close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент РФ 2335543

код для вставки
РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
RU
(19)
(11)
2 335 543
(13)
C2
(51) МПК
C12Q 1/02
(2006.01)
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
(21), (22) За вка: 2006124312/13, 07.07.2006
(72) Автор(ы):
Горленко Михаил Владимирович (RU),
Кожевин Петр Александрович (RU),
Терехов Алексей Сергеевич (RU)
(24) Дата начала отсчета срока действи патента:
07.07.2006
(43) Дата публикации за вки: 20.01.2008
(45) Опубликовано: 10.10.2008 Бюл. № 28
Адрес дл переписки:
119992, Москва, Ленинские горы, владение 1,
стр.77, ООО Экологический центр "Эко-терра"
(54) СПОСОБ МУЛЬТИСУБСТРАТНОГО ТЕСТИРОВАНИЯ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ И ЕГО
2 3 3 5 5 4 3
Последующую инкубацию тест планшетов в
термостатируемой камере до по влени окраски
индикатора,
фотометрическую
регистрацию
интенсивности окраски субстратов с помощью
плашечного
фотометра.
Далее
провод т
математический анализ полученных спектров
потреблени субстратов. Использование метода
недорого и экспрессно позвол ет получить
информацию
об
экологическом
статусе
исследуемого местообитани в течение 48-72
часов. Изобретение может быть использовано в
экологии. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл.
R U
(57) Реферат:
Изобретение
относитс к
области
биотехнологии и экологии. Предложен способ
мультисубстратного тестировани природных
микробных сообществ дл определени типа
местообитани , степени и типа негативного
воздействи неблагопри тных факторов на
почвенные местообитани и оценки качества почв.
Способ предусматривает отбор проб, получение
суспензии почвенного микробного комплекса
внесение суспензии в чейки тест-планшета,
содержащего набор тест-субстратов, минеральную
среду и индикатор потреблени субстратов.
Страница: 1
RU
C 2
C 2
ПРИМЕНЕНИЕ
2 3 3 5 5 4 3
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: BIOLOG reference manual, BIOLOG Ink.,
Hayward, California, 1992; www.biolog.com.
ВИНОГРАДСКИЙ С.Н. Микробилоги почвы. - М.:
Изд-во АН СССР, 1952, 792 с.
R U
(73) Патентообладатель(и):
ООО "Экологический центр "Эко-терра" (RU),
Горленко Михаил Владимирович (RU)
C 2
C 2
2 3 3 5 5 4 3
2 3 3 5 5 4 3
R U
R U
Страница: 2
RUSSIAN FEDERATION
RU
(19)
(11)
2 335 543
(13)
C2
(51) Int. Cl.
C12Q 1/02
(2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY,
PATENTS AND TRADEMARKS
(12)
ABSTRACT OF INVENTION
(21), (22) Application: 2006124312/13, 07.07.2006
(72) Inventor(s):
Gorlenko Mikhail Vladimirovich (RU),
Kozhevin Petr Aleksandrovich (RU),
Terekhov Aleksej Sergeevich (RU)
(24) Effective date for property rights: 07.07.2006
(43) Application published: 20.01.2008
Mail address:
119992, Moskva, Leninskie gory, vladenie 1,
str.77, OOO Ehkologicheskij tsentr "Ehko-terra"
(73) Proprietor(s):
OOO "Ehkologicheskij tsentr "Ehko-terra" (RU),
Gorlenko Mikhail Vladimirovich (RU)
2 3 3 5 5 4 3
R U
(57) Abstract:
FIELD: medicine; biotechnologies; ecology.
SUBSTANCE: method of multisubstrate testing of
natural microbic communities for definition of a
habitat type, degree and type of negative
influence of adverse factors on soil habitats and
estimations of quality of soils is offered. The
method provides sampling, obtaining of suspension
of
a
soil
microbic
complex
(injection
of
suspension
into
cells
of
the
test
tablet
containing a set of test substrates, mineral
medium
and
the
indicator
of
substrate
consumption. The subsequent incubation of the
test of tablets in the thermostatic chamber
before occurrence of colouring of the indicator,
photometric registration of colouring
intensity
of substrates with the help a flatbed photometer
is performed. Further carry out the mathematical
analysis of the received spectra of substrate
consumption. The invention can be used in a
bionomics.
EFFECT: method is cheap and allows quickly
obtain the information on the ecological status
of an investigated habitat.
10 cl, 4 dwg, 1 tbl, 8 ex
Страница: 3
EN
C 2
C 2
APPLICATION
2 3 3 5 5 4 3
(54) METHOD OF MULTISUBSTRATE TESTING OF MICROBIC COMMUNITIES AND ITS
R U
(45) Date of publication: 10.10.2008 Bull. 28
RU 2 335 543 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Использование. Дл объективного, экспрессного, качественного и количественного
определени состо ни природных местообитаний, таких как почва и почвоподобные тела.
Сущность изобретени . Способ осуществл ют путем определени интенсивности
потреблени тестового набора органических моносубстратов исследуемым микробным
сообществом при инкубации в специальных тест-планшетах. Определение производ т
фотометрически с использованием индикатора дегидрогеназной активности (соли
тетразоли ).
Полученный многомерный массив данных вл етс уникальным функциональным
портретом исследуемого микробного объекта, на основании которого можно производить
классификацию сообществ и вычисл ть параметры их функционального биоразнообрази .
Изобретение относитс к экологии, а именно к способам оценки состо ни природных
объектов и окружающей среды. Оно может быть использовано дл простого и относительно
быстрого получени объективной информации об уровне и типе нарушений природной
среды естественными и техногенными физическими, химическими и биологическими
факторами, и общем благополучии таких природных местообитаний как почвы и
почвоподобные тела.
Более полувека известен пр мой метод изучени биоразнообрази микробных
сообществ С.Н.Виноградского (Виноградский С.Н. Микробиологи почвы. М., Изд-во АН
СССР, 1952, 792 с.), вл ющийс идеологическим предшественником системы, а
прототипом вл етс система таксономической дифференциальной диагностики
болезнетворных микроорганизмов BIOLOG (США). В основу алгоритмов анализа и
интерпретации данных положена теори биоразнообрази и методы ранговых
распределений и энтропийного анализа, используемые в общей теории информации.
Современное состо ние проблемы оценки качества окружающей природной среды.
Основными подходами к биологическому мониторингу качества окружающей природной
среды вл ютс использование тест-организмов, либо показателей состо ни природных
экосистем.
1. Использование тест-организмов.
В задачах биомониторинга в качестве тест-объектов служат биологические системы
разных уровней экосистемной иерархии: организмы, попул ции, сообщества.
Традиционным и наиболее удобным с позиций методической стандартизации, но
малоинформативным, а иногда и просто не адекватным поставленным задачам и
преследуемым цел м, служит использование совокупностей относительно одинаковых
тест-организмов в услови х лабораторных экспериментов (Терехова В.А. Биотестирование
как метод определени класса опасности отходов // Экологи и промышленность России,
2003, №12. С.27-29.) по тестированию проб из окружающей среды (сценедесмус, дафни ),
либо в природных экосистемах (так называемые индикаторные виды). Недостатки этого
подхода заключаютс в том, что получаема информаци о качестве среды оцениваетс с
позиций только одной попул ции, со всеми ее особенност ми. В св зи с этим возникают
артефакты, когда тест-организмы используютс дл оценки качества среды, изначально
непригодной дл их существовани (особенно в лабораторных опытах). В то же врем ,
очевидно, что допустимые уровни и эффекты как простых, так и комплексных техногенных
факторов следует оценивать с позиций другого уровн организации живых систем:
индигенных сообществ. Это подразумевает необходимость использовани сообществ в
качестве индикаторов (биосенсоров) допустимых уровней того или иного воздействи .
2. Использование показателей состо ни сообществ.
Этот подход предполагает измерение структурных или функциональных параметров
экосистемы с целью оценки качества среды и, одновременно, степени деградации
сообщества под вли нием тех или иных факторов. Изначально в основе подхода лежала
концепци , постулирующа пр мую св зь между качеством среды и структурным
разнообразием экологических сообществ. Впоследствии она была модифицирована в
теорию оптимального биоразнообрази . Дл оценки и содержательной интерпретации
данных, отражающих состо ние сообществ, в мировой практике используютс методы
Страница: 4
DE
RU 2 335 543 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
многомерной статистики, теории информации, в особенности, анализ ранговых
распределений. Таким образом, сообщество выступает в роли многомерного биосенсора,
используемого как дл самодиагностики, так и дл оценки качества среды дл человека.
При этом микробные сообщества, в силу их масштабов, высокого метаболического
разнообрази , быстроты реакций на изменение условий среды и ключевой роли в
поддержании динамической стабильности экосистем вл ютс оптимальными дл решени этих задач. Качество любого сенсора определ етс его чувствительностью и
селективностью. По этим позици м сообщество превосходит любую попул цию, однако
обсто тельством, определ ющим эффективность применени сообщества как биосенсора,
вл етс тип получаемой информации и методы ее анализа. В современной экологии
единственным оптимальным подходом выступает использование многомерных
показателей тест-объекта, подвергаемых сравнительному анализу относительно эталонов
нормы и тест-объектов, испытывающих модельное воздействие в разной степени в
модельных острых и хронических опытах (В.К.Шитиков, Г.С.Розенберг, Т.Д.Зинченко.
Количественна гидроэкологи : методы системной идентификации // Толь тти 2003: Иэвб
Ран, 2003. - 463 с.). Традиционным направлением в использовании структурных
характеристик сообществ в задачах мониторинга вл етс изучение видового
биоразнообрази . Положительным аспектом данного подхода вл етс , на первый взгл д,
относительна простота содержательной интерпретации первичных данных, особенно если
биологи видов сообщества хорошо изучена. Однако получение информации о структуре
сообщества обычно представл ет собой весьма трудоемкую задачу. Кроме того, в силу
феномена дублировани ключевых экосистемных функций видами с существенно разной
биологией, структурную информацию иногда невозможно интерпретировать с точки зрени оптимальности (нормальности) функционировани сообщества в составе экосистемы
более высокого уровн . В св зи с этим получил развитие подход к оценке состо ни экосистем и качества окружающей среды на основе базовых функций сообщества.
До создани эффективных методов анализа многомерных данных в качестве таких
функций рассматривали эмиссию биогенных газов, отражающих интегральные
биологические функции экосистемы: дыхание, денитрификацию, фиксацию азота из
атмосферы. Другой подход был основан на измерении скорости разложени тех или иных
биополимеров, чаще всего целлюлозы и крахмала. Однако эти методы, в силу аддитивного
характера отслеживаемых параметров и функционального дублировани определ ющих их
процессов, не обладали ни достаточной чувствительностью и информативностью, ни
селективностью, а также не позвол ли св зать ригидность или лабильность
отслеживаемых характеристик системы со степенью ее структурно-функциональной
трансформации и качеством среды с точки зрени ненарушенных сообществ и человека.
Преодоление этих проблем достижимо путем использовани достаточно широкого
спектра характеристик (специфично метаболизируемых субстратов), что позвол ет, с
использованием адекватных методов обработки первичной информации обеспечить и
селективность, и чувствительность. Практическое осуществление этого подхода
относительно просто: необходимо обеспечить стандартное измерение интенсивности
потреблени различных субстратов сообществом либо его репрезентативной частью. Этот
подход практически реализован в системе «BIOLOG» (США) (BIOLOG reference manual,
BIOLOG Ink., Hayward, California, 1992; www.biolog.com), изначально созданной дл дифференциальной диагностики патогенных микроорганизмов и впоследствии успешно
использованной дл содержательной дифференциации микробных сообществ природных
экосистем, испытывающих различные виды техногенного воздействи разной
интенсивности.
Недостатки применени этого подхода св заны с конструктивно-методическими
особенност ми системы «BIOLOG» и концептуальными недостатками ее применени :
использованием в качестве элементарных тестов слишком сложных субстратов,
применение избыточно широкой батареи тестов, тривиальность методов анализа данных,
отсутствие глубокой теоретической проработки методологического подхода и
Страница: 5
RU 2 335 543 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
содержательной интерпретации данных. Эти недостатки в большей или меньшей степени
преодолены в предлагаемой системе мультисубстратного тестировани «Эко-Лог».
Цели изобретени .
1. Разработка экспрессного и информативного метода количественного и качественного
описани функционального биоразнообрази микробных сообществ на основе методики
фотометрического определени интенсивности потреблени тест-субстратов испытуемым
микробным объектом.
2. Скрининг и мониторинг состо ни и качества почв и почвоподобных тел и
установление объективного контрол за общим уровнем техногенного загр знени в любой
точке местности на обширных территори х на основании мультисубстратного тестровани почвенных естественных микробных сообществ. Вы вление неблагополучных участков с
последующим определением в них традиционными физико-химическими методами
токсичных фракций и отдельных токсикантов.
3. Разработка системы параметров, позвол ющих количественно оценить благополучие
местообитани на основании данных о потреблении субстратов естественным микробным
сообществом.
4. Определение «красной черты» - пороговой интенсивности того или иного
воздействи , привод щего к необратимому нарушению системы дл конкретного
местообитани , и св занный с этим пересмотр существующей концепции экологических
стандартов и системы ПДК. Переход от общих универсальных - к локальным ПДК,
получаемых экспериментальным путем непосредственно дл каждого местообитани и
загр знител ).
Поставленные цели достигаютс использованием многомерных параметров
функционировани микробных сообществ исследуемых местообитаний - спектров
потреблени этими сообществами органических субстратов. Используемые параметры
складываютс из специфичных элементарных признаков, что определ ет высокую
разрешающую способность и, вместе с тем, помехоустойчивость данного способа. Анализ
данных при помощи адекватных методов снижени их размерности и классификации
позвол ет решать задачи дифференциальной диагностики и оценки качества природных и
искусственных экосистем по результатам сравнени с эталоном нормы, либо по
абсолютным информационно-энтропийным показател м ранговых распределений спектра
потреблени субстратов микробного сообщества, что более удобно в практике. Дл получени необходимой информации (спектров потреблени субстратов, СПС) создан
программно-аппаратный комплекс, включающий планшеты с набором тест-субстратов,
компьютеризованную систему считывани и анализа получаемой информации «Эко-Лог», а
также соответствующие методические алгоритмы отбора и анализа проб из объектов
окружающей среды.
Оптимальный количественный мониторинг «здоровь » природных местообитаний
достигаютс использованием технологии «Эко-Лог» с обработкой полученных спектров
потреблени субстратов на основе концепции биоразнообрази , с анализом данных в
рамках специальных моделей ранговых распределений.
Способ мультисубстратного тестировани Способ мультисубстратного тестировани микробных сообществ осуществл ли
следующим образом (методика проведени анализа почв соответствует свидетельству об
аттестации МВИ №13-06 «Методика выполнени измерений интенсивности потреблени тест-субстратов микробным сообществом почв и почвоподобных объектов
фотометрическим методом»).
Пробы почвы отбираютс почвенным микробуром, из расчета 10 субпроб с 1 м 2.
Образец дл МСТ должен быть представлен репрезентативной смешанной почвенной
пробой. Дл этого с помощью карманного почвенного бура отбирают случайным образом
10 проб объемом 1 см 3 с 1 м 2 и получают рандомизированную пробу, из которой дл анализа беретс 1 г почвы. Образцы до анализа могут хранитьс 3 мес в холодильнике, в
состо нии естественной влажности или в воздушно-сухом состо нии. Однако при этом
Страница: 6
RU 2 335 543 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
образцы контрольной и сравниваемой с ней групп должны перед анализом хранитьс в
одинаковых услови х и одно и то же врем . Оптимальным вл етс анализ
свежеотобранных образцов
В стаканчик с навеской почвы помещают 100 мл фосфатного буфера (рН 6,5). После
этого содержимое стаканчика обрабатываетс ультразвуком (УЗДН-1, 22 кГц, 0,04 А, 30
секунд). Столь же эффективной вл етс , по нашим данным, предварительна подготовка
на лабораторном встр хивателе типа «ВОРТЭКС» (3400 об/мин, 1.5 мин). Затем следует
отобрать из полученной суспензии около 40 мл в центрифужные пробирки и
отцентрифугировать (ЦУМ-8, 2000 об/мин, 2 минуты).
Отобрать 20 мл супернатанта в кювету дозатора (или крышку чашки Петри) и добавить 2
мл раствора ТТБ. Тщательно перемешать полученную суспензию покачиванием кюветы и
2-3 циклами «набор-выливание» многоканальным дозатором типа ППМ-8.
Раскапать в чашку «Эко-Лог», содержащую набор тест-субстратов (см. таблицу),
содержимое кюветы дозатором ППМ-8 с одноразовыми сменными наконечниками,
установленным на розлив 200 мкл. После раскапывани образца заполненную чашку
накрыть крышкой и инкубировать в термостате при t=+28°С.
Планшеты с суспензи ми инкубируют до по влени визуально регистрируемой окраски
чеек от 12 до 72 часов, в зависимости от особенностей образца и целей исследовани .
В течение инкубационного периода происходит развитие микроорганизмов в чейках с
восстановлением трифенилтетразоли в формазан, придающий среде в чейке красное
окрашивание. Концентраци формазана и обусловленна им оптическа плотность чейки
определ ютс обилием и активностью микроорганизмов. Массив данных фотометрического
измерени значений оптической плотности по всем чейкам (всем субстратам)
представл ет собой спектр потреблени субстратов (СПС) дл данного почвенного
микробного комплекса.
После окончани инкубации осуществл етс регистраци данных МСТ программноаппаратным комплексом «Эко-Лог» (фиг.1).
Считывание происходит автоматически и не требует квалифицированного персонала.
Оптическа плотность чеек чашки измер етс с использованием чашечного
спектрофотометра (анализатора иммуноферментных реакций «Униплан») или
слайдсканера (в зависимости от модификации ПО) диапазоне 510 нм, считываетс и
сохран етс программой «Эко-Лог» в виде файла базы данных формата mdb. При этом
интенсивность потреблени субстратов (окраска каждой чейки) представлена значением в
диапазоне от 0 до 3000. Сохран етс также название образца, его пор дковый номер и
врем измерени . При анализе СПС программное обеспечение «Эко-Лог» автоматически
вычисл ет параметры биоразнообрази и коэффициенты ранговых распределений
спектров потреблени субстратов.
Суть этого, достаточно широко используемого в экологии и других науках, подхода
заключаетс в том, что параметры системы, ранжированные по интенсивности про влени тех или иных свойств от большего к меньшему, аппроксимируютс кривыми модельных
уравнений, коэффициенты которых вл ютс информационными (биоразнообразие) или
энергетическими (своеобразный термометр системы) характеристиками системы
(Пузаченко Ю.Г. Методологические основы географического прогноза и охраны среды. М.:
изд-во УРАО, 1998. - 212 с.). Сравнение этих индексов позвол ет ранжировать системы
по степени их стабильности и сложности вне зависимости от их типа и генезиса.
Коэффициенты ранговых распределений абсолютны, т.е. позвол ют сравнивать разные,
семантически непохожие друг на друга системы. Использование в МСТ классического
(лингвистика) распределени Ципфа f(n)=kB n не всегда приводило к удовлетворительному
описанию микробных сообществ. Поэтому нами была составлена оригинальна трехпараметрическа модель рангового распределени потреблени субстратов
почвенным микробным сообществом почв (фиг.2):
, где n=ln(N), N - номер ранга; F(n)=ln(yN);
yN - интенсивность потреблени субстрата ранга N; е - основание натурального
Страница: 7
RU 2 335 543 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
логарифма; Е0, b, d - параметры. В интересующей нас области значений (положительные
значени n и F(n)) параметры модели могут трактоватьс следующим
образом. Е0 описывает запас энергии системы (среднее потребление субстратов), d крутизна хвоста распределени (адаптационный индекс-критерий гибкости и устойчивости
системы), b - в интересующем нас месте координатной плоскости - ширина плато,
описывающа информационное разнообразие распределени : отношение стационарной
(старшие ранги-доминанты) и динамической частей системы (младшие ранги, редкие
классы) или же с позиций кинетики - отношение быстрых/медленных функциональных
компонентов.
В изученных нами микробных системах наиболее информативным оказалс коэффициент d, отражающий стабильность сообщества. Варьиру в изученных нами
природных и модельных системах от 0.01 до 1.7, он позвол ет оценить благополучие и
стабильность микробных сообществ. На основании экспериментов можно ввести
следующую шкалу: в благополучных избыточных системах, имеющих максимальный запас
прочности, d принимает значени от 0.01 до 0.1; в устойчивых стабильных системах от
0.1 до 0.4; системам с истощенными ресурсами или наход щимс под обратимым
воздействием какого-либо нарушающего фактора характерны значени d от 0.4 до 0.8;
кризисным дестабилизированным системам соответствуют значени 0.8-1; значени >1
характерны дл необратимо нарушенных систем, потер вших исходную функциональную
целостность. Ранее в экологии трехпараметрические модели ранговых распределений не
примен лись. Находитс и мера отклонени реального распределени от модельного
(энтропи Кульбака),
HK=-?pi(logpi/hi),
где pi - веро тность i-го класса дл реального распределени , hi - дл равновесного,
котора вл етс также мерой неравновесности системы. Вычисл етс так же массив
параметров функционального биоразнообрази , наиболее употребительными из которых
вл ютс число потребленных субстратов, обща Н=-?pi(logpi) и удельна (R=Н/logК)
энтропии (Индекс Шеннона и выравненнность в экологии), количество потребленных
субстратов, средн интенсивность потреблени субстратов, трактуема как удельна метаболическа работа сообщества.
Дл качественной идентификации типа системы проводитс кластерный анализ (квадрат
Эвклидова рассто ни - кластеризаци по Варду) дл поиска наиболее близкого эталона.
При необходимости вычислени интенсивности известного воздействи используют
нейросетевые модели св зи интенсивности потреблени субстратов и силы воздействи ,
построенные в процессе предварительных модельных экспериментов.
ПРИМЕР 1. Оценка функционального биоразнообрази дл микробиологического
мониторинга загр знени почвы синтетическими моющими средствами (CMC).
В работе использовались образцы дерново-подзолистой почвы (Московска область),
отобранные из гумусового горизонта. Почва была освобождена от крупных растительных
остатков и просе на через сито диаметром 5 мм, высушена до воздушно-сухого состо ни .
В качестве загр зн ющего вещества использовалось порошкообразное CMC - «Порошок
обычный». Почвенные навески массой 120 г увлажн лись до 30% растворами CMC в
следующих концентраци х: 0,0008, 0,004, 0,01, 0,02, 0,05 и 0,1 г/г почвы и
инкубировались в полиэтиленовых контейнерах при посто нной влажности и комнатной
температуре в течение 8 суток. Контролем служила почва без внесени CMC. Было
проведено МСТ согласно вышеописанной процедуре.
Обработка результатов МСТ проводилась в несколько этапов - от простого к сложному.
На начальной стадии оценивалось количество потребленных субстратов и
интенсивность их потреблени . Резкое снижение анализируемых показателей наблюдаетс дл концентраций 0,05 и 0,1 г/г почвы, которые наиболее негативно повли ли на
сообщество. Токсичность здесь настолько велика, что выживают лишь микроорганизмы,
наиболее резистентные к данному уровню воздействи . Компенсационные процессы
практически отсутствуют. Контрольный образец также характеризуетс довольно низкими
Страница: 8
RU 2 335 543 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
значени ми исследуемых показателей; это объ сн етс малым количеством активных
микроорганизмов, вследствие недостаточного количества источников углерода и энергии в
исследуемой почве (инкубаци происходила без добавлени глюкозы или других
питательных субстратов). Концентраци 0,0008 г/г вызвала некоторую стимул цию
развити сообщества. Резкий рост биоразнообрази мы видим при концентраци х 0,0040,02 г/г почвы; это свидетельствует о том, что содержащиес в почве ПАВ выступают в
роли субстрата, запускают сукцессию и вызывают бурное развитие попул ций, способных
использовать их в качестве источников углерода. Концентраци 0,02 г/г, по всей
видимости, не оказывают сильного токсичного действи на естественное микробное
сообщество и позвол ют развиватьс попул ци м-деструкторам. Происходит
функциональна перестройка сообщества с целью разложени ПАВ, вход щих в состав
CMC.
К аналогичным выводам мы приходим и на основании результатов кластерного анализа.
С его помощью мы классифицировали состо ни микробного сообщества при различных
уровн х нагрузки. Образцы оказались сгруппированы в три крупных кластера: группа
образцов в диапазоне концентраций 0,01-0,02 г/г почвы, представл ющих сообщество с
активным потреблением ПАВ, группа, включающа контрольный образец и концентрации
0,0008 и 0.04, группа экстремальных концентраций 0,05-0,1 г/г почвы, что
соответствует существованию трех функционально-различных систем. Взаимное сходство
между группой образцов с экстремальной концентрацией загр зн ющего вещества и
контрольными вариантами объ сн етс ингибирующим действием этих концентраций,
«прореживающих» контрольный спектр, но не добавл ющих новых компонентов, как в
вариантах с низкими концентраци ми. Объедин все результаты анализа данных,
выдел ем два уровн воздействи поллютанта, вызывающих качественную перестройку
микробной системы: 0,004 и 0,05 г/г почвы. Втора критическа концентраци , однако,
вызывает более сильные изменени , так как практически полностью подавл ет протекание
компенсационных процессов. Сн тие данной нагрузки вр д ли уже позволит системе
вернутьс в исходное состо ние.
Отметим, что подходы, использованные на начальных этапах обработки полученных
данных (обща характеристика спектров, кластерный анализ), не вл ютс достаточными
при проведении мониторинга, так как на их основе невозможно определить универсальный
критерий дл оценки предельно допустимого уровн внешнего воздействи .
Метод ранговых распределений позволил нам с помощью МСТ количественно оценить
изменени , произошедшие в микробной системе под воздействием поллютанта, и
определить абсолютную величину предельного уровн воздействи CMC. Метод ранговых
распределений дл МСТ не примен лс , однако вполне успешно примен етс в общей
экологии (Левич А.П. Структура экологических сообществ. М., МГУ, 1980, 181 с.). В
основе метода - следстви гипотезы равновеси , св занной с теорией термостатики и
неравновесной термодинамики. Допустим, имеетс множество элементов N некоторой
природной системы и пространство свойств m (g1, g2, ..., gm). Множество N в пространстве
свойств m отображаетс в классы К (1, 2, ..., i...k) с числом элементов в классе Ni и
веро тностью попадани элемента в соответствующий класс рi=Ni/N, ?pi=1. Разбиение по
рангам может быть осуществлено различными способами. Если подразумеваетс , что
члены нашего множества взаимодействуют друг с другом, (в частности возникают их
устойчивые комбинации), то это равноценно тому, что они осуществл ют
самоклассификацию, пробега все i возможных классов разбиени . Под разнообразием же
понимаетс множество различимых состо ний или классов природного объекта (системы),
отображающее возможные взаимодействи между его элементами. Оценкой разнообрази вл етс энтропи H=-?pi(logpi). Описываетс ранговое распределение модельными
кривыми, обычно это нелинейные функции, которые используют два параметра. Из них
один - это крутизна распределени (LP=-?logp(i)) показывает информативность системы
(минимальна информативность системы будет в том случае, когда все классы содержат
одинаковое количество элементов, т.е. когда потер ны редкие классы). Второй
Страница: 9
RU 2 335 543 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
параметр - энерги системы (E=?p(i)i). На основании определенных теоретических
представлений выводитс модель равновесного рангового распределени . Дл равновесного состо ни принимаетс , что производные по любой переменной равны нулю,
как и производные, отражающие переход элементов из одного класса в другой.
Разнообразие (энтропи ) равновесной системы, крутизна и энерги равновесного
распределени должны быть максимальны. Дл того же, чтобы оценить степень
неравновесности реальной исследуемой системы, нужно сравнить реальное
распределение с равновесным и измерить степень отклонени . Мерой сравнени может
служить энтропи Кульбака:
HK=-?pi(logpi/hi),
где pi - веро тность i-го класса дл реального распределени , hi - дл равновесного,
либо ? 2=N?((hi-pi)/pi). Кроме этих параметров можно рассмотреть выравненность системы
(R=H/logK) - при равном числе элементов равна 1, резкое снижение данного показател свидетельствует о выраженном доминировании некоторых классов. Все эти показатели
позвол ют охарактеризовать состо ние системы, включа определение универсальной
оценки предельного уровн воздействи . При значении параметра, отражающего крутизну
распределени , равном единице, распределение трансформируетс в пр мую линию, а
прежн система фактически прекращает свое существование.
Существует несколько канонических форм ранговых распределений. В нашей работе
было использовано оригинальное ранговое распределение, адаптированное дл анализа
данных МСТ: провод МСТ, мы получаем ранговое распределение элементов
исследуемого микробного сообщества по интенсивност м потреблени 47-ми различных
субстратов. Уравнение, описывающее распределение у=у0+(-В)?е x?D (-x), где у0 - константа.
В и D - параметры распределени отражающие энергию системы и крутизну
распределени , соответственно. Значение D=1, будем считать критическим (см.
вышеописанное). Исследу динамику значений этого и других параметров
функционального разнообрази при различных уровн х воздействи , мы смогли
определить предельно допустимую дл функционировани микробного сообщества
концентрацию CMC.
Наибольшие значени коэфициэнта D, позвол ющие оценить нестабильность системы,
а следовательно, и наибольшее отклонение от равновесности системы, вызвали
концентрации 0,05 и 0,1 г/г почвы. Микробное сообщество контрольного образца,
вследствие специфичного времени отбора проб, тоже достаточно далеко от равновесного.
Наибольшее стабилизирующее действие наблюдаетс дл концентрации 0,0008 г/г.
Образцы с концентраци ми 0,004-0,02 г/г почвы занимают некоторое промежуточное
состо ние.
ПРИМЕР 2. Микробиологическое картирование почв
Эффективность метода МСТ показана на примере получени микробиологической карты
дл сельскохоз йственной практики. Нами была составлена дл ЗАО "Красненское"
(Белгородска обл.) микробиологическа карта почв этого хоз йства. По всей видимости,
такой подход реализован впервые. С изучаемых полей были отобраны смешанные пробы и
проведено МСТ и рассчитаны параметры биоразнообрази согласно вышеописанной
процедуре.
На карте-схеме в пределах почвы одного типа представлены показатели «здоровь »
микробных сообществ, их биоразнообразие Н (Индекс Шеннона) и показатель стабильности
(коэффициент d рангового распределени ). Вс область значени этих параметров дл исследованных территорий разбивалась на 3 части - область высоких, низких и средних
значений. Дл каждого сочетани указанных значений вводилс на карте свой цветовой
код: например высока стабильность и высокое разнообразие - зеленый, низка стабильность и низкое разнообразие - красный, высока стабильность и низкое
разнообразие - синий, и т.д. (фиг.3). Представленные данные позволили провести
бонитировку земель хоз йства, обозначить неблагополучные территории, нуждающиес в
агромелиоративных меропри ти х, подтвердить изменени в функциональных спектрах
Страница: 10
RU 2 335 543 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
почвенных микробных сообществ после применени комплексных микробных удобрений.
Кроме того, эта информаци вл етс базовой дл планируемого долгосрочного
мониторинга почв хоз йства, ориентированного на получение экологически чистой
продукции.
ПРИМЕР 3. Функциональный мониторинг микробных сообществ почв, загр зненных
керосином.
Нами была проведена оценка возможностей применени метода мультисубстратного
тестировани дл характеристики изменений почвенных микробных сообществ,
нарушенных керосином. Дл исследовани загр знени почвы керосином использовались
образцы окультуренной дерново-подзолистой почвы (Московска обл.), отобранные из
гумусного горизонта. Почва была высушена до воздушно-сухого состо ни , освобождена от
крупных растительных остатков и просе на через сито диаметром 5 мм. В качестве
поллютанта использовали керосин осветительный КО - 25 (ГОСТ ТУ 38.401-58-10-90;
плотность - 0,805 г/см 3).
Мониторинг загр знений керосином проводили в модельных экспериментах. Навески
массой 300 г увлажн ли до 30% от массы воздушно-сухой почвы водными эмульси ми
керосина и инкубировали в полиэтиленовых контейнерах при посто нной влажности и
комнатной температуре в течение 25 суток. Исследуемые концентрации керосина - 1, 2, 5
и 10 мл/100 г почвы (каждый вариант в двух повторност х). Контролем служила почва без
внесени поллютанта. На 7-е, 14-е, и 25-е сутки отбирали средние пробы и проводили
МСТ согласно вышеописанной процедуре.
На основании СПС микробных сообществ почвы при разных уровн х нагрузки и на
разных этапах инициированной сукцессии были рассчитаны показатели и индексы
функционального разнообрази , проведен кластерный анализ. Анализ расположени исследуемых образцов в пространстве параметров ранговых распределений позвол ет
сделать заключение о том, что внесение керосина приводит к увеличению числа редких
классов и повышает метаболическую работу сообщества. Это, без сомнени ,
свидетельствует о расширении адаптационных возможностей микробного сообщества и
свидетельствует об интенсификации биоремедиационных процессов, направленных на
компенсацию внешнего воздействи (известно, что наличие именно «редких» классов
обеспечивает высокие адаптационные способности почвенного сообщества
микроорганизмов). Максимальные значени параметров на 7, 14 и 25 сутки инкубировани приход тс на варианты с концентраци ми 2, 5, 5 мл/100 г почвы соответственно. При
этом на 25 сутки разница между контролем и вариантами 1 и 2 мл/100 г почвы
практически нивелируетс . Подобные выводы можно сделать и при анализе параметров
биоразнообрази .
Проведенный кластерный анализ позволил дополнительно классифицировать
микробные сообщества почвы с различными уровн ми нагрузки. На полученных
дендрограммах выдел етс два функционально различных кластера: увеличение
концентрации керосина до 5 мл/100 г почвы не вызывает серьезных качественных
изменений в сообществе загр зненной почвы по сравнению с контролем и соответствует
некоторому оптимальному интервалу существовани сообщества, адаптированного к
деструкции углеводородов.
Дальнейшее увеличение нагрузки вызывает более серьезные изменени и приводит к
формированию качественно иного по функциональным характеристикам сообщества, не
исключа , тем не менее, протекани деструкционных процессов. Суммиру анализ
исследованных показателей, можно прогнозировать снижение концентрации керосина в
почве и восстановление исходной структуры микробного сообщества веро тно на всем
исследуемом диапазоне концентраций. При этом максимальный темп восстановлени ожидаетс в диапазоне концентраций 1-5 мл/100 г почвы; дальнейшее увеличение нагрузки
снижает темпы ремедиации. Это согласуетс с имеющимис в литературе сведени ми о
способности самоочищени почв от керосина даже в случае достаточно высоких
концентраций (до 60% и более).
Страница: 11
RU 2 335 543 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
ПРИМЕР 4. Оценка эффективности деструкции нефтесодержащих отходов
цианобактериальным комплексом.
Дл постановки эксперимента в лабораторных услови х использовали образцы почв,
отобранные в местах складировани нефтесодержащих отходов Астраханского
газоперерабатывающего завода (АГПЗ). Исходное содержание суммарных нефтепродуктов
в отобранных дл постановки эксперимента почвенных образцах, содержащих нефтешлам,
составило 17,4%. Стандартна процедура биотестировани с использованием сценедесмус
позволила отнести данные образцы к 4-5-му классу опасности.
Экспериментальные системы представлены четырьм стекл нными цилиндрами с
нефтезагр зненной почвой (мощность почвенного профил 15 см). Три варианта
инокулированы сухой биомассой циано-бактериального сообщества (10 г на 1 кг почвы).
Суха биомасса была получена путем естественного высушивани и измельчена до
величины частиц не более 0,5 мм. Модельные экосистемы нефтезагр зненной почвы с
целью определени оптимального варианта использовани циано-бактериального
сообщества выдерживали в следующих услови х: 1 - переизбыточное увлажнение
(затопление); 2 - рыхление (культиваци ); 3 - внесение азотно-фосфорно-калийных
удобрений (биогены). Нефтезагр зненна почва без внесени циано-бактериального
сообщества и применени дополнительных агротехнических меропри тий выступала в
качестве контрольного варианта деструкции нефтепродуктов (загр знение). В качестве
эталона сравнени по окончании экспериментальных работ использовали почву,
отобранную на территории АГПЗ и не подверженную пр мому загр знению
нефтесодержащими отходами (контроль). Наблюдение за модельными экосистемами
продолжалось 18 мес цев.
Степень репарации микробных сообществ почвы под воздействием цианобактериального сообщества и комплекса дополнительных агротехнических приемов
оценивали методом мультисубстратного тестировани (МСТ) с помощью
автоматизированной системы микробиологического мониторинга «Эко-Лог» и
биотестировани с использованием в качестве тест-организмов дафний и сценедесмус.
Полученный массив данных исследовалс методами многомерной статистики. Массив
данных был разделен на группы путем кластерного анализа (квадрат эвклидова
рассто ни , кластеризаци по Варду). Проведена оценка индексов функционального
биоразнообрази и индексов стабильности микробных системы на основе анализа
ранговых распределений.
Анализ функциональной структуры микробных сообществ изученных модельных
экосистем по окончании экспозиции методом кластерного анализа позвол ет выделить две
группы. Одна группа объедин ет в себ образцы контрольной почвы и вариант с
добавлением биогенов. Друга группа включает вариант загр зненной нефтепродуктами
модельной системы и остальные варианты ремедиации. Таким образом, мы сталкиваемс с двум качественно непохожими друг на друга классами систем - нормальной почвенной
системой и загр зненной.
Анализ параметров стабильности системы и запаса энергии системы, вытекающих из
оценки ранговых распределений, позвол ет соотнести образцы исследуемых почв.
Очевидно, что образцы с максимальным запасом энергии и максимальной стабильностью
будут наиболее благополучными. Таким параметрам удовлетвор ет вариант контрол . Он
характеризуетс также максимальной выравненностью и высоким биоразнообразием.
Концентраци остаточных углеводородов в нем составл ет 6,0%. Осуществление
процедуры биотестировани позволило отнести данную пробу к 5-му классу опасности.
Высокой стабильностью, хот и меньшим запасом энергии системы обладает также и
вариант нефтезагр зненной почвы по окончании экспозиции. Концентраци остаточных
углеводородов в нем составл ет 6,9%, 5-й класс опасности. Отмечаетс некоторое
повышение биоразнообрази сообщества и снижение его выровненности. Это кажущеес противоречие легко объ снимо, если прин ть во внимание тот факт, что загр знение
приводит к трансформации естественного природного сообщества почвенных
Страница: 12
RU 2 335 543 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
микроорганизмов, функцией которого вл етс разложение опада, осуществление
глобального цикла углерода и поддержание плодороди в новое сообщество, целевой
функцией которого вл етс разложение углеводородов. При этом при наличии субстрата
(углеводородов) такое сообщество целостно и стабильно, как и люба естественна саморегулирующа с система.
Вариант биоремедиации с добавлением биогенных элементов вл етс оптимальным
среди других вариантов, характеризу сь параметрами запаса энергии и стабильности
системы, наиболее близкими к контрольному варианту. Именно этот вариант ремедиации,
согласно результатам кластерного анализа, и возвращает систему к естественному
функционированию. Концентраци остаточных углеводородов в нем составл ет всего 2,2%,
класс опасности 5-й. Он отличаетс наиболее высоким биоразнообразием и сниженной
выравненностью, что объ сн етс расширенными функциональными возможност ми и
выраженной целевой направленностью сообщества, которое нар ду с общебиосферными
функци ми осуществл ет интенсивное разложение углеводородов.
Остальные варианты биоремедиации вл ютс менее приемлемыми и оптимальными с
точки зрени стабильности и энергетики системы. Они привод т к существенному
понижению параметров биоразнообрази и не могут качественно изменить систему,
вернуть ее к нормальному режиму функционировани .
ПРИМЕР 5. Нефт ное загр знение.
В августе 2003 г. были проведены полевые работы на территории нефт ного
месторождени (Томска обл.). В пределах исследуемого района (Чижапка-Васюганский
почвенно-географический район по Непр хину) на территории месторождени распространены подзолистые, болотно-подзолистые, болотные (верховые, низинные и
переходные), аллювиально-болотные, аллювиально-дерновые, а также дерново-глеевые
почвы. 70% территории занимают почвы автоморфного и полугидроморфного р да.
Описано состо ние почвенно-растительного покрова п ти ключевых участков, включающих
рекультивированные, отсыпанные песком и самовосстанавливающиес участки. Была
оценена степень нарушенности участков, их замазученность и вторична обводненность.
Образцы почвенных горизонтов и слоев были проанализированы с помощью
мультисубстратного тестировани согласно стандартной схеме.
Кластерный анализ позволил выделить группы почвенных субстратов, сходных по типам
функционировани микробного сообщества. Выдел ютс две крупных группы: группа
органогенных субстратов и группа минеральных субстратов. Группа субстратов
органических горизонтов достаточно однородна. Внутри группы минеральных слоев и
горизонтов выдел етс две подгруппы: подгруппа субстратов, в большинстве которых
содержание нефтепродуктов (НП) превышает ПДК, а также втора подгруппа, содержание
НП в субстратах которой находитс в пределах ПДК. Сравнение результатов кластерного
анализа и данных по содержанию нефти в анализируемых субстратах подтверждает
информативность примен емого метода и возможность его использовани дл решени поставленной задачи.
На основании полученных спектров потреблени субстратов система «Эко-Лог»
рассчитала параметры функционального биоразнообрази и коэффициенты ранговых
распределений - критерии нагрузки на экосистемы. Хорошо вы вл ютс различи между
образцами по степени нарушенности. Выдел етс зона (благополучных местообитаний а
также зона нарушенных местообитаний. В серии благополучных местообитаний наход тс образцы горизонтов фоновых участков, верхних органогенных горизонтов нарушенных
участков с развитой растительностью. Остальные образцы характеризуютс той или иной
степенью нарушенности.
Характеризу образцы по их расположению в пространстве признаков функционального
разнообрази (индекс Шеннона и выровненность), можно отметить сходные тенденции.
Наиболее нарушенные образцы характеризуютс низким функциональным разнообразием
и выровненностью сообществ почвенных микроорганизмов.
Дл простоты трактовки результатов был применен подход, в котором область значений
Страница: 13
RU 2 335 543 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
всех важных дл мониторинга параметров разбиваетс на 5 равных областей. Далее эти
параметры выражаютс в баллах по степени увеличени нарушени от 0 до 4.
На их основе рассчитан интегральный балл нарушени функционального разнообрази исследованных местообитаний, по которому были ранжированы образцы. Он варьируетс от 0 до 16. Максимальный балл соответствует максимальной степени нарушени микробного сообщества и подавлени биоразнообрази . Выделены группы: от 0 до 6 хорошее и удовлетворительное состо ние сообщества микроорганизмов, от 7 до 11 неудовлетворительное, выше 11 - критическое состо ние субстрата. В
неудовлетворительную и критическую группы попали образцы слоев и почвенных
горизонтов, в которых наблюдаетс значительное превышение ПДК по нефтепродуктам.
Вместе с тем, в вариантах с максимальным превышением содержани НП в органогенных
горизонтах отмечен феномен стабилизации микробного сообщества и повышение его
функционального разнообрази . Как уже отмечалось, это ненарушенные механически,
самозарастающие участки. В них сохранились признаки существовавших доаварийных
разливов почв и фитоценозов. Веро тно тут довольно быстро сформировалось новое
микробное сообщество, устойчивое к повышенной концентрации НП и, возможно,
способное к ее утилизации. Подобный феномен уже отмечалс в предыдущих
исследовани х. В насыпных субстратах подобной картины не наблюдаетс . Некоторые
образцы фоновых почв характеризуютс повышенной степенью нарушенности
функционального разнообрази микробных сообществ, но они относ тс к глубинным
горизонтам почв, которые исходно обеднены микрофлорой.
Найдена сильна коррел ци (r=0,85) дл органогенных горизонтов (подстилок и
дерновых горизонтов) между логарифмом содержани НП и потреблением цистеина, что
предполагает возможность в дальнейшем определ ть количественно содержание НП на
основании данных МСТ.
Во всех новосформированных путем захоронени песком почвах наблюдаетс пониженна концентраци НП в органогенных горизонтах и превышение допустимых норм
содержани НП в большинстве минеральных слоев, что коррелирует с данными МСТ.
В самозарастающих после нефт ных разливов, но не засыпанных дерново-глеевых
почвах формируетс хорошее трав ное сообщество, а также отмечаетс стабилизаци функциональной де тельности микробного сообщества по МСТ, несмотр на значительные
превышени ПДК нефтепродуктов.
ПРИМЕР 6. Мониторинг загр знени свинцом
Свинец вл етс распространенным поллютантом. Как и другие т желые металлы,
свинец обладает общетоксическим и ингибирующим действием и не имеет субстратного
эффекта. Был проведен мониторинг воздействи свинецсодержащих выбросов из трубы
завода (Гродно, Белорусси ) на качество почв территорий, подверженных воздействию
загр знени . Образцы отбирались по градиенту концентрации. На основании данных МСТ
вышеописанным методом были рассчитаны параметры рангового распределени . В
качестве контрол было вз то фоновое местообитание в парковой зоне, не подверженное
воздействию выбросов и не превышающее предельно допустимые концентрации по
содержанию свинца. В пространстве коэффициентов ранговых распределений образцы
формируют четкий тренд. По мере удалени от источника загр знени качество
исследованных почвенных местообитаний значительно улучшаетс . Наилучшее качество
почвы отмечено в контрольном варианте, не подверженном токсическому действию свинца,
что выражаетс в низких значени х коэффициентов ранговых распределений. Следует
отметить, что даже в наиболее загр зненном варианте, отобранном с территории
предпри ти непосредственно около трубы, не было зарегистрировано критических
значений коэффициента d>1, свидетельствующих о достижении «красной черты». Таким
образом, можно заключить, что в исследуемом диапазоне естественна физиологическа предельно допустима концентраци не достигнута и воздействие свинца на почвенное
микробное сообщество нефатально. Самовосстановление системы представл етс возможным. Приведенный пример иллюстрирует удобство и простоту оценки экологических
Страница: 14
RU 2 335 543 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
нагрузок на почвенные местообитани с помощью анализа ранговых распределений СПС.
ПРИМЕР 7. Определение «красной черты» по данным МСТ
Люба природна система может быть определена как «сложный пространственновременной комплекс субъединиц, систематически взаимодействующих между собой,
который сохран ет внутреннюю конфигурацию в структуре и поведении и способен
самовосстанавливатьс после нефатальных разрушений».
Следовательно, дл сохранени природных экосистем в услови х все возрастающей
антропогенной нагрузки, дл предотвращени необратимых изменений важно определить
величину предельно допустимого воздействи , а также механизмы адаптации и уровни
устойчивости слагаемых системы к антропогенным воздействи м. До сих пор ПДК
загр знителей устанавливались зачастую без св зи с реальными процессами,
происход щими в загр зненном местообитании ввиду отсутстви методов оценки
благополучи местообитани . Предельно допустима нагрузка - это совокупность внешнего
и внутреннего воздействи , котора либо не мен ет качество среды, либо мен ет его в
допустимых пределах (Израэль Ю.А. Экологи и контроль состо ни природной среды. - М.:
Гидрометеоиздат, 1984, - 110 с.). Устойчивость экосистемы - свойство системы
сохран ть и поддерживать значение своих параметров и структуры в пространстве и
времени, качественно не мен характер функционировани (принцип Ле Шателье). В
отличие от устойчивости стабильность - способность экосистемы вернутьс в прежнюю
область устойчивого равновеси после временного воздействи какого-либо фактора.
Определ величину предельно допустимой нагрузки, мы обозначаем порог, начина с
которого принцип Ле Шателье перестает действовать, то есть система перестает быть
устойчивой, тер ет стабильность. На примере загр знени CMC (пример 1) мы
предприн ли попытку оценить диапазон стабильности исследуемой почвенной системы в
случае градиента нагрузки ПАВ. Дл этой цели были исследованы параметры ранговых
распределений. Чем ниже значение параметров b и d, тем благополучнее сообщество.
Теоретически, предельному уровню нагрузки соответствует значение параметра крутизны
распределени d, равное единице. Анализ динамики показателей распределени показал,
что этому значению соответствуют образцы с концентрацией CMC 0,05 и 0,1 г/г почвы.
Эти же концентрации вызвали наибольшее отклонени от равновесных моделей и
продемонстрировали понижение других параметров функционального разнообрази , что
подтверждает правильность предложенного нами критери оценки предельно допустимой
дл микробного сообщества нормы загр знени .
Описанные закономерности были подтверждены также результатами фитотеста и
анализом динамики колонизации стекол обрастани , проводимых параллельно дл контрол .
Таким образом, метод МСТ оказалс чувствительным, информативным и эффективным
при проведении мониторинга загр знени почвы CMC и позволил выделить существование
трех функционально различных сообществ. Первое сообщество, в основном, сохран ет
черты исходного ненарушенного сообщества до уровн загр знени 0,004 г/г почвы.
Второе сообщество с иной функциональной структурой существует в диапазоне
субстратных концентраций CMC 0,01-0,02 г/г почвы, а третье, с наименьшим
разнообразием, формируетс под вли нием ксенобиотического эффекта CMC при
загр знении более 0,02 г/г почвы.
ПРИМЕР 8. Определение уровн загр знени почв полициклическими ароматическими
углеводородами (ПАУ) по данным МСТ
Пон тный интерес представл ет задача прогнозировани уровн различных загр знений
в почвах по данным МСТ. Часто зависимость показателей МСТ от концентрации
загр знени имеет выраженный нелинейный характер: при умеренном загр знении
наблюдаетс стимул ци потреблени р да субстратов, а при сильном - снижение
значений дл тех же признаков. Это делает проблематичным прогноз загр знени на
основе многофакторных линейных регрессионных моделей.
В таких ситуаци х эффективными представл ютс нейронные сети самообучающейс Страница: 15
RU 2 335 543 C2
5
10
15
20
25
системы, имитирующие де тельность человеческого мозга. В нашей работе впервые в
практике МСТ така возможность проверена. Дл р да почв, загр зненных известным
количеством поллютанта, было проведено МСТ согласно процедуре, описанной выше. На
основании полученных данных о потреблении субстратов и данных о содержании
канцерогенных полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) обучали трехслойную
сеть с 10-ю нейронами в каждом слое. Прогноз сети при проверке на всем массиве данных
дал удовлетворительные результаты в широком диапазоне уровней загр знени .
Например, прогнозируемые значени нейронной сети дл концентрации канцерогенных
ПАУ составили 137, 474, 1036 при реальных уровн х 101, 409 и 1069 мг/кг
соответственно. В ходе упрощени и вербализации нейронной сети вы снилось, что дл решени поставленной задачи нейронной сети достаточно данных о потреблении
ограниченного набора субстратов (глюкоза, цитрат, сукцинат, гистидин, аспарагин,
серин, лактат, глутамин и аргинин).
Как видно из приведенных примеров, мультисубстратное тестирование с помощью
предлагаемой системы «Эко-Лог» показало себ как мощьный и информативный способ
биомониторинга.
Эффективность предлагаемых способов определ етс высокой комбинаторикой и
чувствительностью метода.
Использование метода недорого и экспрессно, позвол ет получить информацию об
экологическом статусе исследуемого местообитани в течение 48-72 часов.
Таким образом с помощью МСТ возможно за короткое врем количественно оценить
благополучие местообитани , произвести бонитировку сельхозугодий на базе
биологических критериев, оценить эффективность агромелиоративных и
рекультивационных меропри тий.
Показана возможность экспресс-мониторинга и больших территорий и составлени карт
функционального микробиологического биоразнообрази .
Такие данные могут быть незаменимы в задачах контрол и управлени экологической
ситуацией на территори х, подверженных техногенным воздействи м а также в практике
оперативного контрол состо ни окружающей среды.
Таблица
Список и расположение субстратов в тест-планшете «Эко-Лог»
30
1
35
40
45
50
2
3
4
7
8
9
10
11
12
A Инозит [1]
L+арабиноза [2]
L+рамноза
[3]
Дульцит [4]
D+сорбит лактоза [6]
[5]
D-манит [7]
D+мальтоза
[8]
D+глюкоза
[9]
Сахароза
[10]
Ксилоза
[11]
Пуллулан
[12]
B Ацетат [13]
Аспартат [14]
Цитрат [15]
Сукцинат [16]
Малеинат Целлобиоза
[17]
[18]
Октаноат
(каприлат)
[19]
Глицин [20]
Пролин [21] Рибоза [22] Галактоза
[23]
C Норлейцин 1-глюкозофосфат
[25]
[26]
Гистидин
[27]
Норвалин [28]
Аспарагин
[31]
D-L валин
[32]
D L-аргинин
[37]
Тимидин
[39]
L-лизин [38]
5
6
Треонин
[29]
Аланин [30]
Ацетнилглюкозамин Твин-80
[40]
[41]
Путресцин
[42]
Крахмал [43] Фруктоза [44] Рафиноза
[45]
Глицерин
[46]
Креатин
[47]
Контроль
[48]
Сахароза
[58]
Ксилоза
[59]
Пуллулан
[60]
Дульцит [52]
D+сорбит Лактоза [54] D-маннит [55] D+мальтоза
[53]
[56]
D+глюкоза
[57]
F Ацетат [61]
Цитрат [63]
Сукцинат [64]
Малеинат Целлобиоза
[65]
[66]
Пролин [69] Рибоза [70] Галактоза
[71]
G Норлейцин 1-Глюкозофосфат
[73]
[74]
Гистидин
[75]
Норвалин [76]
Треонин
[77]
Аланин [78]
H L-аргинин
[85]
Тимидин
[87]
Ацетилглюкозамин
[88]
Твин-80
[89]
Путресцин
[90]
L-лизин [86]
Октаноат
(каприлат)
[67]
Глицин [68]
Аспарагин
[79]
D-L валин
[80]
Манноза
[72]
Серин [81] L-фенил
Лактат [83] L-глутамин
аланин [82]
[84]
Крахмал [91] Фруктоза [92] Рафиноза
[93]
Глицерин
[94]
Креатин
[95]
Контроль
[96]
Формула изобретени 1. Способ мультисубстратного тестировани природных микробных сообществ дл определени типа местообитани , степени и типа негативного воздействи неблагопри тных факторов на почвенные местообитани и оценки качества почв,
предусматривающий отбор проб, получение суспензии почвенного микробного комплекса,
внесение суспензии в чейки тест-планшета, содержащего набор тест-субстратов,
минеральную среду и индикатор потреблени субстратов, и последующую инкубацию тестпланшетов в термостатируемой камере до по влени окраски индикатора,
фотометрическую регистрацию интенсивности окраски субстратов с помощью плашечного
Страница: 16
CL
Серин [33] L-фенил
Лактат [35] L-глутамин
аланин [34]
[36]
E Инозит [49] L+арабиноза [50] L+рамноза
[51]
Аспартат [62]
Манноза
[24]
RU 2 335 543 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
фотометра и математический анализ полученных спектров потреблени субстратов,
отличающийс тем, что трактовку результатов провод т с помощью программы Эко-лог с
использованием концепции биоразнообрази , теории систем и оригинальной модели
рангового распределени , с помощью коэффициентов формы рангового распределени оценивают экологическое качество почвенного местообитани , причем почвенна микробна система и, соответственно, почва определ ютс как стабильно благополучные,
если коэффициент рангового распределени d имеет значение от 0,01 до 0,4; при d=0,40,8 система определ етс как наход щ с под воздействием неблагопри тного фактора;
при d=0,8-1,0 система определ етс как кризисно дестабилизированна и при d>1,0
система определ етс как необратимо нарушенна , при этом сочетание высокого
биоразнообрази и низких значений коэффициента d вл етс характерным признаком
ненарушенных сообществ, а понижение биоразнообрази и рост d вл ютс признаком
нарушени функционировани сообщества.
2. Способ по п.1, отличающийс тем, что используют набор из 47 тест-субстратов.
3. Способ по п.1, отличающийс тем, что в качестве набора тест-субстратов
используют набор «Эко-лог», а именно: инозит [1], L+арабиноза [2], L+рамноза [3],
Дульцит [4], D+сорбит [5], лактоза [6], D-маннит [7], D+мальтоза [8], D+глюкоза [9],
Сахароза [10], Ксилоза [11], пуллулан [12], Ацетат [13], Аспартат [14], Цитрат [15],
Сукцинат [16], Малеинат [17], целлобиоза [18], октаноат [19], глицин [20], Пролин [21]
, Рибоза [22], Галактоза [23], Манноза [24], норлейцин [25], 1-глюкозофосфат [26],
Гистидин [27], норвалин [28], Треонин [29], Аланин [30], аспарагин [31], D-L валин
[32], Серин [33], Lфенилаланин [34], лактат [35], Lглутамин[36], Lаргинин [37], L
лизин [38], Тимидин [39], Ацетилглюкозамин [40], твин 80 [41], Путресцин [42],
крахмал [43], Фруктоза [44], Рафиноза [45], Глицерин [46], креатин [47].
4. Способ по п.1, отличаетс тем, что использует бедную минеральную среду,
единственным источником углерода в которой вл етс тест-субстрат.
5. Способ по п.1, отличающийс тем, что использует в качестве индикатора
трифенилтетразолий бромистый.
6. Способ по п.1, отличающийс тем, что регистрацию окрашивани провод т в
оптическом диапазоне 510 нм.
7. Способ по п.1, отличающийс тем, что регистрацию окраски провод т с помощью
фотометра и/или фото слайд-сканера.
8. Способ по п.1, отличающийс тем, что дл определен качества почв провод т
обработку спектров потреблени субстратов с помощью оценки форм ранговых
распределений с использованием оригинального уравнени где n=ln(N), N - номер ранга; F(n)=ln(уN);
yN - интенсивность потреблени субстрата ранга N; е - основание натурального
логарифма; Е0, b, d - параметры
и уравнени Ципфа f(n)=kB n, где n - номер ранга;
yN - интенсивность потреблени субстрата ранга n; d - параметры.
9. Способ по п.1, отличающийс тем, что дл определени степени негативного
воздействи используютс нейросетевые алгоритмы распознавани образов.
10. Применение способа по пп.1-9 дл оценки «здоровь » почвенного местообитани ,
определени типа и силы загр знени , скрининга и нахождени оптимальных схем
проведени ремедиационных, агромелиоративных и рекультивационных меропри тий, дл мониторинга и оценки состо ни местообитани , определени реальной предельно
допустимой силы негативного воздействи и прогнозировани возможности
самовосстановлени экосистемы после негативного воздействи .
Страница: 17
RU 2 335 543 C2
Страница: 18
DR
?ых субстратов и
интенсивность их потреблени . Резкое снижение анализируемых показателей наблюдаетс дл концентраций 0,05 и 0,1 г/г почвы, которые наиболее негативно повли ли на
сообщество. Токсичность здесь настолько велика, что выживают лишь микроорганизмы,
наиболее резистентные к данному уровню воздействи . Компенсационные процессы
практически отсутствуют. Контрольный образец также характеризуетс довольно низкими
Страница: 8
RU 2 335 543 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
значени ми исследуемых показателей; это объ сн етс малым количеством активных
микроорганизмов, вследствие недостаточного количества источников углерода и энергии в
исследуемой почве (инкубаци происходила без добавлени глюкозы или других
питательных субстратов). Концентраци 0,0008 г/г вызвала некоторую стимул цию
развити сообщества. Резкий рост биоразнообрази мы видим при концентраци х 0,0040,02 г/г почвы; это свидетельствует о том, что содержащиес в почве ПАВ выступают в
роли субстрата, запускают сукцессию и вызывают бурное развитие попул ций, способных
использовать их в качестве источников углерода. Концентраци 0,02 г/г, по всей
видимости, не оказывают сильного токсичного действи на естественное микробное
сообщество и позвол ют развиватьс попул ци м-деструкторам. Происходит
функциональна перестройка сообщества с целью разложени ПАВ, вход щих в состав
CMC.
К аналогичным выводам мы приходим и на основании результатов кластерного анализа.
С его помощью мы классифицировали состо ни микробного сообщества при различных
уровн х нагрузки. Образцы оказались сгруппированы в три крупных кластера: группа
образцов в диапазоне концентраций 0,01-0,02 г/г почвы, представл ющих сообщество с
активным потреблением ПАВ, группа, включающа контрольный образец и концентрации
0,0008 и 0.04, группа экстремальных концентраций 0,05-0,1 г/г почвы, что
соответствует существованию трех функционально-различных систем. Взаимное сходство
между группой образцов с экстремальной концентрацией загр зн ющего вещества и
контрольными вариантами объ сн етс ингибирующим действием этих концентраций,
«прореживающих» контрольный спектр, но не добавл ющих новых компонентов, как в
вариантах с низкими концентраци ми. Объедин все результаты анализа данных,
выдел ем два уровн воздействи поллютанта, вызывающих качественную перестройку
микробной системы: 0,004 и 0,05 г/г почвы. Втора критическа концентраци , однако,
вызывает более сильные изменени , так как практически полностью подавл ет протекание
компенсационных процессов. Сн тие данной нагрузки вр д ли уже позволит системе
вернутьс в исходное состо ние.
Отметим, что подходы, использованные на начальных этапах обработки полученных
данных (обща характеристика спектров, кластерный анализ), не вл ютс достаточными
при проведении мониторинга, так как на их основе невозможно определить универсальный
критерий дл оценки предельно допустимого уровн внешнего воздействи .
Метод ранговых распределений позволил нам с помощью МСТ количественно оценить
изменени , произошедшие в микробной системе под воздействием поллютанта, и
определить абсолютную величину предельного уровн воздействи CMC. Метод ранговых
распределений дл МСТ не примен лс , однако вполне успешно примен етс в общей
экологии (Левич А.П. Структура экологических сообществ. М., МГУ, 1980, 181 с.). В
основе метода - следстви гипотезы равновеси , св занной с теорией термостатики и
неравновесной термодинамики. Допустим, имеетс множество элементов N некоторой
природной системы и пространство свойств m (g1, g2, ..., gm). Множество N в пространстве
свойств m отображаетс в классы К (1, 2, ..., i...k) с числом элементов в классе Ni и
веро тностью попадани элемента в соответствующий класс рi=Ni/N, ?pi=1. Разбиение по
рангам может быть осуществлено различными способами. Если подразумеваетс , что
члены нашего множества взаимодействуют друг с другом, (в частности возникают их
устойчивые комбинации), то это равноценно тому, что они осуществл ют
самоклассификацию, пробега все i возможных классов разбиени . Под разнообразием же
понимаетс множество различимых состо ний или классов природного объекта (системы),
отображающее возможные взаимодействи между его элементами. Оценкой разнообрази вл етс энтропи H=-?pi(logpi). Описываетс ранговое распределение модельными
кривыми, обычно это нелинейные функции, которые используют два параметра. Из них
один - это крутизна распределени (LP=-?logp(i)) показывает информативность системы
(минимальна информативность системы будет в том случае, когда все классы содержат
одинаковое количество элементов, т.е. когда потер ны редкие классы). Второй
Страница: 9
RU 2 335 543 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
параметр - энерги системы (E=?p(i)i). На основании определенных теоретических
представлений выводитс модель равновесного рангового распределени . Дл равновесного состо ни принимаетс , что производные по любой переменной равны нулю,
как и производные, отражающие переход элементов из одного класса в другой.
Разнообразие (энтропи ) равновесной системы, крутизна и энерги равновесного
распределени должны быть максимальны. Дл того же, чтобы оценить степень
неравновесности реальной исследуемой системы, нужно сравнить реальное
распределение с равновесным и измерить степень отклонени . Мерой сравнени может
служить энтропи Кульбака:
HK=-?pi(logpi/hi),
где pi - веро тность i-го класса дл реального распределени , hi - дл равновесного,
либо ? 2=N?((hi-pi)/pi). Кроме этих параметров можно рассмотреть выравненность системы
(R=H/logK) - при равном числе элементов равна 1, резкое снижение данного показател свидетельствует о выраженном доминировании некоторых классов. Все эти показатели
позвол ют охарактеризовать состо ние системы, включа определение универсальной
оценки предельного уровн воздействи . При значении параметра, отражающего крутизну
распределени , равном единице, распределение трансформируетс в пр мую линию, а
прежн система фактически прекращает свое существование.
Существует несколько канонических форм ранговых распределений. В нашей работе
было использовано оригинальное ранговое распределение, адаптированное дл анализа
данных МСТ: провод МСТ, мы получаем ранговое распределение элементов
исследуемого микробного сообщества по интенсивност м потреблени 47-ми различных
субстратов. Уравнение, описывающее распределение у=у0+(-В)?е x?D (-x), где у0 - константа.
В и D - параметры распределени отражающие энергию системы и крутизну
распределени , соответственно. Значение D=1, будем считать критическим (см.
вышеописанное). Исследу динамику значений этого и других параметров
функционального разнообрази при различных уровн х воздействи , мы смогли
определить предельно допустимую дл функционировани микробного сообщества
концентрацию CMC.
Наибольшие значени коэфициэнта D, позвол ющие оценить нестабильность системы,
а следовательно, и наибольшее отклонение от равновесности системы, вызвали
концентрации 0,05 и 0,1 г/г почвы. Микробное сообщество контрольного образца,
вследствие специфичного времени отбора проб, тоже достаточно далеко от равновесного.
Наибольшее стабилизирующее действие наблюдаетс дл концентрации 0,0008 г/г.
Образцы с концентраци ми 0,004-0,02 г/г почвы занимают некоторое промежуточное
состо ние.
ПРИМЕР 2. Микробиологическое картирование почв
Эффективность метода МСТ показана на примере получени микробиологической карты
дл сельскохоз йственной практики. Нами была составлена дл ЗАО "Красненское"
(Белгородска обл.) микробиологическа карта почв этого хоз йства. По всей видимости,
такой подход реализован впервые. С изучаемых полей были отобраны смешанные пробы и
проведено МСТ и рассчитаны параметры биоразнообрази согласно вышеописанной
процедуре.
На карте-схеме в пределах почвы одного типа представлены показатели «здоровь »
микробных сообществ, их биоразнообразие Н (Индекс Шеннона) и показатель стабильности
(коэффициент d рангового распределени ). Вс область значени этих параметров дл исследованных территорий разбивалась на 3 части - область высоких, низких и средних
значений. Дл каждого сочетани указанных значений вводилс на карте свой цветовой
код: например высока стабильность и высокое разнообразие - зеленый, низка стабильность и низкое разнообразие - красный, высока стабильность и низкое
разнообразие - синий, и т.д. (фиг.3). Представленные данные позволили провести
бонитировку земель хоз йства, обозначить неблагополучные территории, нуждающиес в
агромелиоративных меропри ти х, подтвердить изменени в функциональных спектрах
Страница: 10
RU 2 335 543 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
почвенных микробных сообществ после применени комплексных микробных удобрений.
Кроме того, эта информаци вл етс базовой дл планируемого долгосрочного
мониторинга почв хоз йства, ориентированного на получение экологически чистой
продукции.
ПРИМЕР 3. Функциональный мониторинг микробных сообществ почв, загр зненных
керосином.
Нами была проведена оценка возможностей применени метода мультисубстратного
тестировани дл характеристики изменений почвенных микробных сообществ,
нарушенных керосином. Дл исследовани загр знени почвы керосином использовались
образцы окультуренной дерново-подзолистой почвы (Московска обл.), отобранные из
гумусного горизонта. Почва была высушена до воздушно-сухого состо ни , освобождена от
крупных растительных остатков и просе на через сито диаметром 5 мм. В качестве
поллютанта использовали керосин осветительный КО - 25 (ГОСТ ТУ 38.401-58-10-90;
плотность - 0,805 г/см 3).
Мониторинг загр знений керосином проводили в модельных экспериментах. Навески
массой 300 г увлажн ли до 30% от массы воздушно-сухой почвы водными эмульси ми
керосина и инкубировали в полиэтиленовых контейнерах при посто нной влажности и
комнатной температуре в течение 25 суток. Исследуемые концентрации керосина - 1, 2, 5
и 10 мл/100 г почвы (каждый вариант в двух повторност х). Контролем служила почва без
внесени поллютанта. На 7-е, 14-е, и 25-е сутки отбирали средние пробы и проводили
МСТ согласно вышеописанной процедуре.
На основании СПС микробных сообществ почвы при разных уровн х нагрузки и на
разных этапах инициированной сукцессии были рассчитаны показатели и индексы
функционального разнообрази , проведен кластерный анализ. Анализ расположени исследуемых образцов в пространстве параметров ранговых распределений позвол ет
сделать заключение о том, что внесение керосина приводит к увеличению числа редких
классов и повышает метаболическую работу сообщества. Это, без сомнени ,
свидетельствует о расширении адаптационных возможностей микробного сообщества и
свидетельствует об интенсификации биоремедиационных процессов, направленных на
компенсацию внешнего воздействи (известно, что наличие именно «редких» классов
обеспечивает высокие адаптационные способности почвенного сообщества
микроорганизмов). Максимальные значени параметров на 7, 14 и 25 сутки инкубировани приход тс на варианты с концентраци ми 2, 5, 5 мл/100 г почвы соответственно. При
этом на 25 сутки разница между контролем и вариантами 1 и 2 мл/100 г почвы
практически нивелируетс . Подобные выводы можно сделать и при анализе параметров
биоразнообрази .
Проведенный кластерный анализ позволил дополнительно классифицировать
микробные сообщества почвы с различными уровн ми нагрузки. На полученных
дендрограммах выдел етс два функционально различных кластера: увеличение
концентрации керосина до 5 мл/100 г почвы не вызывает серьезных качественных
изменений в сообществе загр зненной почвы по сравнению с контролем и соответствует
некоторому оптимальному интервалу существовани сообщества, адаптированного к
деструкции углеводородов.
Дальнейшее увеличение нагрузки вызывает более серьезные изменени и приводит к
формированию качественно иного по функциональным характеристикам сообщества, не
исключа , тем не менее, протекани деструкционных процессов. Суммиру анализ
исследованных показателей, можно прогнозировать снижение концентрации керосина в
почве и восстановление исходной структуры микробного сообщества веро тно на всем
исследуемом диапазоне концентраций. При этом максимальный темп восстановлени ожидаетс в диапазоне концентраций 1-5 мл/100 г почвы; дальнейшее увеличение нагрузки
снижает темпы ремедиации. Это согласуетс с имеющимис в литературе сведени ми о
способности самоочищени почв от керосина даже в случае достаточно высоких
концентраций (до 60% и более).
Страница: 11
RU 2 335 543 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
ПРИМЕР 4. Оценка эффективности деструкции нефтесодержащих отходов
цианобактериальным комплексом.
Дл постановки эксперимента в лабораторных услови х использовали образцы почв,
отобранные в местах складировани нефтесодержащих отходов Астраханского
газоперерабатывающего завода (АГПЗ). Исходное содержание суммарных нефтепродуктов
в отобранных дл постановки эксперимента почвенных образцах, содержащих нефтешлам,
составило 17,4%. Стандартна процедура биотестировани с использованием сценедесмус
позволила отнести данные образцы к 4-5-му классу опасности.
Экспериментальные системы представлены четырьм стекл нными цилиндрами с
нефтезагр зненной почвой (мощность почвенного профил 15 см). Три варианта
инокулированы сухой биомассой циано-бактериального сообщества (10 г на 1 кг почвы).
Суха биомасса была получена путем естественного высушивани и измельчена до
величины частиц не более 0,5 мм. Модельные экосистемы нефтезагр зненной почвы с
целью определени оптимального варианта использо
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
1 617 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа