close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент РФ 2335767

код для вставки
РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
RU
(19)
(11)
2 335 767
(13)
C1
(51) МПК
G01N 33/48
(2006.01)
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
(21), (22) За вка: 2006146575/15, 25.12.2006
(24) Дата начала отсчета срока действи патента:
25.12.2006
(45) Опубликовано: 10.10.2008 Бюл. № 28
2 3 3 5 7 6 7
объеме, провод т зональный высоковольтный
электрофорез при 600 В в течение 60 мин, после
завершени электрофореза бумагу высушивают,
высушенные полоски бумаги обрабатывают в
0,0012% растворе Родамина, затем сушат при
комнатной температуре, провод т обнаружение зон
в УФ-свете и определ ют качественный состав
фосфолипидного комплекса путем сравнени с
электрофореграммой
стандартных
растворов
фосфолипидов. Изобретение позвол ет упростить
способ определени качественного состава
фосфолипидного комплекса дл аналитических
исследований, сократить врем анализа, снизить
материальные затраты и повысить точность
определени . 1 ил.
R U
(57) Реферат:
Изобретение
относитс к
области
аналитической биохимии, а именно к способам
анализа веществ, и может быть использовано дл определени качественного
состава
фосфолипидных
комплексов,
полученных
из
растительных, пищевых и животных объектов, при
проведении
аналитических
и
научноисследовательских работ. Способ заключаетс в
том, что фосфолипидный концентрат, полученный
из исследуемых образцов, сушат под вакуумом,
затем раствор ют в хлороформе, нанос т пробы
хлороформного
раствора
фосфолипидов
на
пропитанную цитратным буферным раствором
хроматографическую
бумагу
в
оптимальном
Страница: 1
RU
C 1
C 1
(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАЧЕСТВЕННОГО СОСТАВА ФОСФОЛИПИДНОГО КОМПЛЕКСА
2 3 3 5 7 6 7
Адрес дл переписки:
394006, г.Воронеж, Университетска пл., 1,
ГОУ ВПО "Воронежский государственный
университет", Центр трансфера технологий
(73) Патентообладатель(и):
Государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образовани "Воронежский государственный университет"
(RU)
R U
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: RU 93042346, 10.10.1996. SU 1091066
A1, 07.05.1984. SU 567133 A1, 30.07.1977. SU
587775 A1, 30.06.1979. KR 960016716 В,
20.12.1996.
(72) Автор(ы):
Жигулина Ольга Валерьевна (RU),
Сафонова Елена Федоровна (RU),
Назарова Александра Александровна (RU),
Чупандина Елена Евгеньевна (RU),
Селеменев Владимир Федорович (RU),
Сливкин Алексей Иванович (RU)
RUSSIAN FEDERATION
(19)
RU
(11)
2 335 767
(13)
C1
(51) Int. Cl.
G01N 33/48
(2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY,
PATENTS AND TRADEMARKS
(12)
ABSTRACT OF INVENTION
(21), (22) Application: 2006146575/15, 25.12.2006
(24) Effective date for property rights: 25.12.2006
(45) Date of publication: 10.10.2008 Bull. 28
Mail address:
394006, g.Voronezh, Universitetskaja pl., 1,
GOU VPO "Voronezhskij gosudarstvennyj
universitet", Tsentr transfera tekhnologij
2 3 3 5 7 6 7
electropherography at 600 V for 60 minutes, after
electropherography the paper is dried, dry paper
strips are processed in 0.0012% rhodamine
solution and dried at room temperature, zone
detection in UV spectre is performed, and
qualitative composition of phospholipide complex
is performed by comparing to electropherogram of
standard phospholipide solutions.
EFFECT: simplified method of determining
qualitative composition of phospholipide complex
for analytical research; shorter analysis time;
reduced cost and increased precision of determination.
1 ex, 1 dwg
R U
(57) Abstract:
FIELD: chemistry.
SUBSTANCE: invention can be applied in
determining
qualitative
composition
of
phospholipide complexes obtained from vegetable,
foodstock and animal objects, for analytical and
research works. The method involves drying of
phospholipide concentrate obtained from examined
samples
in
vacuum
and
dissolving
it
in
chloroform, application of optimal quantity of
chloroform phospholipide solution samples on
chromatographic paper soaked in citrate buffer
solution,
performance
of
zonal
high-voltage
Страница: 2
EN
C 1
C 1
(54) METHOD OF DETERMINING QUALITATIVE COMPOSITION OF PHOSPHOLIPIDE COMPLEX
2 3 3 5 7 6 7
(73) Proprietor(s):
Gosudarstvennoe obrazovatel'noe uchrezhdenie
vysshego professional'nogo obrazovanija
"Voronezhskij gosudarstvennyj universitet" (RU)
R U
(72) Inventor(s):
Zhigulina Ol'ga Valer'evna (RU),
Safonova Elena Fedorovna (RU),
Nazarova Aleksandra Aleksandrovna (RU),
Chupandina Elena Evgen'evna (RU),
Selemenev Vladimir Fedorovich (RU),
Slivkin Aleksej Ivanovich (RU)
RU 2 335 767 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Изобретение относитс к области аналитической биохимии, а именно к способам
анализа веществ, и может быть использовано дл определени качественного состава
фосфолипидного комплекса при проведении аналитических и научно-исследовательских
работ. Изобретение направлено на расширение арсенала способов определени качественного состава фосфолипидного комплекса.
Известны способы определени качественного состава смеси фосфолипидов с
помощью хроматографических методов. Эти способы включают в себ получение раствора
фосфолипидов из пищевых, растительных или животных объектов, хроматографическое
разделение раствора фосфолипидов на отдельные фракции фосфолипидов и
детектирование хроматографических зон специфическими реагентами. Виды
используемого хроматографического разделени различны, чаще всего используетс метод тонкослойной хроматографии и хроматографии на колонках, также различаютс используемые реагенты-обнаружители и системы растворителей дл элюировани .
Известен способ определени состава смеси фосфолипидов, полученной из сливочного
масла, заключающийс в нанесении ее капилл ром на тонкий слой сорбента ТСХ,
разделении ее хроматографическим методом в системе растворителей на отдельные
фракции фосфолипидов, про влении хроматографической пластины реактивом
Васьковского и Костецкого с целью обнаружени индивидуальных фосфолипидов (RU
№567133, МПК G01N 33/04, 1977).
Известен способ определени качественного состава смесей фосфолипидов,
полученных из различных биологических объектов, в котором сочетаютс элементы
афинной и ионообменной хроматографии, а также используютс специально подобранные
различные системы растворителей дл элюировани , что позвол ет разделить смеси
фосфолипидов на индивидуальные фосфолипиды (RU №1284981, МПК 4 C07F 9/10, G01N
33/50, 1987).
Известен способ разделени спиртового раствора смеси фосфолипидов,
заключающийс в пропускании ее через неионогенный сорбент МХДЭ-100, который
предварительно подвергают модификации путем насыщени его этиловым спиртом,
элюировани сорбированного продукта этиловым спиртом и затем разделении
фосфолипидов хроматографическим методом (RU №2169734, МПК C07F 09/09, 2001).
Известен способ качественного определени фосфолипидов, в котором их определ ют
колориметрически после разделени методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) и
обнаружени специфическим молибдатным реагентом (за вка RU №93042346, МПК 6 G01N
33/48, G01N 33/15, 1996.10.10).
Недостатками этих способов вл етс их трудоемкость, а также то, что на их
осуществление требуютс значительные затраты времени, оборудовани и реактивов.
Технический результат заключаетс в упрощении способа определени качественного
состава фосфолипидного комплекса дл аналитических исследований, его экспрессности,
снижении материальных затрат и трудоемкости на его проведение, повышении точности
определени .
Технический результат достигаетс тем, что в способе определени качественного
состава фосфолипидного комплекса, заключающемс в том, что фосфолипидный
концентрат, полученный из исследуемых образцов, сушат при 30-35°С под вакуумом,
затем раствор ют в хлороформе до 1% концентрации, нанос т пробы хлороформного
раствора фосфолипидов на пропитанную цитратным буферным раствором
хроматографическую бумагу в оптимальном объеме 1 и 2 мкл, провод т зональный
высоковольтный электрофорез при 600 В в течение 60 мин, после завершени электрофореза бумагу высушивают при 110°С в течение 20-30 минут, высушенные полоски
бумаги обрабатывают в 0,0012% растворе Родамина, затем сушат при комнатной
температуре, провод т обнаружение зон в УФ-свете и определ ют качественный состав
фосфолипидного комплекса путем сравнени с электрофореграммой стандартных
растворов фосфолипидов.
Предлагаемый способ определени качественного состава фосфолипидных комплексов
Страница: 3
DE
RU 2 335 767 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
позвол ет значительно упростить процесс анализа, сократить врем его проведени ,
уменьшить ошибку определени вследствие сокращени целого р да операций
предпоготовки проб хлороформных растворов фосфолипидного комплекса после его
разделени на индивидуальные фосфолипиды дл дальнейшего их определени .
Отработку предлагаемого способа определени качественного состава фосфолипидного
комплекса с помощью метода электрофоретического разделени проводили на
стандартных растворах фосфатидных кислот (ФК), фосфатидилхолина (ФХ),
фосфатидилинозитола (ФИ), фосфатидилэтаноламина (ФЭА), фосфатидилсерина (ФС) и
фосфатидилглицерина (ФГ) фирм «Sigma», «ICN Biomedical» в хлороформе. Разделение
фосфолипидной смеси проводили на приборе марки LFG (Венгри ) с горизонтальной
камерой и двум электродами из платиновой проволоки. Электрофоретическое разделение
проводилось по следующей схеме:
1. Подготовка носител (среды);
2. Выбор и подготовка провод щей жидкости;
3. Подготовка анализируемых образцов;
4. Нанесение веществ, подлежащих разделению;
5. Проведение электрофореза;
6. Обнаружение и качественна оценка фосфолипидов.
Подготовка носител .
Фильтровальна бумага дл электрофореза должна содержать, по крайней мере, 96% ацеллюлозы, нерастворимой в концентрированном растворе NaOH. В процессе
электрофореза она пропитываетс провод щей жидкостью. Разные марки бумаги
обладают неодинаковой впитывающей способностью - свойством, имеющим большое
значение, так как электропроводимость влажной фильтровальной бумаги зависит от
объема содержащегос в ней провод щей жидкости.
В работе использовалась хроматографическа бумага (ГОСТ №10395-63) форматом
52Ч65 и плотностью 85. На бумагу размером 25Ч10 см в центре наносили стартовую линию
и смачивали провод щей жидкостью всю поверхность бумаги, за исключением полоски
размером 1,5 см с обеих сторон от стартовой линии (дл предотвращени размывани анализируемой пробы).
Выбор и подготовка провод щей жидкости.
На практике в качестве провод щей жидкости чаще всего используютс буферные
растворы. Состав и кислотность буфера вл ютс важнейшими услови ми
электрофоретического процесса.
В качестве провод щей жидкости нами были рассмотрены три буферных раствора (на 1
л): цитратный (17,5 г лимонной кислоты, 8,2 г NaOH, рН 3,41), фосфатный (11,9 г
Na2HPO4Ч2H2O, 9,0 г KH2PO4, рН 7,79), аммиачный (10,0 г NH4Cl, pH 11,78).
Электродные кюветы заполн ли соответствующим буферным раствором и соедин ли
кюветы полосками фильтровальной бумаги. Следует обратить внимание на тот факт, что
после проведени электрофореза уменьшаетс концентраци буферных растворов
(особенно аммиачного) и, следовательно, мен етс величина рН. Поэтому буферные
растворы нельз использовать дважды.
Подготовка образцов.
Фосфолипидный концентрат, полученный из исследуемых образцов, сушили в чашке
Петри под вакуумом при 30-35°С под вакуумом, затем раствор ли в хлороформе до 1%-ной
концентрации. Подготовленный таким способом образец использовали дл дальнейшего
разделени .
Нанесение пробы.
Подготовленный образец наносили микрошприцем МШ-10 (Росси ) на стартовую линию
на рассто ние не менее 1 см от кра бумаги и не менее 2,5 см друг от друга. Бумагу
подсушивали и помещали на электрофоретический столик таким образом, чтобы концы
бумаги были погружены на 1 см в кюветы с провод щей жидкостью. Дл предотвращени чрезмерного испарени провод щей жидкости, которое может привести к снижению ее
Страница: 4
RU 2 335 767 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
концентрации и изменению величины рН, всю систему помещали в закрытую камеру и
проводили электрофорез. Экспериментально было установлено, что объем наносимой
пробы существенно вли ет на процесс разделени и качество электрофоретических зон.
Поэтому предварительно был установлен оптимальный объем наносимой пробы дл ФХ,
так как его количество в любом фосфолипидном концентрате доминирует.
Дл вы снени этого вли ни стандартный раствор ФХ в хлороформе наносили
микрошприцем на стартовую линию в объеме 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 5,0 и 10 мкл.
После проведени электрофореза и детектировани полученных зон были установлены
оптимальные объемы наносимой пробы. Они составили 1 и 2 мкл. Большое количество
наносимого вещества значительно ухудшает картину разделени , и основна масса
вещества остаетс на старте.
Проведение электрофореза.
Дл выбора оптимального напр жени проводили электрофорез стандартного раствора
ФХ при 400, 500 и 600 В. Лучшее разделение и качество зон дл всех трех буферных
систем наблюдалось при 600 В.
Врем экспонировани также устанавливалось экспериментально. Оно составило 30 мин
дл аммиачного буфера и 60 мин дл фосфатного и цитратного буферных растворов.
После завершени электрофоретического процесса бумагу как можно быстрее
переносили в термостат и высушивали при температуре 110°С в течение 20-30 мин.
Быстра фиксаци разделенных веществ проводитс дл того, чтобы предотвратить
диффузию молекул, продолжающуюс и после отключени электрического тока, что
приводит к ухудшению картины разделени .
Обнаружение и качественна оценка оценка.
Детектирование электрофоретических зон после разделени проводили следующим
образом. Высушенные полоски бумаги помещали в сухие кюветы, заливали раствором
про вител и оставл ли на 30-60 мин. Затем полоски бумаги вывешивали на раму и
сушили при комнатной температуре. В качестве реагентов-обнаружителей использовали
следующие растворы:
1) 0,0012% раствор Родамина 6Ж. Явл етс неспецифическим обнаружителем.
Используетс дл определени кислых (голубые и пурпурные зоны) и нейтральных (желтые
и оранжевые зоны) липидов. Это наиболее распространенный обнаружитель. После
обработки электрофореграмм этим реагентом обнаружение зон провод т в УФ-свете.
2) 5% спиртовой раствор фосфорно-молибденовой кислоты (ФМК). Этот реактив широко
используетс дл обнаружени всех фосфолипидов.
3) 0,25% раствор нингидрина в ацетоне. Специфический обнаружитесь дл фосфолипидов, имеющих свободные аминогруппы.
Отработку методики проводили на модельных смес х фосфолипидов
фосфатидилихолина (ФХ). Полученные результаты представлены на чертеже.
При этом было установлено, что:
1) Наилучшее разделение и качество электрофоретических зон получаетс при
напр жении 600 В, времени экспонировани - 60 мин, при использовании в качестве
провод щей жидкости цитратного буферного раствора, приготовленного согласно
стандартной прописи.
2) Объем наносимых проб стандартных хлороформных растворов фосфолипидов
существенно вли ет на процесс разделени и качество электрофоретических зон. Большое
количество наносимых проб значительно ухудшает картину разделени , и основна масса
фосфолипидов остаетс на старте. Экспериментально были установлены оптимальные
объемы наносимых проб хлороформных растворов фосфолипидов, которые составили 1 и
2 мкл.
3) Наиболее предпочтительным реагентом - обнаружителем вл етс 0,0012% раствор
Родамина 6Ж, так как в случае его использовани определ етс наибольшее число
индивидуальных фосфолипидов.
В соответствии с данными чертежа в цитратном и фосфатной буферной системах ФХ и
Страница: 5
RU 2 335 767 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
ФЭА существуют в виде положительно зар женных частиц, т.к. под действием
электрического тока они движутс в катодную область. Следовательно, в кислой и
нейтральной средах ФХ и ФЭА существуют в виде катионов. ФС, ФК, ФГ и ФИ в цитратном
буфере обнаруживаютс в анодной области, т.е. они имеют суммарный зар д и вл ютс анионными фосфолипидами. В аммиачном буфере (щелочна среда) ФИ, ФС и ФЭА
существуют в виде анионов, а ФХ остаетс на линии старта. Это можно объ снить тем,
что вблизи величины рН 12,05 находитс изоэлектрическа точка ФХ. Обнаружить ФК, ФС и
ФИ при использовании фосфатного буфера не удалось. Проверка отдельных
электрофоретических зон на наличие золы показала отсутствие минеральных компонентов
(менее 0,001%), что свидетельствует о разрушении комплекса металл - ФЛК при
использовании этого способа.
Пример. 0,05-0,07 г фосфолипидного комплекса, полученного из масла сем н амаранта,
переносили количественно в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили объем
раствора до метки хлороформом. Получали хлороформный раствор исследуемых
фосфолипидов с концентрацией 2-3 мг/см 3.
Затем путем последовательного разведени готовили серию стандартных растворов
фосфолипидов с концентраци ми 60, 40 и 20 мг/см 3.
На стартовую линию хроматографической бумаги размером 25Ч10 см наносили при
помощи микрошприца МШ (Росси ) по 2 мкл исследуемых хлороформных растворов
фосфолипидов масла сем н амаранта и по 2 мкл стандартных растворов фосфолипидов:
ФХ, ФИ, ФЭА, ФГ, ФС и ФК. Проводили электрофоретическое разделение при 600 В в
цитратном буферном растворе в течение 60 мин. Детектирование электрофоретических
зон после разделени проводили следующим образом. Высушенные полоски бумаги
помещали в сухие кюветы, прот гивали через 0,0012% раствор Родамина 6Ж. Затем
полоски бумаги вывешивали на раму и сушили при комнатной температуре. Обнаружение
электрофоретических зон проводили в УФ-свете. Идентификацию индивидуальных
фосфолипидов хлороформного раствора исследуемого фосфолипидного комплекса
проводили при помощи сравнительного анализа электрофореграмм стандартных
растворов фосфолипидов и хлороформного раствора исследуемого фосфолипидного
комплекса. Установлено, что в состав фосфолипидного комплекса масла сем н амаранта
вход т ФХ, ФИ.
Формула изобретени Способ определени качественного состава фосфолипидных комплексов,
заключающийс в том, что фосфолипидный концентрат, полученный из исследуемых
образцов, сушат при 30-35°С под вакуумом, затем раствор ют в хлороформе до 1%
концентрации, нанос т пробы хлороформного раствора фосфолипидов на пропитанную
цитратным буферным раствором хроматографическую бумагу в оптимальном объеме 1 и 2
мкл, провод т зональный высоковольтный электрофорез при 600 В в течение 60 мин, после
завершени электрофореза бумагу высушивают при 110°С в течение 20-30 мин,
высушенные полоски бумаги обрабатывают в 0,0012% растворе Родамина 6Ж, затем сушат
при комнатной температуре, провод т обнаружение зон в УФ-свете и определ ют
качественный состав фосфолипидного комплекса путем сравнени с электрофореграммой
стандартных растворов фосфолипидов.
50
Страница: 6
CL
RU 2 335 767 C1
Страница: 7
DR
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
147 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа