close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент РФ 2336697

код для вставки
РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
RU
(19)
(11)
2 336 697
(13)
C1
(51) МПК
A01N 1/02 (2006.01)
A61K 35/54 (2006.01)
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
(21), (22) За вка: 2007128032/15, 20.07.2007
(72) Автор(ы):
Быстрова Ольга Владимировна (RU)
(24) Дата начала отсчета срока действи патента:
20.07.2007
(73) Патентообладатель(и):
Быстрова Ольга Владимировна (RU)
(45) Опубликовано: 27.10.2008 Бюл. № 30
R U
Адрес дл переписки:
197046, Санкт-Петербург, Каменноостровский
пр., 1/3, оф.30, ООО "Юридическа фирма
Городисский и Партнеры", филиал в г. СанктПетербург, пат.пов. И.Ю.Спесивцевой
C 1
C 1
2 3 3 6 6 9 7
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: БЫСТРОВА О.В.и др. Криоконсерваци овариальной ткани у пациенток со
злокачественными и доброкачественными
новообразовани ми органов репродуктивной
системы. - Журнал акушерства и женских
болезней, 2006, т. LV, вып. 4, с.63-69.
DONNEZ J. et al. Ovarian tissue
cryopreservation and transplantation: a
review. Human Reprod Update, 2006, Sep-Oct;
(см. прод.)
R U
2 3 3 6 6 9 7
(54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ТКАНИ ЯИЧНИКА К ТРАНСПЛАНТАЦИИ У ПАЦИЕНТОК СО
ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ НОВООБРАЗОВАНИЯМИ ОРГАНОВ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ
(57) Реферат:
Изобретение относитс к криобиологии и
медицине. Предлагаетс способ подготовки ткани
ичника к трансплантации у пациенток со
злокачественными новообразовани ми органов
репродуктивной системы. Способ предполагает
забор ткани ичника, обработку ткани средами,
отделение кортикального сло от медулл рной
части, криоконсервацию замораживанием ткани в
криовиолах от +4°С с пошаговым охлаждением
до -9°С, инициацию кристаллизации при -9°С и
выполнение пошагового охлаждени 0,3 °С/мин до
и
10°С/мин
до
температуры
-40°С
температуры -140°С, погружение в криобанк с
жидким азотом с температурой -196°С и хранение
с последующим размораживанием ткани дл трансплантации. Сущность способа заключаетс в
том, что дл обработки ткани используют Ftushingсреду с гепарином (Medicult) и затем среду Sperm
Preparation Medium (Medicult). Транспортировку во
льду осуществл ют в среде Sperm Preparation
Medium (Medicult). Далее кортикальный слой
нарезают на фрагменты на холодном столе и
подвергают дегидратации в течение 95 мин при
температуре +4°С путем помещени фрагментов
ткани в криовиолы с раствором 1,5 моль/л
пропандиола и с 0,1 моль/л сахарозы, после чего
осуществл ют
криоконсервацию.
После
размораживани ткань помещают в среду Sperm
Preparation Medium (Medicutt) при комнатной
температуре, в которой она находитс до
трансплантации,
но
не
более
20
минут.
Предлагаемый способ обеспечивает сохранение
архитектоники ткани ичника, выживаемость
фолликулов и клеточных компонентов стромы с
последующим
восстановлением
эндокринной
функции ичника после трансплантации. 1 з.п. флы, 3 табл., 4 ил.
(56) (продолжение):
12(5):519-35. Epub 2006 Jul 18. Найдено в Medline. PMID: 16849817. GOOK D.A. Effect of cooling rate
Страница: 1
RU
and dehydration regimen on the histological appearance of human ovarian cortex following
cryopreservation in 1, 2-propanediol. Human Reprod. 1999 Aug; 14(8):2061-8. Найдено в Medline. PMID:
10438427. HOVATTA О. et al. Cryopreservation of human ovarian tissue using dimethylsulphoxide and
propanediol-sucrose as cryoprotectants. Human Reprod. 1996 Jun; 11(6): 1268-72. Найдено в Medline.
PMID: 8671438. HREINSSON J. et al. Cryopreservation of follicles in human ovarian cortical tissue.
Comparison of serum and human serum albumin in the cryoprotectant solutions. Human Reprod. 2003 Nov;
18(11):2420-8. Найдено в Medline. PMID: 14585896.
R U
R U
2 3 3 6 6 9 7
C 1
C 1
2 3 3 6 6 9 7
Страница: 2
RUSSIAN FEDERATION
(19)
RU
(11)
2 336 697
(13)
C1
(51) Int. Cl.
A01N 1/02 (2006.01)
A61K 35/54 (2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY,
PATENTS AND TRADEMARKS
(12)
ABSTRACT OF INVENTION
(21), (22) Application: 2007128032/15, 20.07.2007
(72) Inventor(s):
Bystrova Ol'ga Vladimirovna (RU)
(24) Effective date for property rights: 20.07.2007
(73) Proprietor(s):
Bystrova Ol'ga Vladimirovna (RU)
(45) Date of publication: 27.10.2008 Bull. 30
R U
Mail address:
197046, Sankt-Peterburg, Kamennoostrovskij
pr., 1/3, of.30, OOO "Juridicheskaja firma
Gorodisskij i Partnery", filial v g. SanktPeterburg, pat.pov. I.Ju.Spesivtsevoj
2 3 3 6 6 9 7
the cortical layer is cut into fragments on cold
desk and dehydrated for 95 min. at the
temperature of +4°C through placement of tissue
fragments in the cryoviols filled with solution
of 1.5 gram-mol/l propanediol and 0.1 gram-mol/l
saccharose. The process is followed by further
cryopreservation. After defrosting the tissue is
placed in the Sperm Preparation Medium (Medicult)
at ambient temperature. It is left in this medium
till transplantation, but not more than 20
minutes. Suggested method ensures maintenance of
the ovary tissue architectonics, survival of the
follicles and stroma cellular components with
subsequent recovery of the ovary endocrine
function after transplantation.
EFFECT:
maintenance
of
ovary
tissue
architectonics, survival of follicles and stroma
cellular components with subsequent recovery of
ovary endocrine function after transplantation.
2 cl, 2 ex, 2 tbl, 4 dwg
R U
(57) Abstract:
FIELD: medicine.
SUBSTANCE: invention offers method of ovary
tissue preparation for transplantation for female
patients with malignant neoplasms of reproductive
system organs. Method implies ovary tissue
intake, tissue treatment with media, separation
of
cortical
layer
from
medullar
part,
cryopreservation by tissue freezing in cryoviols
from +4°C up to -9°C with stepwise cooling,
crystallization initiation at -9 °C and performance of
stepwise cooling of 0.3°C/min up to - 40°C and
10°C/min up to -140°C, immersion in the liquid
nitrogen cryobank with the temperature of -196°C and
storage with subsequent defrosting of tissue for
transplantation. The method essence is using
Ftushing media with heparin (Medicult) to treat
the tissue and then Sperm Preparation Medium
(Medicult). The tissue is transported in ice
using Sperm Preparation Medium (Medicult). Then
Страница: 3
EN
C 1
C 1
PATIENTS WITH MALIGNANT NEOPLASMS OF REPRODUCTIVE SYSTEM ORGANS
2 3 3 6 6 9 7
(54) METHOD FOR OVARY TISSUE PREPARATION FOR TRANSPLANTATION FOR FEMALE
RU 2 336 697 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Изобретение относитс к криобиологии и медицине и может найти применение в
онкологии у пациенток, имеющих злокачественные новообразовани органов
репродуктивной системы. Изобретение позвол ет подготовить ткань ичника к
трансплантации с ее дальнейшим проведением дл восстановлени гормонального фона и
репродуктивной функции.
Лечение злокачественных новообразований органов репродуктивной системы пациенток
включает в себ хирургическое лечение и последующую химио- и лучевую терапию. При
таком лечении не всегда удаетс вывести ичники из зоны облучени , что приводит к
выраженному угнетению функции ичников у женщин и гибели фолликул рного аппарата.
В св зи с этим современные методы лечени онкологических больных репродуктивного
возраста преследуют цель сохранени гормонального фона и возможности иметь
генетически собственного ребенка.
При этом особое значение предлагаемый способ имеет дл детей, прошедших курс
лечени по поводу лимфомы Ходжкина, поскольку последствием лечени этого
онкологического заболевани у девочек вл етс бесплодие.
До насто щего времени проблема социально-психологической реабилитации
онкологических пациенток не решена. С каждым годом среди онкологических больных
увеличиваетс дол женщин репродуктивного возраста, не реализовавших свою
репродуктивную функцию.
Современные возможности криобиологии позвол ют осуществл ть криоконсервацию
овариальной ткани с последующим хранением ее в жидком азоте многие годы.
Метод криоконсервации овариальной ткани перед оперативным или терапевтическим
лечением вл етс единственным методом, позвол ющим сохранить ткань ичника и в
дальнейшем восстановить у пациенток репродуктивную функцию и предоставить
возможность иметь генетически собственного ребенка.
Известно, что с помощью криоконсервации ткани ичника человека можно сохран ть
жизнеспособность и гормональную активность ткани ичника на многие годы. Клиническое
применение ткани ичника после размораживани позвол ет отказатьс от заместительной
гормональной терапии, повысить уровень рождаемости и преодолеть социальнопсихологические проблемы реабилитации онкологических пациенток. Особенно это
актуально в случа х наличи противопоказаний у пациентки к заместительной
гормональной терапии.
Известен способ консервации ткани ичника человека путем инкубировани его в
растворе криопротекторов различной концентрации с использованием пошагового
охлаждени в два этапа: сначала со скоростью 1°/мин до -15°С, далее со скоростью
10°/мин до -196°С и помещением в жидкий азот [Пушкарь Н.С. и др. Низкотемпературна консерваци и трансплантаци ичника. Рига, 1972, с.480].
Кроме того, известен способ консервации ткани ичника человека [а.с. SU №1017251,
МКИ А01N 1/00, опубл. 1983.15.05] путем помещени ткани ичника с криопротекторами в
герметичные полиэтиленовые ампулы и инкубировани в них в течение 30-40 мин. При
этом замораживание провод т в два этапа: первый этап ведут со скоростью 0,5-2°/мин до
(-6)-(-8)°С, после чего осуществл ют изотермическую выдержку в течение 8-10 мин, и
второй этап ведут со скоростью 9-10°/мин до (-40)-(-50)°С, после чего погружают в жидкий
азот. Размораживание осуществл ют в два этапа: от -196°С до (-60)-(-70)°С путем
погружени в спиртовую баню с температурой -70°С на 5-7 мин, затем от (-60)-(-70)°С до 0(+1)°С в вод ной бане при +40°С.
К недостаткам вышеуказанных способов следует отнести то, что в результате
применени этих способов происходит значительна потер клеточных элементов ткани
ичника после размораживани , что не позвол ет сохранить гормональную активность
ткани ичника. Данные нарушени привод т к потере функциональной активности ткани
ичника после трансплантации. Необходимо отметить также, что клиническое применение
криоконсервированной ткани ичника известными способами на практике может вызвать
р д проблем.
Страница: 4
DE
RU 2 336 697 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Одной из ключевых проблем сохранени овариальной ткани дл трансплантации
вл етс возникновение ишемии и некроза ткани после операции. Ткань, лишенную
нормальной оксигенации, можно сохранить за счет снижени метаболизма, что достигаетс с помощью гипотермии, котора обеспечивает сохранение ткани вследствие замедлени нормальных катаболических процессов и снижении потребности в кислороде.
Эту проблему успешно решает известный метод помещени ткани ичника после
резекции на лед в коммерческую IVF среду (Medicult) [Schmidt K.L., Byskow A.G., Nyboe
A.A. {et al} // Hum. Reprod. - 2003. - Vol.18 - P.1158-1164], после чего ткань
ичника возможно транспортировать на большие рассто ни .
Согласно методу, предложенному K.L.Schmidt et al., после резекции овариальную ткань
транспортируют на льду в коммерческой IVF среде (Medicult), что позвол ет успешно
сохранить примордиальные, первичные и вторичные фолликулы.
Однако к недостаткам способа, описанного K.L.Schmidt et al., следует отнести то,
что IVF среда быстро тер ет свою рН, что может оказать токсическое действие на
наход щуюс в ней ткань ичника.
Известен метод криоконсервации овариальной ткани у пациенток со злокачественными и
доброкачественными новообразовани ми органов репродуктивной системы [Быстрова
О.В., Диникина Ю.В., Тапильска Н.И., Лис нска А.С., Манихас Г.М. Журнал Акушерства
и женских болезней, том LV, выпуск 4/2006, с.63-69], вл ющийс наиболее близким
аналогом-прототипом дл предлагаемого способа подготовки ткани ичника к
трансплантации.
Согласно способу, прин тому в качестве прототипа, ткань ичника после резекции
обрабатывают физиологическим раствором. В качестве среды дл транспортировки ткани
используют фосфатный буфер Дюльбеко с 2,5% сывороточным альбумином человека
(HAS), после чего выполн ют отделение кортикального сло от медулл рной части и
нарезку фрагментов размером 5Ч10 мм и толщиной 1 мм на холодном столе в буфере
Дюльбеко с альбумином.
Затем провод т по коммерческим средам дл криоконсервации (Medicult) с восход щей
концентрацией криопротекторов (пропандиол и сахароза).
После этого осуществл ют криоконсервацию путем замораживани ткани в криовиолах
со стартовой температурой +4°С и пошаговым охлаждением 2°С/мин до -9°С, инициацию
кристаллизации при -9°С и выполнение пошагового охлаждени 0,3°С/мин до - 40°С,
10°С/мин до - 140°С, затем погружают в криобанк с жидким азотом (-196°С) и хран т до
момента размораживани с об зательным этапом контрольного размораживани одного
фрагмента ткани с целью оценки качества криоконсервации.
Известный способ позвол ет сохранить ткань ичника во врем транспортировки,
криоконсервации, что ведет к сохранению функциональной активности ткани ичника после
трансплантации. Вместе с тем, успешное использование размороженной ткани ичника дл трансплантации возможно при наличии сохраненной архитектоники ткани, структурной
целостности фолликулов и компонентов стромы, что подтверждаетс гистологическим
заключением, содержащим эти сведени .
Поскольку результат замораживани находитс в пр мой зависимости от количества
выживших фолликулов, то предлагаемый способ, в отличие от способа-прототипа,
характеризуетс подбором оптимальных условий сохранени ткани ичника после
резекции, улучшением процесса криоконсервации ткани и адаптации ткани после
размораживани .
Насто щим изобретением поставлена и решена задача создани способа подготовки
ткани ичника к трансплантации у пациенток, имевших злокачественные новообразовани органов репродуктивной системы и прошедших курс лечени по поводу рака тела матки и
рака шейки матки.
Предлагаемый способ позвол ет не только значительно улучшить выживаемость ткани,
но и в дальнейшем реализовать репродуктивную функцию путем клинического применени размороженной ткани ичника в качестве трансплантата.
Страница: 5
RU 2 336 697 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Технический результат изобретени состоит в том, что предлагаемый способ подготовки
ткани ичника к трансплантации у пациенток, имевших новообразовани органов
репродуктивной системы и прошедших курс лечени , обеспечивает сохранение
архитектоники ткани ичника, выживаемость фолликулов и клеточных компонентов стромы
с последующим восстановлением эндокринной функции ичника после трансплантации.
Кроме того, способ обеспечивает не только сохранение архитектоники ткани ичника, но
и увеличивает число фолликулов, способных полноценно функционировать за счет
предлагаемой техники забора ткани, выбранных дл культивировани сред, подобранного
времени эквилибрации в них и протокола замораживани и размораживани . Это
позвол ет после проведени трансплантации восстановить эндокринную функцию ичника
у пациенток, имевших злокачественные новообразовани органов репродуктивной системы
и прошедших курс лечени .
Дл достижени указанного результата в предлагаемом способе подготовки ткани
ичника к трансплантации у пациенток со злокачественными новообразовани ми органов
репродуктивной системы, включающем этап транспортировки ткани во льду,
характеризующемс тем, что осуществл ют забор ткани ичника, обработку ткани средами,
отделение кортикального сло от медулл рной части, криоконсервацию путем
замораживани ткани в криовиолах со стартовой температурой +4°С и пошаговым
охлаждением 2°С/мин до - 9°С, инициацию кристаллизации при -9°С и выполнение
пошагового охлаждени 0,3°С/мин до температуры - 40°С, 10°С/мин до температуры 140°С, последующее погружение в криобанк с жидким азотом с температурой -196°С и
хранение с последующим размораживанием ткани дл трансплантации, согласно
изобретению после забора ткани ее обрабатывают вначале Flushing-средой с гепарином
(Medicult) при комнатной температуре, затем средой Sperm Preparation Medium
(Medicult), после чего отдел ют кортикальный слой от медулл рной части, и ткань,
наход щуюс в стерильных пробирках в среде Sperm Preparation Medium (Medicult),
помещают в лед дл транспортировки, после чего кортикальный слой нарезают на
фрагменты размером 5Ч10 мм и толщиной 1 мм на холодном столе при температуре +4°С
и повергают дегидратации в течение 95 минут при температуре +4°С путем помещени фрагментов ткани в криовиолы с раствором 1,5 моль/л пропандиола и с 0,1 моль/л
сахарозы, затем осуществл ют криоконсервацию, а после размораживани ткань
помещают в среду Sperm Preparation Medium (Medicult) при комнатной температуре, в
которой она находитс до трансплантации, но не более 20 минут.
При этом через день после криоконсервации выполн ют размораживание контрольной
криовиолы по протоколу и гистологическую оценку состо ни фолликулов и стромы до и
после криоконсервации.
В процессе проведени исследований были выбраны среды дл стабилизации ткани
после резекции, растворы криопротекторов, подобраны протоколы замораживани и
размораживани , была установлена важность следующих стадий способа:
непосредственно после резекции фрагмент или целый ичник обрабатывают Flushingсредой с гепарином (Medicult) при комнатной температуре;
затем ткань помещают в Sperm Preparation Medium (Medicult);
отдел ют кортикальный слой от медулл рной части непосредственно перед
транспортировкой в операционной;
затем ткань ичника в Sperm Preparation Medium (Medicult) помещаетс в лед;
после чего кортикальный слой нарезают на фрагменты размером 5Ч10 мм и толщиной 1
мм на холодном столе при температуре +4°С;
перед проведением программного замораживани ткань ичника повергают одноэтапной
дегидратации в течение 95 минут при температуре +4°С путем помещени фрагментов
ткани размером 5Ч10 мм в криовиолы с раствором 1,5 моль/л пропандиола и с 0,1 моль/л
сахарозы;
после размораживани ткань помещают в среду Sperm Preparation Medium (Medicult) при
Страница: 6
RU 2 336 697 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
комнатной температуре, в которой она находитс до трансплантации, но не более 20 минут.
Использование Flushing-среды с гепарином (Medicult), имеющей в своем составе
пируват и бикарбонат натри , позвол ет минимизировать апоптотические процессы в ткани
вследствие резекции и, кроме того, способствует быстрому отмыванию ткани от крови.
Помещение ткани в Sperm Preparation Medium (Medicult), обогащенную глюкозой и
сывороточным альбумином человека, значительно лучше стабилизирует ткань в отсутствие
кровоснабжени . Неотъемлемой частью успешного сохранени ткани ичника вл етс определение времени эквилибрации и концентраци криопротекторов в растворе, что
составл ет 95 минут в растворе 1,5 моль/л пропандиола и с 0,1 моль/л сахарозы.
По данным, полученным в процессе исследований, наилучшие результаты получены с
использованием одноэтапной дегидротации в растворе пропандиола с сахарозой в течение
95 минут - это врем , необходимое дл полного пропитывани ткани криопротектором,
поскольку именно введение этих стадий в совокупности с известными ранее позвол ет
обеспечить не только сохранение архитектоники ткани, но и увеличить число фолликулов,
способных полноценно функционировать после трансплантации у пациенток, прошедших
лечение по поводу злокачественных новообразований.
Возможность объективного про влени технического результата при использовании
изобретени подтверждена достоверными данными, приведенными в примерах,
содержащих сведени экспериментального характера, полученные в процессе проведени исследований по методикам, прин тым в данной области.
Сущность изобретени по сн етс таблицами и фигурами.
В Таблице 1 приведен краткий анализ примеров клинического применени размороженной ткани ичника у пациенток.
В Таблице 2 представлены показатели, характеризующие гистологическую оценку
качества фолликулов.
В Таблице 3 представлены показатели, характеризующие гистологическую оценку
состо ни стромы.
На Фиг.1 показана диаграмма сравнени доли неповрежденных фолликулов в контроле
и после размораживани .
На Фиг.2 показана диаграмма сравнени доли неповрежденных клеточных структур
стромы в контроле и после размораживани .
На Фиг.3 иллюстративно показана методика оценку структуры фолликулов в
овариальной ткани.
На Фиг.4 иллюстративно показана методика оценку структуры стромы овариальной
ткани.
Изобретение иллюстрируетс следующими примерами:
- примером осуществлени способа подготовки ткани ичника к трансплантации (пример
1);
- примером, демонстрирующим сохранение архитектоники ткани ичника, выживаемости
фолликулов, а также увеличение числа фолликулов, способных полноценно
функционировать, и клеточных компонентов стромы, после трансплантации, вследствие
чего происходит восстановление гормонального фона дл реализации репродуктивной
функции пациенток со злокачественными заболевани ми (пример 2).
Пример 1. Способ подготовки ткани ичника к трансплантации
1. Техника забора ткани ичника
Непосредственно после овариоэктомии фрагмент или целый ичник обрабатываетс Flushing-средой с гепарином (Medicult) при комнатной температуре.
Затем ткань помещают в Sperm Preparation Medium (Medicult).
Отдел ют кортикальный слой от медулл рной части непосредственно перед
транспортировкой в операционной.
После этого в стерильных пробирках ткань в Sperm Preparation Medium (Medicult)
помещают в лед и транспортируют в лабораторию дл проведени криоконсервации.
2. Криоконсерваци ткани ичника
Страница: 7
RU 2 336 697 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
Кортикальный слой нарезают на фрагменты 10х5 мм и толщиной 1 мм на холодном
столе при +4°С.
Фрагменты ткани помещают в криовиолы с раствором 1,5 моль/л пропандиола и с 0,1
моль/л сахарозы на 95 минут при +4°С.
Помещают криовиолы с тканью в программный замораживатель Planer Cryo 360-1.7 с
начальной температурой +4°С.
Осуществл ют замораживание путем пошагового охлаждени 2°С/мин до - 9°С.
Выполн ют инициацию кристаллизации при -9°С.
Выполн ют пошаговое охлаждение 0,3°С/ мин до - 40°С, затем 10°С/мин до - 140°С и
последующее погружение в криобанк с жидким азотом (-196°С) дл хранени до момента
размораживани .
3. Контрольное размораживание ткани ичника
На следующий день после криоконсервации выполн ют размораживание контрольной
криовиолы, содержащей 1 фрагмент ткани.
Размораживание выполн етс по следующему протоколу.
Криовиолу с тканью извлекают из криохранилища и выдерживают 30 секунд на воздухе,
после чего быстро погружают в емкость с теплой водой (+37°С) и на вод ной бане ткань
размораживают в течение 3 минут.
Затем ткань провод т по средам коммерческого набора дл размораживани (Medicult).
После проводки ткань фиксируют в жидкости Буэна.
Данный фрагмент ткани отправл етс на гистологическое исследование.
Гистологическую оценку выполн ют на основании разработанной методики, в
соответствии с которой гистологическое заключение должно об зательно содержать
информацию об отсутствии атипичных клеток, о качестве сохранени строени фолликулов
и стромы.
4. Размораживание ткани ичника
Дл трансплантации необходимо от 5 до 10 фрагментов ткани в зависимости от места
трансплантации.
Из криохранилища извлекают 2-3 криовиолы с тканью и выдерживают 30 секунд на
воздухе. Затем быстро погружают в емкость с теплой водой (+37°С), на вод ной бане
ткань размораживают в течение 3 минут. После чего ткань провод т по средам
коммерческого набора дл размораживани (Medicutt) при комнатной температуре. Ткань
помещают в Sperm Preparation Medium при комнатной температуре, где она и находитс до
момента трансплантации, но не более 20 минут.
Пример 2. Восстановление эндокринной функции ичников у онкологическогих пациенток
Способ сохранени , криоконсервации и подготовки ткани ичника к трансплантации был
проведен в соответствии с Примером 1 в клинике АВА-ПЕТЕР (г.Санкт-Петербург)
совместно с Городским онкологическим диспансером г.Санкт-Петербурга на 5 пациентках с
новообразовани ми органов репродуктивной системы. Краткий анализ примеров
клинического применени размороженной ткани ичника у пациенток (клинический диагноз,
возраст, проводимое лечение, место трансплантации) представлен в Таблице 1.
Таблица 1
№ Нозоологическа форма Возраст
заболевани 45
Проводима терапи Место
имплантации
1. Рак шейки матки
31
Хирургическое лечение, химиотерапи , Верхн треть
Сочетанна лучева терапи (СЛТ)
предплечь 2. Рак шейки матки
30
Хирургическое лечение, СЛТ
3. Рак шейки матки
45
Хирургическое лечение, химиотерапи , Верхн треть
Сочетанна лучева терапи (СЛТ)
предплечь 4. Рак шейки матки
31
Хирургическое лечение
5. Рак тела матки
30
Хирургическое лечение, химиотерапи , Верхн треть
лучева терапи предплечь Сроки инициации фолликулогенеза, от
момента аутотрансплантации
11 недель
Передн брюшна 10 недель
стенка
Более 11 недель, наблюдение
продолжено
Передн брюшна 16 недель
стенка
50
Более 16 недель, стимул ци овул ции
Через 10 недель в случа х 1, 2, 3 на УЗ-исследовании обнаруживались растущие
Страница: 8
RU 2 336 697 C1
5
10
15
фолликулы в местах трансплантации. Через 12 недель отмечено стойкое увеличение
концентрации 17?-эстрадиола в крови пациенток в случа х 1, 2, 3. В случа х 4, 5
инициаци фолликулогенеза отмечена на несколько недель позже, но также
сопровождалась увеличением концентрации ингибина В и 17? -эстрадиола.
Представленные данные свидетельствуют о восстановлении эндокринной функции
ичников пациенток после криоконсервации и трансплантации.
Гистологическое исследование ткани ичника с целью оценки жизнеспособности
фолликулов было выполнено, как описано в Таблице 2 и Таблице 3. Эндокринна функци ичников подтверждаетс анализом крови на гормоны (17? -эстрадиол, ингибин В),
вырабатываемые тканью ичника. Перед трансплантацией концентраци 17?-эстрадиола
ингибина В не определ лись в крови. После трансплантации через 10 недель отмечалось
стойкое увеличение концентрации ингибина В, свидетельствующее о инициации
фолликулогенеза. В Таблице 1 представлен краткий анализ примеров клинического
применени размороженной ткани ичника у пациенток.
В Таблице 2 представлена гистологическа оценка качества фолликулов во фрагментах
ткани ичника.
Таблица 2
Оценка
20
25
Описание
1
Неповрежденное дро, неповрежденна цитоплазма, нет полости между гранулезными клетками и базальной мембраной фолликула,
нет пикноза в гранулезных клетках (норма).
2
Неповрежденное дро, неповрежденна цитоплазма, небольшое пространство между гранулезными клетками и базальной мембраной
фолликула (до 30% поверхности ооцита), и/или до 10% вакуолизации клеток гранулезы, нет пикноза в гранулезных клетках.
3
Конденсированное или пикнотическое дро, коллапсированна цитоплазма ооцита, эозинофили ооплазмы, наличие полости или
полостей между гранулезными клетками и базальной мембраной фолликула, выраженный пикноз в гранулезных клетках.
В Таблице 3 представлена гистологическа оценка клеточных компонентов стромы ткани
ичника.
Таблица 3
Оценка
1
30
35
40
45
50
Описание
Многоклеточна строма, отсутствие пикнотических дер в клетках, отсутствие полостей между клетками, без вакуолизации (норма).
2
Наличие немногочисленных пикнотических клеток, слаба вакуолизаци , наличие коллапсированных клеток.
3
Большое количество пикнотических клеток, выраженна вакуслизаци и/или наличие полостей между клетками, наличие
коллапсированных клеток.
Гистологический метод оценки позвол ет оценить нарушени в ткани, возникшие
вследствие криоконсервации.
На Фиг.1 показана диаграмма сравнени доли неповрежденных фолликулов в контроле
до и после размораживани с полностью сохраненной структурой, со слабо выраженными
повреждени ми и с выраженными повреждени ми строени фолликулов как в контроле, так
и после размораживани . Как видно из диаграммы сравнени , представленной на Фиг.1,
достоверна разница в количестве сохраненных фолликулов после размораживани составила 24% по сравнению с контролем.
На Фиг.2 показаны результаты доли клеточных компонентов стромы с полностью
сохраненной структурой, со слабо выраженными повреждени ми и с выраженными
повреждени ми строени стромы в контроле и после размораживани . При этом, как это
видно из диаграммы, представленной на Фиг.2, наблюдалась достоверна разница в 15%
между контролем и после размораживани ткани. Анализ клинического применени размороженной ткани ичника, проведенной на 5 пациентках, позвол ет сделать выводы о
том, что ткань ичника после овариоэктомии и криотрансплантации, а также ее
размораживани и трансплантации, восстанавливает эндокринную функцию.
На Фиг.3 иллюстративно показана методика оценки структуры фолликулов в
овариальной ткани. А - примордиальный фолликул с полностью сохраненной
гистологической структурой (оценка 1). Окраска гематоксилин-эозин. Ч1000; Б примордиальный фолликул с наличием полостей (показано стрелками) (оценка 2). Окраска
гематоксилин-эозинЧ1000; В - Примордиальный фолликул с конденсированным дром (1),
коллапсиоранной и эозинофильной цитоплазмой ооцита (2), с наличием полостей между
Страница: 9
RU 2 336 697 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
гранулезными клетками и базальной мембраной фолликула (3) (оценка 3). Окраска
гематоксилин-эозинЧ600. Как нагл дно видно из гистологических фотографий,
представленных на Фиг.3, услови криоконсервации и метод оценки вл ютс важными
критери ми клинического успеха.
На Фиг.4 иллюстративно показана методика оценки структуры стромы овариальной
ткани. А - многоклеточна строма с сохраненной гистологической структурой (оценка 1).
Окраска гематоксилин-эозинЧ1000; Б - строма со слабо выраженной вакуолизацией (1), с
наличием единичных пикнотических клеток (2) (оценка 2). Окраска гематоксилинэозинЧ1000; В - Строма с выраженной вакуолизацией клеток (3), с наличием
коллапсированных клеток (Оценка 3). Окраска гематоксилин-эозин. Ч1000. Состо ние
клеточных компонентов стромы, как нагл дно видно из гистологических фотографий,
представленных на Фиг.4, неотъемлемо св зано с выживаемостью фолликулов. Начальные
этапы фолликулогенеза завис т от паракринной регул ции между стремой и фолликулом.
Приведенные данные демонстрируют сохранение архитектоники ткани ичника,
выживаемость фолликулов, а также увеличение числа фолликулов, способных полноценно
функционировать, и клеточных компонентов стромы, после трансплантации, вследствие
чего и происходит восстановление гормонального фона дл реализации репродуктивной
функции пациенток со злокачественными заболевани ми.
Таким образом, предложенный способ сохран ет ткань ичника на многие годы, что
вл етс важным дл реабилитации пациенток со злокачественными новообразовани ми,
что подтверждаетс анализами крови на 17?-эстрадиол и ингибин, а также УЗисследованием.
Формула изобретени 1. Способ подготовки ткани ичника к трансплантации у пациенток со злокачественными
новообразовани ми органов репродуктивной системы, включающий этап транспортировки
ткани во льду, характеризующийс тем, что осуществл ют забор ткани ичника, обработку
ткани средами, отделение кортикального сло от медулл рной части, криоконсервацию
путем замораживани ткани в криовиолах со стартовой температурой +4°С и пошаговым
охлаждением 2°С/мин до -9°С, инициацию кристаллизации при -9°С и выполнение
пошагового охлаждени 0,3°С/мин до температуры -40°С, 10°С/мин до
температуры -140°С, последующее погружение в криобанк с жидким азотом с
температурой -196°С и хранение с последующим размораживанием ткани дл трансплантации, отличающийс тем, что после забора ткани, ее обрабатывают вначале
Flushing-средой с гепарином (Medicult) при комнатной температуре, затем средой Sperm
Preparation Medium (Medicult), после чего отдел ют кортикальный слой от медулл рной
части, и ткань, наход щуюс в стерильных пробирках в среде Sperm Preparation Medium
(Medicult) помещают в лед дл транспортировки, после чего кортикальный слой нарезают
на фрагменты размером 5Ч10 мм и толщиной 1 мм на холодном столе при
температуре +4°С и подвергают дегидратации в течение 95 мин при температуре +4°С
путем помещени фрагментов ткани в криовиолы с раствором 1,5 моль/л пропандиола и с
0,1 моль/л сахарозы, затем осуществл ют криоконсервацию, а после размораживани ткань помещают в среду Sperm Preparation Medium (Medicult) при комнатной температуре,
в которой она находитс до трансплантации, но не более 20 мин.
2. Способ подготовки по п.1, отличающийс тем, что через день после
криоконсервации, выполн ют размораживание контрольной криовиолы по протоколу и
гистологическую оценку состо ни фолликулов и стромы до и после криоконсервации.
50
Страница: 10
CL
RU 2 336 697 C1
Страница: 11
DR
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
1
Размер файла
798 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа