close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент РФ 2336525

код для вставки
РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
RU
(19)
(11)
2 336 525
(13)
C2
(51) МПК
G01N 33/49
(2006.01)
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
(21), (22) За вка: 2006132298/15, 08.09.2006
(73) Патентообладатель(и):
Государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образовани Российский государственный медицинский
университет Министерства здравоохранени Российской Федерации (RU)
(43) Дата публикации за вки: 20.03.2008
Адрес дл переписки:
117997, Москва, ул.Островит нова, 1, РГМУ,
пат.отдел, С.В.Пыжеву
(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ И ВРЕМЕНИ ЕЕ
2 3 3 6 5 2 5
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: GB 1325730, 08.08.1973. RU 2067764 С1,
10.10.1996. RU 2108579 C1, 10.04.1998. RU
2063037 C1, 27.06.1996. SU 1499234 A1,
07.08.1989. DE 3814838 C1, 24.05.1989. JP
5130899, 28.05.1993. WO 9207954, 14.05.1992.
(24) Дата начала отсчета срока действи патента:
08.09.2006
R U
(45) Опубликовано: 20.10.2008 Бюл. № 29
(72) Автор(ы):
Рощупкин Дмитрий Иванович (RU),
Мурина Марина Алексеевна (RU),
Петренко Юрий Михайлович (RU),
Филиппов Сергей Викторович (RU),
Соколов Александр Юрьевич (RU),
Сергиенко Валерий Иванович (RU)
2 3 3 6 5 2 5
параллельный пучок света, выдел ют пучок света,
прошедшего через образец в определенном
направлении, добавл ют агент, вызывающий
агрегацию клеток и свертывание плазмы, измер ют
параметры
выделенного
пучка
света.
Одновременное
исследование
агрегации
тромбоцитов и времени коагул ции плазмы на
одном и том же образце позвол ет более точно и
эффективно оценивать способность крови к
коагул ции. 4 ил.
R U
(57) Реферат:
Изобретение относитс к медицине, а именно к
способам исследовани крови, к анализу
функциональной
активности
тромбоцитов
и
коагул ционной способности плазмы крови.
Предложен оптический способ одновременного
исследовани агрегации тромбоцитов и времени
коагул ции плазмы. Дл осуществлени способа
смесь тромбоцитов и плазмы крови посто нно
перемешивают,
пропускают
через
нее
Страница: 1
RU
C 2
C 2
КОАГУЛЯЦИИ
RUSSIAN FEDERATION
RU
(19)
(11)
2 336 525
(13)
C2
(51) Int. Cl.
G01N 33/49
(2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY,
PATENTS AND TRADEMARKS
(12)
ABSTRACT OF INVENTION
(21), (22) Application: 2006132298/15, 08.09.2006
(24) Effective date for property rights: 08.09.2006
(43) Application published: 20.03.2008
(45) Date of publication: 20.10.2008 Bull. 29
Mail address:
117997, Moskva, ul.Ostrovitjanova, 1, RGMU,
pat.otdel, S.V.Pyzhevu
(54) METHOD OF EVALUATION OF THROMBOCYTE AGGREGATION IN BLOOD PLASMA AND
2 3 3 6 5 2 5
beam are measured. Simultaneous analysis of
thrombocyte aggregation and plasma coagulation
time of the same sample allows for more precise
and affective evaluation of blood coagulation.
EFFECT: more precise and affective evaluation
of blood coagulation.
3 ex, 4 dwg
R U
(57) Abstract:
FIELD: physics, measurement.
SUBSTANCE: invention refers to medicine,
specifically to methods of blood testing, to
analysis of thrombocyte functional activity and
coagulation ability of blood plasma. Optical
method of simultaneously analysed thrombocyte
aggregation and plasma coagulation time is
offered. Method is realised as follows. Mixed
thrombocytes and blood plasma are constantly
stirred. Parallel light beam is passed through
this mixture. Light beam passed through the
sample in certain direction is separated. Mixture
is added with agent inducing cell aggregation and
plasma coagulation. Parameters of separated light
Страница: 2
EN
C 2
C 2
TIME OF ITS COAGULATION
2 3 3 6 5 2 5
(73) Proprietor(s):
Gosudarstvennoe obrazovatel'noe uchrezhdenie
vysshego professional'nogo obrazovanija
Rossijskij gosudarstvennyj meditsinskij
universitet Ministerstva zdravookhranenija
Rossijskoj Federatsii (RU)
R U
(72) Inventor(s):
Roshchupkin Dmitrij Ivanovich (RU),
Murina Marina Alekseevna (RU),
Petrenko Jurij Mikhajlovich (RU),
Filippov Sergej Viktorovich (RU),
Sokolov Aleksandr Jur'evich (RU),
Sergienko Valerij Ivanovich (RU)
RU 2 336 525 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Изобретение относитс к медицине, а именно к способам исследовани крови. В
медицине существует больша потребность в способах анализа функциональной
активности тромбоцитов и коагул ционной способности плазмы крови. Активаци тромбоцитов, привод ща к их агрегации, и свертывание плазмы крови определ ют
внутрисосудистое тромбообразование при многих сердечно-сосудистых заболевани х.
Агрегацию тромбоцитов и свертывание крови необходимо исследовать при разработке
лекарств антиагрегантного и антикоагул нтного типа действи в цел х профилактики и
лечени опосредованных тромбоцитами тромбозов, при разработке способов диагностики
тромботических состо ний. Способность тромбоцитов к агрегации необходимо также
контролировать при консервировании и хранении тромбоцитарной массы, предназначенной
дл борьбы с кровотечени ми. Широко распространено лабораторное исследование смеси
тромбоцитов и плазмы крови и, в особенности, суспензии, называемой богатой
тромбоцитами плазмой, которую получают путем удалени из крови эритроцитов и
лейкоцитов. Существуют способы, позвол ющие раздельно исследовать либо агрегацию
тромбоцитов, либо процесс коагул ции плазмы крови.
Известен оптический турбидиметрический способ исследовани агрегации тромбоцитов
(Born, G.V.P. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its
reversal. "Nature", 1962. о.194, о.4832, pp.927-929), который заключаетс в том, что
на богатую тромбоцитами плазму крови направл ют пучок света, измер ют интенсивность
пучка света, прошедшего через исследуемый образец. Способность тромбоцитов к
агрегации оценивают по величине увеличени интенсивности этого прошедшего света.
Известен также способ анализа агрегации тромбоцитов, описанный в за вке РСТ
89/10562. Способ заключаетс в том, что через суспензию тромбоцитов пропускают пучок
света, измер ют интенсивность прошедшего света и параметры ее флуктуации,
возникающих при перемешивании образца тромбоцитов, на основании этих параметров
определ ют средний размер агрегатов.
Указанные способы не предусматривают измерение коагул ционной способности
исследуемого образца.
Имеетс изобретение (патент GB 1325730, за витель TECHNICON INSTRUMENS
CORP), которое предлагает оптический способ определени времени коагул ции
(свертывани ) жидкостей, включа кровь. Способ заключаетс в том, что исследуемый
образец смешивают с коагулирующим агентом и опаковыми магнитными частицами, смесь
перемешивают магнитной мешалкой, направл ют на образец пучок света и регистрируют
момент изменени мутности, которое происходит при коагул ции. Этот способ не включает
измерение агрегационной способности тромбоцитов.
Задача изобретени состо ла в создании простого оптического способа,
предназначенного дл одновременного исследовани агрегации тромбоцитов и времени
коагул ции плазмы в образце, представл ющем собой смесь тромбоцитов и плазмы крови.
Одновременное исследование агрегации тромбоцитов и времени коагул ции плазмы на
одном и том же образце позвол ет более точно и эффективно оценивать способность
крови к коагул ции.
Эта задача решаетс тем, что смесь тромбоцитов и плазмы крови посто нно
перемешивают, пропускают через нее параллельный пучок света, выдел ют пучок света,
прошедшего через образец в определенном направлении, добавл ют агент, вызывающий
агрегацию клеток и свертывание плазмы, измер ют параметры выделенного пучка света.
Одним из измер емых параметров вл етс интенсивность пучка света, прошедшего через
образец с отклонением от первоначального направлени распространени в интервале
малых углов, вход щих в диапазон от 0,5 до 10 градусов. Агрегационную способность
тромбоцитов устанавливают по величине, на которую возрастает интенсивность
выделенного пучка света до того, как произойдет коагул ци плазмы. Это достигаетс за
счет того оптического влени , что образование небольших тромбоцитарных агрегатов
вызывает увеличение интенсивности света, изменившего направление распространени в
результате рассе ни и распростран ющегос под малыми углами. Другой параметр
Страница: 3
DE
RU 2 336 525 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
представл ет собой зависимость от времени стандартного отклонени (его синонимом
вл етс среднее квадратическое отклонение) интенсивности прошедшего через образец
пучка света от ее средней величины. Непрерывно, с частотой не менее 10 Гц, фиксируют
интенсивность какого-либо пучка света, прошедшего через смесь тромбоцитов и плазмы
крови. Каждое значение стандартного отклонени и соответствующие ему величины
интенсивности света определ ют в пределах ограниченного периода, зависимость от
времени стандартного отклонени получают путем последовательного смещени по
времени такого периода на одно или более измерений величины интенсивности света.
Врем коагул ции плазмы крови устанавливают по промежутку времени с момента
введени в нее коагул нта до момента наибольшего значени стандартного отклонени .
Это значение стандартного отклонени достигаетс вследствие скачка интенсивности
прошедшего света в момент коагул ции плазмы, в который прекращаетс перемешивание
как результат остановки мешалки. Измерение стандартного отклонени по сравнению с
регистрацией изменени интенсивности света обладает тем преимуществом, что оно
отражает скорость изменени интенсивности, вл етс объективным параметром.
Наибольшее значение стандартного отклонени достигаетс в момент перегиба временной
зависимости интенсивности прошедшего света.
На фиг.1 дана схема использованного аппарата дл выделени пучков света,
прошедших через исследуемый образец; на фиг.2 - иллюстраци временной зависимости
интенсивности пучка света, прошедшего через образец богатой тромбоцитами плазмы
крови кролика с отклонением в пределах 0,5-10 градусов; на фиг.3 - иллюстраци временной зависимости интенсивности пучка света, прошедшего через образец богатой
тромбоцитами плазмы крови кролика без отклонени от первоначального направлени распространени и иллюстраци временной зависимости стандартного отклонени интенсивности прошедшего пучка света; на фиг.4 - зависимость интенсивности пучка
света, прошедшего через образец богатой тромбоцитами плазмы крови человека с
отклонением в пределах 0,5-10 градусов, и зависимость от времени стандартного
отклонени интенсивности этого пучка света; на фиг.5 - зависимость интенсивности
пучка света, прошедшего через образец с отклонением в пределах 0,5-10 градусов, в
случае богатой тромбоцитами плазмы крови человека с добавкой гепарина и без него и
зависимость от времени стандартного отклонени интенсивности этого пучка света.
Осуществление предлагаемого способа одновременного исследовани агрегации
тромбоцитов и времени коагул ции плазмы крови подтверждаетс следующими
примерами.
Пример 1
Кровь кролика из краевой вены уха, стабилизированную цитратом натри (9:1 по
объему), разливали в пластиковые пробирки и центрифугировали при 460 g в течение 15
минут при комнатной температуре. Полученный супернатант, представл ющий собой
богатую тромбоцитами плазму крови, использовали дл одновременного исследовани процессов агрегации тромбоцитов и коагул ции плазмы. Агрегацию тромбоцитов и
коагул цию плазмы стимулировали введением в образцы коллагена в конечной
концентрации 10 мкг/мл и ионов кальци в конечной концентрации 12 мМ. Момент введени этих реагентов служил точкой отсчета начала агрегации тромбоцитов и коагул ции
плазмы. Дл сравнени коагул цию исследуемого образца фиксировали также визуально,
при этом временем ее окончани служил момент остановки вращени мешалки. Врем коагул ции исследуемого образца составл ло 154 секунды.
В данном примере использовали два пучка света, один из которых проходит через
исследуемый образец без отклонени от первоначального направлени распространени ,
а другой проходит с отклонением. Измерени интенсивностей двух пучков света проводили
на кинетическом нефелометре (Рощупкин Д.И., Соколов А.Ю. Патент РФ №2067764),
который имеет два канала и позвол ет получать зависимость от времени (t)
интенсивностей рассе нного света (нефелометри ) и света, прошедшего без изменени направлени распространени (турбидиметри ). Схема аппарата представлена на фиг.1.
Страница: 4
RU 2 336 525 C2
5
10
15
Исследуемый образец богатой тромбоцитами плазмы крови в объеме 1 мл помещали в
пластиковую кювету толщиной 0,3 см (2), перемешивание образца осуществл ли с
помощью магнитной мешалки (3). На образец направл ли пучок излучени гелий-неонового
лазера (1) с длиной волны 631,8 нм. В канале дл измерени интенсивности света,
прошедшего через образец с отклонением от исходного направлени распространени ,
выдел етс пучок, который проходит в окрестности вокруг отражательного зеркала (4) и
попадает на собирательную линзу (5). Эта линза направл ет свет на детектор
(фототранзистор) (6) дл измерени интенсивности. Пр мой пучок света, т.е. прошедший
через образец без изменени направлени распространени , попадает на круглое
отражательное зеркало (4), которое направл ет его на второй детектор (фототранзистор)
(7). Электрические сигналы фотодетекторов, пропорциональные интенсивности света,
непрерывно поступали в компьютер с аналогово-цифровым преобразователем (плата ЛА70) (8) и обрабатывали с помощью специального программного обеспечени . Отсчет
интенсивности света в обоих каналах (I) проводили с частотой 10 Гц, т.е. через 0,1 с.
Стандартное отклонение (?) дл центра данного периода определ ли по обычной формуле
дл этого параметра
20
25
30
35
40
45
50
В этой формуле n обозначает количество измерений интенсивностей данного пучка
света, оно было равно 40 за период 4 секунды. Нижний индекс j обозначает текущее
значение интенсивности. Зависимость от времени получали, смеща период на 1
измерение (0,1 с).
После стимул ции образца интенсивность света, прошедшего через образец с
отклонением от первоначального направлени распространени , увеличивалась в
начальный временной интервал до 44 секунд, когда коагул ци еще не происходила
(фиг.2). Величина, на которую увеличиваетс интенсивность света, служит мерой
агрегационной способности тромбоцитов. В более поздний период на временной
зависимости обнаруживаетс резкий скачок, обозначенный стрелкой. Параллельно на
временной зависимости интенсивности пр мого пучка света (фиг.3, крива 1) и ее
стандартного отклонени (фиг.3, крива 2) регистрируетс резкий скачок. Период от
момента стимул ции до этого скачка стандартного отклонени составл ет 154 секунды,
практически совпадает с величиной времени коагул ции, определ емой визуально. Таким
образом, дл одновременного анализа агрегационной способности тромбоцитов и времени
свертывани плазмы в богатой тромбоцитами плазме крови допустимо одновременное
измерение интенсивности света, прошедшего через образец с отклонением, и определение
момента скачка стандартного отклонени интенсивности пр мого пучка света.
Пример 2
Кровь человека, вз тую из локтевой вены здорового донора, стабилизировали цитратом
натри (9:1 по объему), разливали в пластиковые пробирки и центрифугировали при 460 g
в течение 12 минут при комнатной температуре. Полученный супернатант,
представл ющий собой богатую тромбоцитами плазму крови, использовали дл одновременного исследовани процессов агрегации тромбоцитов и коагул ции плазмы.
Процедура стимул ции образца и используемый аппарат описаны в примере 1. Врем коагул ции, определ емое визуально, составл ло 273 секунды. В данном примере
использовали один пучок света, проход щий через исследуемый образец с отклонением от
первоначального направлени распространени .
Как и в предыдущем примере, после стимул ции образца интенсивность света
возрастала в начальный период (0-200 с). Это отражает агрегацию тромбоцитов (фиг.4,
крива 1). Позднее интенсивность отклоненного пучка света скачкообразно падает
(фиг.4, крива 1) и на временной зависимости ее стандартного отклонени (фиг.4,
крива 2) возникает резкий скачок (этот момент обозначен стрелкой). Врем от момента
Страница: 5
RU 2 336 525 C2
5
10
15
20
стимул ции до этого скачка стандартного отклонени есть врем коагул ции.
Действительно, оно составл ет 269 секунд, близко к величине времени коагул ции,
определ емой визуально. Таким образом, дл одновременного анализа агрегационной
способности тромбоцитов и времени свертывани плазмы в богатой тромбоцитами плазме
крови удобно измерение интенсивности света, прошедшего через образец с отклонением, в
сочетании с определением момента скачка стандартного отклонени дл интенсивности
пр мого пучка света.
Пример 3
Получали богатую тромбоцитами плазму крови человека, как это описано в примере 2.
Анализировали параметры пучка света, прошедшего через образец с отклонением от
первоначального направлени , на описанном в примере 1 аппарате. Процедуры
стимул ции образца и измерени параметров пучка света описаны в примере 2. Измерени параметров пучка света проводили два раза: в присутствии антикоагул нта гепарина,
введенного в образец до его стимул ции в конечной концентрации 0,1 МЕ/мл и без
антикоагул нта. Врем коагул ции при ее визуальном определении в присутствии гепарина
было равно 565 секунд и, как это должно быть, оно почти в 2 раза больше времени
коагул ции образца без антикоагул нта, составившее 283 секунды. В обоих случа х в
начальный промежуток времени после стимул ции (фиг.5, кривые 1 и 2) имело место
увеличение интенсивности пучка света за счет агрегации тромбоцитов. Период до скачка
(момент скачка обозначен стрелкой) стандартного отклонени в присутствии гепарина
(фиг.5, крива 4) достигал 570 секунд, превышал тот же параметр, равный 283 секунды,
в отсутствие гепарина (фиг.5, крива 3) в 2 раза. Таким образом, предлагаемый способ
позвол ет проводить анализ веществ на их способность оказывать антиагрегационный или
антикоагул нтный эффекты.
25
30
35
40
Формула изобретени Способ одновременного исследовани агрегации тромбоцитов и времени коагул ции
плазмы крови, заключающийс в том, что образец смеси тромбоцитов и плазмы крови
непрерывно перемешивают, направл ют на него параллельный пучок света, стимулируют
агрегацию тромбоцитов и коагул цию плазмы, выдел ют пучок света, прошедший через
образец с отклонением от первоначального направлени распространени в интервале
углов отклонени от 0,5 до 10°, определ ют интенсивность этого пучка света и по ее
величине определ ют агрегационную способность тромбоцитов, измер ют зависимость от
времени стандартного отклонени интенсивности прошедшего через образец пучка света
от ее средней величины, при этом каждое значение стандартного отклонени и
соответствующие ему величины интенсивности света определ ют в пределах
ограниченного периода, а зависимость от времени стандартного отклонени получают
путем последовательного смещени такого периода на одно или более измерений
величины интенсивности света, определ ют врем коагул ции плазмы как разницу между
моментом резкого увеличени стандартного отклонени интенсивности прошедшего света
и моментом стимул ции тромбоцитов и плазмы крови.
45
50
Страница: 6
CL
RU 2 336 525 C2
Страница: 7
DR
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
1
Размер файла
148 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа