close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент РФ 2335540

код для вставки
РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
RU
(19)
(11)
2 335 540
(13)
C1
(51) МПК
C12N 15/00
(2006.01)
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
(21), (22) За вка: 2006145771/13, 25.12.2006
(24) Дата начала отсчета срока действи патента:
25.12.2006
(45) Опубликовано: 10.10.2008 Бюл. № 28
(57) Реферат:
Изобретение
относитс к
области
биотехнологии, в частности к способам получени вакцинных препаратов с помощью методов
генетической
инженерии
и
иммунологии.
Предложена плазмидна ДНК рВМС-nef(A)-hum дл экспрессии белка Nef вируса иммунодефицита
человека субтипа А, содержаща искусственный
ген nef(A)-hum, кодирующий полипептид Nef(A)hum. Изобретение может быть использовано в
медицине и смежных отрасл х дл повышени экспрессии кодируемого геном nef белка Nef или
его фрагментов в эукариотических клетках. 3 ил.,
1 табл.
(56) (продолжение):
progression. Sex Health. 2006 Dec; 3(4):281-6. GILBERT P.B. NOVITSKY V, ESSEX M.Covariability of
selected amino acid positions for HIV type 1 subtypes С and B. AIDS Res Hum Retroviruses. 2005 Dec;
21(12):1016-30.
R U
2 3 3 5 5 4 0
(54) ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBMC-nef(A)-hum
Страница: 1
RU
C 1
C 1
Адрес дл переписки:
193318, Санкт-Петербург, ул. Подвойского, 14,
к.1, кв.741, В.А. Кузнецову
2 3 3 5 5 4 0
(73) Патентообладатель(и):
ФГУП Государственный научноисследовательский институт особо чистых
биопрепаратов ФМБА (RU),
АНО "БИОМЕДИЦИНСКИЙ ЦЕНТР" (RU)
R U
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: RU 2232815 С2, 20.07.2004. RU 2229518
С2, 27.05.2004. AZAD A.A. Novel drugs and
vaccines based on the structure and function
of HIV pathogenic proteins including Nef. Ann
N Y Acad Sci. 2005 Nov; 1056:279-92. TOLSTRUP
M, LAURSEN A.L, GERSTOFT J, PEDERSEN F.S,
OSTERGAARD L, DUCH M.Cysteine 138 mutation
in HIV-1 Nef from patients with delayed disease
(см. прод.)
(72) Автор(ы):
Козлов Андрей Петрович (RU),
Климов Николай Анатольевич (RU),
Мурашев Борис Владимирович (RU),
Духовлинов Иль Владимирович (RU),
Астанина Марина Сергеевна (RU),
Машарский Алексей Эльвинович (RU)
RUSSIAN FEDERATION
RU
(19)
(11)
2 335 540
(13)
C1
(51) Int. Cl.
C12N 15/00
(2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY,
PATENTS AND TRADEMARKS
(12)
ABSTRACT OF INVENTION
(21), (22) Application: 2006145771/13, 25.12.2006
(24) Effective date for property rights: 25.12.2006
(45) Date of publication: 10.10.2008 Bull. 28
Mail address:
193318, Sankt-Peterburg, ul. Podvojskogo, 14,
k.1, kv.741, V.A. Kuznetsovu
(57) Abstract:
FIELD: medicine; biotechnologies.
SUBSTANCE: it is offered a plasmid DNA pBMC nef (A)-hum for an expression of human Nef
protein of immunodeficiency virus of subtype A,
containing an artificial gene nef (A)-hum, coding
polypeptide Nef (A)-hum. The invention can be
used in medicine and allied industries for the
rising of an expression coded by a gene nef of a
Nef protein or its fragments in eucariotic cells.
EFFECT: increase of expression.
3 dwg, 1 tbl, 3 ex
R U
2 3 3 5 5 4 0
C 1
C 1
(54) EXPRESSION PLASMID DNA pBMC - nef (A)-hum
Страница: 2
EN
2 3 3 5 5 4 0
(73) Proprietor(s):
FGUP Gosudarstvennyj nauchnoissledovatel'skij institut osobo chistykh
biopreparatov FMBA (RU),
ANO "BIOMEDITsINSKIJ TsENTR" (RU)
R U
(72) Inventor(s):
Kozlov Andrej Petrovich (RU),
Klimov Nikolaj Anatol'evich (RU),
Murashev Boris Vladimirovich (RU),
Dukhovlinov Il'ja Vladimirovich (RU),
Astanina Marina Sergeevna (RU),
Masharskij Aleksej Ehl'vinovich (RU)
RU 2 335 540 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Изобретение относитс к области биотехнологии, в частности к технологии получени вакцинных препаратов с помощью методов генетической инженерии и иммунологии, и
может быть использовано в медицине и смежных отрасл х дл повышени экспрессии
белков, в частности белка Nef вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) субтипа А
или его фрагментов и синтетических аналогов в эукариотических клетках.
Одной из глобальных проблем, сто щих перед биотехнологией, вл етс повышение
выхода веществ, продуцируемых клетками прокариот и эукариот. Дл решени указанных
задач, как правило, клетки подвергают воздействию различных внешних факторов:
повышению температуры выше 42°С, уменьшению количества питательных веществ,
например фосфатов или азота, до уровн , лежащего ниже того, который требуетс дл выживани микроорганизмов, токсическое воздействие - например, использование
красителей, кислот или эксудатов растений, метаболическое разрушение клеток в
результате изменени уровн содержани ионов, воздействующих на способность
микроорганизмов к осморегул ции, или уровн содержани витаминов или кофакторов,
которые способны вызвать прекращение метаболизма (RU 2179980, 2002).
Однако, т.к. воздействие вышеперечисленных факторов на выход конкретных
продуцентов характеризуетс высокой видоспецифичностью, то дл каждого конкретного
случа необходимо проведение большого объема исследований
Наиболее сложно вопросы стимулировани экспрессии решаютс в случае получени вакцин против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), дл изготовлени которых
необходимо научитьс добиватьс экспрессии вирусных белков в клетках эукариот без
введени вируса, что позволило бы выработать в организме необходимый иммунный ответ.
Проблема св зана с особенност ми последовательностей генов вируса иммунодефицита
человека, в частности с использованием в вирусных генах кодонов, не характерных дл интенсивно экспрессирующихс генов млекопитающих, в частности человека, а также
больша вариабельность вирусной попул ции, выраженна в генетической дивергенции.
Одним из подходов к решению этой проблемы вл етс использование геномов ретровирусов, аденовирусов, папилломавирусов и паповавирусов в качестве стимул торов дл экспрессии протективных антигенов патогенных вирусов в клетках млекопитающих.
Наиболее детально исследовани проводились с использованием вируса осповакцины
(ВОВ). В частности, были сконструированы рекомбинантные ВОВ, экспрессирующие
отдельно индивидуальные белки ВИЧ-1: gp160, gp120. Tat и обратную транскриптазу (Moss
В., and Flexner С.// Ann. Rev. Immunol, 1987, v.5, p.305; Moss В. // Seminars in
Virology, 1992, v.3, p.277; Falkner F.G., et al. // Virology, 1988, v.164, p.450;
Flexner C., et al. // Virology, 1988, v.166, p.339; Takahashi H, et al. // Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1988, v.85, p.3105; Walker B.D., et al. // Science, 1988,
v.240, p.64; Willey R.L., et al. // J.Virol, 1988, v.62, p.139). Полученные
рекомбинантные BOB были использованы дл иммунизации лабораторных животных и
вы влени белков ВИЧ-1, способных вызывать индукцию нейтрализующих вирус антител.
Однако с помощью рекомбинантных ВОВ не удалось индуцировать полноценный
протективный иммунный ответ против ВИЧ-инфекции. По-видимому, это обусловлено
низкой иммуногенностью индивидуальных вирусных белков (RU 2194075, 2002).
Дл решени проблемы получени иммунного ответа на белки ВИЧ был создан белок
TBI, который включает в свой состав несколько клеточных эпитопов ВИЧ-1. Однако при
его использовании не удаетс получить весь спектр целевых продуктов. Кроме того,
степень экспрессии получаемых белков недостаточно высока (RU 2237089, 2005).
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к за вл емому
изобретению вл етс стимулирование экспрессии белка Nef, введением в клетку высших
эукариот экспрессионной плазмидной ДНК pBMC-nef(A)m-1, содержащей
модифицированный ген nef вируса иммунодефицита человека типа 1 субтипа А (RU
2229518, 2002).
Технической задачей, решаемой авторами, вл лось создание экспрессионной
плазмидной ДНК дл экспрессии синтетического белка Nef(A)-hum, позвол ющей повысить
Страница: 3
DE
RU 2 335 540 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
его выход и иммуногенность.
Технический результат был получен при использовании экспрессионной плазмидной
ДНК pBMC-nef(A)-hum, содержащей модифицированный ген nef вируса иммунодефицита
человека типа 1 субтипа А, названный nef(A)m-1, последовательность которого
представлена на фиг.1.
В основу изобретени были положены представлени о том, что в генах вируса имеютс кодоны, в которых преобладает много аденина и тимина и редко встречаютс гуанин и
цитозин, не характерные дл интенсивно экспрессирующихс генов человека. В результате
проведенных авторами исследований было установлено, что при замене в гене nef части А
и Т - богатых кодонов на синонимические G и С - богатые кодоны удаетс в 10-15 раз
повысить выход белка Nef(A)-hum.
Недостатками указанного изобретени вл ютс : относительно невысокий выход
целевого продукта и низка встречаемость некоторых аминокислот синтезируемого белка
Nef(A)-hum в попул ции ВИЧ-1, циркулирующей на территории России.
Согласно насто щему изобретению нова плазмидна ДНК pBMC-nef(A)-hum была
получена по следующей методике.
Был осуществлен анализ кодонов в составе фрагмента гена nef, кодирующего белок Nef
ВИЧ-1 субтипа А. Все кодоны с высоким содержанием аденина и тимина были заменены на
синонимичные кодоны со сниженным содержанием аденина и тимина и соответственно
более высоким содержанием гуанина и цитозина, при этом в состав гена предпочтительно
включали кодоны, характерные дл интенсивно экспрессирующихс генов человека. Кроме
того, в последовательность гена включили последовательность Козака, инициирующий и
два терминирующих трансл цию кодоны. Также были вы влены кодоны, кодирующие
некоторые редко встречаемые аминокислоты в иммунологически важных област х белка
Nef и заменены на кодоны аминокислот, встречающихс чаще в попул ции
инфицированных ВИЧ людей на территории России и стран СНГ. Кроме того, из
последовательности были удалены кодоны, кодирующие первых две NH2-концевые
аминокислоты белка Nef, что делает невозможным его миристелирование, нежелательное
при использовании данного белка в качестве иммуногена. В результате с помощью
автоматизированного химического синтеза был получен искусственный ген nef(A)-hum,
кодирующий синтетический белок Nef(A)-hum, который был вставлен в вектор рВМС с
получением экспрессионной плазмиды pBMC-nef(A)-hum.
Сущность изобретени по сн етс чертежами, на которых представлены:
на фиг.1 - последовательность нуклеотидов гена nef(A)-hum в сравнении с
последовательностью нуклеотидов генапе1(А)m-1 (прототип);
на фиг.2 - последовательность нуклеотидов гена nef(A)-hum в сравнении с
последовательностью нуклеотидов природного гена nef(A);
на фиг.3 - последовательность аминокислот белка Nef(A)-hum в сравнении с
последовательностью аминокислот белка Nef(A) (прототип).
Нуклеотиды и аминокислоты, одинаковые дл представленных генов, отмечены в
сравниваемой последовательности точкой (.), отсутствующие в последовательност х тильдой (~), различающиес - приведены соответствующей буквой, терминирующие кодоны
обозначены (*). Ген nef(A)-hum длиной 627 нуклеотидов отличаетс от прототипа Nef(A)m1 по 104 нуклеотидам и по 175 нуклеотидам отличаетс от природного гена nef(A). Белок
Nef(A)-syn длиной 207 аминокислот отличаетс от прототипа Nef(A) по 9 аминокислотам.
Промышленна применимость за вл емого стимул тора синтеза белка и синтетического
белка иллюстрируетс следующими примерами.
Пример 1. Получение плазмидной ДНК, обеспечивающий экспрессию синтетического
белка Nef(A)-hum с использованием искусственного гена nef(A)-hum.
Искусственный ген nef(A)-hum, последовательность которого представлена на фиг.1,
получали при помощи химического синтеза перекрывающихс фрагментов с последующим
отжигом и лигированием. Собранный ген вставл ли известным способом в плазмидный
вектор рВМС с получением экспрессионной плазмиды pBMC-nef(A)-hum. Полученной
Страница: 4
RU 2 335 540 C1
5
10
15
20
плазмидой pBMC-nef(A)-hum трансформировали клетки Escherichia coli дл ее
последующей наработки.
Пример 2. Изучение синтеза синтетического белка Nef(A)-hum в эукариотических
клетках.
Культуру клеток человека линии 293 трансформировали ДНК рекомбинантной плазмиды
pBMC-nef(A)-hum. В качестве контрол параллельную культуру клеток 293
трансформировали равным количеством ДНК плазмиды pBMC-nef(A)m-1.
Трансформированные культуры клеток инкубировали в питательной среде в течение 48
часов при температуре +37°С и содержании СО2 в воздухе, равном 5%, лизировали и
анализировали белки клеточных лизатов с помощью электрофореза в ПААГ с
последующим иммуноблоттингом с сывороткой пациента, инфицированного ВИЧ-1 субтипа
А. Интенсивность окраски полос, соответствующих белку Nef, анализировали с помощью
компьютизированной видеосистемы. Установлено, что в культуре клеток,
трансформированных плазмидной ДНК pBMC-nef(A)-hum, уровень синтеза белка Nef(A)hum не менее чем 6-8 раз выше, чем синтез белка Nef(A) в клетках, трансформированных
контрольной плазмидой pBMC-nef(A)m-1.
Пример 3. Использование плазмидной ДНК pBMC-nef(A)-hum дл иммунизации.
Лабораторным мышам линии BALB/c вводили внутримышечно трехкратно по 10
микрограмм плазмидной ДНК pBMC-nef(A)-hum, контрольной группе мышей вводили
аналогичную дозу pBMC-nef(A)m-1. Через 6 недель в сыворотках крови животных
определ ли титры антител к природному белку Nef известным способом. Результаты
приведены в таблице.
Таблица
Титры антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных плазмидными ДНК pBMC-RT(A)-hum и pBMC-RT(A)m-1
25
Титры антител при введении ДНК плазмиды pBMC-nef(A)-hum
1:2048
Титры антител при введении ДНК плазмиды pBMC-nef(A)m-1
1:512
Использование за вл емого стимул тора позвол ет в 4-5 раз повысить выход
синтетического белка Nef по сравнению с прототипом.
30
35
Формула изобретени Экспрессионна плазмидна ДНК pBMC-nef(A)-hum дл экспрессии синтетического белка
Nef(A)-hum в клетках эукариот, содержаща экспрессионную плазмидную ДНК,
отличающа с тем, что она содержит искусственный ген nef(A)-hum, имеющий
последовательность нуклеотидов, представленную на фиг.1, и кодирующий полипептид,
последовательность аминокислот которого представлена на фиг.3.
40
45
50
Страница: 5
CL
RU 2 335 540 C1
Страница: 6
DR
RU 2 335 540 C1
Страница: 7
RU 2 335 540 C1
Страница: 8
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
276 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа