close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент РФ 2336306

код для вставки
РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
(19)
RU
(11)
2 336 306
(13)
C1
(51) МПК
C12N
C12Q
G01N
C12N
C12N
C12M
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
(12)
9/04 (2006.01)
1/00 (2006.01)
33/66 (2006.01)
15/10 (2006.01)
15/53 (2006.01)
1/40 (2006.01)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
(21), (22) За вка: 2007106070/13, 19.07.2005
(24) Дата начала отсчета срока действи патента:
19.07.2005
(30) Конвенционный приоритет:
20.07.2004 EP 04017069.8
(73) Патентообладатель(и):
Ф.ХОФФМАНН-ЛЯ РОШ АГ (CH)
(45) Опубликовано: 20.10.2008 Бюл. № 29
2 3 3 6 3 0 6
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: ЕР 1367120 А, 03.12.2003. RU 99109103
А, 27.03.2001.
(85) Дата перевода за вки PCT на национальную фазу:
20.02.2007
(86) За вка PCT:
EP 2005/007844 (19.07.2005)
2 3 3 6 3 0 6
R U
Адрес дл переписки:
129090, Москва, ул. Б.Спасска , 25, стр.3,
ООО "Юридическа фирма Городисский и
Партнеры", пат.пов. А.В.Мицу
C 1
C 1
(87) Публикаци PCT:
WO 2006/008132 (26.01.2006)
(54) ГЕНЕТИЧЕСКИ СКОНСТРУИРОВАННАЯ ЗАВИСИМАЯ ОТ ПИРРОЛОХИНОЛИНХИНОНА
ГЛЮКОЗОДЕГИДРОГЕНАЗА, СОДЕРЖАЩАЯ ИНСЕРЦИЮ АМИНОКИСЛОТЫ
(57) Реферат:
Изобретение относитс к биотехнологии.
Описан вариант растворимой зависимой от
пирролохинолинхинона (PQQ)
глюкозодегидрогеназы
(s-GDH),
содержащей
инсерцию
аминокислотного
остатка
между
положени ми 428 и 429, которые соответствуют
аминокислотной последовательности дикого типа,
известной дл Acinetobacter calcoaceticus, и
может
содержать
одну
или
несколько
дополнительных
аминокислотных
замен.
Представлен
полинуклеотид,
кодирующий
описанный вариант s-GDH. Описан вектор
экспрессии,
содержащий
представленный
полинуклеотид. Описана клетка-хоз ин E.coli,
содержаща описанный вектор. Описан способ
получени указанного
варианта
s-GDH,
включающий в себ культивирование клеткихоз ина E.coli в услови х, подход щих дл получени варианта фермента. Предложен способ
вы влени , определени или измерени глюкозы в
образце с использованием описанного варианта sGDH, который включает приведение в контакт
образца с указанным вариантом. Изобретение
позвол ет эффективно определ ть концентрации
сахаров, особенно глюкозы в образце, так как
обладает
повышенной
субстратной
специфичностью по отношению к глюкозе. 7 н. и 13
з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл.
Страница: 1
RU
R U
(72) Автор(ы):
БЕНИТЦ-ДУЛАТ Мара (DE),
ЛАГГЕРБАУЭР Джессика (DE),
ШМУК Райнер (DE),
КРАТЦШ Петер (DE),
КНАППЕ Вольфганг-Райнхольд (DE)
RUSSIAN FEDERATION
(19)
RU
(11)
2 336 306
(13)
C1
(51) Int. Cl.
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY,
PATENTS AND TRADEMARKS
(12)
C12N
C12Q
G01N
C12N
C12N
C12M
9/04 (2006.01)
1/00 (2006.01)
33/66 (2006.01)
15/10 (2006.01)
15/53 (2006.01)
1/40 (2006.01)
ABSTRACT OF INVENTION
(21), (22) Application: 2007106070/13, 19.07.2005
(24) Effective date for property rights: 19.07.2005
(30) Priority:
20.07.2004 EP 04017069.8
(45) Date of publication: 20.10.2008 Bull. 29
(73) Proprietor(s):
F.KhOFFMANN-LJa ROSh AG (CH)
(85) Commencement of national phase: 20.02.2007
2 3 3 6 3 0 6
(86) PCT application:
EP 2005/007844 (19.07.2005)
(87) PCT publication:
WO 2006/008132 (26.01.2006)
(57) Abstract:
FIELD: chemistry.
SUBSTANCE: invention relates to biotechnology.
Version
of
solvable
dependent
on
pyrroloquinolinquinone (PQQ) glucosodehydrogenase
(s-GDH), containing insertion of amino acid
residual between positions 428 and 429, which
correspond to amino acid sequence of wild type
known for Acinetobacter calcoaceticus and can
contain one or several additional amino acid
substitutions,
is
described.
Represented
is
polynucleotide, coding described s-GDH version.
Expression vector is described. It containes
represented
polynucleotide.
Host-cell
E.coli,
containing described vector is described. Method
of
obtaining
said
s-GDH version,
including
cultivation
of
host-cell
E.coli
in
conditions,
suitable
for
obtaining
enzyme
version
is
described. Method of detection is described. It
determines or measuring glucose in sample by
means of described s-GDH version, which includes
bringing sample in contact with said version.
EFFECT: obtaining possibility to determine
concentration of sugars, especially glucose in
sample efficiently.
20 cl, 8 ex, 4 dwg, 1 tbl
R U
2 3 3 6 3 0 6
(54) GENETICALLY CONSTRUCTED DEPENDENT ON PYRROLOQUINOLINQUINONE
GLUCOSODEHYDROGENASE, CONTAINING INSERTION OF AMINO ACID
Страница: 2
C 1
C 1
Mail address:
129090, Moskva, ul. B.Spasskaja, 25, str.3,
OOO "Juridicheskaja firma Gorodisskij i
Partnery", pat.pov. A.V.Mitsu
EN
R U
(72) Inventor(s):
BENITTs-DULAT Mara (DE),
LAGGERBAUEhR Dzhessika (DE),
ShMUK Rajner (DE),
KRATTsSh Peter (DE),
KNAPPE Vol'fgang-Rajnkhol'd (DE)
RU 2 336 306 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Описание
Насто щее изобретение относитс к улучшенным вариантам растворимых зависимых от
пирролохинолинхинона (PQQ) глюкозодегидрогеназ (s-GDH), содержащих инсерцию
аминокислоты между положени ми 428 и 429, которые соответствуют аминокислотной
последовательности, известной дл Acinetobacter calcoaceticus, к генам, кодирующим
такой вариант s-GDH, к белкам таких вариантов s-GDH с улучшенной субстратной
специфичностью в отношении глюкозы и к различным применени м указанных вариантов
s-GDH, в частности, дл определени концентраций сахаров, особенно глюкозы, в образце.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Определение концентрации глюкозы в крови очень важно дл клинической диагностики и
терапии диабета. Примерно 150 миллионов людей во всем мире страдают хроническим
заболеванием сахарным диабетом, и согласно ВОЗ эта цифра может удвоитьс к 2025
году. Хот диабет легко диагностируетс и поддаетс лечению, но дл успешной
долговременной терапии требуютс недорогиие диагностические средства, которые быстро
и точно представл ют данные о концентраци х глюкозы в крови. PQQ-зависимые
глюкозодегидрогеназы (EC 1.1.99.17) катализируют реакцию, в которой глюкоза
окисл етс до глюконолактона. Поэтому указанный тип фермента используют дл измерени сахара в крови. Одним из таких средств вл етс диагностическа полоска на
основе растворимой глюкозодегидрогеназы (s-GlucDOR, EC 1.1.99.17), фермента,
содержащего пирролохинолинхинон, исходно полученного из Acinetobacter calcoaceticus.
Хинопротеины используют хинон в качестве кофактора дл окислени спиртов, аминов и
альдоз до соответствующих лактонов, альдегидов и альдоновых кислот (Duine, J. A.
Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter in "The Biology
of Acinetobacter" (1991) 295-312, New York, Plenum Press; Duine, J. A., Eur J Biochem
200 (1991) 271-284; Davidson, V. L., in "Principles and applications of
quinoproteins" (1993) the whole book, New York, Marcel Dekker; Anthony, C., Biochem.
J. 320 (1996) 697-711; Anthony, C. and Ghosh, M., Current Science 72 (1997) 716-727;
Anthony, C., Biochem. Soc. Trans. 26 (1998) 413-417; Anthony, C. and Ghosh, M., Prog.
Biophys. Mol. Biol. 69 (1998) 1-21. Среди хинопротеинов самую большую подгруппу
составл ют хинопротеины, содержащие нековалентно св занный кофактор 2,7,9трикарбокси-1H-пирроло[2,3-f]хинолин-4,5-дион (PQQ) (Duine 1991, выше). Все известные
до насто щего времени бактериальные хинон-глюкозодегидрогеназы относ тс к данной
подгруппе с PQQ в качестве кофактора (Anthony and Ghosh 1997 выше, Goodwin, P.M. and
Anthony, C., Adv. Microbiol. Physiol. 40 (1998) 1-80; Anthony, C., Adv. in Phot. and
Resp. 15 (2004) 203-225).
Два типа PQQ-зависимой глюкозодегидрогеназы (EC 1.1.99.17) были описаны у
бактерий: одна вл етс мембраносв занной (m-GDH), друга - растворимой (s-GDH). Оба
типа не имеют какой-либо существенной гомологии последовательностей (Cleton-Jansen,
A. M., et al., Mol. Gen. Genet. 217 (1989) 430-436; Cleton-Jansen, A. M., et al.,
Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 73-79; Oubrie, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A 96 (1999) 11787-11791. Они также отличаютс как кинетическими, так и
иммунологическими свойствами (Matsushita, K., et al., Bioscience Biotechnol. and
Biochem. 59 (1995) 1548-1555). m-GDH широко распространены у грамотрицательных
бактерий, тогда как s-GDH были обнаружены только в периплазматическом пространстве
штаммов Acinetobacter, таких как A. calcoaceticus (Duine, J.A., 1991a; Cleton-Jansen,
A.M. et al., J. Bacteriol. 170 (1988) 2121-2125; Matsushita and Adachi, 1993) и A. baumannii
(JP 11243949).
Посредством поиска в базах данных последовательностей были идентифицированы две
последовательности, гомологичные полноразмерной s-GDH A. calcoaceticus в E.coli K-12 и
видах Synechocystis. Кроме того, две неполные последовательности, гомологичные sGDH A. calcoaceticus, также были обнаружены в геноме P. aeruginosa и Bordetella pertussis
(Oubrie et al. 1999 a, b, c) и Enterobacter intermedium (Kim, C.H. et al., Current
Microbiol. 47 (2003) 457-461), соответственно. Установленные аминокислотные
Страница: 3
DE
RU 2 336 306 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
последовательности этих четырех не охарактеризованных белков вл ютс близко
родственными s-GDH A. calcoaceticus, при этом большое количество остатков в
предполагаемом активном сайте вл етс абсолютно консервативным. Веро тно, эти
гомологичные белки имеют сходную структуру и катализируют сходные PQQ-зависимые
реакции (Oubrie et al., 1999 a, b, c; Oubrie A., Biochim. Biophys. Acta 1647 (2003)
143-151; Reddy, S., and Bruice, T.C., J. Am. Chem. Soc. 126 (2004) 2431-2438; Yamada,
M. et al., Biochim. Biophys. Acta 1647 (2003) 185-192).
Было обнаружено, что бактериальные s-GDH и m-GDH обладают довольно разными
последовательност ми и имеют разную субстратную специфичность. Например, A.
calcoaceticus содержит две разные PQQ-зависимые глюкозодегидрогеназы, одну m-GDH,
котора активна in vivo, а друга , - названна s-GDH, дл которой может быть показана
только активность in vitro. Cleton-Jansen et al., 1988; 1989 a, b клонировали гены,
кодирующие два фермента GDH, и определили последовательности ДНК обоих указанных
генов GDH. Не существует вной гомологии между m-GDH и s-GDH, что подтверждает тот
факт, что m-GDH и s-GDH представл ют собой две совершенно разные молекулы
(Laurinavicius, V., et al, Biologija (2003) 31-34).
Гены s-GDH A. calcoaceticus клонированы в E. coli. После образовани в клетке s-GDH
перемещаетс через цитоплазматическую мембрану в периплазматическое пространство
(Duine, J. A., Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter in
"The Biology of Acinetobacter" (1991) 295-312, New York, Plenum Press; Matsushita, K.
and Adachi, O., Bacterial quinoproteins glucose dehydrogenase and alcohol
dehydrogenase in "Principles and applications of Quinoproteins" (1993) 47-63, New
York, Marcel Dekker). Подобно нативной s-GDH A. Calcoaceticus рекомбинантна s-GDH,
экспрессированна в E. coli, представл ет собой гомодимер с одной молекулой PQQ и
трем ионами кальци на мономер (Dokter, P. et al., Biochem. J. 239 (1986) 163-167;
Dokter, P. et al., FEMS Microbiol. Lett. 43 (1987) 195-200; Dokter, P. et al.,
Biochem. J. 254 (1988) 131-138; Olsthoorn, A. and Duine, J. A., Arch. Biochem.
Biophys. 336 (1996) 42-48; Oubrie, A., et al., J. Mol. Biol. 289 (1999) 319-333,
Oubrie, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 96 (1999) 11787-11791, Oubrie, A.,
et al., Embo J. 18 (1999) 5187-5194). s-GDH окисл ет большое число моно- и
дисахаридов до соответствующих кетонов, которые затем гидролизуютс до альдоновых
кислот, и s-GDH также может быть донором электронов дл PMS (феназинметосульфат),
DCPIP (2,6-дихлорфенолиндофенол), WB (голубой Вюрстера) и убихинонов с короткой
цепью, таких как убихинон Q1 и убихинон Q2 (Matsushita, K., et al., Biochem. 28
(1989) 6276-6280; Matsushita, K., et al., Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 63-72),
нескольких искусственных акцепторов электронов, таких как метилсульфат Nметилфеназони (Olsthoorn, A. J. and Duine, J. A., Arch. Biochem. Biophys. 336 (1996)
42-48; Olsthoorn, A. J. and Duine, J. A., Biochem. 37 (1998) 13854-13861) и
электропровод щие полимеры (Ye, L., et al., Anal. Chem. 65 (1993) 238-241). Ввиду
высокой специфичной активности s-GDH по отношению к глюкозе (Olsthoorn, A. J. and
Duine, J. A., (1996) выше) и своей широкой специфичности по отношению к искусственным
акцепторам электронов фермент подходит дл аналитического использовани , особенно
дл применени в (био)сенсоре или индикаторных полосках дл определени глюкозы в
случае диагностических применений (Kaufmann, N. et al., Development and evaluation of
a new system for determining glucose from fresh capillary blood and heparinised blood
in "Glucotrend" (1997) 1-16, Boehringer Mannheim GmbH; Malinauskas, A.; et al.,
Sensors and Actuators, B: Chemical B100 (2004) 395-402).
Окисление глюкозы может катализировать по меньшей мере три совершенно разные
группы ферментов, т.е. NAD/P-зависимые глюкозодегидрогеназы, флавопротеиновые
глюкозооксидазы или хинопротеиновые GDH (Duine, J.A., Biosens. Bioelectronics 10
(1995) 17-23). Наблюдали довольно медленное автоокисление восстановленной s-GDH, что
свидетельствует о том, что кислород вл етс очень плохим акцептором электронов дл sGDH (Olsthoorn and Duine, 1996). s-GDH может быть эффективным донором электронов от
Страница: 4
RU 2 336 306 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
восстановленного хинона к таким переносчикам, как PMS, DCPIP, WB и убихиноны с
короткой цепью, такие как Q1 и Q2, но не может эффективно отдавать электроны
непосредственно на кислород.
В общеприн тых индикаторных полосках и сенсорах дл наблюдени за уровнем
глюкозы в крови, сыворотке и моче, например, больных диабетом, используют
глюкозооксидазу. Эффективность фермента зависит от концентрации кислорода.
Измерение глюкозы на разной высоте над уровнем мор при разных концентраци х
кислорода в воздухе может приводить к ошибочным результатам. Основным
преимуществом PQQ-зависимых глюкозодегидрогеназ вл етс их независимость от
кислорода. Такое важное свойство описано, например, в патенте US 6103509, в котором
исследованы некоторые свойства мембраносв занной GDH.
Важным вкладом в данную область стало использование s-GDH вместе с подход щими
переносчиками. Способы анализа и устройства в виде индикаторных полосок на основе sGDH подробно описаны в патенте US 5484708. Указанный патент также содержит
подробную информацию о проведении анализов и получении основанных на s-GDH
индикаторных полосках дл измерени глюкозы. Способы, описанные в этой публикации, а
также в цитированных документах, приведены в насто щее описание в качестве ссылки.
Другими патентами или за вками, относ щимис к данной области и содержащими
конкретную информацию о различных способах применени ферментов с
глюкозодегидрогеназной активностью, вл ютс US 5997817; US 6057120; EP 0 620 283 и
JP 11-243949-A.
Коммерческой системой, в которой используют s-GDH, и индикатор, который вызывает
изменение окраски в том случае, когда происходит реакци (Kaufmann et al. 1997 выше),
вл етс система Glucotrend®, распростран ема Roche Diagnostics GmbH.
Несмотр на обсуждаемые выше преимущества в случае применени PQQ-зависимой sGDH, при определении глюкозы также необходимо учитывать некоторые недостатки.
Фермент имеет довольно широкий спектр субстратов по сравнению с m-GDH. То есть sGDH окисл ет не только глюкозу, но также некоторые другие сахара, включа мальтозу,
галактозу, лактозу, маннозу, ксилозу и рибозу (Dokter et al. 1986 a; Oubrie A.,
Biochim. Biophys. Acta 1647 (2003) 143-151). Реактивность по отношению к другим
сахарам, отличным от глюкозы, может в некоторых случа х снижать точность определени уровней глюкозы в крови. В частности, у пациентов, наход щихс на перитонеальном
диализе, получающих лечение икодекстрином (полимером глюкозы), в жидкост х
организма, например, в крови, могут находитьс высокие уровни других сахаров,
особенно мальтозы (Wens, R., et al., Perit. Dial. Int. 18 (1998) 603-609).
Поэтому клинические образцы, которые, например, получены у больных диабетом,
особенно у пациентов с почечными осложнени ми и особенно у пациентов, наход щихс на диализе, могут быть значительные уровни других сахаров, особенно мальтозы.
Определени глюкозы в образцах, полученных у таких пациентов в критическом состо нии,
могут быть искажены за счет мальтозы (Davies, D., Perit. Dial. Int. 14 (1994) 45-50;
Frampton, J. E.; and Plosker, G. L., Drugs 63 (2003) 2079-2105).
В литературе имеетс мало сообщений о попытках получить модифицированные PQQзависимые s-GDH с измененной субстратной специфичностью. В статье Igarashi, S., et
al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 264 (1999) 820-824 указано, что введение точечной
мутации в положение Glu277 приводит к мутантам с измененным профилем субстратной
специфичности.
Sode в патенте EP 1 176 202 указывает, что некоторые аминокислотные замены в s-GDH
привод т к образованию мутанта s-GDH с повышенной аффинностью к глюкозе. В патенте
EP 1 167 519 тот же автор сообщает о мутанте s-GDH с повышенной стабильностью. Кроме
того, тот же автор в патенте JP2004173538 сообщает о других мутантах s-GDH с
повышенной аффинностью к глюкозе.
Kratzsch, P. et al. в WO 02/34919 указывают, что специфичность s-GDH в отношении
глюкозы по сравнению с другими сахарами-субстратами, особенно по сравнению с
Страница: 5
RU 2 336 306 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
мальтозой, может быть повышена посредством аминокислотных замен в некоторых
положени х s-GDH.
Takeshima, S., et al. (EP 1 367 120) сообщали о мутантной s-GDH, содержащей
некоторые аминокислотные замены или инсерцию аминокислоты между положени ми 427
и 428 в соответствии с аминокислотной последовательностью, известной
дл Acinetobacter calcoaceticus.
Однако, несмотр на сообщени о некоторых усовершенствовани х в создании мутантов
или вариантов s-GDH с улучшенными свойствами, все еще требуютс дальнейшие,
альтернативные и/или дополнительные усовершенствовани .
Следовательно, существует потребность и клиническа необходимость в
дополнительных мутантных или вариантных формах s-GDH, которые самосто тельно или в
комбинации с уже известными мутаци ми могут привести к улучшенной специфичности в
отношении глюкозы в качестве субстрата.
Целью насто щего изобретени было получение новых мутантов или вариантов s-GDH,
которые либо самосто тельно, либо в комбинации с уже известными мутаци ми привод т к
существенно улучшенной субстратной специфичности в отношении глюкозы по сравнению
с другими выбранными молекулами сахаров, например, такими как галактоза или мальтоза.
Неожиданно было обнаружено, что можно значительно улучшить субстратную
специфичность s-GDH в отношении глюкозы по сравнению с другими сахарами путем
вставки аминокислоты между положени ми 428 и 429 s-GDH, соответствующим
аминокислотной последовательности, известной дл Acinetobacter calcoaceticus, и, таким
образом, по меньшей мере частично решить описанные выше проблемы, известные в
данной области.
Субстратна специфичность в отношении к глюкозе по сравнению с другими
выбранными молекулами сахаров была значительно повышена в результате получени инсерционных вариантов s-GHD согласно насто щему изобретению и как описано в данной
публикации ниже и в прилагаемой формуле изобретени .
Благодар повышенной субстратной специфичности новых форм s-GDH возможен
значительный технический прогресс в определении глюкозы в случае применени в
различных област х. Улучшенные варианты s-GDH можно использовать с большим
преимуществом дл специфичного определени или измерени глюкозы в биологических
образцах, особенно в устройствах на основе индикаторных полосок или в биосенсорах.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Насто щее изобретение относитс к варианту растворимой формы EC 1.1.99.17, также
известной, как PQQ-зависима растворима глюкозодегидрогеназа (s-GDH), при этом
указанный вариант содержит по меньшей мере одну инсерцию аминокислотного остатка
между положени ми аминокислот, соответствующими положени м 428 и 429
последовательности s-GDH дикого типа, известной дл A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2), и
необ зательно дополнительно содержит одну или несколько аминокислотных замен,
предпочтительно замен в положении 348 и 428.
Также насто щее изобретение относитс к предпочтительным вариантам s-GDH,
обладающим улучшенными свойствами, особенно повышенной специфичностью по
отношению к глюкозе, а также к полинуклеотидным последовательност м, кодирующим
такие варианты, к экспрессирующему вектору, содержащему такую полинуклеотидную
последовательность, и к клетке-хоз ину, содержащей указанный экспрессирующий вектор.
Изобретение, кроме того, относитс к применению варианта по насто щему
изобретению в способе измерени глюкозы, особенно с помощью устройства на основе
индикаторных полосок или биосенсора.
Следующие примеры, ссылки, список последовательностей и фигуры предлагаютс дл большего понимани насто щего изобретени , действительный объем которого указан в
прилагаемой формуле изобретени . Пон тно, что могут быть осуществлены модификации
в указанных способах, не отход от сути изобретени .
ОПИСАНИЕ ФИГУР
Страница: 6
RU 2 336 306 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Фиг.1 - Последовательности белков PQQ-зависимой s-GDH A. calcoaceticus (вверху) и sGDH A. baumannii (внизу), выровненные в соответствии с гомологией
последовательностей.
Фиг.2 - Иллюстраци вектора pACSGDH, указанного в примере 1, содержащего
соответственно последовательность ДНК дикого типа или мутантную последовательность
ДНК растворимой PQQ-зависимой глюкозодегидрогеназы.
Фиг.3 - Нуклеотидна последовательность (ДНК) вектора pACSGDH, указанного в
примере 1, содержащего последовательность ДНК дикого типа растворимой PQQзависимой глюкозодегидрогеназы.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Как обсуждалось выше, два совершенно разных типа хинопротеидных ферментов с
глюкозодегидрогеназной активностью (мембраносв занный и растворимый) объедин ют в
группу с названием EC 1.1.99.17. По-видимому, указанные два типа не вл ютс родственными друг другу.
В цел х насто щего изобретени подходит только растворима форма GDH (s-GDH), и
ниже в описании обсуждаютс ее улучшенные варианты.
В первом варианте осуществлени изобретение относитс к варианту растворимой
формы EC 1.1.99.17, так же известной, как PQQ-зависима растворима глюкозодегидрогеназа (s-GDH), при этом указанный вариант содержит по меньшей мере
одну инсерцию аминокислотного остатка между положени ми аминокислот,
соответствующими положени м 428 и 429 последовательности s-GDH дикого типа,
известной дл A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2), и необ зательно дополнительно содержит
одну или несколько аминокислотных замен.
Предпочтительно только одна аминокислота встроена между положени ми аминокислот,
соответствующими положени м 428 и 429 последовательности s-GDH дикого типа,
известной дл A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2).
Кроме того, предпочтительно вариант s-GDH, содержащий инсерцию аминокислоты
между положени ми аминокислот, соответствующими положени м 428 и 429
последовательности s-GDH дикого типа, известной дл A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2),
отличаетс тем, что указанна встроенна аминокислота выбрана из группы, состо щей из
лейцина, фенилаланина, метионина и пролина. Предпочтительно встроенной
аминокислотой вл етс пролин.
В данной области известно, что ДНК-последовательность дикого типа растворимой
PQQ-зависимой глюкозодегидрогеназы может быть выделена из штаммов Acinetobacter.
Наиболее предпочтительным вл етс выделение из штамма типа Acinetobacter
calcoaceticus LMD 79.41. Последовательность s-GDH дикого типа (зрелого белка)
приведена в SEQ ID NO: 2. Также можно использовать другие LMD-штаммы Acinetobacter
в качестве источника s-GDH дикого типа. Такие последовательности могут быть выровнены
с последовательностью, полученной из A. calcoaceticus, и могут быть проведены
сравнени последовательностей. Очевидно, также можно провести скрининг ДНКбиблиотек других бактериальных штаммов, например, как описано дл E. coli K-12
(Oubrie, A., et al., J. Mol. Biol. 289 (1999) 319-333), и в таких геномах
идентифицировать последовательности, родственные s-GDH. Такие последовательности и
еще не идентифицированные гомологичные последовательности можно использовать дл создани вариантов s-GDH с улучшенной субстратной специфичностью.
Термин «вариант», используемый в насто щем изобретении, относитс к белку s-GDH,
который по сравнению с соответствующей последовательностью дикого типа имеет
инсерцию аминокислоты между положени ми аминокислот, соответствующими
положени м 428 и 429 последовательности s-GDH дикого типа, известной дл A.
calcoaceticus (SEQ ID NO: 2).
Термин «мутант», используемый в насто щем изобретении, относитс к белку s-GDH,
который по сравнению с соответствующей последовательностью дикого типа имеет по
меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с последовательностью s-GDH
Страница: 7
RU 2 336 306 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
дикого типа, известной дл A. calcoaceticus (SEQ ID NO:2).
Следовательно, оба термина «вариант» или «мутант» вместе могут использоватьс в
отношении белка s-GDH, который по сравнению с соответствующей последовательностью
дикого типа имеет инсерцию аминокислоты между положени ми аминокислот,
соответствующими положени м 428 и 429 последовательности s-GDH дикого типа,
известной дл A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) и, дополнительно, по меньшей мере одну
аминокислотную замену.
В следующем предпочтительном варианте осуществлени изобретени ферментативные или функциональные свойства улучшенного варианта s-GDH сравнивают
с ферментом дикого типа или мутантами без инсерции аминокислоты между положени ми
428 и 429, соответственно.
Предпочтительный вариант насто щего изобретени отличаетс тем, что по сравнению
с соответствующим ферментом дикого типа он обладает по меньшей мере в два раза
повышенной субстратной специфичностью по отношению к глюкозе, по сравнению с по
меньшей мере одним другим выбранным в качестве субстрата сахаром.
Дл расчета субстратной специфичности или перекрестной реактивности один из
простых способов заключаетс в том, чтобы прин ть активность, измеренную с глюкозой в
качестве субстрата, за 100% и сравнить активность, измеренную с другим выбранным
сахаром, со значением дл глюкозы. Иногда, чтобы не быть многословными, термин
специфичность просто используют без специальной ссылки на глюкозу, с одной стороны, и
выбранный в качестве субстрата сахар, с другой стороны.
Специалисту в данной области пон тно, что сравнение ферментативных активностей
лучше всего осуществл ть при эквимол рных концентраци х исследуемых молекул
субстратов, использу хорошо определенные услови анализа. В противном случае
необходимо делать корректировку в отношении различий в концентраци х.
Необходимо выбрать стандартизованные и хорошо определенные услови анализа,
чтобы оценить субстратную специфичность (улучшени ). Ферментативную активность sGDH по отношению к глюкозе в качестве субстрата, а также по отношению к другим
выбранным в качестве субстратов сахарам измер ют, как описано в примере 7.
На основании таких измерений ферментативной активности по отношению к глюкозе или
другому выбранному сахару, предпочтительно мальтозе, анализируют перекрестную
реактивность (и ее улучшени ).
(Перекрестную) реактивность s-GDH к выбранному сахару в процентах рассчитывают
следующим образом
Перекрестна реактивность [%] = (активность к выбранному сахару/активность к
глюкозе) x 100%.
Определена (перекрестна ) реактивность по отношению к мальтозе s-GDH дикого типа
согласно указанной выше формуле, составл юща примерно 105%. Измерена
(перекрестна ) реактивность s-GDH дикого типа к галактозе, составл юща примерно 50%
(сравнение в таблице).
(Повышенную) специфичность рассчитывают согласно следующей формуле:
Активность мутанта к глюкозе
Специфичность (повышенна ) =
----------------Активность дикого типа к глюкозе
45
50
Активность дикого типа к выбранному сахару
Ч
---------------------Активность мутанта к выбранному сахару
По сравнению с ферментом дикого типа форма s-GDH по меньшей мере с 10-кратным
повышением специфичности по отношению к глюкозе по сравнению с мальтозой
(мальтоза/глюкоза) соответственно при использовании мальтозы в качестве субстрата
обладает не больше, чем 10,5% активности от активности, измер емой при использовании
в качестве субстрата глюкозы. Или, если, например, мутантна s-GDH обладает
перекрестной реактивностью к мальтозе, составл ющей 20% (определенной и
рассчитанной, как описано выше), то указанный мутант по сравнению с s-GDH дикого типа
имеет увеличенную в 5,25 раз субстратную специфичность (мальтоза/глюкоза).
Термин «удельна активность» по отношению к субстрату хорошо известен в данной
Страница: 8
RU 2 336 306 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
области, предпочтительно его используют дл описани ферментативной активности на
количество белка. В данной области известны различные способы определени удельной
активности молекул GDH с использованием глюкозы или других сахаров в качестве
субстратов (Igarashi, S., et al., (1999) выше). Один из имеющихс способов измерени подробно описан в разделе «Примеры».
Хот можно выбрать много разных молекул сахаров и исследовать специфичность sGDH к глюкозе по сравнению с любой такой выбранной молекулой сахара, предпочтителен
выбор клинически важной молекулы сахара дл такого сравнени . Предпочтительные
выбранные сахара выбраны из группы, состо щей из маннозы, аллозы, галактозы, ксилозы
и мальтозы. Предпочтительно выбирают мальтозу или галактозу и мутантную s-GDH
тестируют в отношении повышенной субстратной специфичности по отношению к глюкозе
по сравнению с галактозой или мальтозой. В следующем предпочтительном варианте
выбранным сахаром вл етс мальтоза.
Обнаружено, что повышение специфичности к глюкозе вариантов s-GDH согласно
данному изобретению, например, к мальтозе по сравнению с глюкозой, довольно
значительно. Поэтому более предпочтительно, чтобы указанна субстратна специфичность по отношению к глюкозе по сравнению с субстратной специфичностью по
меньшей мере к одному другому выбранному в качестве субстрата сахару повышена по
меньшей мере в три раза. Другие предпочтительные варианты осуществлени изобретени включают мутанты s-GDH, характеризующиес повышенной субстратной специфичностью
по отношению к глюкозе, котора по меньшей мере в 5 раз выше или также
предпочтительно по меньшей мере в 10 раз выше, чем к другой выбранной молекуле
сахара.
Мутации в s-GDH во многих случа х привод т к вариантам фермента с сильно
пониженной удельной активностью по отношению к субстрату глюкозе. Однако более чем
10-кратное снижение (абсолютной или общей) удельной активности по отношению к
субстрату глюкозе может быть критическим дл обычных применений. Поэтому
предпочтительно, чтобы s-GDH с повышенной специфичностью к субстрату глюкозы
обладал по меньшей мере 10% удельной активностью по отношению к глюкозе,
измеренной с использованием фермента дикого типа. Конечно, более предпочтительно,
чтобы такие мутантные ферменты обладали по меньшей мере 20% или более
предпочтительно по меньшей мере 30% от соответствующей активности на глюкозе s-GDH
дикого типа.
Более предпочтительны такие мутанты, дл которых удельна активность к мальтозе
составл ет 10% или меньше или даже только 5% или меньше от удельной активности к
мальтозе, измеренной дл соответствующего фермента дикого типа на индикаторных
полосках или в тестах в жидкой фазе, тогда как удельна активность по отношению к
глюкозе составл ет ? 10% по сравнению с удельной активностью по отношению к глюкозе
соответствующего фермента дикого типа.
Обнаружено, что можно дополнительно повысить субстратную специфичность варианта
s-GDH, содержащего инсерцию между положени ми 428 и 429, посредством дальнейшей
модификации такого варианта так, чтобы он дополнительно содержал одну или несколько
аминокислотных замен в некоторых определенных положени х аминокислот.
Осуществление насто щего изобретени очень подробно описано с указанием
положений аминокислот, известных, исход из SEQ ID NO: 2, последовательности s-GDH
дикого типа, котора выделена из штамма типа Acinetobacter calcoaceticus LMD 79.41.
Положени аминокислот в разных изол тах s-GDH, соответствующие положени м в
последовательности SEQ ID NO: 2, легко идентифицируют с помощью подход щего
сравнени последовательностей.
Множественное выравнивание и сравнение последовательности s-GDH с
последовательностью SEQ ID NO: 2 дикого типа осуществл ют с использованием
программы PileUp пакета программ GCG, верси 10.2 (Genetics Computer Group, Inc.).
PileUp создает множественное выравнивание последовательностей с использованием
Страница: 9
RU 2 336 306 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
упрощени способа последовательного выравнивани Feng, D. F. and Doolittle, R. F., J.
Mol. Evol. 25 (1987) 351-360, и соответственно задают матрицы оценок дл идентичных,
сходных или разных аминокислотных остатков. Указанный способ начинаетс с попарного
выравнивани двух наиболее сходных последовательностей с получением кластера из
двух выровненных последовательностей. Указанный кластер затем можно выравнивать со
следующей наиболее родственной последовательностью или кластером выровненных
последовательностей. Два кластера последовательностей могут быть выровнены простым
удлинением попарного выравнивани двух отдельных последовательностей. Конечное
выравнивание осуществл ют с помощью серии последовательных попарных
выравниваний, которые включают все больше и больше отличающиес последовательности и кластеры вплоть до того, пока в конечное попарное выравнивание
не будут включены все последовательности. Таким образом, положени в других
гомологичных молекулах s-GDH могут быть легко идентифицированы как соответствующие
положени м, установленным дл s-GDH A. Calcoaceticus в SEQ ID NO: 1 и 2,
соответственно. Вот почему положени аминокислот, приведенные в данном описании,
следует понимать как положени аминокислот в последовательности SEQ ID NO: 2 или как
положени , соответствующие им в другой гомологичной молекуле s-GDH.
Обнаружено, что мутанты s-GDH, содержащие аминокислотную замену в положении,
соответствующем положению 348, в комбинации с инсерцией аминокислоты между
положени ми 428 и 429 в s-GDH, про вл ют удивительный позитивный эффект в
отношении специфичности к глюкозе. Как показано в таблице, было идентифицировано и
создано множество вариантов s-GDH с повышенной специфичностью по отношению к
глюкозе. Повышение специфичности к глюкозе в случае варианта s-GDH наблюдаетс при
условии, что аминокислота в положении треонина 348 заменена другой подход щей
аминокислотой и подход ща аминокислота встроена между положени ми 428 и 429.
Поэтому очень предпочтительный вариант осуществлени насто щего изобретени относитс к варианту белка PQQ-зависимой s-GDH, содержащему инсерцию между
аминокислотами 428 и 429 последовательности s-GDH дикого типа, известной дл A.
calcoaceticus (SEQ ID NO: 2), и дополнительно содержащему замену аминокислотного
остатка в положении аминокислоты, соответствующем положению 348.
Также обнаружено, что дополнительные замены в положении аминокислот,
соответствующем положени м 169, 171, 245, 341, 349 и/или 428 последовательности SEQ
ID NO: 2, вл ютс полезными при попытках дополнительно повысить специфичность по
отношению к глюкозе варианта s-GDH, содержащего инсерцию между аминокислотами 428
и 429 и замену аминокислотного остатка в положении 348.
В данной области известно, что ни остаток треонина в положении 348, ни инсерци аминокислоты между положени ми 428 и 429 s-GDH, котора выделена из штамма
типа Acinetobacter calcoaceticus LMD 79.41, не внос т вклада в св зывание субстрата
молекулой s-GDH (Oubrie, A., et al., Embo J. 18 (1999) 5187-5194; Oubrie, A. и
Dijkstra, B. W., Protein Sci. 9 (2000) 1265-1273). Не имеетс ни химического, ни
физического объ снени , почему указанные две модификации s-GDH особенно повышают
субстратную специфичность по отношению к глюкозе по сравнению с другими
представл ющими интерес молекулами сахаров, особенно по сравнению с мальтозой.
В следующем предпочтительном варианте осуществлени изобретени вариант s-GDH
отличаетс тем, что аминокислотный остаток треонина в положении 348 заменен
аминокислотным остатком, выбранным из группы, состо щей из аланина, глицина и серина.
В более предпочтительном варианте используют глицин дл замены треонина в положении
348. Терминологи T348G известна специалисту в данной области и указывает, что
треонин в положении 348 заменен глицином.
Дополнительным предпочтительным вариантом осуществлени изобретени вл етс вариант растворимой формы EC 1.1.99.17, так же известной, как PQQ-зависима растворима глюкозодегидрогеназа (s-GDH), при этом указанный вариант содержит по
меньшей мере одну инсерцию аминокислотного остатка между положени ми аминокислот,
Страница: 10
RU 2 336 306 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
соответствующими положени м 428 и 429 последовательности s-GDH дикого типа,
известной дл A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2), и по меньшей мере одну замену
аминокислотного остатка в положении аминокислоты, соответствующем положению 428.
Предпочтительно замену аспарагина в положении 428 осуществл ют лейцином, пролином
и валином. Более предпочтительной заменой в положении 428 вл етс пролин.
Одна группа предпочтительных вариантов s-GDH по данному изобретению содержит
замену аминокислотного остатка в положении 348 и/или замену аминокислоты в положении
428 и инсерцию аминокислоты между положени ми 428 и 429. Указанные варианты
необ зательно могут быть дополнительно модифицированы так, чтобы они содержали
одну или несколько аминокислотных замен в положени х аминокислот, соответствующих
положени м 169, 171, 245, 341 и/или 349 последовательности s-GDH дикого типа,
известной дл A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2).
В том случае, когда аминокислоту, соответствующую положению 169
последовательности s-GDH дикого типа, известной дл A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2),
замен ют в варианте согласно насто щему изобретению, предпочтительно, чтобы
встречающа с в природе аминокислота лейцин была заменена фенилаланином,
тирозином или триптофаном. Более предпочтительно замену в положении 169
осуществл ют фенилаланином.
В том случае, когда аминокислоту, соответствующую положению 171
последовательности s-GDH дикого типа, известной дл A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2),
замен ют в варианте согласно насто щему изобретению, предпочтительно, чтобы
встречающа с в природе аминокислота тирозин была заменена аминокислотой,
выбранной из группы, состо щей из аланина, метионина, глицина. Более предпочтительно
замену в положении 171 осуществл ют глицином.
В том случае, когда аминокислоту, соответствующую положению 245
последовательности s-GDH дикого типа, известной дл A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2),
замен ют в варианте согласно насто щему изобретению, предпочтительно, чтобы
встречающа с в природе аминокислота глутаминова кислота была заменена
аспарагиновой кислотой, аспарагином или глутамином. Более предпочтительно замену в
положении 245 осуществл ют аспарагиновой кислотой.
В том случае, когда аминокислоту, соответствующую положению 341
последовательности s-GDH дикого типа, известной дл A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2),
замен ют в варианте согласно насто щему изобретению, предпочтительно, чтобы
встречающа с в природе аминокислота метионин была заменена валином, аланином,
лейцином или изолейцином. Более предпочтительно замену в положении 341
осуществл ют валином.
В том случае, когда аминокислоту, соответствующую положению 349
последовательности s-GDH дикого типа, известной дл A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2),
замен ют в варианте согласно насто щему изобретению, предпочтительно, чтобы
встречающа с в природе аминокислота валин была заменена аланином, глицином. Более
предпочтительно замену в положении 349 осуществл ют аланином.
Как описано в WO 02/34919, замену аминокислоты в положении 348 последовательности
s-GDH, соответствующей последовательности дикого типа, выделенной из A.
calcoaceticus, можно использовать дл существенного повышени специфичности s-GDH к
глюкозе. Специалист в данной области найдет в WO 02/34919 другие подход щие
положени , которые можно замен ть и комбинировать с инсерцией согласно насто щему
изобретению.
В следующем предпочтительном варианте осуществлени изобретени вариант s-GDH
согласно насто щему изобретению дополнительно к инсерции между аминокислотными
остатками 428 и 429 содержит по меньшей мере две аминокислотные замены, выбранные
из группы, состо щей из положений 171, 245, 341, 348 и 349, которые соответствуют
положени м аминокислот в последовательности s-GDH дикого типа, известной дл A.
calcoaceticus (SEQ ID NO: 2).
Страница: 11
RU 2 336 306 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
В еще одном предпочтительном варианте осуществлени изобретени вариант s-GDH
согласно насто щему изобретению дополнительно к инсерции между аминокислотными
остатками 428 и 429 содержит по меньшей мере три аминокислотные замены, выбранные
из группы, состо щей из положений 171, 245, 341, 348 и 349, которые соответствуют
положени м аминокислот в последовательности s-GDH дикого типа, известной дл A.
calcoaceticus (SEQ ID NO: 2).
Как будет пон тно специалисту в данной области, можно осуществить аминокислотные
замены, например, молчащие мутации, которые не вли ют на свойства s-GDH в значимой
степени. Однако вариант согласно насто щему изобретению будет иметь не более 45
изменений аминокислот по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 2.
Предпочтительно вариант будет содержать 20 или меньше аминокислотных замен, более
предпочтительно будут присутствовать только 10 аминокислотных замен или меньше
замен.
Варианты s-GDH согласно насто щему изобретению приведены в разделе «Примеры».
Указанные варианты также представл ют собой предпочтительные варианты
осуществлени изобретени . Варианты, в случае которых существует меньше всего
взаимовли ний при определении глюкозы, обнаруженные до насто щего времени,
содержат инсерцию между аминокислотами 428 и 429, предпочтительно пролина, и
мутации Y171G, E245D, M341V и T348G или мутации L169F, Y171G, E245D, M341V и
T348G, соответственно. Указанные два варианта также вл ютс дополнительными
предпочтительными вариантами осуществлени насто щего изобретени .
Анализ аминокислотной последовательности показал, что мотивы последовательности,
обнаруженные в s-GDH дикого типа из A. Calcoaceticus, с одной стороны, и A. Baumannii, с
другой стороны, по-видимому, вл ютс высоко консервативными вблизи положений,
особенно важных дл повышени специфичности по отношению к глюкозе, которые
идентифицированы в насто щем изобретении, т.е. сайт инсерции вблизи положений 428 и
429, которые соответствуют s-GDH дикого типа из A. calcoaceticus.
Вариант PQQ-зависимой s-GDH, содержащий аминокислотную последовательность
AGNXaaVQK (SEQ ID NO: 2), представл ет собой предпочтительный вариант
осуществлени насто щего изобретени . Последовательность SEQ ID NO: 2 соответствует
положени м 426-431 s-GDH дикого типа A. calcoaceticus или положени м 427-432 s-GDH
дикого типа A. baumannii, но содержит инсерцию одной аминокислоты (Xaa) между
положени ми 428 и 429 (A. calcoaceticus) или между 429 и 430 (A. baumannii),
соответственно.
В предпочтительном варианте насто щее изобретение относитс к варианту s-GDH,
содержащему последовательность G-N-Xaa-V-Q-K-D (SEQ ID NO: 11). Предпочтительно
вариант s-GDH, содержащий последовательность SEQ ID NO: 11, дополнительно
отличаетс тем, что указанна встроенна аминокислота Xaa выбрана из группы,
состо щей из лейцина, пролина, фенилаланина и метионина, более предпочтительно Xaa
вл етс остатком пролина.
Как объ сн етс выше, аминокислота аспарагин в положении 428 s-GDH дикого типа
может быть подвергнута аминокислотной замене. В данном случае последовательность
SEQ ID NO: 11 будет содержать замен ющую аминокислоту вместо P428.
В данной области известны многочисленные возможности дл получени мутантных
белков. На основании важного открыти согласно насто щему изобретению, вы влени критической важности инсерции аминокислоты между положени ми 428 и 429, специалист
в данной области теперь может легко получить следующие подход щие варианты s-GDH.
Такие варианты, например, могут быть получены способами, известными как случайный
мутагенез (Leung, D. W., et al., Technique 1 (1989) 11-15) и/или направленный
мутагенез (Hill, D. E., et al., Methods Enzymol. 155 (1987) 558-568). Альтернативным
способом получени белка с требуемыми свойствами вл етс получение химерных
конструкций, которые содержат элементы последовательностей по меньшей мере из двух
разных источников, или полный синтез подход щего гена s-GDH. Такие способы, известные
Страница: 12
RU 2 336 306 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
в данной области, могут быть использованы вместе с информацией, раскрытой в
насто щем изобретении, дл получени мутантов или вариантов s-GDH, содержащих,
например, дополнительные аминокислотные замены в комбинации с описанной инсерцией
между положени ми 428 и 429 последовательности SEQ ID NO: 2.
Вариант s-GDH согласно насто щему изобретению, например, может быть получен,
начина с гена s-GDH, который выделен из штамма типа Acinetobacter calcoaceticus LMD
79.41, а также начина с гомологичной последовательности. В контексте данной за вки
подразумеваетс , что термин «гомологична » включает аминокислотную
последовательность s-GDH по меньшей мере с 90% идентичностью по сравнению с
последовательностью SEQ ID NO: 2. Другими словами, после соответствующего
выравнивани с использованием программы PileUp по меньшей мере 90% аминокислот
такой гомологичной s-GDH идентичны аминокислотам, описанным в виде SEQ ID NO: 2.
Будет пон тно, что изменени последовательностей ДНК и аминокислот существуют в
природе или могут быть намеренно введены с использованием способов, известных в
данной области. Указанные изменени могут в результате давать различи до 10%
аминокислот в полной последовательности вследствие делеций, замен, инсерций,
инверсий или присоединений одного или нескольких аминокислотных остатков в указанной
последовательности по сравнению с SEQ ID NO: 2. Такие аминокислотные замены могут
быть осуществлены, например, на основе сходства пол рности, зар да, растворимости,
гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы вовлеченных остатков.
Например, отрицательно зар женные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и
глутаминовую кислоту; положительно зар женные аминокислоты включают лизин и
аргинин; аминокислоты с группами незар женных пол рных головок или группами
непол рных головок, имеющие сходные значени гидрофобности, включают следующие
аминокислоты: лейцин, изолейцин, валин, глицин, аланин, аспарагин, глутамин, серин,
треонин, фенилаланин, тирозин. Другие предполагаемые варианты включают соли и
сложные эфиры указанных выше полипептидов, а также предшественники указанных выше
полипептидов, например, предшественники, имеющие N-концевую замену, такую как
метионин, N-формилметионин, используемый в качестве лидерных последовательностей.
Такие варианты могут быть получены, не выход за рамки объема и не отход от сути
насто щего изобретени .
Согласно способам, известным в данной области, или согласно способам, приведенным
в разделе «Примеры», можно получить полинуклеотидные последовательности,
кодирующие любой из мутантов s-GDH, которые обсуждаютс выше. Поэтому изобретение
также относитс к изолированным полинуклеотидным последовательност м, кодирующим
мутантные белки s-GDH, которые описаны выше.
Насто щее изобретение, кроме того, относитс к экспрессирующему вектору,
содержащему последовательность нуклеиновой кислоты согласно насто щему
изобретению, оперативно св занную с последовательностью промотора, способного
управл ть ее экспрессией в клетке-хоз ине.
Насто щее изобретение, кроме того, относитс к экспрессирующему вектору,
содержащему последовательность нуклеиновой кислоты согласно насто щему
изобретению, оперативно св занную с последовательностью промотора, способного
управл ть ее экспрессией в клетке-хоз ине. Предпочтительными векторами вл ютс плазмиды, такие как pACSGDH, показанна на фигурах 2 и 3.
Экспрессирующие векторы, применимые в насто щем изобретении, обычно содержат
начало репликации, ген резистентности к антибиотику дл селекции, промотор дл экспрессии и полный или часть варианта гена s-GDH. Экспрессирующие векторы также
могут содержать другие последовательности ДНК, известные в данной области, подобные
сигнальным последовательност м (дл лучшей укладки, транспорта в периплазму или
секреции), индукторы дл лучшего модулировани экспрессии или сайты расщеплени дл клонировани .
Характеристики выбранного экспрессирующего вектора должны быть совместимы с
Страница: 13
RU 2 336 306 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
клеткой-хоз ином, который необходимо использовать. Например, при клонировании в
системе клеток E. coli экспрессирующий вектор должен содержать промоторы, выделенные
из генома клеток E. coli (например lac или trp). Могут быть использованы подход щие
начала репликации, подобные началу репликации плазмиды ColE1. К подход щим
промоторам относ тс , например, lac и trp. Также предпочтительно, чтобы
экспрессирующий вектор содержал последовательность, кодирующую маркер дл селекции, подобный гену резистентности к антибиотику. В качестве селектируемых
маркеров легко можно использовать резистентность к ампициллину или резистентность к
канамицину. Все указанные материалы известны в данной области и вл ютс коммерчески доступными.
Подход щие экспрессирующие векторы, содержащие требуемую кодирующую и
регул торную последовательности, могут быть сконструированы с использованием
стандартных способов рекомбинантной ДНК, известных в данной области, многие из
которых описаны в Sambrook et al., в «Molecular Cloning: A Laboratory Manual» (1989)
Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbour Laboratory Press.
Насто щее изобретение дополнительно относитс к клеткам-хоз евам, содержащим
экспрессирующий вектор, который содержит последовательность ДНК, кодирующую всю
или часть мутантной s-GDH. Клетки-хоз ева предпочтительно содержат экспрессирующий
вектор, который включает в себ всю или часть одной из последовательностей ДНК,
имеющих одну или несколько мутаций, показанных в примерах 2-8. Подход щие клеткихоз ева включают, например, E. coli HB101 (ATCC 33694), доступные из Pomega (2800
Woods Hollow Road, Madison, WI, USA), XL1-Blue MRF, доступные из Stratagene (11011
North Torrey Pine Road, La Jolla, CA, USA), и тому подобные.
Экспрессирующие векторы могут быть внедрены в клетки-хоз ева различными
способами, известными в данной области. Например, трансформаци клеток-хоз ев
экспрессирующими векторами может быть осуществлена способом трансформации
протопластов, опосредованной полиэтиленгликолем (Sambrook et al. 1989, выше). Однако
также могут быть использованы другие способы введени экспрессирующих векторов в
клетки-хоз ева, например, электропораци , биолистическа инъекци или сли ние
протопластов.
После введени в подход щую клетку-хоз ина экспрессирующего вектора, содержащего
вариант s-GDH, клетку-хоз ина можно культивировать в услови х, обеспечивающих
возможность экспрессии требуемых вариантов s-GDH. Клетки-хоз ева, содержащие
требуемый экспрессирующий вектор с последовательностью ДНК, кодирующей всю или
часть мутантной s-GDH, легко можно идентифицировать, например, селекцией на
антибиотиках. Экспрессию вариантов s-GDH можно идентифицировать разными
способами, подобными измерению образовани транскриптов мРНК s-GDH mRNA,
регистрации генного продукта иммунологически или регистрации ферментативной
активности генного продукта. Предпочтительно используют ферментный анализ.
Насто щее изобретение также содержит инструкции относительно создани и скрининга
вариантов s-GDH. Осуществл ют случайный мутагенез и насыщающий мутагенез, как
известно в данной области. Варианты подвергают скринингу в отношении субстратной
специфичности (активность с глюкозой по сравнению с мальтозой) и значени KM дл глюкозы. Выбранные услови анализа адаптируют, чтобы гарантировать, что ожидаемые
небольшие усилени , вызванные, например, единственной аминокислотной заменой,
можно измерить. Один из способов селекции или скрининга подход щих мутантов приведен
в примере 3. Таким способом можно сно вы вить любое изменение или улучшение по
сравнению с ферментом дикого типа.
Конечно следует понимать, что не все экспрессирующие векторы и регул торные
последовательности ДНК могли бы функционировать одинаково хорошо, чтобы
экспрессировать последовательности ДНК согласно насто щему изобретению. И не все
клетки-хоз ева функционируют одинаково хорошо с одной и той же системой экспрессии.
Однако специалистом в данной области проведен соответствующий отбор среди
Страница: 14
RU 2 336 306 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
экспрессирующих векторов, регул торных последовательностей ДНК и клеток-хоз ев,
использу руководство, приведенное в данном описании без чрезмерного
экспериментировани .
Изобретение также относитс к способу получени вариантов s-GDH согласно
насто щему изобретению, включающему в себ культивирование клетки-хоз ина согласно
изобретению в услови х, подход щих дл получени мутантной s-GDH согласно
изобретению. Дл бактериальных клеток-хоз ев обычными услови ми культивировани вл ютс : жидка среда, содержаща источники углерода и азота, подход щий антибиотик
и индуцирующий агент (в зависимости от используемого экспрессирующего вектора).
Обычные подход щие антибиотики включают ампициллин, канамицин, хлорамфеникол,
тетрациклин и тому подобные. Обычные индукторы включают IPTG, глюкозу, лактозу и тому
подобные.
Предпочтительно полипептиды согласно насто щему изобретению получают
посредством продуцировани в клетках-хоз евах, экспрессирующих последовательность
ДНК, кодирующую мутантную s-GDH. Полипептиды согласно насто щему изобретению
также могут быть получены посредством трансл ции in vitro мРНК, кодируемой
последовательностью ДНК, кодирующей мутантную s-GDH, например, последовательности
ДНК могут быть синтезированы, как описано выше и встроены в подход щий
экспрессирующий вектор, который, в свою очередь, может быть использован в системе
транскрипции/трансл ции in vitro.
Экспрессирующий вектор, содержащий изолированный полинуклеотид, который
определен и описан выше, оперативно св занный с последовательностью промотора,
способного стимулировать его экспрессию в бесклеточной системе синтеза пептидов,
представл ет собой другой предпочтительный вариант осуществлени насто щего
изобретени .
Полипептиды, полученные, например, способами, которые описаны выше, затем могут
быть выделены и очищены с использованием различных стандартных способов очистки
белка. Например, можно использовать хроматографические способы, такие как
ионообменна хроматографи , гель-фильтрационна хроматографи и аффинна хроматографи .
Одним из основных применений улучшенных вариантов s-GDH согласно данному
изобретению вл етс применение в индикаторных полосках дл мониторинга уровней
глюкозы в крови у диабетических пациентов. Нечувствительность PQQ-зависимой
глюкозодегидрогеназы к кислороду вл етс , как обсуждалось выше, большим
преимуществом по сравнению с глюкозооксидазой. Более важно, что так как варианты sGDH имеют повышенную специфичность к глюкозе и существенно сниженную
ферментативную активность по отношению к другим сахарам, то мешающее воздействие
вследствие мальтозы, галактозы и/или других родственных сахаров, которые могут
присутствовать в анализируемом образце, существенно снижено. Конечно, могут быть
исследованы многие виды образцов. Жидкости организма, подобные сыворотке, плазме,
кишечному соку или моче, вл ютс предпочтительными источниками дл таких образцов.
Изобретение также относитс к способу вы влени , определени или измерени глюкозы в образце с использованием мутанта s-GDH согласно насто щему изобретению.
Особенно предпочтительно, что усовершенствованный способ вы влени глюкозы в
образце отличаетс тем, что указанное вы вление, определение или измерение глюкозы
осуществл ют с использованием сенсора или устройства на основе индикаторных
пластинок.
Также, в объем насто щего изобретени входит устройство дл вы влени или
измерени глюкозы в образце, содержащее мутант s-GDH согласно данному изобретению,
а также другие реагенты, требуемые дл указанного измерени .
Варианты s-GDH с улучшенной субстратной специфичностью согласно данному
изобретению также можно использовать с большим преимуществом в биосенсорах
(D'Costa, E. J., et al., Biosensors 2 (1986) 71-87; Laurinavicius, V., et al.,
Страница: 15
RU 2 336 306 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Analytical Letters 32 (1999) 299-316; Laurinavicius, V., et al., Monatshefte fuer
Chemie 130 (1999) 1269-1281; Malinauskas, A. et al., Sensors and Actuators, B:
Chemical 100 (2004) 395-402) дл оперативного мониторинга глюкозы в образце или
реакторе. С этой целью варианты s-GDH можно, например, использовать дл покрыти нечувствительного к кислороду стекл нного электрода с использованием комплекса осми ,
содержащего окислительно-восстановительную провод щую эпоксидную сеть (Ye et al.,
1993 выше) дл более точного определени концентрации глюкозы.
Также имеютс другие возможные применени вариантов s-GDH с улучшенной
субстратной специфичностью согласно данному изобретению. Например, указанные
варианты s-GDH можно использовать в способе получени альдоновых кислот. s-GDH
дикого типа имеет высокий оборот при окислении субстрата, продуциру глюконовую и
другие альдоновые кислоты. При использовании вариантов s-GDH, которые вл ютс более специфичными по отношению к глюкозе, получение глюконовой кислоты будет
давать намного меньше побочных продуктов. С использованием других вариантов s-GDH с
разной субстратной специфичностью можно получать разные альдоновые кислоты,
которые необходимы.
В следующих примерах все реагенты, ферменты рестрикции и другие материалы
получены из Roche Diagnostics Germany, если конкретно не указаны другие коммерческие
источники, и использованы согласно инструкци м, предлагаемым поставщиками. Процессы
и способы, используемые дл очистки, характеристики и клонировани ДНК, хорошо
известны в данной области (Ausubel, F., et al., в «Current protocols in molecular
biology» (1994) Wiley Verlag) и при необходимости могут быть адаптированы
специалистом в данной области.
Следующие примеры дополнительно иллюстрируют насто щее изобретение. Указанные
примеры не предназначены дл ограничени объема насто щего изобретени , а
обеспечивают дальнейшее понимание изобретени .
Пример 1
Клонирование и экспресси растворимой PQQ-зависимой глюкозодегидрогеназы дикого
типа A. calcoaceticus в E. coli
Ген s-GDH выдел ли из штамма Acinetobacter calcoaceticus LMD 79.41 согласно
стандартным способам. Ген s-GDH дикого типа субклонировали в плазмиде, содержащей
промотор mgl дл регулируемой экспрессии (сравни за вку на выдачу патента WO
88/09373). Новую конструкцию назвали pACSGDH (смотри фигуры 2 и 3). Рекомбинантные
плазмиды вводили в организм хоз ина, выбранный из группы E.coli. Затем указанные
организмы культивировали в подход щих услови х и отбирали колонии, про вл ющие
активность s-GDH.
Плазмиду pACSGDH выдел ли из 200 мл ночной культуры клона, указанного выше, с
использованием набора QIAGEN Plasmid Maxi (Qiagen) согласно протоколу производител .
Плазмиду ресуспендировали в 1 мл дважды дистиллированной воды. Концентрацию
плазмиды определ ли с использованием фотометра Beckman DU 7400.
Выход составл л 600 мкг. Затем определ ли качество плазмиды электрофорезом в
агарозном геле.
Пример 2
Создание мутанта T348G
В качестве важной исходной матрицы дл создани инсерционных вариантов получали
мутант s-GDH с мутацией T348G. Указанный мутант s-GDH был выбран потому, что он, как
известно, имеет пониженную активность по отношению к мальтозе по сравнению с
глюкозой (смотри WO 02/34919).
Использовали набор дл сайт-направленного мутагенеза QuickChange (Stratagene,
номер в каталоге 200518), чтобы заменить треонин в положении 348 глицином.
Конструировали подход щие праймеры.
5'- и 3'-праймеры, используемые дл мутагенеза, были комплементарны друг другу и
содержали модифицированный кодон дл замены треонин на глицин (ACA на GGG) в
Страница: 16
RU 2 336 306 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
центральном положении. Указанные нуклеотиды фланкировали 12-16 нуклеотидами на
каждом конце. Последовательности нуклеотидов были идентичны смысловой и
антисмысловой нити ДНК, фланкирующей кодон, используемый дл аминокислотной
замены. Вместо кодона ACA = треонину дл смысловой и TGT дл антисмысловой нити
праймеры содержали GGG = глицину дл смысловой и CCC дл антисмысловой нити
(смотри SEQ ID NO:3 и 4).
ПЦР-реакцию и расщепление DpnI осуществл ли согласно руководству. После этого 1
мкл образца использовали дл электропорации клеток XL-MRF'. Электропорацию
осуществл ли с использованием 2,5 кВ в 0,2 см-кювете, использу импульсный генератор
BioRad E. coli (BioRad). После выращивани в 1 мл LB при 37°C в течение одного часа
бактерии высевали на чашки с агаром и LB-ампициллином (100 мкг/мл ампициллина) и
выращивали в течение ночи при 37°C. Клоны с мутантной s-GDH исследовали, использу способ скрининга.
Пример 3
Скрининг
Мутантные колонии на чашках с агаром, описанных выше, собирали в планшеты дл микротитровани (MTP), содержащие 200 мкл среды LB с ампициллином/лунку и
инкубировали в течение ночи при 37°C. Такие планшеты названы матричными планшетами.
Из каждого матричного планшета по 5 мкл образца/лунку переносили в MTP,
содержащие 5 мкл на лунку B (B = реагент дл экстракции бактериального белка; Pierce
No. 78248) дл разрушени клеток и добавл ли 240 мкл 0,0556 мМ пирролохинолинхинона
(PQQ); 50 мМ Hepes; 15 мМ CaCl2 pH 7,0/лунку дл активации s-GDH. Чтобы завершить
образование голофермента, MTP инкубировали при 25°C в течение 2 часов и при 10°C в
течение ночи. Такой планшет назван рабочим планшетом.
Из рабочего планшета 3Ч10 мкл образца/лунку переносили в три пустых MTP. После
этого один планшет подвергали тестированию с использованием глюкозы в стандартной
концентрации, второй планшет с использованием пониженной концентрации глюкозы (1,9
мМ вместо 30 мМ) и третий с использованием мальтозы или другой выбранной молекулы
сахара в качестве субстрата. Все другие выбранные молекулы сахаров использовали в
эквимол рной стандартной концентрации, т.е. при 30 мМ. Дл всех анализов использовали
90 мкл раствора переносчика (смотри пример 7), уже содержащего анализируемый сахар.
Рассчитывали dE/мин и значение, полученное при использовании в качестве субстрата
30 мМ глюкозы, принимали за 100% активности. Значение, полученное с использованием
другого сахара, сравнивали со значением дл глюкозы и рассчитывали в процентах
активности ((например, дл мальтозы в виде: dE/мин дл мальтозы/dE дл глюкозы)?100).
Это эквивалентно перекрестной реактивности дл (варианта) фермента.
Значение, полученное с использованием 1,9 мМ глюкозы, сравнивали со значением дл 30 мМ глюкозы и рассчитывали в виде процента активности ((dE/мин дл 1,9 мМ
глюкозы/значение дл 30 мМ глюкозы)?100). В результате, получали %-значение, которое
вл етс непр мым показателем значени KM дл анализируемого варианта. Согласно
такому расчету более высокое %-значение свидетельствует о более низком (= более
хорошем) значении KM.
Идентифицировали следующий мутант:
Фермент M/G (30 мМ сахар в %) Активность 1,9/30 мМ глюкозы в % Аминокислотные замены
45
50
WT
105
70%
-
мутант
25-30%
21%
T348G
Пример 4
Секвенирование мутантного гена s-GDH, полученного в результате сайт-направленного
мутагенеза
Выдел ли плазмиду, содержащую ген мутанта s-GDH T348G, при этом мутант обладал
25-30% перекрестной реактивностью мальтоза/глюкоза (набор дл выделени высокоочищенной плазмиды, Roche Diagnostics GmbH, No. 1754785) и секвенировали,
Страница: 17
RU 2 336 306 C1
5
10
15
20
25
30
использу набор дл секвенировани с мечеными красителем терминаторами ABI Prism и
секвенатор ABI 3/73 и 3/77 (Amersham Pharmacia Biotech).
Использовали следующие праймеры:
Смыслова нить:
GDH 1: 5'-TTA ACG TGC TGA ACA GCC GG-3' (= SEQ ID NO:5)
GDH 2: 5'-ATA TGG GTA AAG TAC TAC GC -3' (= SEQ ID NO:6)
Результат:
Получена требуема мутаци на уровне ДНК и аминокислот, привод ща к замене T на
G в положении 348 (зрелый фермент). Дополнительной мутации в гене не обнаружено.
Пример 5
Создание инсерционных вариантов на основе мутанта T348G
Инсерционные варианты создавали, использу набор дл сайт-направленного
мутагенеза QuickChange (Stratagene, No. в каталоге 200518). Конструировали подход щие
праймеры дл инсерции между положени ми аминокислот 428 и 429 (смотри
последовательность ID NO: 2) и осуществл ли ПЦР с использованием мутанта s-GDH
(мутант T348G, смотри пример 4) согласно описанию производител .
Дл праймеров соответствующий кодон в положении инсерции синтезировали
случайным образом, получа все возможные замены 20 аминокислотами. Указанные
нуклеотиды кодона фланкировали 11-13 нуклеотидами на каждом конце.
Смыслова нить:
in429X_F: 5'-CTGCCGGAAATNNNGTCCAAAAAGATG -3' (=SEQ ID NO:7)
Антимыслова нить:
in429X_R: 5'-CATCTTTTTGGACNNNATTTCCGGCAG -3' (=SEQ ID NO:8)
ПЦР-реакцию и расщепление DpnI осуществл ли согласно руководству. После этого 1
мкл каждой реакционной смеси использовали дл электропорации клеток XL1F, как описано
выше. После выращивани в 1 мл LB при 37°C в течение одного часа бактерии высевали
на чашки с агаром и LB с ампициллином (100 мкг/мл ампициллина) и выращивали в
течение ночи при 37°C. Мутантные клоны s-GDH подвергали описанной процедуре
скрининга. Дл того чтобы статистически гарантировать, что скринингу были подвергнуты
варианты с 20 возможными аминокислотными инсерци ми, тестировали 200 клонов. Из
клонов с измененной субстратной специфичностью выдел ли плазмиды и секвенировали,
как описано выше.
Результаты:
Фермент M/G (30 мМ сахар) в % Активность 1,9/30 мМ глюкозы в % Аминокислотные замены
35
40
45
50
WT
105
70%
-
мутант A
25%
21%
T348G
A/2
36%
33%
T348G+ ins429G
A/3
34%
21%
T348G+ ins429K
A/4
19%
23%
T348G+ ins429F
A/5
26%
24%
T348G+ ins429V
A/6
22%
24%
T348G+ ins429L
A/7
16%
17%
T348G+ ins429M
A/8
18%
31%
T348G+ ins429P
Пример 6
Создание дополнительных инсерционных мутантов с высокой субстратной
специфичностью по отношению к глюкозе по сравнению с мальтозой
В WO 02/34919 идентифицировано несколько аминокислотных замен в разных
положени х s-GDH, чтобы повысить субстратную специфичность по отношению к глюкозе
по сравнению, например, с мальтозой. Комбинации аминокислотной замены T348G с
аминокислотными заменами в других положени х, например, в положени х 169, 171, 245,
341 и/или 349, еще больше повышали субстратную специфичность. Отбирали два мутанта,
описанных в данной публикации, с субстратной специфичностью дл мальтозы/глюкозы 3,5
и 7%, соответственно, чтобы получить инсерцию (в данном случае пролина) согласно
насто щему изобретению между положени ми 428 и 429. Инсерцию получали, использу Страница: 18
RU 2 336 306 C1
праймеры с последовательност ми SEQ ID NO: 9 и 10.
SEQ ID NO:9
insP429_F:
5'-GATACTGCCGGAAATCCAGTCCAAAAAG -3'
SEQ ID NO:10
insP429_R:
5'-CTTTTTGGACTGGTCCTCCGGCAGTATC -3'
5
Выделение плазмидных ДНК матриц, сайт-направленный мутагенез, ПЦР,
электропорацию, скрининг, секвенирование ДНК выбранных мутантов осуществл ли, как
описано выше.
Результаты:
10
Фермент
M/G (30 мМ сахар) в % Активность 1,9/30 мМ глюкозы в %
Аминокислотные замены
WT
105
70%
-
Матрица C/0
7%
9%
Y171G+E245D+M341V+ T348G
Инсерционный мутант C/1
4%
14%
Y171G+E245D+M341V+ T348G+ins429P
Матрица D/0
3,5%
10%
L169F+Y171G+E245D+M341V+ T348G
Инсерционный мутант D/1
2%
9%
L169F+Y171G+E245D+M341V+ T348G+ins429P
15
20
25
30
35
40
45
50
Из приведенных выше результатов можно легко увидеть, что субстратна специфичность мальтоза/глюкоза существенно изменена. Обнаружено, что превращение
мальтозы снизилось со 105% до 2-4% по сравнению с превращением мальтозы/глюкозы sGDH дикого типа. Мутанты C/1 и D/1 исследовали подробно.
Пример 7
Очистка и анализ ферментативной активности s-GDH дикого типа и варианта s-GDH,
соответственно
Выращенные клетки (LB-ампициллин 37°C) собирали и ресуспендировали в калийфосфатном буфере pH 7,0. Разрушение клеток осуществл ли, использу Френч-пресс (700900 бар). После центрифугировани надосадок наносили на колонку с S-сефарозой
(Amersham Biosciences), уравновешенную 10 мМ калий-фосфатным буфером pH 7,0. После
промывки s-GDH элюировали, использу градиент соли 0-1 М NaCl. Фракции, про вл ющие
активность s-GDH, объедин ли, диализовали против калий-фосфатного буфера pH 7,0 и
повторно хроматографировали на повторно уравновешенной колонке с S-сефарозой.
Активные фракции объедин ли и подвергали гель-фильтрации, использу колонку
Superdex® 200 (Amersham Biosciences). Активные фракции объедин ли и хранили
при -20°C.
Ферментный анализ и определение белка очищенного s-GDH дикого типа и варианта sGDH, соответственно:
Определение белка осуществл ли, использу реагент дл анализа белка No. 23225 из
Pierce (калибровочна крива с БСА, 30 мин, 37°C).
Образцы GDH разбавл ли до 1 мг белка/мл, использу 0,0556 мМ
пирролохинолинхинона (PQQ); 50 мМ Hepes; 15 мМ CaCl2 pH 7,0, и инкубировали при 25°C
в течение 30 минут дл разбавлени или активации.
После активации образцы разбавл ли 50 мМ Hepes; 15 мМ CaCl2 pH 7,0 примерно до
0,02 ед./мл и 50 мкл каждого разбавленного образца добавл ли к 1000 мкл 0,2 М
раствора цитратного буфера (pH 5,8; при 25°C), содержащего 0,315 мг (4(диметилфосфинилметил)-2-метилпиразоло[1.5a]имидазол-3-ил)-(4-нитрозофенил)амина
(смотри патент США 5484708)/мл в качестве переносчика и 30 мМ сахар).
Экстинкцию при 620 нм регистрировали в течение первых 5 минут при 25°C.
Одна единица активности фермента соответствует превращению 1 ммоль
переносчика/мин в указанных выше услови х.
Расчет: Активность = (общий объем ? dE/мин [ед./мл]): (? ? объем образца ? 1).
(? = коэффициент экстинкции; ?620 нм = 30[1? ммоль -1 ? см -1]).
Анализ осуществл ли с глюкозой и мальтозой (Merck, Germany), соответственно.
Результаты:
Фермент M/G (30 мМ сахар) в % Ед./мл белка
WT
105
800
Страница: 19
Аминокислотные замены
-
RU 2 336 306 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
C/1
4%
106
Y171G+E245D+M341V+ T348G+ins429P
D/1
1,5%
109
L169F+Y171G+E245D+M341V+ T348G+ins429P
Из указанных выше результатов очевидно, что новые варианты C/1 и D/1, содержащие
инсерцию между положени ми 428 и 429 s-GDH, представл ют собой дальнейшие
улучшени в отношении перекрестной реактивности к мальтозе/глюкозе. Несмотр на
различные аминокислотные замены и несмотр на инсерцию ферментативна активность
по отношению к глюкозе на мг/белка все еще составл ет более 10% от соответствующей
ферментативной активности дикого типа.
Пример 8
Определение глюкозы в присутствии или отсутствие мальтозы
s-GDH дикого типа и варианты s-GDH C/1 и D/1, соответственно, могут быть применены
дл определени глюкозы в присутствии или отсутствие мальтозы. Эталонный образец
содержит 50 мг глюкозы/дл. «Тестируемый» образец содержит 50 мг глюкозы/дл и 100 или
200 мг/дл мальтозы, соответственно. Дл каждого анализа используют одинаковые
количества активности GDH (ед./мл; смотри ферментный анализ выше).
В кювете смешивают:
1 мл 0,315 мг (4-(диметилфосфинилметил)-2-метилпиразоло[1.5a]имидазол-3-ил)-(4нитрозофенил)амин мл/0,2 М цитрат pH 5,8
0,033 мл эталонного или тестируемого образца
Анализ начинают добавлением в кювету 0,050 мл s-GDH (что вл етс избыточным
количеством s-GDH дл превращени глюкозы). Наблюдают изменение поглощени при
620 нм. Через 2-5 минут наблюдают посто нные значени и рассчитывают dE/5 мин.
Значение, полученное при измерении эталонного образца с s-GDH дикого типа, принимают
за 100%. Другие значени сравнивают с данным эталонным значением и рассчитывают в
%.
Результаты:
Безусловно, меньшее мешающее действие мальтозы вы влено в тестируемых образцах
при использовании новых вариантов. Очевидно, что концентраци s-GDH дл того, чтобы
лучше всего отличить глюкозу от мальтозы в образце, может быть дополнительно
оптимизирована. Слишком большое количество фермента может увеличивать
превращение мальтозы, слишком маленькое количество фермента может не превращать
всю глюкозу, и, следовательно, можно не достичь конечной точки поглощени .
Список литературы
Anthony C., Biochem. J. 320 (1996) 697-711.
Anthony, C. and Ghosh, M., Current Science 72 (1997) 716-727.
Anthony, C. and Ghosh, M., Prog. Biophys. Mol. Biol. 69 (1998) 1-21.
Anthony, C., Biochem. Soc. Trans. 26 (1998) 413-417.
Anthony, C., Adv. in Phot. and Resp. 15 (2004) 203-225.
Ausubel, F., et al., in "Current protocols in molcular biology" (1994), Wiley Verlag.
Cleton-Jansen, A. M., et al., Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 73-79.
Cleton-Jansen, A. M., et al., J. Bacteriol. 170 (1988) 2121-2125.
Cleton-Jansen, A. M., et al., Mol. Gen. Genet 217 (1989) 430-436.
Davidson, V. L. in "Principles and applications of quinoproteins" (1993) the whole
book, New York, Marcel Dekker.
Davies, D., Perit. Dial. Int. 14 (1994) 45-50.
D'Costa, E. J., et al., Biosensors 2 (1986) 71-87.
Dokter, P., et al., FEMS Microbiology Letters 43 (1987) 195-200.
Dokter, P., et al., Biochem J. 239 (1986) 163-167.
Dokter, P., et al., Biochem J. 254 (1988) 131-138.
Duine, J. A. Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter in
"The Biology of Acinetobacter" (1991) 295-312, New York, Plenum Press.
Duine, J. A., Biosens. Bioelectronics 10 (1995) 17-23.
Duine, J. A., Eur. J. Biochem. 200 (1991) 271-284.
Страница: 20
RU 2 336 306 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
EP 0 620 283.
EP 1 167 519.
EP 1 176 202.
EP 1 367 120.
Feng, D. F. and Doolittle, R. F., J. Mol. Evol. 25 (1987) 351-360.
Frampton, J. E.. and Plosker, G. L., Drugs 63 (2003) 2079-2105.
Goodwin, P. M. and Anthony, C., Adv. Microbiol. Physiol. 40 (1998) 1-80.
Hill, D. E., et al., Methods Enzymol. 155 (1987) 558-568.
Igarashi, S., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 264 (1999) 820-824.
JP 11243949.
JP2004173538.
Kaufmann, N., et al. Development and evaluation of a new system for determining
glucose from fresh capillary blood and heparinised venous blood in "Glucotrend"
(1997) 1-16, Mannheim, Boehringer Mannheim GmbH.
Kim, C. H. et al., Current Microbiology 47 (2003) 457-461.
Laurinavicius, V., et al., Analytical Letters 32 (1999) 299-316.
Laurinavicius, V., et al., Monatshefte fuer Chemie 130 (1999) 1269-1281.
Laurinavicius, V. et al, Biologija (2003) 31-34.
Leung, D. W., et al., Technique 1 (1989) 11-15.
Malinauskas, A. et al., Sensors and Actuators, B: Chemical 100 (2004) 395-402.
Matsushita, K. and Adachi, O. Bacterial quinoproteins glucose dehydrogenase and
alcohol dehydrogenase in "Principles and applications of Quinoproteins" (1993) 47-63,
New York, Marcel Dekker.
Matsushita, K., et al., Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 63-72.
Matsushita, K., et al., Biochemistry 28 (1989) 6276-6280.
Matsushita, K., et al., Bioscience Biotechnology & Biochemistry 59 (1995) 1548-1555.
Olsthoorn, A. J. and Duine, J. A., Arch. Biochem. Biophys. 336 (1996) 42-48.
Olsthoorn, A. J. and Duine, J. A., Biochemistry 37 (1998) 13854-13861.
Oubrie A., Biochim. Biophys. Acta 1647 (2003) 143-151.
Oubrie, A. and Dijkstra, B. W., Protein Sci. 9 (2000) 1265-1273.
Oubrie, A., et al., Embo J. 18 (1999) 5187-5194.
Oubrie, A., et al., J. Mol. Biol. 289 (1999) 319-333.
Oubrie, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 96 (1999) 11787-11791.
Reddy S, and Bruice, T.C., J. Am. Chem. Soc. 126 (2004) 2431-2438.
Sambrook, J., et al., in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989) -, Cold
Spring Harbour, NY, Cold Spring Harbour Laboratory Press.
US 5,484,708.
US 5,997,817.
US 6,057,120.
US 6,103,509.
Wens, R., et al., Perit. Dial. Int. 18 (1998) 603-609.
WO 02/34919 WO 88/09373 Yamada, M. et al., Biochim. Biophys. Acta 1647 (2003) 185-192.
Ye, L., et al., Anal. Chem. 65 (1993) 238-241.
Формула изобретени 1. Вариант PQQ-зависимой растворимой глюкозодегидрогеназы (s-GDH) (ЕС 1.1.99.17),
где указанный вариант содержит одну инсерцию аминокислотного остатка между
положени ми аминокислот, соответствующим положени м 428 и 429 последовательности
s-GDH дикого типа, известной дл A.calcoaceticus (SEQ ID NO:2), и, необ зательно,
дополнительно содержит одну или несколько аминокислотных замен.
2. Вариант по п.1, дополнительно отличающийс тем, что указанна встроенна аминокислота выбрана из группы, состо щей из фенилаланина, лейцина, метионина и
пролина.
Страница: 21
CL
RU 2 336 306 C1
5
10
15
20
25
30
35
3. Вариант по п.1 или 2, в котором указанной встроенной аминокислотой вл етс пролин.
4. Вариант по п.1, дополнительно отличающийс тем, что содержит замену
аминокислотного остатка в положении аминокислоты, соответствующем положению 348.
5. Вариант по п.4, дополнительно отличающийс тем, что треонин в положении 348
заменен аминокислотным остатком, выбранным из группы, состо щей из аланина, глицина
и серина.
6. Вариант PQQ-зависимой s-GDH по любому из пп.1-3, дополнительно отличающийс тем, что содержит по меньшей мере одну замену аминокислотного остатка в положении
аминокислоты, соответствующем положению 428.
7. Вариант PQQ-зависимой s-GDH по п.6, дополнительно отличающийс тем, что
аспарагин в положении 428 заменен аминокислотным остатком, выбранным из группы,
состо щей из лейцина, пролина и валина.
8. Вариант по п.1, содержащий замены в обоих положени х 348 и 428.
9. Вариант по п.1, дополнительно содержащий замену в положении 171.
10. Вариант по п.1, дополнительно содержащий замену в положении 245.
11. Вариант по п.1, дополнительно содержащий замену в положении 341.
12. Вариант по п.1, дополнительно содержащий замену в положении 169.
13. Вариант по п.1, дополнительно содержащий замену в положении 349.
14. Выделенный полинуклеотид, кодирующий s-GDH вариант белка по любому из пп.113.
15. Вектор экспрессии, содержащий выделенный полинуклеотид по п.14, функционально
св занный с последовательностью промотора, способного стимулировать экспрессию
указанного полинуклеотида в клетке-хоз ине E.coli.
16. Клетка-хоз ин E.coli, содержаща вектор экспрессии по п.15, котора используетс дл продукции s-GDH варианта белка по любому из пп.1-13.
17. Способ получени вариантов s-GDH, включающий в себ культивирование клеткихоз ина E.coli по п.16 в услови х, подход щих дл получени вариантов фермента.
18. Способ вы влени , определени или измерени глюкозы в образце с
использованием варианта s-GDH по любому из пп.1-13, который включает приведение в
контакт образца с указанным вариантом.
19. Способ по п.18, дополнительно отличающийс тем, что указанное вы вление,
определение или измерение глюкозы осуществл ют с использованием сенсорного
устройства или устройства на основе индикаторных полосок.
20. Применение варианта s-GDH по любому из пп.1-13 в устройстве дл вы влени или
измерени глюкозы в образце.
40
45
50
Страница: 22
RU 2 336 306 C1
Страница: 23
DR
RU 2 336 306 C1
Страница: 24
RU 2 336 306 C1
Страница: 25
RU 2 336 306 C1
Страница: 26
RU 2 336 306 C1
Страница: 27
RU 2 336 306 C1
Страница: 28
RU 2 336 306 C1
Страница: 29
RU 2 336 306 C1
Страница: 30
RU 2 336 306 C1
Страница: 31
RU 2 336 306 C1
Страница: 32
RU 2 336 306 C1
Страница: 33
?ин была заменена аланином, глицином. Более
предпочтительно замену в положении 349 осуществл ют аланином.
Как описано в WO 02/34919, замену аминокислоты в положении 348 последовательности
s-GDH, соответствующей последовательности дикого типа, выделенной из A.
calcoaceticus, можно использовать дл существенного повышени специфичности s-GDH к
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
1 075 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа