close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент РФ 2337109

код для вставки
РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
RU
(19)
(11)
2 337 109
(13)
C2
(51) МПК
C07K 16/06 (2006.01)
A61L 2/00 (2006.01)
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
(21), (22) За вка: 2006134285/13, 25.02.2005
(30) Конвенционный приоритет:
27.02.2004 US 60/548,107
(73) Патентообладатель(и):
ОКТАФАРМА АГ (CH)
(43) Дата публикации за вки: 10.04.2008
R U
(24) Дата начала отсчета срока действи патента:
25.02.2005
(72) Автор(ы):
БУХАХЕР Андреа (AT),
ИБЕРЕР Гюнтер (AT),
РЕМИШ Юрген (AT)
(45) Опубликовано: 27.10.2008 Бюл. № 30
2 3 3 7 1 0 9
2 3 3 7 1 0 9
R U
(85) Дата перевода за вки PCT на национальную фазу:
27.09.2006
C 2
C 2
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: STEINBUCH М. ЕТ AL. The isolation of
IgG from mammalian sera with the aid of
caprylic acid. Arch Biochem biophys, 1969
Nov., 134(2), p.279-84. HABEEV A.F.S.A. ET
AL. Preparation of human immunoglobulin by
caprylic acid preparation, Preparative
Biochemistry, 1984, 14(1), p.1-17. SU 836831,
23.04.1982.
(86) За вка PCT:
EP 2005/050812 (25.02.2005)
(87) Публикаци PCT:
WO 2005/082937 (09.09.2005)
Адрес дл переписки:
129010, Москва, ул. Б.Спасска , 25, стр.3,
ООО "Юридическа фирма Городисский и
Партнеры", пат.пов. Е.Е.Назиной, рег. № 517
(54) ПРЕПАРАТ ИММУНОГЛОБУЛИНА IgG И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
(57) Реферат:
Изобретение относитс к биотехнологии.
Способ осуществл ют следующим образом:
довод т рН исходного раствора до 4,6-4,95 и
добавл ют к нему каприлат- и/или гептаноат-ионы,
поддержива рН на уровне 4,8-4,95. Инкубируют
раствор супернатанта в услови х, при которых
концентраци каприлат- и/или гептаноат-ионов
составл ет 10-30 мМ. Нанос т фильтрованный
раствор на анионообменную смолу в услови х,
обеспечивающих св зывание загр зн ющих
примесей со смолой в отсутствие значительного
св зывани антител со смолой. Способ позвол ет
получить очищенный, вирусологически безопасный
и инактивированный с вирусологической точки
зрени препарат антител. 2 н. и 20 з.п. ф-лы, 2
ил., 2 табл.
Страница: 1
RU
C 2
C 2
2 3 3 7 1 0 9
2 3 3 7 1 0 9
R U
R U
Страница: 2
RUSSIAN FEDERATION
RU
(19)
(11)
2 337 109
(13)
C2
(51) Int. Cl.
C07K 16/06 (2006.01)
A61L 2/00 (2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY,
PATENTS AND TRADEMARKS
(12)
ABSTRACT OF INVENTION
(21), (22) Application: 2006134285/13, 25.02.2005
(72) Inventor(s):
BUKhAKhER Andrea (AT),
IBERER Gjunter (AT),
REMISh Jurgen (AT)
(24) Effective date for property rights: 25.02.2005
(30) Priority:
27.02.2004 US 60/548,107
(43) Application published: 10.04.2008
(45) Date of publication: 27.10.2008 Bull. 30
2 3 3 7 1 0 9
(85) Commencement of national phase: 27.09.2006
(86) PCT application:
EP 2005/050812 (25.02.2005)
(87) PCT publication:
WO 2005/082937 (09.09.2005)
2 3 3 7 1 0 9
R U
(54) PREPARATION OF ANTIBODY IgG AND METHOD OF ITS PRODUCTION
(57) Abstract:
FIELD: technological processes; pharmacology.
SUBSTANCE: method is implemented in the
following manner: pH of initial solution is
brought
to
4.6-4.95,
and
caprilatand/or
heptanoate-ions are added to it, while pH is
maintained at the level of 4.8-4.95. Supernatant
solution is incubated under conditions, at which
concentration of caprilat- and/or heptanoate-ions
makes 10-30 mM. Filtered solution is applied on
anion-exchanging resin, under conditions that
provide binding of contaminating admixtures with
resin in the absence of considerable binding of
antibodies with resin.
EFFECT: method makes it possible to produce
preparation
of
antibody
that
is
purified,
virologically
safe
and
inactivated
from
virological point of view.
Страница: 3
22 cl, 2 dwg, 2 tbl, 3 ex
C 2
C 2
Mail address:
129010, Moskva, ul. B.Spasskaja, 25, str.3,
OOO "Juridicheskaja firma Gorodisskij i
Partnery", pat.pov. E.E.Nazinoj, reg. № 517
EN
R U
(73) Proprietor(s):
OKTAFARMA AG (CH)
RU 2 337 109 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Насто щее изобретение относитс к способу получени очищенных, безопасных с
вирусологической точки зрени препаратов антител из исходного раствора, содержащего
антитела и загр зн ющие примеси. Описываетс процесс очистки гамма-глобулинов из
плазмы крови человека и других первичных источников. Стадии инактивации и удалени вирусов включены в описанный здесь производственный процесс.
Преципитаци и происход щее в результате удаление/инактиваци вирусов
В 1940-х годах Cohn с соавторами ввели в практику фракционирование человеческой
плазмы холодным этанолом. Несколько вариантов данной методики были позже
разработаны дл повышени чистоты и/или выхода различных интермедиатов. Было
показано, что некоторые стадии в процессе фракционировани по Cohn вл ютс эффективными в инактивации и удалении вирусов. В особенности в процессе очистки IgG
отделение фракции I+III, по Cohn, чрезвычайно эффективно дл данных целей.
Определенные чувствительные вирусы (главным образом оболочечные вирусы)
разрушаютс под воздействием низких pH и EtOH, и значительна часть как оболочечных,
так и безоболочечных вирусов может быть удалена путем распределени в преципитате I+
III, который обычно отбрасываетс .
В 1960-х годах было показано, что низкомолекул рные жирные кислоты (С6-С12)
образуют нерастворимые комплексы с ?- и ?-глобулинами, в то врем как ?-глобулины
обычно столь же легко не преципитируютс (Chanutin et al., 1960). Steinbruch с
соавторами (1996) описали процесс очистки с каприлатом (т.е. октаноатом, солью С8насыщенной жирной кислоты) в качестве преципитирующего агента.
Неиммуноглобулиновые компоненты преципитировали из человеческой плазмы после
разбавлени ацетатным буфером до конечного значени pH 4,8. После добавлени каприлата при интенсивном перемешивании получали раствор, обогащенный IgG. Чистота
и выход зависели от количества каприловой кислоты, pH, мол рности буфера и фактора
разведени . Steinbruch с соавторами утверждали также, что преимущественным вл етс добавление эффективного количества каприлата в две стадии с удалением промежуточных
преципитатов. Вирусы, имеющие и не имеющие внешнюю оболочку, удал ют путем
распределени в преципитате не-IgG-белков, как в случае отделени фракции I+III.
Хроматографи В нескольких патентах описана очистка растворов IgG в так называемом отрицательном
режиме; IgG проходит без св зывани (только в следовых количествах), в то врем как бульша часть не-IgG-белков св зываетс с анионными лигандами (Bertolini et al.
1998, WO-A-98/05686; Lebing 1999, US-A-5886154; Friesen et al., 1986, CA 1201063).
Комбинаци преципитации каприлатом с последующей ионообменной хроматографией дл очистки IgG была описана во многих публикаци х. Одной из первых была работа Steinbuch
с соавторами (1969). Он описал дальнейшую очистку IgG на DEAE-целлюлозе после
преципитации каприлатом. В недавней работе Lebing с соавторами (2003) описано
последовательное использование двух анионообменных колонок дл удалени IgM, IgA,
альбумина и других загр зн ющих примесей. Lebing с соавторами скомбинировали оба
эффекта, опосредованных действием каприлата, а именно, необходимое снижение
содержани не-IgG-белков за счет преципитации, обеспечивающее отделение вирусов, и
способность жирных кислот инактивировать оболочечные вирусы, реализованную на
дополнительной стадии инкубации. Так называемый «pH-свинг» Lebing с соавторами
(2003), заключающийс в последовательных стади х разведени содержащей IgG
пасты/преципитата при pH 4,2 и добавлени каприлата одновременно с доведением
значени pH до 5,2, подчеркиваетс как необходимый дл процедуры обогащени IgG,
таким образом нужда сь в эффективном снижении содержани не-IgG-белков. Как
некоторые другие загр зн ющие примеси, такие как IgM и IgA, так и каприлат затем
удал ют за счет выполнени вышеупом нутых последующих стадий ионообменной
хроматографии.
Неожиданно авторами было обнаружено, что подобный обсуждаемый выше pH-сдвиг,
описанный Lebing с соавторами, не вл етс необходимым дл достижени значительного
Страница: 4
DE
RU 2 337 109 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
эффекта очистки в результате добавлени каприлата и удалени полученного
преципитата. Вместо этого эффективное обогащение IgG достигаетс при поддержании
посто нного pH на уровне 4,6-4,95 в течение всего процесса разведени пасты,
инкубации с каприлатом и удалени преципитата. Также содержание загр зн ющих
примесей, в особенности альбумина, снижаетс более эффективно при поддержании
посто нного pH на уровне 4,8-4,95. В то же врем вирусы также удал ютс . На последней
стадии оставшиес загр зн ющие примеси и каприлат удал ют путем ионообменной
хроматографии.
Классическа инактиваци вирусов
Использование растворител /детергента (S/D) и действие pH 4 вл ютс хорошо
известными способами и широко используютс дл (очистки) иммуноглобулинов. Обычно в
подобных процессах используетс обработка SD из-за превосходства этого метода в
инактивации оболочечных вирусов (Biesert L. Clinical and Experimental Rheumatology
1996; 14: 47). Как оболочечные, так и безоболочечные вирусы чувствительны к действию
низких значений pH, хот оболочечные вирусы более чувствительны, нежели
безоболочечные (Biesert. Clinical and Experimental Rheumatology 1996; 14: 47, Bos et
al. Biologicals 1998; 26: 267, In Seop et al. J Microbiol Biotechnol 2001; 11: 619).
В документе EP-A-0 525 502 описано комбинированное действие растворител /детергента
(S/D) и pH 4 в качестве стадий инактивации вирусов.
Фильтраци вирусов
Дл повышени вирусологической безопасности растворы IgG фильтруют через
мембраны с чрезвычайно малым размером пор (обычно от 15 до 50 нм) в услови х,
удерживающих вирусы по механизму, в основном основанному на гель-фильтрации
(Burnouf and Radosevich. Haemophilia 2003; 9: 24). Также дл фильтрации
иммуноглобулинов используютс глубинные фильтры, удерживающие вирусы за счет
ионообменной адсорбции.
Краткое описание изобретени Насто щее изобретение относитс к процессу очистки IgG с высоким выходом и
сниженным временем процесса по сравнению с классическим процессом
фракционировани по Кону-Онкли. IgG развод т в буфере в услови х кислого pH в
диапазоне от 4,6 до 4,95, предпочтительно 4,9. Не-IgG-белки отдел ют путем
двухстадийной инкубации с каприлатом в диапазоне концентраций от 10 до 30 мМ,
предпочтительно 20 мМ.
Дл эффективной инактивации оболочечных вирусов и повышени инактивирующей
активности всего процесса в целом может быть добавлена стади инкубации, известна как обработка растворителем/детергентом, т.е. одновременна обработка растворителем
(таким как TnBP) и детергентом, таким как Triton X-100, Tween 80 и т.д. К процедурам
удалени вирусов также может быть добавлено удаление вирусов, к примеру, путем так
называемой нанофильтрации либо использовани зар женных глубинных фильтров. Далее
в комбинации с вышеупом нутыми способами может быть использована обработка УФ-С.
Подобные способы описаны, к примеру, в документах EP-A-0 840 624 и EP-A-0 422 007.
Далее каприлат/каприлова кислота могут быть заменены или скомбинированы с
гептаноатом/гептановой кислотой дл выполнени вышеупом нутых стадий преципитации
и инкубации.
В продукте, получаемом описанным в за вке способом, вирусы инактивированы (либо
удалены). Прионы также инактивируют/удал ют в процессе обработки каприлатом.
Фиг.1 и 2 представл ют из себ блок-схему, иллюстрирующую специфические
воплощени процесса согласно насто щему изобретению.
Подробное описание изобретени Данное изобретение относитс к способу получени очищенных, вирусологически
безопасных и инактивированных с вирусологической точки зрени препаратов антител из
исходного раствора, содержащего антитела и загр зн ющие примеси, способ включает в
себ следующие стадии:
Страница: 5
RU 2 337 109 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
(а) доведение pH исходного раствора приблизительно до 4,6-4,95, в частности
приблизительно до 4,8-4,95, дл получени промежуточного раствора;
(b) добавление каприлат- и/или гептаноат-ионов в промежуточный раствор при
поддерживании pH на уровне приблизительно 4,6-4,95, в частности на уровне
приблизительно 4,8-4,95, что приводит к образованию преципитата, при этом антитела
присутствуют в основном в супернатанте;
(с) инкубирование раствора супернатанта в услови х, включающих в себ определенные
концентрации каприлат- и/или гептаноат-ионов, врем , pH и температуру; необ зательно
концентрирование и диафильтрацию раствора до доведени pH;
(d) нанесение фильтрованного раствора по меньшей мере на одну анионообменную
смолу и необ зательно - на две различные анионообменные смолы в услови х,
обеспечивающих св зывание загр зн ющих примесей со смолой в отсутствие
значительного св зывани антител со смолой, с получением очищенных, вирусологически
безопасных и инактивированных с вирусологической точки зрени препаратов антител.
В одном из воплощений насто щего изобретени инактивированный с вирусологической
точки зрени раствор на стадии (d) привод т в контакт по меньшей мере с одной
анионообменной смолой в диапазоне pH приблизительно 5,0-5,2. В случае применени двух хроматографических стадий с двум анионообменниками втора стади должна
выполн тьс в диапазоне pH от 6,7 до 6,9. Стадии (b) и (с) могут быть (но
необ зательно) повторены по меньшей мере один раз. Обработка каприлатом при pH 4,9
приводит к значительному удалению нежелательных белков.
В типичном случае исходный раствор содержит антитела, полученные из плазмы.
На стадии (d) может быть полезно привести инактивированный раствор в контакт с
двум различными анионообменными смолами в услови х, обеспечивающих св зывание
загр зн ющих примесей со смолой в отсутствие значительного св зывани антител со
смолой.
Предпочтительно, антитела представл ют собой иммуноглобулины G-типа.
Между двум стади ми анионообменной хроматографии (AEX) pH может быть изменен,
в частности, до 6,8±0,1. Сошедший с хроматографической колонки раствор может быть
сконцентрирован до 60-90 мг/мл и подвергнут диафильтрации против, к примеру,
фосфатного буфера. В другом воплощении насто щего изобретени сошедший после
первой AEX с хроматографической колонки раствор одновременно обрабатывают
растворителем и детергентом, предпочтительно TnBP и Triton X-100 соответственно, в
предпочтительных концентраци х 1% Triton X-100 и 0,3% TnBP на прот жении от 4,5 до 8
часов, дл инактивации вирусов с липидной оболочкой. Данный способ известен как
обработка растворителем и раскрыт в документе EP-A-0 131 740 (включен посредством
ссылки). Согласно изобретению детергенты инкубируемой смеси, в частности, удал ют
путем экстракции из твердой и жидкой фаз. После экстракции твердой фазы pH раствора
довод т до 6,7-6,9. Комбинаци S/D-обработки и инактивации вирусов каприлатом
приводит к получению более (вирусологически) безопасного продукта.
Раствор далее может быть подвергнут AEX на второй колонке, и pH сошедшего с
колонки в результате AEX раствора может быть доведен, к примеру, до 3,5-4,5, в
частности - до 4,0±0,1. Согласно изобретению раствор IgG с доведенным pH далее
привод т в контакт с фильтром, удерживающим вирусы. Эта необ зательна стади в
комбинации с обработкой каприлатом приводит к получению более вирусологически
безопасного продукта.
Раствор IgG также может быть проинкубирован при 37°С±1 на прот жении по меньшей
мере 24 часов. Дл повышени уровн вирусологической безопасности препарата антител
обработка УФ-C-излучением может быть использована в комбинации с обработкой
фракции, содержащей антитела, каприлатом. Инактивационные методы по отдельности
либо в комбинации с такими методами, как обработка TnBP, УФ-C, фильтраци вирусов
либо нагревание, могут быть скомбинированы с процессом согласно насто щему
изобретению.
Страница: 6
RU 2 337 109 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Способ согласно насто щему изобретению может быть скомбинирован с методами
удалени или инактивации прионов, к примеру, с фильтрационными, адсорбционными или
хроматографическими методами согласно ранее раскрытому в данной области техники, к
примеру, в документе EP-A-0 954 528, Trejo, S.R. et al., Vox Sanguinis, (2003) 84,
176-187. Раствор IgG, получаемый согласно насто щему изобретению, концентрируют дл дальнейшего терапевтического использовани , обычно до концентраций 5 или 10%, и
осмол рность концентрата довод т до 200-400 мОсмоль/кг подход щей добавкой. Тем не
менее, любые другие значени также допустимы в случае сохранени фармакологической
приемлемости. Подобные добавки хорошо известны экспертам и включают в себ (без
ограничени общности) сахара, сахарные спирты и аминокислоты. pH раствора IgG может
быть доведен до 3,5-6,0, в частности до 4,0-5,5. Далее раствор IgG стерильно
фильтруют и разливают в стекл нные бутыли или пластиковые контейнеры. Альтернативно
раствор, сошедший с колонки после первого либо второго этапа AEX, подвергают
фильтрованию на нанофильтрах дл достижени еще большей безопасности продукта.
Процесс согласно насто щему изобретению более подробно описан и предпочтительно
выполнен в соответствии с нижеследующей схемой.
В качестве исходного материала использовали фракции плазмы I+II+III либо II+III.
Данные фракции были получены согласно описанному Cohn с соавторами (1946).
Доведение pH в процессе проводили при помощи 1M уксусной кислоты, 0,1M NaOH или
0,3M HCl. Каприлат добавл ли в виде 1M сток-раствора каприлата натри . Данный раствор
готовили путем растворени 166 г каприлата натри в 1 л воды дл инъекций (WFI) и
перемешивани до полного растворени каприлата натри .
В качестве контрол дл SD-обработки использовали Triton X-100 и TnBP. Дл удалени S/D-реагентов использовали растительное масло, такое как масло бобов сои либо
касторовое масло.
Все используемые реагенты имели степень чистоты «USP» и выше.
Количественную хроматографию с исключением по размеру и ELISA использовали дл определени концентрации IgG. Аналитическую ВЭЖХ проводили при помощи Agilent HPLC
System на колонках TosoHaas G3000SW.
Схематическа иллюстраци процесса приведена на фиг.1. Процесс начинаетс с
растворени преципитата IgG, называемого пастой, в очищенной воде. Обычно чем
больший объем воды используетс дл разведени пасты, тем выше выход IgG. pH
раствора довод т до 4,60-4,95, предпочтительно до 4,90 1М уксусной кислотой. Раствор
перемешивают несколько часов дл растворени максимально возможного количества IgG.
Далее добавл ют каприлат в виде сток-раствора до концентрации от 10 до 30 мМ,
предпочтительно до 20 мМ каприлата. pH в процессе добавлени каприлата поддерживают
посто нным на уровне 4,80-4,95, предпочтительно на уровне 4,90. В процессе инкубации
раствора IgG с каприлатом не-IgG-белки и липиды преципитируют. Полученный преципитат
удал ют из раствора IgG фильтрованием. После первой стадии преципитации некоторые
загр зн ющие примеси могут остатьс в растворе IgG. Подобно первой стадии, далее
добавл ют каприлат приблизительно до 20 мМ при посто нном pH на уровне 4,80-4,95,
предпочтительно на уровне 4,9. После инкубации преципитат удал ют путем фильтровани или центрифугировани . Дл более эффективного фильтровани используют сорбент дл нанесени на фильтр. pH фильтрованного раствора довод т до 5,0-5,2, предпочтительно
до 5,1, и помещают на анионообменную колонку. В качестве анионообменных колонок были
выбраны такие сильные анионообменники, как Q-Sepharose-FF, Q-Sepharose HP, QSepharose-XL, Source Q 15 или 30 (Amersham Biosience), Q- Thruput, Q-Thruput plus
(Sterogene), Macro Prep Q и Macro Prep High Q (Bio- Rad), Q Hyper D (BioSepra) и
Poros HQ (PerSeptive Biosystem).
При выбранных услови х IgG проходит через колонку, в то врем как определенные
добавки/загр зн ющие примеси, такие как каприлат и IgA, св зываютс со смолой.
Белковый раствор помещают на колонку из расчета от 40 до 120 г, в частности от 40 до
90 мг на мл смолы. Прошедший через колонку раствор концентрируют до содержани Страница: 7
RU 2 337 109 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
белка от 60 до 90 мг/мл, предпочтительно до 70 мг/мл, и подвергают диафильтрации
против 5 объемов фосфатного буфера с концентрацией от 5 до 20 мМ, предпочтительно 10
мМ фосфата натри . В качестве необ зательной дополнительной стадии инактивации
вирусов после диафильтрации может быть выполнена S/D-обработка. Подвергнутый
диафильтрации раствор подвергают инактивации вирусов путем S/D-обработки согласно
описанному Horowitz, к примеру, в документе EP-A-0 131 740. В качестве S/D-реагентов
использовали TnBP и Triton X-100. После перемешивани раствор инкубировали вплоть до
8 часов при температуре от 4 до 10°С. Далее добавл ли растительное масло, такое как
масло бобов сои или касторовое масло, предпочтительно касторовое масло добавл ли в
раствор до концентрации от 3 до 5% (мас./мас.). После разделени водной и масл ной
фаз водную фазу фильтруют. Дл этого используют подход щий глубинный фильтр.
Примерами подобных фильтров могут служить Polysep II (Millipore), Sartofine PP и
Sartobran P (Sartorius). Дальнейшую экстракцию водной фазы выполн ют предпочтительно
с использованием гидрофобного «support»-буфера, используемого также в хроматографии
с обращенной фазой с гелевой матрицей, сделанной из диоксида кремни , сополимеров
стирола и дивинилбензола (SDVB), глицидилметакрилата и этилендиметакрилата, либо
полиароматики.
Примерами подобных буферов могут служить µBondapak (Waters), Amberchrom CG-161
M и S, Amberchrom CG-070 (Tosoh Biosep), PLRP-S (Polymer Laboratories), RPC-1 и
Toyopearl Hexyl 650C (Tosoh Biosep), Source 15 RPC (Amersham Biosiences), LiChroprep
Si60 (Merck), Chromabond Sorbent HR-P and EASY (Machery-Nagel), ProntoSORB SPE
(Bischoff Chrom). Раствор белка нанос т на колонку в расчете от 0,5 до 1,5 мг/мл
сухой смолы. Прошедший раствор, полученный в результате экстракции твердой фазы (или
стадии хроматографии соответственно), подвергают обработке УФ-C, после чего его pH
довод т до 6,7-6,9, предпочтительно до 6,8 путем добавлени 0,1M NaOH при температуре
от 4 до 10°С. Далее раствор IgG помещают на вторую анионообменную колонку. IgG
проходит через колонку, не св зыва сь, в то врем как загр зн ющие примеси и полимеры
св зываютс с колонкой. В качестве анионообменных колонок были выбраны такие
сильные анионообменники, как Q-Sepharose-FF, Q-Sepharose HP, Q-Sepharose-XL, Source
Q 15 или 30 (Amersham Biosience), Q-Thruput, Q-Thruput plus (Sterogene), Macro Prep Q
и Macro Prep High Q (Bio- Rad), Q Hyper D (BioSepra) и Poros HQ (PerSeptive
Biosystem). Колонку уравновешивают 10 мМ буфера фосфата натри . После нанесени раствора IgG колонку промывают уравновешивающим буфером дл того, чтобы весь не
св завшийс IgG сошел с колонки. Раствор белка помещают на колонку из расчета от 120
до 300 мг белка/мл смолы. pH собранного раствора IgG довод т до значений 3,9-4,1,
предпочтительно до 4,0 0,3M HCl при температуре от 4 до 10°С. Далее раствор стерильно
фильтруют и инкубируют при 37°С по меньшей мере 24 часа. После обработки низкими pH
pH раствора довод т до 4,7 0,1M NaOH при температуре от 4 до 10°С. В качестве
дополнительного этапа снижени количества вирусов может быть использован подход щий
фильтр дл очистки от вирусов. Дл фильтровани от вирусов раствор IgG фильтровали
через 0,1 мкм фильтр с последующей фильтрацией через фильтры дл очистки от вирусов
с размером пор от 200 до 15 нм. Примерами подобных фильтров могут служить DVD, DV
50, DV 20 (Pall), Viresolve NFP, Viresolve NFR (Millipore), Planova 75, 35, 20, 15N
(Asahi Kasei Pharma). Также может быть использован зар женный глубинный фильтр, такой
как Zeta Plus VR (Cuno). Стади фильтрации также может быть проведена после инкубации
при pH 4. Предпочтительно эта стади будет включена в процесс до обработки низкими
pH. Высокоочищенный раствор IgG подвергают диафильтрации и концентрируют до
требуемого в данном препарате содержани IgG. В качестве конечных концентраций белка
в жидком препарате были выбраны концентрации 5 или 10% (мас./об.). После доведени концентрации осмол рность раствора также довод т до значений, совместимых с
применением препарата путем внутривенных инъекций, за счет подход щей добавки.
Могут быть использованы сахара, сахарные спирты и аминокислоты. pH снова провер ют и
довод т до значений 4,5-5,0, предпочтительно 4,7. Далее выполн етс стерильное
Страница: 8
RU 2 337 109 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
фильтрование, и раствор разливают в инфузионные бутыли.
Нижеследующие примеры более подробно по сн ют процесс согласно насто щему
изобретению:
Пример 1
Фракцию I+II+III либо II+III, по Cohn, раствор ли в 12 объемах воды, pH доводили до
4,9 1М уксусной кислотой и раствор перемешивали вплоть до 5 часов, пока больша часть
IgG не перешла в раствор при температуре от 2 до 8°С. Далее в раствор IgG добавл ли
каприлат в виде 1M сток-раствора каприлата натри до концентрации 20 мМ каприлата при
поддержании посто нного pH на уровне 4,9 путем добавлени 1М уксусной кислоты.
Раствор перемешивали на прот жении одного часа. Липиды и загр зн ющие примеси в
этих услови х преципитировали, их удал ли фильтрованием. Далее в раствор снова
добавл ли каприлат до концентрации 20 мМ каприлата при поддержании посто нного pH
на уровне 4,9. Образовавшийс преципитат снова отдел ли фильтрованием. После этого
был получен прозрачный раствор. pH раствора доводили до 5,1 0,1M NaOH при
температуре 7±3°С и раствор помещали на колонку Source Q 30 column. Раствор IgG
проходил через колонку, в то врем как загр зн ющие примеси и каприлат св зывались с
колонкой. Собранный раствор IgG концентрировали до содержани 70 мг/мл и подвергали
диафильтрации против 5 объемов фосфатного буфера, pH 5,1. Далее в раствор добавл ли
0,3% (мас./мас.) TnBP и 1% (мас./мас.) Triton X-100, после чего интенсивно
перемешивали. После по меньшей мере 4,5 часов перемешивани при
температуре 7±3°С, в раствор добавл ли 5% (мас./мас.) касторового масла. Масл ную
экстракцию проводили при комнатной температуре. Масл ную и водную фазы раздел ли и
водную фазу фильтровали через фильтр Millipore Opticap Polysep. Фильтрованный раствор
помещали на колонку с матрицей обращенной фазы µBondapak (Waters). pH раствора
доводили до 6,8 0,1M NaOH при температуре 7±3°С и помещали на колонку с сильным
анионообменником, а именно на Q-Sepharose-XL. IgG проходил через колонку, в то врем как загр зн ющие примеси св зывались с колонкой. pH собранного раствора доводили до
4,7 0,1M NaOH при температуре 7±3°С. После этого вновь проводили ультрафильтрацию
дл достижени конечной концентрации белка 50 или 100 мг/мл, после чего добавл ли
мальтозу до концентрации от 2 до 10% по массе, предпочтительно 8%, либо глицин до
концентрации 0,1-0,5М, предпочтительно 0,3М, в особенности 0,2. После стерильной
фильтрации раствор разливали в стерилизованные и силиконизированные инфузионные
бутыли различных объемов (50, 100, 200 мл). Бутыли закупоривали пробками.
Пример 2
Данный пример отличаетс от примера 1, в частности, использованием стадии
инкубации при pH 4. Фракцию I+II+III либо II+III, по Cohn, раствор ли в 12 объемах
воды, pH доводили до 4,9 1М уксусной кислотой и раствор перемешивали вплоть до 5
часов, пока больша часть IgG не перешла в раствор при температуре от 2 до 8°С. Далее
в раствор IgG добавл ли каприлат в виде 1M сток-раствора каприлата натри до
концентрации 20 мМ каприлата при поддержании посто нного pH на уровне 4,9 путем
добавлени 1М уксусной кислоты. Раствор перемешивали на прот жении одного часа.
Липиды и загр зн ющие примеси в этих услови х преципитировали, их удал ли
фильтрованием. Далее в раствор снова добавл ли каприлат до концентрации 20 мМ
каприлата при поддержании посто нного pH на уровне 4,9. Образовавшийс преципитат
снова отдел ли фильтрованием. После этого был получен прозрачный раствор. Собранный
раствор IgG концентрировали до 70 мг/мл и подвергали диафильтрации против 5 объемов
фосфатного буфера pH 5,1. pH раствора доводили до 5,1 0,1M NaOH при
температуре 7±3°С и раствор помещали на колонку c сильным анионообменником QSepharose-XL. Раствор IgG проходил через колонку, в то врем как загр зн ющие примеси
и каприлат св зывались с колонкой. Далее в раствор добавл ли 0,3% (мас./мас.) TnBP и
1% (мас./мас.) Triton X-100, после чего интенсивно перемешивали. После по меньшей
мере 4,5 часов перемешивани при температуре от 4 до 10°С в раствор добавл ли 5%
Страница: 9
RU 2 337 109 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
(мас./мас.) касторового масла. Масл ную экстракцию проводили при комнатной
температуре. Масл ную и водную фазы раздел ли и водную фазу фильтровали через
фильтр Millipore Opticap Polysep. Фильтрованный раствор помещали на колонку,
наполненную Amberchrom CG-161M. pH раствора доводили до 6,8 0,1M NaOH при
температуре 7±3°С и помещали на колонку с сильным анионообменником Q-Hyper D. IgG
проходил через колонку, в то врем как загр зн ющие примеси св зывались с колонкой.
pH собранного раствора доводили до 4,0 0,3M HCl при температуре 7±3°С. Раствор
стерильно фильтровали и хранили при температуре 37±3°С по меньшей мере 24 часа.
Далее pH раствора доводили до 4,7 0,1M NaOH при температуре 7±3°С. После этого
вновь проводили ультрафильтрацию дл достижени концентрации белка 50 или 100 мг/мл
после смешивани с раствором мальтозы или глицина. После стерильной фильтрации
раствор разливали в стерилизованные и силиконизированные инфузионные бутыли
различных объемов (50, 100, 200 мл). Бутыли закупоривали пробками.
Пример 3
Данный пример отличаетс от предыдущих концентрированием раствора IgG до 70
мг/мл белка перед первой AEX, а также использованием стадии нанофильтрации.
Фракцию I+II+III либо II+III, по Cohn, раствор ли в 12 объемах воды, pH доводили до
4,9 1М уксусной кислотой и раствор перемешивали вплоть до 5 часов, пока больша часть
IgG не перешла в раствор при температуре от 2 до 8°С. Далее в раствор IgG добавл ли
каприлат в виде 1M сток-раствора каприлата натри до концентрации 20 мМ каприлата при
поддержании посто нного pH на уровне 4,9 путем добавлени 1М уксусной кислоты.
Раствор перемешивали на прот жении одного часа. Липиды и загр зн ющие примеси в
этих услови х преципитировали, и их удал ли фильтрованием. Далее в раствор снова
добавл ли каприлат до концентрации 20 мМ каприлата при поддержании посто нного pH
на уровне 4,9. Образовавшийс преципитат снова отдел ли фильтрованием. После этого
был получен прозрачный раствор. Собранный раствор IgG концентрировали до 70 мг/мл и
подвергали диафильтрации против 5 объемов фосфатного буфера pH 5,1. pH раствора
доводили до 5,1 0,1M NaOH при температуре 7±3°С и раствор помещали на колонку c
сильным анионообменником. Раствор IgG проходил через колонку, в то врем как
загр зн ющие примеси и каприлат св зывались с колонкой. Далее pH раствора доводили
до 6,8 0,1M NaOH при температуре 7±3°С и раствор помещали на колонку со вторым
сильным анионообменником. Раствор IgG проходил через колонку, в то врем как
загр зн ющие примеси св зывались с колонкой. pH собранного раствора доводили до 4,0
0,3M HCl при температуре 7±3°С. Раствор фильтровали через 0,1 мкм фильтр, после чего
дл нанофильтрации примен ли каскад фильтров PALL, а именно - PALL DVD, DV 50 и DV
20 с размером пор, последовательно уменьшающимс до 20 нм. Нанофильтрованный
раствор инкубировали при температуре 37±3°С по меньшей мере 24 часа. Далее pH
раствора доводили до 4,7 0,1M NaOH при температуре 7±3°С. После этого вновь
проводили ультрафильтрацию дл достижени концентрации белка 50 или 100 мг/мл после
смешивани с раствором мальтозы или глицина. После стерильного фильтровани раствор
разливали в стерилизованные и силиконизированные инфузионные бутыли различных
объемов (50, 100, 200 мл). Бутыли закупоривали пробками.
Сравнительные примеры
Способ согласно изобретению
Около 310 г фракции I+II+III (включа пре-сорбент дл фильтровани ) развод т в 12
объемах WFI, рассчитанных на основе теоретической массы фракции I+II+III (без пресорбента дл фильтровани ). Раствор перемешивают 1 час при 5°С. Далее pH довод т до
4,9±0,1 (прибл. 950 г). Разведение продолжают на прот жении 2 часов при 5°С.
Содержание альбумина и IgA в пробе «разведенна фракци I+II+III» приведено в
таблицах в конце сравнительных примеров. Далее в раствор добавл ют одномол рный
раствор каприлата до достижени концентрации в растворе 20 мМ. pH поддерживают
посто нным на уровне 4,9. Раствор инкубируют 1 час при 5°С. Раствор фильтруют через
Страница: 10
RU 2 337 109 C2
5
глубинный фильтр и листок бумаги при 5°С (прибл. 1050 г). Фильтр промывают 10 мМ
раствором хлорида натри . Фильтрат довод т до температуры 25°С и добавл ют
одномол рный раствор каприлата дл достижени дополнительной 10 мМ концентрации.
Раствор инкубируют 1 час при 25°С. Далее раствор центрифугируют, и супернатант
фильтруют через фильтр (1110 г) c размером пор 1 мкм и 0,5 мкм. Содержание альбумина
и IgA в пробе «после каприлата» приведено в таблицах в конце сравнительных примеров.
Согласно EP 0 893 450
10
15
20
Около 310 г фракции I+II+III (включа пре-сорбент дл фильтровани ) развод т в 7
объемах WFI, рассчитанных на основе теоретической массы фракции I+II+III (без пресорбента дл фильтровани ). Раствор перемешивают 1 час при 5°С. Далее pH довод т до
4,1±0,1. Разведение продолжают на прот жении 2 часов при 5°С. Содержание альбумина и
IgA в пробе «разведенна фракци I+II+III» приведено в таблицах в конце сравнительных
примеров. Далее в раствор добавл ют одномол рный раствор каприлата до достижени концентрации в растворе 20 мМ. pH измен етс до 4,9 в ходе добавлени каприлата, и
его довод т до 5,1. Раствор инкубируют 1 час при 5°С. Раствор фильтруют через глубинный
фильтр и листок бумаги при 5°С. Фильтр промывают 10 мМ раствором хлорида натри (прибл. 1050 г). Фильтрат довод т до температуры 25°С и добавл ют одномол рный
раствор каприлата дл достижени дополнительной 10 мМ концентрации. Раствор
инкубируют 1 час при 25°С. Далее раствор центрифугируют и супернатант фильтруют
через фильтр (прибл. 1110 г) c размером пор 0,45 мкм. Содержание альбумина и IgA в
пробе «после каприлата» приведено в таблицах в конце сравнительных примеров.
Удаление альбумина и IgA
pH 4,9
5,1
Изобретение EP 0893450
25
Эксперимент
1
Альбумин
Альбумин
мкг/мг IgG
мкг/мг IgG
Разведенна фракци I+II+III
27,1
32,9
После каприлата
0,2
10,2
Разведенна фракци I+II+III
44,2
32,6
После каприлата
0,2
2,2
3
Разведенна фракци I+II+III
30,2
31,2
После каприлата
0,8
9,9
4
Разведенна фракци I+II+III
22,7
33,1
2
30
Пробы
35
После каприлата
0,9
10,7
Среднее по разведенной фракции I+II+III
31,1
32,5
Стандартное отклонение по разведенной фракции I+II+III
9,3
0,9
Среднее по «после каприлата»
0,5
8,3
Стандартное отклонение по «после каприлата»
0,4
4,0
pH 4,9
5,1
Изобретение EP 0893450
40
Эксперимент
1
2
45
3
4
50
Пробы
IgA
IgA
мкг/мг IgG
мкг/мг IgG
Разведенна фракци I+II+III
86
106
После каприлата
40,9
49,3
Разведенна фракци I+II+III
74,3
120,7
После каприлата
23,7
60,5
Разведенна фракци I+II+III
88,5
114
После каприлата
30,8
56,9
Разведенна фракци I+II+III
115,5
113,6
После каприлата
34,4
51,3
Среднее по разведенной фракции I+II+III
91,1
113,6
Стандартное отклонение по разведенной фракции I+II+III
17,4
6,0
Среднее по пробе «после каприлата»
32,5
54,5
Стандартное отклонение по пробе «после каприлата»
7,2
5,1
Страница: 11
RU 2 337 109 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Формула изобретени 1. Способ получени препарата иммуноглобулина IgG, включающий в себ следующие
стадии:
(a) доведение рН исходного раствора до 4,6-4,95 дл получени промежуточного
раствора;
(b) добавление каприлат- и/или гептаноат-ионов к промежуточному раствору и
поддержание рН на уровне 4,8-4,95, что приводит к образованию преципитата, при этом
антитела главным образом присутствуют в супернатанте;
(c) инкубирование раствора супернатанта в услови х, когда концентраци каприлати/или гептаноат-ионов составл ет 10-30 мМ;
(d) проведение по меньшей мере одной хроматографии инактивированного
фильтрованного раствора с использованием анионообменной смолы при рН от 5,0 до 5,2 в
услови х, обеспечивающих св зывание преципитатов со смолой в отсутствие
значительного св зывани IgG, с получением препарата IgG.
2. Способ по п.1, согласно которому на стадии (а) рН довод т до 4,8-4,95.
3. Способ по п.1 или 2, согласно которому дополнительно провод т вторую
анионообменную хроматографию при рН в диапазоне от 6,7 до 6,9.
4. Способ по п.1, согласно которому стадии (b) и (с) повтор ют по меньшей мере один
раз.
5. Способ по п.1, согласно которому исходный раствор содержит антитела, полученные
из плазмы.
6. Способ по п.1, согласно которому на стадии (d) вирус-инактивированный
фильтрованный раствор привод т в контакт с двум различными анионообменными
смолами в услови х, при которых загр зн ющие примеси селективно св зываютс со
смолой, в то врем как IgG в значительной степени со смолой не св зываютс .
7. Способ по п.6, согласно которому рН довод т до значений 6,8±0,1 перед выполнением
второй анионообменной хроматографии.
8. Способ по п.1, согласно которому раствор, сошедший с колонки анионообменной
хроматографии, концентрируют до 60-90 мг/мл и подвергают диафильтрации против
буферного раствора, предпочтительно фосфатного буфера.
9. Способ по п.1, согласно которому по меньшей мере один из способов, выбранных из
группы, состо щей из обработки УФ-С, тепловой обработки, фильтрации вирусов и
удалени или инактивации прионов, комбинируют с обработкой каприлатом согласно п.1.
10. Способ по п.1, согласно которому раствор, прошедший через колонку в ходе первой
анионообменной хроматографии, обрабатывают растворителем-детергентом,
предпочтительно Triton Х-100 и TnBP, наиболее предпочтительно, в концентрации 1%
Triton Х-100 и 0,3% TnBP в течение 4,5-8 ч дл инактивации покрытых липидами вирусов.
11. Способ по п.10, согласно которому детергенты инкубационной смеси удал ют путем
твердофазной и жидкофазной экстракций.
12. Способ по п.11, согласно которому в ходе экстракции твердой фазы значение рН
довод т до 6,7-6,9.
13. Способ по п.12, согласно которому провод т вторую анионообменную
хроматографию.
14. Способ по п.13, согласно которому значение рН раствора, сошедшего с колонки с
анионообменной смолой, довод т до 3,5-4,5, предпочтительно до рН 4,0±0,1.
15. Способ по п.14, согласно которому раствор IgG привод т в контакт с фильтром дл удалени вирусов.
16. Способ по п.14, согласно которому раствор IgG привод т в контакт с нанофильтром.
17. Способ по п.14, согласно которому раствор IgG инкубируют по меньшей мере 24 ч
предпочтительно при 37°С±1.
18. Способ по п.14, согласно которому раствор IgG концентрируют до 5 или 10%.
19. Способ по п.18, согласно которому осмол рность концентрата довод т до 200-400
мОсмоль/кг подход щей добавкой.
Страница: 12
CL
RU 2 337 109 C2
5
20. Способ по п.19, согласно которому рН раствора IgG довод т до 3,5-6,0,
предпочтительно до значени рН от 4,0 до 5,5.
21. Способ по п.20, согласно которому раствор IgG стерильно фильтруют и разливают в
стекл нные бутыли или пластиковые контейнеры.
22. Препарат иммуноглобулина IgG, полученный согласно любому из пп.1-21.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Страница: 13
RU 2 337 109 C2
Страница: 14
DR
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
1
Размер файла
239 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа