из фибробластов кожи, предполагаемый
заменитель с подобными кости свойствами, полученный из остеогенных клеток,
полученных из жировых стромальных клеток, и предполагаемый заменитель хр ща,
полученный из хондроцитов.
7. Подобна ткани организаци клеток по п.5, котора вл етс трехмерной по природе
и охватывает трехмерные макроскопические конструкции, подобные ткани.
8. Подобна ткани организаци клеток по п.6, полученна из различных типов клеток,
включающих:
фибробласты кожи;
жировые стромальные клетки;
остеогенные клетки, полученные из жировых стромальных клеток;
хондроциты и остеобласты.
9. Подобна ткани организаци клеток по п.6, котора вл етс трехмерной и котора обладает гибкостью относительно размеров, включающих различные размеры в трех
измерени х;
большие или меньшие подобные ткани конструкции, полученные при увеличении или
уменьшении культивировани макромассы; и измен емый размер или масштаб при
изменении числа клеток, используемых дл получени плотности высевани в пределах
благопри тного дл макромассы диапазона формирующих ткань величин плотности, при
увеличении или уменьшении культивировани макромассы.
10. Подобна ткани организаци клеток по п.6, обладающа гибкостью в отношении
используемой среды культивировани , где подобна ткани организаци клеток
формируетс в присутствии различных сред культивировани , различных сред роста и/или
сред дл формировани ткани; и
свойства подобной ткани организации клеток модулируютс посредством включени компонентов в среду роста и/или формировани ткани при условии, что добавление данных
компонентов не вли ет негативно на образование ткани, или
среду клеток подвергают изменени м при условии, что это изменение среды не вли ет
негативно на образование ткани.
11. Подобна ткани организаци клеток по п.6, где подобные ткани конструкции
получены в сосудах дл культивировани любой формы с плоским или закругленным дном.
12. Подобна ткани организаци клеток по п.5, где макроскопические трехмерные
Страница: 21
RU 2 335 538 C2
конструкции вл ютс подобными пласту.
13. Подобна ткани организаци клеток по п.5, где макроскопическа трехмерна конструкци обладает плотностью клеток в диапазоне от 3,33Ч10 5 до 3Ч10 6 клеток на см 2.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Страница: 22
RU 2 335 538 C2
Страница: 23
DR
RU 2 335 538 C2
Страница: 24
RU 2 335 538 C2
Страница: 25
RU 2 335 538 C2
Страница: 26
RU 2 335 538 C2
Страница: 27
RU 2 335 538 C2
Страница: 28
RU 2 335 538 C2
Страница: 29
RU 2 335 538 C2
Страница: 30
RU 2 335 538 C2
Страница: 31
RU 2 335 538 C2
Страница: 32
RU 2 335 538 C2
Страница: 33
RU 2 335 538 C2
Страница: 34
?нных из жировых стромальных клеток. Продукты RT-PCR показаны в виде
разделенных электрофорезом в 2% агарозном геле (M) маркеров молекул рного веса ДНК,
(1) коллагена типа I, (2) остеопонтина, (3) рецептора паратиреоидного гормона, (4)
формообразующего кость белка 2, (5) формообразующего кость белка 4, (6) рецептора
формообразующего кость белка IA, (7) рецептора формообразующего кость белка IB.
ФИГ.10. Экспресси генов в подобной ткани конструкции, созданной из хондроцитов.
Продукты RT-PCR показаны в виде разделенных электрофорезом в 2% агарозном геле (M)
маркеров молекул рного веса ДНК, (1) аггрекана, (2) коллагена типа II, (3) коллагена
типа X.
ФИГ.11. Гистологический анализ подобной ткани конструкции, созданной из остеогенных
клеток, полученных из жировых стромальных клеток в присутствии кондиционированной
остеогенной среды, показывающий (a) фокальное фактическое формирование кости в
подобной ткани конструкции (трихром по Массону) и (b) фокальное отложение кальци (Von Kossa), демонстрирующий, что свойства подобных ткани конструкций, полученных при
культивировании макромассы, можно модулировать при помощи изменений среды.
ФИГ.12. Гистологические срезы (окрашивание толуидином синим) подобных ткани
конструкций, созданных из хондроцитов в присутствии (a) DMEM + 10% FCS, (b)
хондрогенной среды, показывающие формирование специфичного дл хр ща
внеклеточного матрикса в (b), демонстрирующих, что свойства подобных ткани
конструкций, полученных при культивировании макромассы, можно модулировать при
помощи изменений среды.
ФИГ.13. Гистологический срез (окрашивание трихромом по Массону) сложного объекта,
состо щего из подобного ткани пласта, полученного из фибробластов кожи и гел коллаген + фибрин, демонстрирующий, что подобна ткани организаци клеток, полученна при культивировании макромассы, может представл ть собой компонент объекта.
ФИГ.14. Гистологический срез (окрашивание гематоксилином и эозином) культуры
макромассы в желатиновом пористом материале, показывающий сформированные
кластеры микроскопических трехмерных подобных ткани организаций.
Различные другие аспекты изобретени дополнительно подробно описаны в следующих
ниже разделах.
МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ
Авторами насто щего изобретени разъ снено, что по всему описанию данного
изобретени и в приложенной формуле изобретени , хот площадь сосуда дл культивировани упом нута в терминах диаметра круглого сосуда дл культивировани ,
описываемый фактически аспект включает сосуд дл культивировани любой формы,
причем его площадь представл ет собой ту же самую площадь, что и дл круглого сосуда
дл культивировани упом нутого диаметра. Также, культивирование макромассы можно
осуществить в сосуде дл культивировани с плоским или неплоским дном, хот работа,
представленна в насто щем описании, относитс к сосудам с плоским дном.
Выделение клеток, среда и культура
В насто щем изобретении фибробласты кожи человека выдел ли из биопсий кожи
человека. Дерму отдел ли от эпидермиса обработкой диспазой (Sigma, St. Louis, США).
Дерму крошили и расщепл ли с использованием 0,01% коллагеназы в смеси DMEM +
10% FCS в течение ночи и затем позвол ли клеткам прикрепитьс . Клетки культивировали
в DMEM + 10% FCS при 37°C в 5% CO2 и пересевали, использу раствор трипсин-ЭДТА.
Жировые стромальные клетки выдел ли из полученного при отсасывании жира материала
человека согласно протоколу, описанному Zuk et al. (2001). Данные клетки содержали в
DMEM + 10% FCS. Данные клетки вовлекали в остеогенное дифференцирование согласно
Страница: 12
RU 2 335 538 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
протоколу, описанному Zuk et al. (2001). Хондроциты выдел ли из фрагмента хр ща
человека, разруша хр щ и обрабатыва его коллагеназой перед инкубированием в
поддерживающей среде из DMEM + 10% FCS. Остеобласты выдел ли из кости человека
похожим способом и сохран ли в среде DMEM + 10% FCS, содержащей 50 мкг/мл
аскорбиновой кислоты. Кондиционированную остеогенную среду готовили, использу среду, в которой росли остеогенные жировые стромальные клетки, в качестве части
остеогенной среды дл тех же самых клеток в следующей пересе нной культуре.
Хондрогенную среду готовили согласно описанию Zuk et al. (2001).
Получение подобной ткани конструкции
Получение подобной ткани конструкции осуществл ли при помощи культивировани макромассы, которое представл ет собой новый способ по насто щему изобретению,
ранее описанный в насто щем описании изобретени .
Культивируемые клетки собирали, использу трипсин-ЭДТА. Их ресуспендировали в
подход щем объеме среды и высевали в чашки дл культивировани с диаметром лунки
3,5 см при плотности высевани приблизительно 10 6 клеток на см 2 или в макромассовом
подход щем диапазоне плотностей формирующих ткань клеток. Таким образом,
предпочтительно, приблизительно всего 10 7 клеток высевали в отдельную лунку
шестилуночного планшета (площадь 9,6 см 2) дл образовани отдельной ткани. Дл меньших или больших по размеру подобных ткани конструкций общее количество
высе нных клеток измен ли так, чтобы достичь плотности высевани , благопри тной дл подобной ткани организации.
Гистологический анализ
После формировани подобные ткани конструкции фиксировали и обрабатывали дл гистологического анализа. Окрашивание Von Kossa и окрашивание альциановым синим
осуществл ли на соответствующих конструкци х ткани по насто щему изобретению,
согласно способам, описанным Zuk и другими (2001) и Bancroft и другими (1994).
Окрашивание масл ным красным O осуществл ли способом, описанным Bancroft и другими
(1994). Окрашивание толуидином синим осуществл ли, как указано ниже - после
депарафинизации и гидратации срезов, их окрашивали в течение 1 минуты в 2% водном
растворе толуидина синего, затем промывали в воде в течение 2-3 мин. Срезы затем
дегидратировали в двух циклах 100% ацетоном, очищали в ксилоле и приготавливали
препарат дл исследовани .
Другие гистологические процедуры выполн ли в лаборатории гистопатологии в Sir
Hurkisondas Nurrotamdas Hospital & Research Centre, Мумбаи Инди .
Иммуногистохими Иммуноокрашивание коллагена типа I проводили на срезах залитой в парафин ткани,
использу козье антитело против коллагена типа I и систему окрашивани ABC Santa Cruz
Biotechnology, Санта-Круз, США.
Жизнеспособность клеток в сформированных подобных ткани конструкци х
Массы ткани по насто щему изобретению крошили, расщепл ли коллагеназой в
количестве 0,5 мг/мл в бессывороточной среде DMEM в течение 15 мин и высвобожденные
клетки повторно ресуспендировали в среде роста. Аликвоту окрашивали трипановым
синим. Клетки высевали в колбу дл культур, чтобы оценить жинзнеспособность.
Анализ экспрессии генов
Экспрессию генов в подобных ткани конструкци х, полученных из фибробластов кожи,
остеогенных жировых стромальных клеток и хондроцитов анализировали при PCR с
обратной транскриптазой. РНК экстрагировали из подобной ткани конструкции, использу тризол (Gibco-BRL, Гранд-Айленд, США). RT-PCR проводили, использу праймеры,
специфичные дл соответствующих генов, и систему Titan One-Tube RT-PCR (Roche,
Мангейм, Германи ).
Приготовление гел коллаген + фибрин
Дл приготовлени гел коллаген + фибрин смешивали 134 мкл коллагена типа I из
хвоста мыши rat tail collagen type (Sigma, Сент-Луис, США) в количестве 3,33 мг/мл в
Страница: 13
RU 2 335 538 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0,1 N уксусной кислоты, 8 мкл 4N NaOH, 165 мкл фибриногена в количестве 28,8 мг/мл в
1X DMEM и 210 мкл тромбина в количестве 1,48 мг/мл в 1,66X DMEM. Смеси давали
превратитьс в гель в течение 2 часов при 37°C.
Формирование ткани при культивировании макромассы в желатиновом пористом
материале
Используемый желатиновый пористый материал представл л собой AbGel (Sri Gopal
Krishna Labs. Pvt. Ltd, Мумбаи, Инди ).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Формирование трехмерной подобной ткани организации и макроскопических подобных
ткани конструкций
При культивировании макромассы формировали подобные ткани массы (ФИГ. 1) из
фибробластов кожи в присутствии DMEM + 10% FCS в форме пласта, который либо
самопроизвольно отдел лс от поверхности роста, либо при аккуратном очищении тупым
инструментом. Жировые стромальные клетки также формировали подобную ткани массу в
DMEM + 10%-ый FCS, котора была отрицательно в отношении липидов окрашена
масл ным красным О. Так как это имело место, то дл того чтобы получить возможно
применимую ткань из жировых стромальных клеток, их дифференцировали в остеогенные
клетки, которые после культивировани макромассы формировали схожий пласт, который
может сжиматьс в плотную массу после дополнительной инкубации после отсоединени .
Хондроциты, выделенные из хр ща человека, также формировали тканевой пласт при
культивировании макромассы в DMEM + 10% FCS. Остеобласты, выделенные из кости
человека, также формировали подобную ткани конструкцию при культивировании
макромассы в DMEM + 10% FCS, после промывани от поддерживающей среды,
содержащей аскорбиновую кислоту. Объединение клеток, по-видимому, играет важную
роль при таком формировании подобной ткани конструкции, как замечено при расширенном
формировании прироста из клеток и клеточной интеграции, показанной на ФИГ.2. Когда
культуру макромассы фибробластов кожи увеличивали в размере, высева клетки при
упом нутой плотности отбора в чашку Петри диаметром 8,5 см, получали намного больший
пласт. Таким образом, по-видимому, культуру макромассы можно непосредственно
увеличить в размере по площади, чтобы получить настолько большую ткань, насколько
необходимо. Фибробласты кожи также формировали пласт при культивировании
макромассы в бессывороточной среде DMEM, но врем формировани было больше, чем
дл DMEM, содержащей 10% FCS, в течение ночи по сравнению с 3-4 часами в среде,
содержащей сыворотку. В среде, содержащей сыворотку, врем формировани ткани из
фибробластов кожи, из жировых стромальных клеток и остеогенных клеток, полученных из
них, составл ло приблизительно 4 часа и из хондроцитов составл ло приблизительно 18
часов. Остеогенные клетки, полученные из жировых стромальных клеток, формировали
подобную ткани массу в остеогенной среде, а также и в DMEM + 10% FCS, после
промывани клеток дл удалени остеогенной среды, содержащей аскорбиновую кислоту.
Получение подобных ткани конструкций при культивировании макромассы успешно
проводили в сосудах дл культивировани диаметром от 0,75 см до 8,5 см. Можно
экстраполировать, что культивирование макромассы в сосудах дл культивировани с
диаметром меньшим, чем 0,75 см, и большим, чем 8,5 см, привело бы к формированию
меньших или больших подобных ткани конструкций, соответственно. Таким образом,
размеры трехмерных подобных ткани конструкций можно варьировать.
Хот такие подобные ткани конструкции представл ют собой не полностью
сформированные ткани, они могут оказатьс способными к стимулированию и участию в
процессе заживлени в организме, способом, аналогичным дл полученных данных, что
имплантаци даже стволовых клеток или частично дифференцированных клеток (которые
представл ют собой не полностью сформированную ткань, но наход тс в самом начале
формировани ткани), может привести к восстановлению и регенерации (Kaji & Leiden,
2001).
Было обнаружено, что вление формировани трехмерной подобной ткани массы при
Страница: 14
RU 2 335 538 C2
5
10
15
20
25
30
культивировании макромассы зависит от плотности высевани клеток. Дл того чтобы
исследовать, имело ли место формирование ткани при всех высоких плотност х или нет,
фибробласты кожи высевали в диапазоне различных плотностей клеток на единицу
площади. Обнаружено, что ощутимое формирование пласта имело место при примерно
3,33Ч10 5 клеток на см 2, в то врем как при плотности высевани 6,66Ч10 4 клеток на см 2 (в
п ть раз меньше) или ниже, пласт ткани не формировалс . Кроме того, формирование
пласта ткани происходило при плотности высевани 3Ч10 6 клеток на см 2, но не при 7Ч10 6
клеток на см 2 или выше; при последней плотности высевани клеток только образовались
кластеры на большом рассто нии друг от друга, но не формировалось когезивной массы
ткани. Таким образом, формирование пласта ткани имело место при 3,33Ч10 5 клеток на см 2
и при 3Ч10 6 клеток на см 2, так же как и при всех величинах плотности, лежащих между
данными двум проверенными показател ми. При проверенных величинах плотности выше
или ниже данного диапазона не происходило формирование ткани. Подобные
эксперименты были сделаны с нативными жировыми стромальными клетками и с
хондроцитами, и результаты приведены в таблице. Как и в случае с фибробластами кожи,
также существовала минимальна и максимальна плотность высевани дл формировани подобной ткани конструкции дл данных типов клеток, подобна плотности
дл фибробластов кожи. Такие данные указывают, что существует минимальна и
максимальна плотность высевани клеток на единицу площади дл формировани ткани
при культивировании макромассы. Диапазон высоких значений плотности клеток, при
которых происходит формирование ткани при культивировании макромассы, может
отличатьс дл других непроверенных типов клеток.
Более низкие плотности высевани клеток, используемые как показано в таблице,
приводили к более тонким подобным ткани конструкци м, то есть имеющим более мелкие
размеры в трех измерени х, в то врем как используемые более высокие плотности
высевани приводили к более толстым подобным ткани конструкци м, то есть имеющим
большие размеры в трех измерени х. Таким образом, размеры трехмерных подобных
ткани конструкций можно варьировать.
Зависимость образовани трехмерной подобной ткани конструкции от плотности высевани клеток
Общее количество клеток, помещен-ных на см 2 Фибробласты кожи Жировые стромальные клетки
-
-
-
6,0x10 4
-
-
-
1x10 5
35
40
45
50
Хондроциты
1,3x10 4
-
-
3,0x10 5
+
+
+/-(очень слабо)
7x10 5
+
+
+
1x10 6
+
+
3x10 6
+
+/-(менее когезивные)
+
7x10 6
-
-
-
10x10 6
-
-
-
+
Гистологи (фиг.3, 4, 5)
Окрашивание гематоксилином и эозином срезов различных подобных ткани конструкций
по насто щему изобретению показывает формирование трехмерной структурной
организации и внеклеточного матрикса. Окрашивание трихромом по Массону конструкций,
сформированных из фибробластов кожи, а также и нативных стромальных клеток и
остеогенных стромальных клеток показывало синтез коллагена. Иммуноокрашивание
коллагена типа I подобной ткани конструкции, полученной из фибробластов кожи,
инкубированных в течение 10 дней, показывало положительное окрашивание дл коллагена типа I (фиг.6). Таким образом, формирование внеклеточного матрикса, повидимому, имеет место при формировании подобной ткани конструкции при использовании
способа культивировани макромассы.
Выживаемость клеток в полученных подобных ткани конструкци х
Клетки, повторно выделенные из тканей, полученных из фибробластов кожи и
хондроцитов, обладали жизнеспособностью большей чем 98% по окрашиванию
Страница: 15
RU 2 335 538 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
трипановым синим; клетки из тканевой массы из жировых стромальных клеток составл ли
примерно 90% жизнеспособных. Выделенные клетки и агрегаты помещали в планшеты,
чтобы оценить повторный рост, и, как было обнаружено, они были жизнеспособны в каждом
случае, как показано на фиг. 7, демонстрирующей клеточный рост агрегатов отделенного
тканевого пласта фибробластов кожи.
Анализ экспрессии в подобных ткани конструкци х
Чтобы оценить, обладает ли пласт ткани, сформированный из фибробластов кожи,
потенциалом в качестве заменител кожи, анализировали экспрессию генов, которые, как
известно, играют важную роль в процессе заживлени раны кожи (фиг. 8). Коллаген I
типа, коллагена III типа, фактор роста кератиноцитов, TGF?1, фибронектин, васкул рный
эндотелиальный фактор роста, танасцин-C и синдекан-2, как обнаружили,
экспрессировались в пласте ткани, таким образом демонстриру , что данный подобный
ткани пласт, полученный из фибробластов кожи, обладает потенциалом в качестве
заменител кожи. Чтобы оценить, обладает ли подобна ткани конструкци , полученна из
жировых стромальных клеток, потенциалом в качестве заменител подобной кости ткани,
анализировали экспрессию специфичных дл кости генов. Подобна ткани конструкци , как
было обнаружено, экспрессировала коллаген I типа, остеопонтин, рецептор
паратиреоидного гормона, формообразующий кость белок 2, формообразующий кость
белок 4, рецепторы формообразующего кость белка IA, IB и II, таким образом
демонстриру подобные кости свойства (фиг.9), в дополнение к фокальной кальцификации
и фактическому формированию обломка кости, упом нутого ниже. Аналогичным образом
подобную ткани конструкцию, полученную из хондроцитов, оценивали в отношении ее
потенциала в качестве заменител ткани хр ща. Специфичные дл хр ща гены коллагена
II типа, аггрекана и коллагена X типа, как обнаружили, экспрессировались, таким
образом демонстриру подобные хр щу свойства (фиг.10), в дополнение к формированию
специфичного дл хр ща внеклеточного матрикса, как упом нуто ниже.
Модул ци свойств подобных ткани конструкций посредством трансформировани формирующей ткань среды
При культивировании макромассы возможно заранее подогнать свойства ткани,
полученной добавлением соответствующих компонентов среды или измен среду,
поскольку, насколько было проверено, формирование ткани не зависит от условий среды,
пока что-нибудь, что ингибирует организацию подобной ткани макромассы, не добав т в
среду. Данный факт очевиден из формировани пласта ткани фибробластами кожи как в
содержащий сыворотку, так и бессыворотчной среде, а также и из формировани ткани
жировых стромальных клеток как в DMEM + FCS, так и в остеогенной среде, котора содержит дексаметазон и ?-глицерофосфат. Таким образом, свойства формируемой ткани
можно модулировать дл того, чтобы придать необходимые свойства, измен формирующую ткань среду и/или питательную среду дл клеток. Например, как
представлено в данном изобретении, подобные кости свойства в виде фактического
формировани кости были индуцированы в ткани, полученной из жировых стромальных
клеток, при культивировании клеток и формировании подобной ткани конструкции в
кондиционированной остеогенной среде по сравнению с одной только остеогенной средой,
где не наблюдали никакого фактического формировани спикулы кости (фиг.11).
Окрашивание Von Kossa тканевой массы, полученной из остеогенных стромальных клеток в
присутствии кондиционированной остеогенной среды, показало фокальные области
кальцификации, демонстриру таким образом подобные кости свойства, тогда как
конструкци , полученна из остеогенных стромальных клеток в некондиционированной
остеогенной среде, не показало таких свойств.
Другой пример такой модул ции представл ет собой образование подобных ткани
конструкций из хондроцитов в присутствии DMEM + 10% FCS или в присутствии
хондрогенной среды, котора содержит 1% FCS и инсулин; и TGF? 1 в качестве
индуцирующего образование хр ща средства. Свойство наличи внеклеточного матрикса,
характеристичного дл фенотипа хр ща, получили в подобной ткани конструкции,
Страница: 16
RU 2 335 538 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
полученной в хондрогенной среде, в то врем как конструкции, полученные в DMEM + 10%
FCS, не обладали таким свойством. Это показано при окрашивании толуидином синим на
фиг.12. Таким образом, даже если остаетс тот факт, что формирование ткани при
культивировании макромассы не имеет определенных сложных требований к среде, такие
определенные компоненты можно использовать в среде дл того, чтобы модулировать
свойства формируемой ткани. Это также следует из упом нутых выше результатов, что
подобна ткани организаци и макроскопические подобные ткани конструкции можно
получить в присутствии различных сред культивировани , причем различные среды,
представленные здесь, представл ют собой примеры и не ограничивают насто щее
изобретение данными примерами.
Поверхность роста дл культуры макромассы
Подобные ткани пласты, сформированные из клеток, размещенных на пластмассовой
поверхности, имели тенденцию самопроизвольно отдел тьс и витьс или свертыватьс ,
что нежелательно, так как однажды скатанный пласт не выправл етс . Дл ткани,
создаваемой в качестве возможного заменител кожи, необходимо оставатьс пр мой. Дл этого культуру макромассы фибробластов кожи получали на фильтре Hybond-N (Amersham
Pharmacia Biotech, Бакингемшир, Великобритани ), помещенном в пластмассовую чашку. С
таким изменением пласт, который сформировалс , оставалс пр мым и прикрепленным к
фильтру, так что, в будущем, его можно было бы примен ть на пораженной коже со
стороны фильтра. Данный эксперимент демонстрирует, что возможно осуществить
формирование ткани при культивировании макромассы на различных совместимых
поверхност х дл роста. Таким образом, в этом случае, пласт, полученный при
культивировании макромассы, становитс компонентом предполагаемого имплантата,
который содержит нейлоновый фильтр, который служит поддерживающим слоем, и
необходимость в нем не вл етс необходимостью в качестве каркаса дл подобной ткани
организации клеток. Данный поддерживающий слой разработан не дл того, чтобы
интегрироватьс в организм нар ду с подобным коже пластом, и таким образом это не
каркас, который стал бы частью организма, а поддерживающее устройство дл манипул ций дл использовани подобного коже пласта. Такой поддерживающий слой был
бы удален после заживлени .
Подобна ткани конструкци в качестве компонента объекта
Дл того чтобы продемонстрировать, что подобную ткани конструкцию можно включить в
состав объекта, чтобы она стала компонентом или частью (большего) объекта,
фибробласты кожи высевали при культивировании макромассы, чтобы сформировать
подобный ткани пласт, и затем после удалени среды культивировани , его покрывали
гелевой смесью коллагена и фибрина. Затем позвол ли осуществитьс образованию гел .
Затем, гель можно было подн ть с подобным ткани пластом, прикрепленным к его одной
стороне. Гистологический срез данного состава, в котором подобна ткани конструкци вл етс компонентом, показан на фиг.13. Кроме гелей и пластов, другие матриксы,
такие как пористые материалы или мембраны также могут поддерживать подобные ткани
конструкции с одной стороны, прикрепл их. Таким образом, подобную ткани организацию
и макроскопические подобные ткани конструкции можно объедин ть с различными
объектами, например, пластом или мембраной, гелем, пористым материалом или другими
матриксами.
Микроскопическа трехмерна организаци при культивировании макромасс
Фибробласты кожи высевали на желатиновом пористом материале диаметром 3,5 см
при плотности высевани примерно 2,5 Ч 10 6 клеток на см 2 площади пористого материала
в DMEM + 10% FCS. Такое применение способа культивировани макромассы при высокой
плотности высевани клеток в отношении желатинового пористого материала привело к
формированию микроскопических групп трехмерных подобных ткани организаций в
пористом материале, как замечено при гистологической секции губки, показанной на
фиг.14. Таким образом, способ культивировани макромассы можно использовать дл того,
чтобы также получить трехмерную подобную ткани организацию клеток на
Страница: 17
RU 2 335 538 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
микроскопическом уровне, подобные ткани организации, станов щиес компонентом
целостной структуры.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Новизна насто щего изобретени состоит в том факте, что культивирование при
высокой плотности высевани клеток может привести к образованию целостной
трехмерной подобной ткани организации клеток без каких-либо определенных средств,
которые способствуют формированию ткани, чтобы инициировать такую организацию, и
можно увеличить ее по площади, чтобы получить макроскопические трехмерные подобные
ткани конструкции различных типов, кроме того в других важных характеристиках, таких
как тот факт, что каркасный материал не используетс или что нет необходимости в
наличии определенных средств, которые способствуют формированию ткани/сложного
состава среды, как подробно описано в данном описании. Авторы насто щего изобретени вл ютс первыми, кто сообщил, что целостную трехмерную подобную ткани организацию
клеток и макроскопические трехмерные подобные ткани конструкции различных типов
можно получить при одном только культивировании при высокой плотности высевани клеток.
Возможно, что другие мезодермальные клетки или клетки эндодермального или
эктодермального происхождени могут также сформировать такую подобную ткани
организацию при культивировании макромассы. Следовательно, подобна ткани
организаци и макроскопические подобные ткани конструкции, полученные при
культивировании макромассы любого типа клеток млекопитающих, если они возможны,
наход тс в объеме данного изобретени , причем определ юща характеристика состоит в
подобной ткани организации, достигнутой способом культивировани макромассы.
Тогда как макроскопические подобные ткани конструкции представл ют собой
предпочтительное осуществление данного изобретени , очевидно, что культура макромасы
в меньшем масштабе, который составл ет по площади культуры сколько-нибудь меньше,
чем диаметр приблизительно 0,75 см, привела бы к меньшим подобным ткани
организаци м, уменьшающимс в размере до микроскопических размеров, поскольку
масштаб культуры макромассы уменьшен. Микроскопическа подобна ткани организаци при культивировании макромассы с высокой плотностью высевани клеток в упом нутой
выше форме или в другой форме, такой как желатиновый пористый материал, описанный
ранее, также находитс , таким образом в объеме данного изобретени . Аналогично,
подобные ткани конструкции можно получить при культивировании макромассы в сосудах
дл культивировани , с диаметром большим чем 8,5 см.
Таким образом, в предшествующем описании описаны определенные осуществлени данного изобретени : представлены примеры, в отношении аспектов использовани различных типов клеток, использовани альтернативной поверхности дл роста,
использовани изменений в среде, чтобы модулировать свойства формируемой ткани,
увеличени объемов формировани ткани, размеров сосудов дл культивировани ,
диапазона высоких значений плотности клеток при формировании ткани и получени предполагаемого имплантата, ткань которого, полученна при культивировании
макромассы, вл етс частью целого. Хот , сно показаны только описанные
осуществлени , они служат только в качестве примера или иллюстрации и не ограничивают
изобретение.
Следует понимать, что можно сделать различные модификации или замены по данному
изобретению, которые будут находитьс в рамках насто щего изобретени . Например, как
предполагают авторы изобретени , одна така модификаци представл ла бы собой
захват или инкапсул цию масс ткани, полученных при культивировании макромассы, в
подход щий гель или матрикс, или друга така модификаци представл ла бы собой
конструкцию, в которой множество подобных ткани масс или пластов присоедин ютс или
прикрепл ютс друг к другу при помощи некоторых средств. В таких конструкци х,
подобна ткани конструкци , полученна при культивировании макромассы, в этом случае
была бы компонентом целого заменител . Упом нутое выше представл ет собой другие
Страница: 18
RU 2 335 538 C2
5
10
15
20
способы, чем способы, представленные в результатах, которыми подобна ткани
организаци и конструкции, полученные при культивировании макромассы, могут вл тьс компонентом объекта. Как демонстрируетс в результатах, даже когда сохран етс , что
подобна ткани организаци клеток при культивировании макромассы не требует наличи никакого каркаса и также гистологически компетентные подобные ткани конструкции,
полученные без помощи каркаса, каркас можно приложить дл культивировани макромассы, например, в качестве альтернативной поверхности дл роста, такой, что
каркас становитс частью целостного заменител . Таким образом, трехмерна подобна ткани организаци и гистологически компетентные подобные ткани конструкции данного
изобретени можно создать без каркаса, но можно их комбинировать с подход щим
каркасом, если это придает благопри тные свойства или преимущества относительно
одной только подобной ткани конструкции. Другие модификации представл ли бы собой
использование других типов клеток, которые обладают свойством формировать подобную
ткани массу при культивировании макромассы, использование другой совместимой
поверхности дл роста, чем описанные поверхности, другие изменени среды дл модул ции и другие размеры при увеличении масштаба и так далее. Следовательно,
данное описание насто щего изобретени не предназначено дл того, чтобы ограничить
данное изобретение точными иллюстративными описанными осуществлени ми.
УПОМЯНУТЫЕ ССЫЛКИ
ПАТЕНТНЫЕ ДОКУМЕНТЫ США
5489304
Февраль 1996
5460939
Окт брь 1995 Hansbrough и другие
5613982
Март 1997
20020127711 Сент брь 2002
5723331
Март 1998
Orgill и другие
Goldstein
Kale и другие
Tubo и другие
25
30
35
40
45
50
ДРУГИЕ ССЫЛКИ
Abu-Absi SF, Friend JR, Hansen LK, Hu W (2002) Structural polarity and functional
bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids. Experimental Cell Research 274, 56-67.
Ahrens PB, Solursh M, Reiter RS (1977) Stage-related capacity for limb
chondrogenesis in cell culture. Developmental Biology 60, 69-82.
Baldwin SP, Saltzman WM (2001) Aggregation enhances catecholamine secretion in
cultured cells. Tissue Engineering 7(2) 179-190.
Bancroft JD, Cook HC (1994) Manual of Histological Techniques and their Diagnostic
Application, Churchill Livingstone, Edinburgh, UK.
Buttery LDK, Bourne S, Xynos JD, Wood H, Hughes FJ, Hughes SPF, Episkopou V, Polak
JM (2001) Differentiation of osteoblasts and in vitro bone formation from murine embryonic
stem cells. Tissue Engineering 7(1) 89-99.
Davies CdeL, Berk DA, Pluen A, Jain RK (2002) Comparison of IgG diffusion and
extracellular matrix composition in rhabdomyosarcomas grown in mice versus in vitro as
spheroids reveals the role of host stromal cells. British Journal of Cancer 86, 1639-1644.
Denker AE, Nicoll SB, Tuan RS (1995) Formation of cartilage-like spheroids by
micromass cultures of murine C3H10T1/2 cells upon treatment with transforming growth
factor-beta 1. Differentiation 59(1) 25-34.
Downie SA, Newman SA (1994) Morphogenetic differences between fore and hind limb
precartilage mesenchyme: Relation to mechanisms of skeletal pattern formation.
Developmental Biology 162, 195-208.
Eaglstein WH, Falanga V (1997) Tissue engineering and the development of Apligraf®, a
human skin equivalent. Clinical Therapeutics 19(5) 894-905.
Furukawa KS, Ushida T, Sakai Y, Suzuki M, Tanaka J, Tateishi T (2001) Formation of
human fibroblast aggregates (spheroids) by rotational culture. Cell Transplantation 10, 441-445.
Hamamoto R, Yamada K, Kamihira M, Iijima S (1998) Differentiation and proliferation
of primary rat hepatocytes cultured as spheroids. Journal of Biochemistry 124, 972-979.
Johnstone B, Hering TM, Caplan AI, Goldberg VM, Yoo JU (1998) In vitro chondrogenesis of
Страница: 19
RU 2 335 538 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. Experimental Cell Research 238, 265-272.
Kaji EH, Leiden JM (2001) Gene and stem cell therapies. Journal of the American
Medical Association 285(5) 545-550.
Kale S, Biermann S, Edwards C, Tarnowski C, Morris M, Long MW (2000) Threedimensional cellular development is essential for ex vivo formation of human bone.
Nature Biotechnology 18, 954-958.
Kim HW, Han CD (2000) An overview of cartilage tissue engineering. Yonsei Medical
Journal 41(6) 766-773.
Lang SH, Stark M, Collins A, Paul AB, Stower MJ, Maitland NJ (2001) Experimental
prostate epithelial morphogenesis in response to stroma and three-dimensional
Matrigel culture. Cell Growth & Differentiation 12, 631-640.
L'Heureux N, Pвquet S, Labbe R, Germain L, Auger FA (1998) A completely biological
tissue-engineered human blood vessel. FASEB Journal 12, 47-56.
Mackay AM, Beck SC, Murphy JM, Barry FP, Chichester CO, Pittenger MF (1998)
Chondrogenic differentiation of cultured human mesenchymal stem cells from marrow.
Tissue Engineering 4(4) 415-428.
McPherson JM, Tubo R (2000) Articular cartilage injury. In Principles of Tissue
Engineering, 2 nd Edition, Academic Press, San Diego, USA, p. 697-709.
Michel M, L'Heureux N, Pouliot R, Xu W, Auger FA, Germain L (1999) Characterization
of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair. In vitro Cellular & Developmental
Biology - Animal 35, 318-326.
Pollok JM, Kluth D, Cusick RA, Lee H, Utsunomiya H, Ma PX, Langer R, Broelsch CE,
Vacanti JP (1998) Formation of spheroidal aggregates of hepatocytes on biodegradable
polymers under continuous flow bioreactor conditions. Journal of Pediatric Surgery 8, 195-199.
Service RF (2000) Tissue engineers build new bone. Science 289, 1498-1500.
Shinji T, Koide N, Tsuji T (1988) Glycosaminoglycans partially substitute for
proteoglycans in spheroid formation of adult rat hepatocytes in primary culture. Cell Structure &
Function 13, 179-188.
Takezawa T, Mori Y, Yonaha T, Yoshizato К (1993) Characterization of morphology and
cellular metabolism during the spheroid formation by fibroblasts. Experimental Cell
Research 208, 430-441.
Yamada K, Kamihira M, Hamamoto R, Iijima S (1998) Efficient induction of hepatocyte
spheroids in a suspension culture using a water-soluble synthetic polymer as an
artificial matrix. Journal of Biochemistry 123, 1017-1023.
Yoon Y, Oh C, Kim D, Lee Y, Park J, Huh T, Kang S, Chun J (2000) Epidermal growth
factor negatively regulates chondrogenesis of mesenchymal cells by modulating the
protein kinase C-?, Erk-1, and p38 МАРК signaling pathways. Journal of Biological
Chemistry 275(16) 12353-12359.
Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz HP,
Hedrick MH (2001) Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cellbased therapies. Tissue Engineering 7(2) 211-228.
Формула изобретени 1. Способ получени живой организации клеток, подобной ткани, то есть культуры
макромассы, включающей трехмерные конструкции подобные ткани, без помощи каркаса
или чужеродного матрикса, предусматривающий:
систему культивировани , в которой клетки высевают с высокой плотностью на единицу
площади сосуда дл культ
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
1 784 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа