close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент РФ 2337140

код для вставки
РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
RU
(19)
(11)
2 337 140
(13)
C2
(51) МПК
C12P 13/08 (2006.01)
C12R 1/185 (2006.01)
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
(21), (22) За вка: 2006101328/13, 29.07.2004
(24) Дата начала отсчета срока действи патента:
29.07.2004
(30) Конвенционный приоритет:
29.07.2003 JP 2003-202842
(43) Дата публикации за вки: 27.06.2006
(45) Опубликовано: 27.10.2008 Бюл. № 30
(73) Патентообладатель(и):
АДЗИНОМОТО КО., ИНК. (JP)
(86) За вка PCT:
JP 2004/011220 (29.07.2004)
C 2
C 2
(85) Дата перевода за вки PCT на национальную фазу:
17.01.2006
R U
2 3 3 7 1 4 0
(87) Публикаци PCT:
WO 2005/010175 (03.02.2005)
Адрес дл переписки:
129010, Москва, ул. Б.Спасска , 25, стр.3,
ООО "Юридическа фирма Городисский и
Партнеры", пат.пов. Е.Е.Назиной, рег. № 517
(54) СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ L-ЛИЗИНА ИЛИ L-ТРЕОНИНА С ПОМОЩЬЮ БАКТЕРИЙ
ESCHERICHIA, ИМЕЮЩИХ АТТЕНУИРОВАННУЮ АКТИВНОСТЬ МАЛЕИНОВОГО ФЕРМЕНТА
(57) Реферат:
Изобретение относитс к биотехнологии и
представл ет собой способ продуцировани Lлизина
или
L-треонина,
включающий
культивирование
бактерии
в
среде
дл продуцировани и секреции L-лизина или Lтреонина, сбор и выделение L-лизина или Lтреонина из среды. При этом указанна бактери представл ет собой бактерию Escherichia, котора обладает способностью продуцировать L-лизин
или L-треонин, при этом указанна бактери модифицирована так, что нарушена нормальна функци малеинового фермента в клетке, при этом
малеиновый фермент кодируетс геном sfcA и/или
геном b2463. Изобретение позвол ет получать Lлизин или L-треонин с высокой степенью
эффективности. 11 з.п. ф-лы, 4 ил., 11 табл.
Страница: 1
RU
2 3 3 7 1 4 0
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: VAN DER REST et.al. Functions of the
membrane-associated and cytoplasmic malate
dehydrogenases in the citric acid cycle of
Escherichia coli. J Bacteriol. 2000. Dec;
182(24):6892-9. WO 98/04715, 05.02.1998. RU
2002104983 A, 27.08.2003.
R U
(72) Автор(ы):
ВАН ДИН Стефен (JP),
ИВАТАНИ Синтаро (JP),
УСУДА Йосихиро (JP),
МАЦУИ Казухико (JP),
НАКАИ Юта (JP),
СУЗУКИ Томоко (JP),
МОРИЯ Мика (JP),
ЦУДЗИ Юитиро (JP),
УЕДА Такудзи (JP)
RUSSIAN FEDERATION
(19)
RU
(11)
2 337 140
(13)
C2
(51) Int. Cl.
C12P 13/08 (2006.01)
C12R 1/185 (2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY,
PATENTS AND TRADEMARKS
(12)
ABSTRACT OF INVENTION
(21), (22) Application: 2006101328/13, 29.07.2004
(24) Effective date for property rights: 29.07.2004
(30) Priority:
29.07.2003 JP 2003-202842
(43) Application published: 27.06.2006
(45) Date of publication: 27.10.2008 Bull. 30
(73) Proprietor(s):
ADZINOMOTO KO., INK. (JP)
(86) PCT application:
JP 2004/011220 (29.07.2004)
(87) PCT publication:
WO 2005/010175 (03.02.2005)
(54) METHOD OF PRODUCING OF L-LYSINE OR L-THREONINE BY MEANS OF BACTERIA
(57) Abstract:
FIELD: medicine.
SUBSTANCE: method of producing of L-lysine or
L-threonine includes plating of bacteria in a
medium for producing and secretion of L-lysine or
L-threonine,
collecting
and
allocation
of
Llysine or L-threonine from the medium. Thus the
specified
bacterium
represents
bacterium
Escherichia which possesses ability to produce a
L-lysine or L-threonine, and where the specified
bacterium is modified so that normal function of
maleic enzyme in a cell is broken and where
maleic enzyme is coded by the sfcA gene and/or
the b2463 gene.
EFFECT: high degree of efficiency.
12 cl, 4 dwg, 11 tbl, 6 ex
R U
2 3 3 7 1 4 0
ESCHERICHIA HAVING ATTENUATED ACTIVITY OF MALEIC ENZYME
Страница: 2
EN
C 2
C 2
Mail address:
129010, Moskva, ul. B.Spasskaja, 25, str.3,
OOO "Juridicheskaja firma Gorodisskij i
Partnery", pat.pov. E.E.Nazinoj, reg. № 517
2 3 3 7 1 4 0
(85) Commencement of national phase: 17.01.2006
R U
(72) Inventor(s):
VAN DIN Stefen (JP),
IVATANI Sintaro (JP),
USUDA Josikhiro (JP),
MATsUI Kazukhiko (JP),
NAKAI Juta (JP),
SUZUKI Tomoko (JP),
MORIJa Mika (JP),
TsUDZI Juitiro (JP),
UEDA Takudzi (JP)
RU 2 337 140 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Область техники, к которой относитс изобретение
Насто щее изобретение относитс к способу продуцировани L-лизина или L-треонина с
помощью бактерии Escherichia. L-лизин и L-треонин, как известно, вл ютс незаменимыми аминокислотами и используютс в качестве компонентов в
фармацевтических композици х и различных питательных смес х, таких как пищевые
добавки и животные корма.
Предшествующий уровень техники
L-аминокислоты, такие как L-треонин и L-лизин, производ т в промышленных масштабах
путем ферментации с использованием продуцирующих L-аминокислоты бактерий, таких как
коринебактерии или бактерий Escherichia, которые обладают способностью продуцировать
L-аминокислоты. Дл повышени продуктивности в качестве бактерии, продуцирующей Lаминокислоты, используют выделенный природный штамм, его мутант, полученный
искусственным путем, или рекомбинант, у которых активность фермента биосинтеза Lаминокислот усилена в результате генной рекомбинации. Способ продуцировани L-лизина
описан в патентах 1-4. Способ продуцировани L-треонина описан в патентных документах
5-8.
К способам усилени способности продуцировани аминокислот, таких как L-треонин и
L-лизин, относитс способ усилени энергетической эффективности путем модификации
пути дыхательной цепи (патентный документ 13) и способ усилени способности
вырабатывать никотинамидадениндинуклеотидфосфат путем амплификации
никотинамиднуклеотидтрансдегидрогеназы (патентный документ 9), а также способ
повышени уровн экспрессии фермента эндогенного биосинтетического пути.
Кроме того, известны способы модификации общих путей систем биосинтеза
аминокислот, которые включают модификацию анаплеротических путей продуцирующих Lаминокислоты бактерий, таких как продуцирующа L-лизин коринебактери , в которой
усилена активность пируваткарбоксилазы (патентный документ 10), продуцирующа Lлизин бактери Escherichia, дефектна по пируваткиназе (патентный документ 11), и
продуцирующа L-лизин коринебактери , дефектна по малатхининоксидоредуктазе
(патентный документ 12).
Малеиновый фермент вл етс одним из ферментов анаплеротического пути. Известно,
что у бактерий Escherichia каждый из генов sfcA и b2463 кодирует малеиновый
фермент (непатентный документ 9). Однако независимо от снижени активности
малеиновых ферментов, кодируемых генами sfcA и b2463, об эффективности усилени продуцировани L-лизина или L-треонина не сообщалось.
Анализ метаболического потока, также названный как анализ баланса потока, вл етс методом предсказани распределений внутриклеточного метаболического потока путем
конструировани стехиометрической модели внутриклеточных биохимических реакций и
линейной оптимизации. Этот метод примен етс дл изучени возможностей систем
биохимических реакций микроорганизмов или дл предсказани распределений
внутриклеточного метаболического потока при различных внешних услови х (непатентные
документы 1, 2 и 3). Также имеютс сообщени о конструировании стехиометрической
модели дл Escherichia coli (непатентные документы 4 и 5). Также известен пример
использовани такой стехиометрической модели в метаболической инженерии
продуцировани лизина, разработанной дл Corynebacterium glutamicum и используемой в
производстве аминокислот (непатентный документ 6). Кроме того, имеютс сообщени о
большом числе теоретических и экспериментальных методов анализа метаболического
потока и их применени (непатентные документы 7 и 8, патентные документы 14, 15 и
16). В патентном документе 14 описывают способ предсказани гена, необходимого дл роста на основе стехиометрической модели. В патентном документе 15 описывают метод
генетического и эволюционного изменени клеток с целью придани им оптимальных
функций в клетках. Далее в патентном документе 16 представл ют способ применени ограничений качественной кинетической информации, ограничений качественной
контрольной информации и ограничений, основанных на экспериментальных данных,
Страница: 3
DE
RU 2 337 140 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
полученных на ДНК-микрочипах, в различных услови х стехиометрической модели. Хот все они вл ютс способами предсказани более желательных распределений
внутриклеточного метаболического потока, не разработали способ теоретического
предсказани специфического потока как мишени направленного усилени продуцировани клеточного вещества.
<Патентный документ 1>
Выложенна за вка на патент Японии № 10-165180
<Патентный документ 2>
Выложенна за вка на патент Японии № 11-192088
<Патентный документ 3>
Выложенна за вка на патент Японии № 2000-253879
<Патентный документ 4>
Выложенна за вка на патент Японии № 2001-57896
<Патентный документ 5>
Выложенна за вка на патент Японии № 5-304969
<Патентный документ 6>
Международна публикаци № WO98/04715
<Патентный документ 7>
Выложенна за вка на патент Японии № 5-227977
<Патентный документ 8>
Опубликованна за вка на патент США № 2002/0110876
<Патентный документ 9>
Патент Японии № 2817400
<Патентный документ 10>
Выложенна за вка на патент Японии № 2002-508921
<Патентный документ 11>
Международна публикаци № WO03/008600
<Патентный документ 12>
Опубликованна за вка на патент США № 2003/0044943
<Патентный документ 13>
Выложенна за вка на патент Японии № 2002-17363
<Патентный документ 14>
Международна публикаци № WO00/46405
<Патентный документ 15>
Международна публикаци № WO02/061115
<Патентный документ 16>
Международна публикаци № WO02/055995
<Непатентный документ 1>
Varma A. and Palsson B.O. Appl. Environ. Microbiol. 60:3724-3731, 1994
<Непатентный документ 2>
Schilling C.H. et al., Biotechnol. Prog., 15:288-295, 1999
<Непатентный документ 3>
Schilling C.H. et al., Biotechnol. Prog., 15:296-303, 1999
<Непатентный документ 4>
Pramanik J. and Keasling J.D., Biotechnol. Bioeng., 56:398-421, 1997
<Непатентный документ 5>
Ibarra R.U. et al., Nature, 420:186-189, 2002
<Непатентный документ 6>
Vallino J.J. and Stephanopoulos G., Biotechnol. Bioeng., 41:633-646, 1993
<Непатентный документ 7>
Wiechert W., Journal of Biotechnology, 94:37-63, 2002
<Непатентный документ 8>
Wiechert W., Metabolic Engineering, 3:195-205, 2001
Страница: 4
RU 2 337 140 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
<Непатентный документ 9>
van der Rest M.E., Frank C., Molenaar D.J., J. Bacteriol., 182(24):6892-6899, 2000
Описание изобретени В насто щем изобретении предлагаетс бактери Escherichia, котора имеет
улучшенную способность продуцировани L-лизина или L-треонина, и способ
продуцировани L-лизина или L-треонина с помощью бактерии.
Авторы насто щего изобретени дл решени проблемы провели тщательное
исследование и в результате установили, что производительность метаболического
потока, вли ющего на продуцирование вещества, может быть определена путем: 1) выбора
определенного числа свободных потоков как степени свободы стехиометрической матрицы,
рассчитанной по формулам биохимических реакций на субстрате дл продуцируемого
желательного вещества; 2) расчета распределений метаболического потока на основе
выборки случайных комбинаций свободных потоков, достаточной дл статистического
анализа, основанного на стехиометрической матрице; 3) получени уравнени регрессии,
включающего минимальное число свободных потоков, которое коррелирует с
продуцированием вещества по рассчитанным распределени м метаболического потока на
основе статистического анализа.
Определение метаболических потоков бактерии, продуцирующей L-лизин или L-треонин,
с помощью этого способа показало, что модификаци , нарушающа нормальную функцию
малеинового фермента, вызывает увеличение продуктивности бактерии. Насто щее
изобретение выполнено на основе вышеупом нутых данных и предлагает следующее:
1) бактерию Escherichia, котора имеет способность продуцировать L-лизин или Lтреонин, и где указанна бактери модифицирована так, что нарушена нормальна функци малеинового фермента в клетке;
2) бактерию по (1), где ген, кодирующий указанный малеиновый фермент на
бактериальной хромосоме, вл етс мутированным и/или мутированной вл етс последовательность, контролирующа экспрессию этого гена, что нарушает нормальную
функцию малеинового фермента в клетке;
3) бактерию по (1), где указанный малеиновый фермент не обладает нормальной
функцией в результате нарушени гена, кодирующего указанный малеиновый фермент на
бактериальной хромосоме;
4) бактерию по (1), где ген, кодирующий указанный малеиновый фермент, содержит sfcA;
5) бактерию по (1), где ген, кодирующий указанный малеиновый фермент,
содержит b2463;
6) бактерию по (1), где указанный малеиновый фермент выбран из группы, содержащей:
А) белок, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:
6;
и
B) белок, который имеет аминокислотную последовательность, содержащую замещение,
делецию, инсерцию или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков в
аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:6, и имеет активность
малеинового фермента;
7) бактерию по (1), где указанный малеиновый фермент выбран из группы, содержащей:
С) белок, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:
8;
и
D) белок, который имеет аминокислотную последовательность, содержащую замещение,
делецию, инсерцию или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков в
аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:8, и имеет активность
малеинового фермента;
8) бактерию по (1), где геном, кодирующим указанный малеиновый фермент, вл етс ДНК, выбранна из группы, содержащей:
а) ДНК, имеющую нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:5;
Страница: 5
RU 2 337 140 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
b) ДНК, котора гибридизируетс с нуклеотидной последовательностью, представленной
в SEQ ID NO:5, или зонд, который может быть получен из нуклеотидной
последовательности, где указанна гибридизаци проходит в жестких услови х и где
указанна ДНК кодирует белок, имеющий активность малеинового фермента;
9) бактерию по (1), где геном, кодирующим малеиновый фермент, вл етс ДНК,
выбранна из группы, содержащей:
c) ДНК, имеющую нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO:7;
и
d) ДНК, котора гибридизируетс с нуклеотидной последовательностью, представленной
в SEQ ID NO:7, или зонд, который может быть получен из нуклеотидной
последовательности, где указанна гибридизаци проходит в жестких услови х и где
указанна ДНК кодирует белок, имеющий активность малеинового фермента;
10) способ продуцировани L-лизина или L-треонина, включающий культивирование
бактерии, как определено в любом из (1)-(9), в среде, обеспечивающей продуцирование и
секрецию указанных L-лизина или L-треонина, и сбор и выделение L-лизина или Lтреонина из среды.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. График продуцировани лизина как функции различных значений свободных
потоков посредством использовани набора данных 5000 случайных распределений
потоков. Выход лизина показан дл : а) потока изоцитратлиазы; b) потока малеинового
фермента; c) потока PEP-карбоксилазы.
Фиг. 2. График продуцировани лизина как функции величин уравнени 2 дл набора
данных 5000 случайных распределений потоков. Исходной величиной вл етс поток,
выраженный в нм/ч, в расчете на 10 нм/ч потока глюкозы.
Фиг. 3. Представлена структура плазмид pMW118-attL-Tc-attR и pMW118-attL-Cm-attR.
Фиг. 4. Представлена структура плазмиды pMW-intxis-ts.
Лучший способ выполнени изобретени Далее насто щее изобретение будет объ снено детально.
<I> Бактери Escherichia насто щего изобретени Бактери Escherichia насто щего изобретени вл етс бактерией, принадлежащей к
роду Escherichia, котора обладает способностью продуцировать L-лизин или L-треонин и
котора модифицирована так, что нарушена нормальна функци малеинового фермента.
Бактери Escherichia насто щего изобретени может иметь способность продуцировать
либо L-лизин, либо L-треонин либо может иметь способность продуцировать как L-лизин,
так и L-треонин.
Родительский штамм, принадлежащий к роду Escherichia, который использовали дл получени бактерии Escherichia насто щего изобретени , включает, но не ограничива сь
ими, штаммы, описанные в книге Neidhardt с сотр. (Neidhardt F.C. с сотр., Escherichia
coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C.,
1029, таблица 1). Например, родительским штаммом может быть Escherichia coli.
Escherichia coli может быть штаммом W3110 Escherichia coli (ATCC 27325) или штаммом
MG1655 Escherichia coli (ATCC 47076), которые оба получены из прототипного штамма K12
дикого типа.
Эти штаммы можно получить, например, из Американской коллекции типовых культур
(Адрес: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America).
Штаммам даны соответствующие регистрационные номера. Существует возможность
затребовать желательный штамм по его регистрационному номеру. Регистрационные
номера, которые соответствуют штаммам, представлены в каталоге Американской
коллекции типовых культур.
<1>-1. Придание способности продуцировать L-лизин или L-треонин
Ниже представлен способ придани бактерии Escherichia способности продуцировать Lлизин или L-треонин. Фраза «способность продуцировать L-лизин», как использовано в
данном описании, означает способность продуцировать и вызывать накопление или
Страница: 6
RU 2 337 140 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
секрецию L-лизина в среде, например, свободного внеклеточного L-лизина, при
культивировании бактерии в среде. В частности, фраза «способность продуцировать Lлизин» означает способность вызывать накопление большего количества L-лизина по
сравнению с диким типом или родительским штаммом.
Фраза «способность продуцировать L-треонин», как использовано в данном описании,
означает способность продуцировать и вызывать накопление или секрецию L-треонина в
среде, например, свободного внеклеточного L-треонина, при культивировании бактерии в
среде. В частности, эта фраза означает способность вызывать накопление большего
количества L-треонина по сравнению с диким типом или родительским штаммом.
Дл придани способности продуцировать L-лизин или L-треонин могут быть
использованы стандартные способы селекции бактерий Escherichia и коринебактерий,
такие как способы получени ауксотрофных мутантных штаммов, штаммов, резистентных к
аналогам, или штаммов, мутантных по метаболическому контролю, которые обладают
способностью продуцировать L-лизин или L-треонин, и способы продуцировани рекомбинантных штаммов, в которых усилены активности ферментов биосинтеза L-лизина
или L-треонина. В селективных бактери х, продуцирующих L-лизин или L-треонин, такие
характеристики, как ауксотрофность, резистентность к аналогам и мутации
метаболического контрол , могут быть получены по отдельности или в комбинации.
Усиленна активность ферментов биосинтеза L-лизина или L-треонина может быть
представлена по отдельности или в комбинации. Далее, получение таких характеристик,
как ауксотрофность, резистентность к аналогам и мутации метаболического контрол ,
может быть комбинировано с усилением активности ферментов биосинтеза L-лизина или Lтреонина.
Варианты способов придани или усилени способности продуцировать L-лизин или Lтреонин путем усилени активности ферментов биосинтеза L-лизина или L-треонина
описаны ниже. Усиление ферментативной активности может быть осуществлено путем,
например, введени мутации в ген, кодирующий фермент, или амплификации гена с целью
усилени внутриклеточной активности фермента. Это же может быть осуществлено
посредством генной рекомбинации.
Гены, кодирующие ферменты биосинтеза L-треонина, включают, но не ограничива сь
ими, ген аспартокиназы III (lysC), ген аспартатполуальдегиддегидрогеназы (asd),
аспартокиназу I, кодируемую опероном thr (thrA), ген гомосеринкиназы (thrB), ген
треонинсинтазы (thrC). Сокращенное условное обозначение гена показано в круглых
скобках. В штамм могут быть введены два или более этих генов. Ген фермента биосинтеза
L-треонина может быть введен в бактерию Escherichia, в которой супрессировано
расщепление треонина. Примером бактерии Escherichia, в которой супрессировано
расщепление треонина, служит штамм TDH6, который вл етс дефектным по активности
треониндегидрогеназы (Выложенна за вка на патент Японии № 2001-346578).
Гены, кодирующие ферменты биосинтеза L-лизина, включают, но не ограничива сь
ферментами пути диаминопимелата, такие гены, как ген
дигидродипиколинатсинтазы (dapA ), ген аспартокиназы (lysC), ген
дигидродипиколинатредуктазы (dapB), ген диаминопимелатдекарбоксилазы (lysA), ген
диаминопимелатдегидрогеназы (ddh), (все вышеприведенные; Международна публикаци № 96/40934), ген фосфоенолпируваткарбоксилазы (ppc) (Выложенна за вка на патент
Японии № 60-87788), ген аспартатаминотрансферазы (aspC) (Опубликованна за вка на
патент Японии № 6-102028), ген диаминопимелатэпимеразы (dapF) (Выложенна за вка
на патент Японии № 2003-135066), ген аспартатполуальдегиддегидрогеназы (asd)
(Международна публикаци № 00/61723) и ген ферментов пути аминоадипата, такой как
ген гомоаконинтатгидратазы (Выложенна за вка на патент Японии № 2000-157276).
Кроме того, бактери насто щего изобретени может иметь сниженную активность
фермента, который катализирует реакцию генерировани соединени , отличающегос от Lлизина, путем ответвлени от пути биосинтеза L-лизина или может быть дефектной по
такому ферменту. Ферменты, которые катализируют реакцию генерировани соединени ,
Страница: 7
RU 2 337 140 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
отличающегос от L-лизина, путем ответвлени от пути биосинтеза L-лизина, включают
гомосериндегидрогеназу и лизиндекарбоксилазу. Штаммы, имеющие сниженные
активности ферментов, описаны в патентах WO95/23864 и WO 96/178930.
Усиление активности фермента, кодируемого геном, может быть достигнуто, например,
путем амплификации гена биосинтеза L-лизина или L-треонина с плазмидой, автономно
реплицирующейс в бактери х Escherichia. Ген биосинтеза может быть интегрирован в
бактериальную хромосому. Усиление активности также может быть достигнуто
посредством введени гена, который содержит мутацию, вызывающую усиление
активности фермента, кодируемого геном. Примерами такой мутации вл етс мутаци промоторной последовательности, вызывающей усиление уровн транскрипции гена, и
мутаци в кодирующей области гена, усиливающа специфическую активность
ферментативного белка.
Помимо генной амплификации, как описано выше, экспресси гена может быть усилена
путем замещени последовательности, контролирующей экспрессию, такой как промотор
гена на хромосомной ДНК или плазмиде, на функционально более сильную
(Международна публикаци № WO 00/18935). Сильные промоторы общеизвестны и
включают, например, промотор lac, промотор trp, промотор trc, промотор tac и
промотор PR бактериофага л мбда. Экспресси гена может быть усилена путем замещени эндогенного промотора на либо хромосому, либо плазмиду, содержащую функционально
более сильный промотор, или путем модификации эндогенного промотора. Модификаци последовательности, контролирующей экспрессию, может быть комбинирована с
повышением числа копий гена.
Примеры бактерий Escherichia, в которых способность продуцировать L-лизин или Lтреонин вл етс приобретенной и которые могут быть использованы в насто щем
изобретении, приведены ниже. Однако бактери насто щего изобретени не ограничена
этими примерами, к ней относ тс любые бактерии, способные продуцировать L-лизин или
L-треонин.
Специфическими примерами штаммов, резистентных к аналогам, или штаммов,
мутантных по метаболическому контролю, которые обладают способностью продуцировать
L-лизин, вл ютс Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; Выложенна за вка на патент Японии № 56-18596 и Патент США № 4346170) и Escherichia coli VL611.
Штамм WC196 может быть использован как продуцирующа L-лизин бактери Escherichia
coli (Международна публикаци № WO96/17930). Штамм WC196 селектировали путем
придани штамму W3110, полученному от штамма K-12 Escherichia coli, резистентности к
AEC (S-(2-аминоэтил)цистеину). Этот штамм обозначили как Escherichia coli AJ13069 и
депонировали в Национальном институте биологической науки и технологии человека,
Агентство по промышленной науке и технике (в насто щее врем Национальный институт
передовой промышленной науки и технологии, Международна организаци по хранению
патентов, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 3058566, Japan) от 6 декабр 1994 г. и присвоили инвентарный номер FERM P-14690. Его
передали в международный депозитарий по услови м Будапештского соглашени от 29
сент бр 1995 г. и присвоили инвентарный номер FERM BP-5252.
Примеры бактерий Escherichia, обладающих способностью продуцировать L-треонин,
включают продуцирующий L-треонин мутантный штамм, который вл етс резистентным к
6-диметиламинопурину (Выложенна за вка на патент Японии № 5-304969),
рекомбинантные штаммы Escherichia coli, такие как штамм, в котором ген биосинтеза
треонина, содержащий введенную мутацию, котора вызывает избыточное
продуцирование фермента биосинтеза L-треонина, амплифицирован на плазмиде
(Опубликованна за вка на патент Японии № 1-29559 и Выложенна за вка на патент
Японии № 5-227977), штамм, в котором оперон треонина амплифицирован на плазмиде
(Выложенна за вка на патент Японии № 2-109985), и штамм, в котором гены, кодирующие
пируваткарбоксилазу и никотинамиднуклеотидтрансгидрогеназу, амплифицированы
(Выложенна за вка на патент Японии № 2002-51787).
Страница: 8
RU 2 337 140 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Escherichia coli VKPM B-3996 (Патент США № 5175107) также относитс к насто щему
изобретению. Штамм VKPM B-3996 депонировали в Российской национальной коллекции
промышленных микроорганизмов (VKPM), ГНИИ Генетика) от 19 но бр 1987 г. и
присвоили инвентарный номер VKPM B-3996. VKPM B-3996 содержит плазмиду pVIC40
(Международна публикаци № WO 90/04636), которую получили путем введени генов
биосинтеза треонина (треониновый оперон thrABC) в предназначенный дл широкого круга
хоз ев вектор, например плазмиду pAYC32 (Chistoserdov A.Y., Tsygankov Y.D., Plasmid,
1986, 16, 161-167). В pVIC40 десенсибилизировано ингибирование обратной св зи
посредством L-треонина аспартокиназа I-гомосериндегидрогеназы I, кодируемой thrA в
треониновом опероне.
Кроме того, Escherichia coli B-5318 (Патент Европы № 0593792) относитс к насто щему
изобретению. Штамм B-5318 депонировали в Российской национальной коллекции
промышленных микроорганизмов (VKPM), ГНИИ Генетика) от 19 но бр 1987 г. и
присвоили инвентарный номер VKPM B-5318. Штамм VKPM вл етс прототрофным по
отношению к изолейцину и содержит рекомбинантную плазмидную ДНК. Эту плазмида
сконструирована так, что треониновый оперон, включающий гены биосинтеза треонина,
содержит дефект в области аттенуации, например в эндогенной области регул ции
транскрипции. Оперон расположен ниже температурочувствительного репрессора C1 фага
л мбда, промотора PR и N-конца белка Cro и сконструирован таким образом, что
экспресси генов биосинтез треонина находитс под контролем репрессора фага л мбда и
промотора.
<2> Конструирование бактерии Escherichia насто щего изобретени Бактери Escherichia насто щего изобретени вл етс бактерией, принадлежащей к
роду Escherichia, котора обладает способностью продуцировать L-лизин или L-треонин и
котора модифицирована так, что нарушена нормальна функци малеинового фермента.
В процессе селекции бактери Escherichia насто щего изобретени либо приобретает
способность продуцировать L-лизин или L-треонин, либо несет мутацию, нарушающую
нормальную функцию малеинового фермента (EC 1.1.1.38, EC 1.1.1.40). Также бактери Escherichia, обладающа способностью продуцировать L-лизин или L-треонин, может быть
модифицирована так, что нарушена нормальна функци малеинового фермента, и
способность продуцировать L-лизин или L-треонин может быть придана бактерии
Escherichia, котора пока еще не имеет нормальной функции малеинового фермента.
Фраза «активность малеинового фермента» означает активность, котора катализирует
обратимую реакцию продуцировани диоксида углерода и пирувата из малата. Известны
малеиновые ферменты, которые используют НАД (EC 1.1.1.38) и НАДФ (EC 1.1.1.40) как
коферменты. (EC 1.1.1.38 (S)-малат+НАД+=пируват+CO2+НАДН+H +) (EC 1.1.1.40 (S)малат+НАДФ +=пируват+CO2+НАДФН+H +). Малеиновый фермент также называют
«малатдегидрогеназа» или «малатоксидоредуктаза».
Фраза «модифицированный так, что нарушена нормальна функци малеинового
фермента в клетке» означает, что он модифицирован так, что функци малеинового
фермента должна быть элиминирована или активность малеинового фермента должна
быть снижена или аттенуирована по сравнению с немодифицированным штаммом, таким
как штамм дикого типа (родительский). Состо нием, когда нормальна функци малеинового фермента нарушена, может быть, например, состо ние ингибировани транскрипции или трансл ции гена, кодирующего малеиновый фермент, и, следовательно,
его продукта, малеиновый фермент не продуцируетс , или его продуцирование снижено,
или состо ние, когда ген, кодирующий малеиновый фермент на бактериальной хромосоме,
мутирован, и/или мутирована последовательность, контролирующа экспрессию гена, и
таким образом, активность малеинового фермента снижена или элиминирована. Типичным
примером бактерии Escherichia, в которой нарушена функци малеинового фермента,
вл етс штамм, несущий разрушенный ген, в котором ген, кодирующий малеиновый
фермент на бактериальной хромосоме, разрушен с помощью метода генетической
рекомбинации, и мутантный штамм, в котором регулирующа экспрессию
Страница: 9
RU 2 337 140 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
последовательность или кодирующа область гена малеинового фермента мутированы, и
поэтому функциональный малеиновый фермент не продуцируетс длительно.
Фраза «модифицированный так, что активность малеинового фермента аттенуирована»
означает, что активность малеинового фермента снижена по сравнению с
немодифицированным штаммом, например штаммом дикого типа (родительским)
бактерии Escherichia. Предпочтительно активность малеинового фермента снижена не
более чем на 50%, более предпочтительно не более чем на 30% и наиболее
предпочтительно не более чем на 10% на клетку по сравнению с немодифицированным
штаммом.
Примерами бактерии Escherichia, котора может действовать в качестве контрол ,
вл ютс Escherichia coli W3110 (ATCC 27325) и Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076). Эти
штаммы дикого типа получены из прототипного штамма K12 дикого типа. Активность
малеинового фермента с использованием НАД в качестве кофермента может быть
определена по способу Korkes S. с сотр., (Korkes S. с сотр., (1950) J. Biol. Chem.
187, 891-905). Активность малеинового фермента с использованием в качестве
кофермента НАДФ может быть определена по способу Ochoa S. (Ochoa S. с сотр., (1947)
J. Biol. Chem. 167, 871-872).
Термин «аттенуаци » включает, но не ограничива сь этим, полную элиминацию
активности. Кажда активность малеинового фермента с использованием в качестве
коферментов НАД или НАДФ может быть аттенуированна индивидуально или совместно. В
рамках насто щего изобретени достаточно, что бактери Escherichia имеет
аттенуированную активность малеинового фермента по сравнению со штаммом дикого
типа или немодифицированным штаммом. Однако предпочтительно, если бактери Escherichia насто щего изобретени также имеет усиленную способность вызывать
накопление или секрецию L-лизина или L-треонина по сравнению со штаммом дикого типа
или немодифицированным штаммом и/или улучшенную продуктивность L-лизина или Lтреонина вследствие хорошего роста, главным образом за счет улучшенного выхода
продукта за вычетом клеток.
Малеиновый фермент насто щего изобретени содержит белок, имеющий
аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:6 или 8. Малеиновый
фермент может быть вариантом аминокислотной последовательности, представленной в
SEQ ID NO:6 или 8, в которой он может содержать замещение, делецию, инсерцию или
добавление одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной
последовательности, представленной в SEQ ID NO:6 или 8, при условии, что он имеет
активность малеинового фермента. Как использовано в данном описании, «нескольких»
означает, например, 2-20, предпочтительно 2-10, более предпочтительно 2-5
аминокислотных остатков.
Замещение, делеци , инсерци или добавление одного или нескольких аминокислотных
остатков должно быть консервативной мутацией( ми), с тем чтобы сохран лась активность
малеинового фермента. Типичной консервативной мутацией вл етс консервативное
замещение. Примеры консервативных замещений включают: замещение Ser или Thr на Ala;
замещение Gln, His или Lys на Arg; замещение Glu, Gln, Lys, His или Asp на Asn;
замещение Asn, Glu или Gln на Asp; замещение Ser или Ala на Cys; замещение Asn, Glu,
Lys, His, Asp или Arg на Gln; замещение Asn, Gln, Lys или Asp на Glu; замещение Pro
на Gly; замещение Asn, Lys, Gln, Arg или Tyr на His; замещение Leu, Met, Val или Phe
на Ile; замещение Ile, Met, Val или Phe на Leu; замещение Asn, Glu, Gln, His или Arg
на Lys; замещение Ile, Leu, Val или Phe на Met; замещение Trp, Tyr, Met, Ile или Leu
на Phe; замещение Thr или Ala на Ser; замещение Ser или Ala на Thr; замещение Phe или
Tyr на Trp; замещение His, Phe или Trp на Tyr и замещение Met, Ile или Leu на Val.
Фраза «модифицированный так, что нарушена нормальна функци малеинового
фермента в клетке» может означать снижение числа молекул малеинового фермента на
клетку и снижение активности малеинового фермента на молекулу. В частности,
модификаци может быть проведена путем получени дефектов гена, кодирующего
Страница: 10
RU 2 337 140 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
малеиновый фермент на бактериальной хромосоме, или путем модификации
последовательности, контролирующей экспрессию, такой как промотор или
последовательность Шайна-Дальгарно (SD). Также модификаци может быть проведена
путем введени замещени аминокислоты (миссенс-мутаци ) или стоп-кодона (нонсенсмутаци ) в кодирующую область, или введени инсерции или делеции 1-2 оснований в
кодирующую область (мутаци сдвига рамки считывани ), или делетировани части гена
(Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997)).
Примером гена малеинового фермента (ген mez) на хромосоме вл етс ген sfcA,
поскольку его ДНК имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID
NO:5. Эта ДНК кодирует фермент, который использует НАД в качестве кофермента. Другим
примером вл етс ген b2463, ДНК которого имеет нуклеотидную последовательность,
представленную в SEQ ID NO:7. Эта ДНК кодирует фермент, который использует НАДФ в
качестве кофермента.
Ген mez может быть ДНК, котора гибридизируетс с нуклеотидной
последовательностью, представленной в SEQ ID NO:5 или 7, или зондом, полученным из
нуклеотидной последовательности в жестких услови х при условии, что он кодирует
белок, который имеет активность малеинового фермента. «Жесткие услови » означают
услови , при которых формируетс специфический гибрид и неспецифический гибрид не
формируетс . Например, к жестким услови м относитс однократное промывание,
предпочтительно 2-3-кратное промывание при концентрации соли,
соответствующей 1ЧSSC, 0,1% SDS, предпочтительно 0,1ЧSSC, 0,1% SDS при 60°C.
Подход ща длина зонда может быть выбрана в зависимости от условий гибридизации, как
правило, она составл ет 100 п.н.-1 т.п.н.
Ген, кодирующий малеиновый фермент, (sfcA, b2643), может быть получен с помощью
ПЦР с использованием в качестве матрицы хромосомы Escherichia coli и
олигонуклеотидов, синтезированных на основе следующих
последовательностей Escherichia coli, зарегистрированных в GenBank в качестве
праймеров: sfcA: AAC74552. NAD-св занный малат...[gi:1787754], комплементарный
AE000245.1:1208..2932, b2643: AAC75516, предположительно мультимодальный...[gi:
1788806], комплементарный AE000333.1:141..2420.
Хромосомна ДНК может быть получена из бактерии дл использовани в качестве
донорной ДНК посредством, например, способа Saito и Miura (ссылка на H. Saito и K.
Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Text for Bioengineering Experiments,
Edited by the Society for Bioscience and Bioengineering, Japan, pp.97-98, Baifukan,
1992) или т.п.
Ген sfcA или b2643, полученный, как описано выше, или его часть может быть
использована дл разрушени гена. Достаточным условием дл гена, используемого дл разрушени гена, вл етс степень гомологии, позвол юща проводить гомологичную
рекомбинацию генов sfcA или b2463 на хромосоме бактерии Escherichia. Поэтому может
быть использован такой гомологичный ген. Степень гомологии, котора должна разрешать
гомологичную рекомбинацию, предпочтительно составл ет 70% или более, более
предпочтительно 80% или более, еще более предпочтительно 90% или более и наиболее
предпочтительно 95% или более. Также гомологична рекомбинаци может происходить,
если используетс ДНК, котора гибридизируетс с геном в жестких услови х. «Жесткие
услови » вл ютс услови ми, в которых формируетс специфический гибрид и
неспецифический гибрид не формируетс . Например, к жестким услови м относитс однократное промывание, предпочтительно 2-3-кратное промывание при концентрации
соли, соответствующей 1ЧSSC, 0,1% SDS, предпочтительно 0,1ЧSSC, 0,1% SDS при 60°C.
Ген sfcA или b2463 может быть разрушен путем, например, получени из гена, как
описано выше, гена sfcA или b2463 делеционного типа, в котором частична последовательность делетирована так, что малеиновый фермент с нормальной функцией
не продуцируетс . Этим геном делетированного типа или ДНК, содержащей ген, затем
может быть трансформирована бактери Escherichia и вызвана рекомбинаци между геном
Страница: 11
RU 2 337 140 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
делетированного типа и геном на хромосоме. Разрушение гена посредством подставлени гена с помощью гомологичной рекомбинации уже разработано и подтверждено примером с
использованием линейной ДНК в способе, разработанном Datsenko К.А. и Wanner B.L.
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645), также названном как "Redзапускаема интеграци ", и способом, основанным на применении плазмиды, несущей
температурочувствительную область инициации репликации (Патент США №6303383 и
Выложенна за вка на патент Японии №5-7491). Разрушение гена посредством генного
вычитани с помощью гомологичной рекомбинации также может быть выполнено
посредством использовани плазмиды, котора не обладает способностью к репликации в
хоз ине.
Кроме того, может быть использован способ, основанный на комбинации способа,
названного «red-запускаема интеграци », и эксцизионной системы, полученной из фага
л мбда (J.Bacteriol. 2002 Sep; 184(18): 5200-3). Может быть использовано
взаимодействие между интегразой и эксцизионазой в фаге л мбда, вырезающее
нуклеопротеиновый комплекс (Cho EH, Gumport RI, Gardner JF.), как способ разрушени гена на хромосоме.
В соответствии со способом red-запускаемой интеграции шт??мм, несущий разрушенный
ген, может быть сконструирован в один этап с использованием ПЦР-продукта, который
получают с использованием синтетических олигонуклеотидов в качестве праймеров,
которые сконструированы так, что содержат часть адресного гена на своем 5'-конце и
часть гена резистентности к антибиотику на своем 3'-конце. Кроме того,
интегрированный ген резистентности к антибиотику может быть удален путем введени attL и attR, которые вл ютс сайтами прикреплени фага л мбда, и ПЦР-продукта и
комбинировани эксцизионной системы, полученной из фага л мбда, со способом redзапускаемой интеграции.
В частности, штамм, в котором адресный ген разрушен и ген резистентности к
антибиотику удален, может быть получен с помощью описанного ниже способа.
В первую очередь получили линейную ДНК-кассету, содержащую ген резистентности к
антибиотику, сайты прикреплени фага л мбда и адресный ген. Ее получили, как обычно,
с помощью ПЦР с использованием специальной полученной матрицы.
Матрицу, в которой attL и attR (SEQ ID NO:9 (GenBank, инвентарный № M12458 и SEQ ID
NO:10 (GenBank, инвентарный № M12459)) вл ютс сайтами прикреплени фага л мбда,
вводили в соответствующие концы гена резистентности к антибиотику, который
использовали как матрицу линейной ДНК-кассеты. Матрица может быть плазмидой, геном,
введенным в хромосому, или синтетическим олигонуклеотидом. Хот геном резистентности
к антибиотику предпочтительно вл етс ген резистентности к хлорамфениколу, может
быть использован ген резистентности к стрептомицину, или ген резистентности к
ампициллину, или ген резистентности к любому другому антибиотику, при условии, что
генные функции в качестве гена резистентности к антибиотику в бактери х Escherichia
отличаютс от маркерного гена, который может содержатьс в двух хелперных плазмидах,
как описано ниже. Бесспорным подтверждением приобретени резистентности к
антибиотику может быть увеличение уровн экспрессии примен емого гена резистентности
к антибиотику путем замещени промоторной последовательности и т.п. или усиление
активности фермента в результате введени мутации в последовательность структурного
гена. Линейную ДНК-кассету получали в следующем пор дке, начина с 5'-конца: (5'последовательность адресного гена)-(attL)-(ген резистентности к антибиотику)-(attR)-(3'последовательность адресного гена).
Линейную ДНК-кассету вводили в хромосому. В качестве хелперной плазмиды дл интеграции линейной ДНК-кассеты в хромосому может быть использована плазмида pKD46
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645). pKD46 характеризуетс температурочувствительной репликацией и резистентностью к ампициллину и содержит
фрагмент 2154 п.н. фрагмента ДНК фага л мбда (GenBank/EMBL, инвентарный № J02459,
31088-33241), который содержит гены (гены ?, ? и exo), кодирующие Red-рекомбиназу
Страница: 12
RU 2 337 140 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
системы гомологичной рекомбинации ? Red, котора находитс под контролем
индуцируемого арабинозой промотора ParaB.
pKD46 может быть введена в хоз ина с помощью электропорации. pKD46амплифицированный штамм культивировали с арабинозой. Линейную ДНК-кассету вводили
в логарифмической фазе роста и инкубировали при высокой температуре дл получени штамма с разрушенным геном, который резистентен к антибиотику благодар гену
резистентности к антибиотику в линейной ДНК-кассете. Подтверждение разрушени гена
может быть получено с помощью ПЦР или путем измерени концентрации L-лизина или Lтреонина, продуцированного штаммом.
Далее вводили хелперную плазмиду дл удалени гена резистентности к антибиотику.
Хелперна плазмида содержит ген, кодирующий интегразу (Int) (SEQ ID NO:13, GenBank,
инвентарный № J02459. B [gi:215104]), и ген, кодирующий эксцизионазу (Xis) (SEQ ID NO:
15, GenBank, инвентарный № J02459 [gi:215104]) фага л мбда, и характеризуетс температурочувствительной репликацией. Вследствие введени хелперной плазмиды
рекомбинаци происходит благодар узнаванию attL (SEQ ID NO:11) и attR (SEQ ID NO:12)
на хромосоме. Ген резистентности к антибиотику, расположенный между attL и attR,
вырезаетс , и в результате структура, котора содержит только последовательности attL
или attR, остаетс на хромосоме. Инкубаци при высокой температуре вызывает утрату
хелперной плазмиды. Так может быть получен штамм, в котором разрушен адресный ген и
элиминирован ген резистентности к антибиотику.
Другой, отличающийс от методов генетической инженерии, способ модификации
бактерии, вызывающей нарушение нормальной функции малеинового фермента, может
быть примером способа обработки бактерии Escherichia УФ-облучением или мутагенным
агентом, обычно используемым дл мутагенеза, таким как N-метил-N'-нитро-Nнитрозогуанидин или азотна кислота с последующим отбором бактерий, про вл ющих
аттенуированную активность малеинового фермента.
Насто щее изобретение было разработано на основании информации о
метаболическом потоке. Эта информаци была рассчитана с помощью нижеприведенного
способа определени вли ни метаболического потока на продуцирование вещества с
использованием клеток. Однако насто щее изобретение не ограничено способом
получени такой информации, то есть способом определени .
Способ определени вли ни метаболического потока на продукцию вещества с
использованием клеток включает в себ этапы:
1) создание стехиометрической матрицы на основании формул биохимических реакций
субстрата с получением желательного вещества;
2) выбор определенного числа независимых метаболических потоков из всей
совокупности метаболических потоков в качестве степени свободы стехиометрической
матрицы как совокупности свободных потоков;
3) создание достаточного числа случайных комбинаций свободных потоков дл статистического анализа и расчета распределени метаболического потока по каждой
созданной комбинации на основе стехиометрической матрицы;
4) получение уравнени регрессии, включающего минимальное число свободных
потоков, которое показывает коррел цию с продуцированием вещества по рассчитанным
распределени м метаболического потока с помощью мультивариантного статистического
анализа;
и
5) определение не менее одного метаболического потока, вли ющего на
продуцирование вещества, на основе коэффициента в полученном уравнении регрессии.
Метаболический поток, использованный в насто щем изобретении, выражаетс как
скорость метаболической реакции (потока), полученна на основе стехиометрической
модели внутриклеточных биохимических реакций и закона действи масс между
метаболитами; между тем, распределение метаболического потока, как использовано в
данном описании, состоит из всех метаболических потоков, где каждый метаболический
Страница: 13
RU 2 337 140 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
поток означает отдельную биохимическую реакцию.
На первом этапе способа определени получили стехиометрическую матрицу на основе
формул биохимических реакций субстрата с получением желательного вещества в
качестве продукта.
Биохимические реакции отражают процесс, в результате которого внутриклеточные
метаболиты конвертируют посредством ферментативных реакций в клетке и который был
компилирован в различных базах данных в соответствии с типом организма. Например, дл ссылки может быть доступна Энциклопеди генов и геномов Kyoto (KEGG,
www.genome.ad.jp/kegg/).
Субстрат вл етс веществом, обычно используемым клеткой как источник углерода, и
примерами его вл ютс глюкоза, сахароза, фруктоза и т.п.
Вещество в качестве продукта включает не только отдельный вид метаболита, но также
агрегаты метаболитов, такие как биомасса (клеточное тело). Продуцирование вещества
обычно оценивают по скорости продуцировани вещества. В частности, если желательное
вещество вл етс биомассой, ее оценивали по выходу биомассы. Выход биомассы
отражает эффективность превращени субстратов, таких как глюкоза, в клеточные
компоненты, такие как белок, углевод, нуклеинова кислота или липид.
Стехиометрическа матрица вл етс матрицей, обычно используемой дл анализа
метаболического потока, и может быть создана путем составлени списков формул
биохимических реакций субстрата с образованием желательного вещества в качестве
продукта посредством стандартных способов, используемых дл анализа метаболического
потока. Такие способы, допускающие квазиравновесное состо ние внутриклеточного
метаболического промежуточного соединени , широко известны (Savinell J.M. and Palsson
B.O.J., Theor. Biol., 154:421-454, 1992; Vallino J.J. and Stephanopoulos G.,
Biotechnol. Bioeng., 41:633-646, 1993). После составлени списков формул реакций
реакционные пути могут быть упрощены путем допущени серий реакций без
разветвлени , в виде одной реакции, или допущени метаболитов, конвертируемых с
помощью реакции с высокой метаболической скоростью до или после реакции, как одного
метаболита и т.д. Когда вещество в качестве продукта вл етс биомассой,
стехиометрическа матрица может быть описана путем перечислени биохимических
реакций, протекающих в компонентах клетки.
На втором этапе способа определени из общего числа метаболических потоков
отобрали определенное число независимых метаболических потоков в качестве свободных
потоков, характеризующих степень свободы вышеупом нутой стехиометрической матрицы.
Независимые потоки представл ют собой совокупность потоков, каждый из которых
должен однозначно соответствовать определенному потоку в системе метаболической
сети, как задано стехиометрическим уравнением.
Способ отбора свободных потоков особым образом не ограничен, поскольку может быть
отобрано только то число независимых метаболических потоков, которое соответствует
степени свободы системы, используемой дл анализа. Хот независимость произвольно
выбранных потоков может быть подтверждена, дл этого также может быть использована
предложенна Reder SIMS-матрица или равновесна внутренн метаболическа стехиометрическа матрица (Reder C.J., Theor. Biol., 135:175-201, 1988). Согласно
этому способу конкретную группу числа метаболических потоков как степень свободы
вышеупом нутой стехиометрической матрицы определ ли из числа свободных потоков из
независимых групп метаболических потоков, определенных на основании вышеупом нутых
формул биохимических реакций и метаболический поток выбирали как свободный поток из
определенной группы метаболических потоков. Определение специфических групп среди
групп потоков гарантирует, что любой поток в группе может быть изменен без вли ни на
поток других групп. Поэтому становитс возможным отбор одного потока из каждой группы
как независимого свободного потока. Когда свободный поток отобран из группы потоков,
поток замыкает предварительно отобранную точку ветвлени .
На третьем этапе способа определени получили случайные комбинации свободных
Страница: 14
RU 2 337 140 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
потоков в числе, достаточном дл статистического анализа, и распределение
метаболических потоков рассчитали дл каждой созданной комбинации на основе
стехиометрической матрицы.
Случайные комбинации свободных потоков могут быть получены путем подставлени случайных значений в свободные потоки, выбранные на предыдущем этапе с целью
создани набора данных по комбинаци м различных распределений потоков. Способ
подставлени случайных значений в свободные потоки практически не имеет ограничений,
поскольку выбран способ получени комбинаций свободных потоков в специфическом
пределе. Указанный специфический предел вл етс набором дл придани биологически
пригодных значений в последних расчетах. Если число свободных потоков вл етс таким
же, как степень свободы специфической стехиометрической матрицы, однозначное
распределение метаболического потока может быть разрешено. Дл раствора матрична операци с использованием обратной матрицы, в общем, выполнима, и все потоки
предпочтительно должны быть нормализованы, например, дл определенного количества
субстрата. Если субстратом вл етс глюкоза, все значени потока должны быть
репрезентативными, например, со значени ми дл 10 мМ поглощени глюкозы. Растворы
распределений метаболического потока, полученные исход из случайных значений
свободного потока, как описано выше, должны быть биологически значимыми. То есть все
значени дл потоков необратимых реакций должны равн тьс 0 или более, и значени дл биомассы, сформированной потоками, должны равн тьс 0 или более. Дл получени комбинаций более предпочтительных свободных потоков могут быть добавлены услови ,
основанные на теоретических и/или эмпирических знани х о продуцировании вещества с
помощью клеток. Должно быть получено определенное число комбинаций, то есть
рассчитано число биологически значимых распределений потока, не ограниченное
практически, пока оно не окажетс достаточным дл статистического анализа. Дл одного
свободного потока обычно используют три или п ть значений. Поэтому в случае n
свободных потоков существует около n степеней р да значений дл одного свободного
потока комбинаций. Например, при использовании трех значений дл одного свободного
потока существует 3 в n-й степени (3 n) комбинаций. То есть дл семи свободных потоков
(n=7) может быть использовано около 2200 комбинаций. В качестве альтернативы, так как
число значений дл каждого свободного потока в совокупности данных биологически
значимых распределений потока может измен тьс в зависимости от выбранных
свободных потоков или дополнительных условий, число комбинаций, которое может быть
использовано, составл ет приблизительно от 3 до n-й степени (3 n) или от приблизительно
5 до n-й степени (5 n), в целом, дл n свободных потоков. Дл получени растворов
биологически значимых распределений потоков в этом р ду обычно начинают с
комбинаций случайных свободных потоков с использованием 6-10 значений дл одного
свободного потока, то есть комбинаций свободных потоков шесть в n-й степени (6 n) или
10 в n-й степени (10 n).
На четвертом этапе способа определени на основании распределений
метаболического потока (совокупность данных по распределени м метаболического
потока) и мультивариантного статистического анализа получили уравнение регрессии,
включающее минимальное число свободных потоков, которое показывает коррел цию с
продуцированием вещества.
Путем проведени мультивариантного статистического анализа совокупности данных по
распределени м потока, рассчитанным по случайным комбинаци м свободных потоков,
полученным на предыдущем этапе, может быть получено уравнение регрессии,
включающее минимальное число свободных потоков, которое показывает коррел цию с
продуцированием вещества. Мультивариантный статистический анализ (включающий
мультивариантный нелинейный регрессионный анализ и мультивариантный линейный
регрессионный анализ) может быть выполнен с помощью любого метода, поскольку
выбирали метод, с помощью которого можно исследовать коррел ции комбинаций
свободного потока с продуцированием вещества. Однако более подход щим вл етс Страница: 15
RU 2 337 140 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
мультивариантный линейный регрессионный анализ. Этот метод описан, например,
Kachigan S.K., Chapter 4, Regression Analysis in Multivariate Statistical Analysis
2nd Ed., Radius Press, New York, pp.160-193.
Выражение «показывает коррел цию с продуцированием вещества» означает, что
коэффициент коррел ции вл етс достаточно большим, и «быть значимо большим»
обычно означает, что коэффициент коррел ции R 2 равен 0,8 или более, предпочтительно
0,9 или более.
Уравнение регрессии, содержащее минимальное число свободных потоков (термов),
которое показывает коррел цию с продуцированием вещества, может быть получено путем
последовательного изменени числа термов, используемых дл получени уравнени регрессии. Такое уравнение, которое показывает наиболее высокий коэффициент
коррел ции, включает в себ каждый терм, и создаетс возможность отобрать уравнение
регрессии, содержащее минимальное число термов со значимо большим коэффициентом
коррел ции. В качестве альтернативы уравнение регрессии может быть получено способом
исключени из общего числа термов одного терма дл исследовани степени снижени коэффициента коррел ции в результате исключени терма; така же процедура может
быть повторена с другими термами за исключением терма, показывающего снижение
коэффициента коррел ции наименьшее из всех термов; и когда уравнение регрессии,
которое показывает коррел цию с продуцированием вещества, может долго не получатьс ,
это позвол ет немедленно выбрать уравнение регрессии.
Хот эти математические операции могут быть запрограммированы по отдельности, они
могут быть легко выполнены с помощью серийно выпускаемых математических
компьютерных программ, таких как MatLab® (торговое название MathWorks) и Mathematica®
(торговое название Wolfram Research).
На п том этапе способа определени метаболический поток, вли ющий на
продуцирование вещества, определ ли на основании коэффициентов полученного
уравнени регрессии.
Вклад свободных потоков в продуцирование вещества с использованием клеток, таких
как микроорганизмы, в частности выход биомассы или выход продукта, необходимого дл продуцировани вещества, может быть определен путем использовани уравнени регрессии, полученного на предыдущем этапе. То есть свободные потоки, представленные
в уравнении регрессии, могут быть определены как потоки, вли ющие на продуцирование
вещества. К тому же, так как коэффициенты уравнени регрессии представл ют величину
вклада, свободные потоки, имеющие достоверно больший коэффициент (когда потоки
нормализованы, свободные потоки имеют большее абсолютное значение относительного
коэффициента), могут быть определены как метаболические потоки, значительно
вли ющие на продуцирование вещества.
Способ определени насто щего изобретени может предоставить информацию,
котора имеет важное значение дл улучшени бактериальных штаммов, то есть какой
свободный поток наиболее вли ет на продуцирование адресного вещества и имеет ли
свободный поток положительное или отрицательное вли ние на продуцирование целевого
вещества. Также можно заранее предсказать поток, который требуетс изменить дл получени благопри тного эффекта на выход адресного продукта и продуктивность.
Как показано в примерах данного описани , можно ожидать, что бактериальные штаммы
с улучшенной лизин-продуцирующей способностью могут быть получены путем усилени активности фосфоенолпируваткарбоксилазы при продуцировании лизина с
помощью Escherichia coli. В международной публикации № WO01/53459 представлен
пример усовершенствовани продуцировани лизина путем усилени активности
фосфоенолпируваткарбоксилазы. Следовательно, было подтверждено, что бактериальный
штамм, обладающий способностью продуцировать вещество, может быть создан на основе
способа определени .
<3> Способ получени дл продуцировани L-лизина или L-треонина
Способ насто щего изобретени представл ет собой способ продуцировани L-лизина
Страница: 16
RU 2 337 140 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
или L-треонина и включает в себ этапы: культивирование бактерии, обладающей
способностью продуцировать L-лизин или L-треонин в среде; накопление L-лизина или Lтреонина в среде или в клетках бактерии; и сбор и выделение L-лизина или L-треонина
из среды или из клеток.
Культуральна среда, используема в насто щем изобретении, может быть средой,
обычно примен емой дл ферментативного продуцировани L-лизина или L-треонина с
помощью микроорганизма. Может быть использована стандартна среда, содержаща источник углерода, источник азота, неорганические ионы и другие органические
компоненты, при необходимости. В качестве источника углерода могут быть использованы
различные сахариды, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, галактоза, фруктоза и
гидролизат крахмала, различные спирты, такие как глицерин и сорбит, и различные
органические кислоты, такие как фумарова кислота, лимонна кислота и нтарна кислота. В качестве источника азота могут быть использованы различные неорганические
соли аммони , такие как сульфат аммони , хлорид аммони и фосфат аммони ,
органический азот, такой как соевый гидролизат, газообразный аммиак и водный раствор
аммиака и т.п. В качестве следовых количеств органических питательных веществ
желательно добавл ть необходимые вещества, такие как витамин B1, гомосерин или
дрожжевой экстракт и т.п. Кроме того, могут быть добавлены следовые количества
фосфата кали , сульфата магни , ион железа, ион марганца. Среда, используема дл культивировани , может быть либо синтетической средой, либо естественной средой,
поскольку среда содержит источник углерода и источник азота, неорганические ионы и,
если необходимо, следы органических питательных веществ.
Культивирование предпочтительно проводили в аэробных услови х в течение одногосеми дней при температуре 24-37°C и pH 5-9. pH культуры можно регулировать
неорганической или органической кислотой или щелочным веществом, например
газообразным аммиаком и т.п. Сбор и выделение L-лизина или L-треонина из
культуральной среды можно проводить с помощью стандартных способов, таких как способ
на основе ионообменной смолы, способ осаждени и других известных способов и их
комбинаций. После накоплени L-лизина или L-треонина в клетках их можно собирать с
помощью способа на основе ионообменной смолы и т.п. из супернатанта, полученного
путем разрушени клеток с помощью ультразвука и т.п., и удалени обломков клеток
путем центрифугировани .
Примеры
Насто щее изобретение далее детально описано на основании примеров.
Пример 1.
Определение метаболического потока в отношении L-лизина
(1) Создание стехиометрической матрицы
Стехиометрическое уравнение дл расчета метаболического потока было получено
путем допущени квазиравновесного состо ни внутриклеточных метаболических
промежуточных соединений (Savinell J.M. and Palsson B.O.J., Theor. Biol., 154:421454, 1992; Vallino J.J. and Stephanopoulos G., Biotechnol. Bioeng., 41:633-646,
1993). Формулы реакций, включенные в эту модель, показаны в таблице 2. Описание
сокращений, примен емых в насто щем изобретении, представлено в таблице 1. Дл упрощени формул некоторые реакции без разветвлени объединили. Поскольку
пентозофосфатный путь вл етс сложным, его представили двум формулами.
Полученные данные использовали дл определени соотношени компонентов биомассы
(Neidhardt F.C. с сотр., Physiology of the Bacterial Cell., Sinauer Associates,
Massachusetts, 1990) и биомассу представили с помощью формулы реакции [68]. Степень
свободы стехиометрической матрицы в этой модели равн лась 7.
Таблица 1
50
3PG
3-фосфо-D-глицеринова кислота
AcCoA
Ацетил-кофермент A
AcOH
Уксусна кислота
aIVA
?-кето-изовалерианова кислота
Страница: 17
RU 2 337 140 C2
aKG
5
10
15
20
25
30
35
40
2-оксоглутарова кислота
Ala
Аланин
ALC
Ацетооксикислота
Arg
Аргинин
ASA
Аспарагиновой кислоты полуальдегид
Asn
Аспарагин
Asp
Аспарагинова кислота
CHR
Хоризмова кислота
Cit
Лимонна кислота
CO2
Диоксид углерода
CoA
Кофермент A
Cys
Цистеин
DDP
Дигидродипиколинова кислота
E4P
Эритрозо-4-фосфат
F6P
Фруктозо-6-фосфат
FBP
Фруктозобифосфат
Form
Муравьина кислота
Fum
Фумарова кислота
G6P
Глюкозо-6-фосфат
GAP
Глицеральдегидфосфат
Glc
Глюкоза
Gln
Глутамин
Glu
Глутаминова кислота
Gly
Глицин
Glyox
Глиоксилова кислота
His
Гистидин
Hse
Гомосерин
Ile
Изолейцин
Ind
Индолглицеринфосфат
Isocit
Изолимонна кислота
Leu
Лейцин
Lys
Лизин
Lysext
Продукт лизина (внеклеточный)
Mal
Яблочна (малеинова ) кислота
Met
Метионин
mDAP
meso-диаминопимелинова кислота
mTHF
Метилтетрагидрофолат
NH3
Аммиак
OAA
Щавелевоацетоуксусна кислота
PEP
Фосфоенолпировиноградна кислота
Phe
Фенилаланин
PPA
Префенова кислота
Pro
Пролин
PRPP
Фосфорибозилпирофосфат
Pyr
Пировиноградна кислота
R5P
Рибозо-5-фосфат
Ribu5P
Рибулозо-5-фосфат
SDAP N-сукцинил-L-2,6-диаминогептандиоат
45
50
SKA
Шикимова кислота
Sed7P
D-седогептулозо-7-фосфат
Ser
Серин
Suc
Янтарна кислота
SucCoA
Сукцинил-кофермент A
THDP
Тетрагидродипиколинова кислота
THF
Тетрагидрофолиева кислота
Thr
Треонин
Trp
Триптофан
Tyr
Тирозин
Val
Валин
X5P
Ксилулозо-5-фосфат
Таблица 2
Список использованных формул реакций. Обратимые реакции обозначены буквой r
Страница: 18
RU 2 337 140 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
[1]
Glc+PEP-->G6P+Pyr
[2]
G6P+2НАДФ-->Ribu5P+2НАДФН+CO2
[3] r
Ribu5P-->R5P
[4] r
Ribu5P-->X5P
[5] r
X5P+R5P-->Sed7P+GAP
[6] r
Sed7P+GAP-->E4P+F6P
[7] r
X5P+E4P-->F6P+GAP
[8] r
G6P-->F6P
[9] r
F6P+АТФ-->FBP+АДФ
[10] r
FBP-->2GAP
[11] r
GAP+НАД+АДФ-->3PG+НАДН+АТФ
[12] r
3PG-->PEP
[13]
PEP+АДФ-->Pyr+АТФ
[14]
Pyr+НАД+КоА-->AcCoA+НАДН+CO2
[15]
PEP+CO2-->OAA
[16]
AcCoA+АДФ-->AcOH+АТФ+КоА
[17]
AcCoA+OAA-->Cit+КоА
[18] r
Cit-->Isocit
[19] r
Isocit+НАДФ-->aKG+НАДФН+CO2
[20]
aKG+НАДФН+NH3-->Glu+НАДФ
[21]
aKG+НАД+КоА-->SucCoA+НАДН+CO2
[22] r
SucCoA+АДФ-->Suc+АТФ+КоА
[23] r
Suc+ФАД-->Fum+ФАДН
[24] r
Fum-->Mal
[25] r
Mal+НАД-->OAA+НАДН
[26]
OAA+Glu-->Asp+aKG
[27]
Asp+АТФ+НАДФН-->ASA+АДФ+НАДФ
[28]
ASA+Pyr-->DDP
[29]
DDP+НАДФН-->THDP+НАДФ
[30]
THDP+SucCoA+Glu-->SDAP+aKG+КоА
[31]
SDAP-->mDAP+Suc
[32]
mDAP-->Lys+CO2
[33] r
Glu+ATP+NH3-->Gln+АДФ
[34]
Glu+2НАДФН+АТФ-->Pro+2НАДФ+АДФ
[35]
Glu+5АТФ+НАДФН+Gln+Asp+AcCoA+CO2-->Arg+5АДФ+НАДФ+aKG+Fum
[36]
ASA+НАДФН-->Hse+НАДФ
[37]
Hse+SucCoA+Cys+mTHF-->Met+Suc+КоА+THF+Pyr+NH3
[38]
Hse+АТФ-->Thr+АДФ
[39]
Thr+Glu+НАДФН+Pyr-->Ile+aKG+НАДФ+NH3+CO2
[40] r
3PG-->Ser
[41] r
Ser+THF-->Gly+mTHF
[42] r
PEP+E4P+NADPH-->SKA+НАДФ
[43]
CHR-->PPA
[44]
PPA+НАД+Glu-->Tyr+НАДН+CO2+Akg
[45]
PPA+Glu-->Phe+CO2+aKG
[46]
CHR+R5P+2АТФ+Gln-->Ind+Glu+Pyr+CO2+GAP+2АДФ
[47]
2Pyr-->ALC
[48]
aIVA+Glu-->Val+aKG
[49]
Val+Pyr-->ALA+aIVA
[50]
aIVA+AcCoA+НАД+Glu-->Leu+НАДН+CO2+aKG+КоА
[51]
PRPP+АТФ+Gln+Glu+2НАД-->His+ADP+Glu+aKG+2НАДН
[52]
Ser+AcCoA+H2S-->Cys+AcOH
[53]
SKA+PEP+АТФ-->CHR+ADP
[54]
Ind+Ser-->Trp
[55]
ALC+НАДФН-->aIVA+NADP+CO2
[56] r
НАДН-->NADPH
[57]
2НАДН+O2+2АДФ-->2ATP+2NAD
[58]
2ФАДН+O2+АДФ-->ATP+2FAD
[59] r
Asp+2АТФ+NH3-->Asn+2ADP
[60]
Isocit-->Glyox+Succ
[61]
AcCoA+Glyox-->Mal+CoA
[62]
Mal+НАД-->Pyr+CO2+NADH
Страница: 19
RU 2 337 140 C2
5
[63] r
R5P+2АТФ-->PRPP+2АДФ
[64]
mTHF+НАДФ-->НАДФН+THF+Form
[65]
НАД+Gly+THF-->mTHF+НАДН+CO2+NH3
[66]
АТФ-->АДФ
[67]
Lys-->Lysext
[68]
Синтез биомассы (описан ниже)
РНК (21,33%)
3,47 PRPP+5,02 Gln+-5,02 Glu+3,08 Gly+6,17 Asp+32,41 АТФ+-32,41 АДФ+6,17 mTHF+-6,17 THF+3,09 НАД+-3,09 НАДН+6,17 НАДФ+-6,17
НАДФН+1,16 CO2+-3,47 Fum+-3,86 NH3
ДНК (3,23%)
10
3,37 PRPP+4,88 Gln+-4,88 Glu+3 Gly+6 Asp+31,5 АТФ+-31,5 АДФ+7,12 mTHF+-7,12 THF+3 НАД+-3 НАДН+3,75 НАДФ+-3,75 НАДФН+1,12 CO2+3,37 Fum+-3,75 NH3
Фосфолипид (9,47%)
20,8 AcCoA+-20,8 КоА+1,95 GAP+0,65 Ser+44,2 АТФ+-44,2 АДФ+38,35 НАДН+-38,35 НАД+-0,65 CO2
Пептидогликан (2,60%)
1,94 F6P+1,94 AcCoA+-1,94 КоА+1,94 Gln+-1,94 Glu+2,91 Ala+0,97 PEP+0,97 Lys+6,97 АТФ+-6,97 АДФ+0,97 НАДФН+-0,97 НАДФ+-0,97 CO2
Липополисахарид (3,54%)
15
0,91 R5P+0,91 F6P+0,91 PEP+15,47 AcCoA+-0,91 AcOH+-0,91 Glu+0,91 Gln+32,76 АТФ+12,74 НАДН
Белок (57,23%)
0,77 Gly+0,96 Ala+0,67 Val+0,85 Leu+0,44 Ile+0,44 Ser+0,48 Thr+0,30 Phe+0,26 Tyr+0,01 Trp+0,15 Cys+0,22 Met+0,54 Lys+0,46 Arg+0,16 His+
0,46 Asp+0,52 Glu+0,46 Asn+0,52 Gln+0,34 Pro
Гликоген (2,60%)
F6P+АТФ
20
25
(2) Селекци свободных потоков и получение их случайных комбинаций
Специфические группы потоков определили по способу Reder (Reder C.J., Theor. Biol.,
135:175-201, 1988). Из каждой группы отобрали поток, замыкающий точку ветвлени . В
таблице 3 представлены семь отобранных свободных потоков. Путем спецификации этих
семи потоков может быть получен уникальный раствор дл баланса потоков.
Таблица 3
Список свободных потоков дл получени случайного распределени потоков
30
35
40
45
50
Номер реакции
Наименование фермента или пути реакции
2
Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа
15
PEP-карбоксилаза
16
Секреци уксусной кислоты
60
Изоцитратлиаза (глиоксилатный цикл)
62
Малеиновый фермент
64
Секреци муравьиной кислоты
66
АТФаза
Из почти 300000 комбинаций значений дл 7 случайных свободных потоков исключили
те, которые нарушали любое ограничение, касающеес обратимой реакционной
способности, и те, которые показывали значени как дл лизина, так и дл биомассы, не
превышающие в совокупности пороговые уровни на 20% каждого максимального значени .
В результате получили совокупность данных распределений 5000 метаболических потоков
в биологически значимой специфической области. Результаты представили с помощью
значений, основанных на 10 мМ поглощени глюкозы, и получили матрицу, содержащую
5000 строк, соответствующих распределению случайных потоков, и 68 столбцов, каждый из
которых соответствует реакционному потоку.
(3) Коррел ционный анализ с помощью мультивариантного анализа и определение
метаболических потоков, вли ющих на продуцирование вещества
Провели мультивариантную линейную регрессию конденсированной матрицы,
включающей Z-меток только столбцов, соответствующих 7 свободным потокам. Дл мультивариантной линейной регрессии использовали ступенчатую регрессионную функцию
статистической прикладной программы MatLab. С помощью этого метода биомасса или
продуцирование лизина может быть выведена из линейной функции 7 свободных потоков.
Идентификаци этих 7 свободных потоков показывает уникальное определение состо ни системы. Поэтому, если все 7 термов использовали в качестве параметров, коэффициент
коррел ции равен 1, что указывает на полную аппроксимацию. Однако, как правило, можно
Страница: 20
RU 2 337 140 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
получить относительно благопри тную аппроксимацию с меньшим числом термов, чем в
уравнении. Дл проверки различных комбинаций термов уравнение, показывающее
наилучшую аппроксимацию дл каждого числа содержащихс термов, отбирали с помощью
ступенчатой функции программы MatLab. Дл выхода биомассы аппроксимацию R 2=0,980
получили только с 4 термами - изоцитратлиазой (ICL), малеиновым ферментом (MEZ), PEPкарбоксилазой (PEPC) и АТФазой. Когда число термов в дальнейшем снижали,
значение R 2 заметно уменьшалось, и люба приемлема аппроксимаци не могла быть
получена. Когда реакционные потоки нормализовали по значению на 10 мМ глюкозы и
использовали как исходное, точное уравнение представили в следующем виде:
Уравнение 1) Выход биомассы=1,552-0,194 (ICL)+0,184 (MEZ)-0,194 (PEPC)-0,011
(АТФаза)
Выход лизина мог бы быть аппроксимированным согласно модели, содержащий 4
параметра, и в результате получили R 2=0,997. Далее, даже когда терм дл АТФазы
исключили, R 2 снизилс лишь до 0,856, и аппроксимаци была еще положительной.
Поэтому в модели лизина использовали следующие 3 параметра.
Уравнение 2) Выход лизина=-1,694+1,176 (ICL) - 1,095 (MEZ)+1,162 (PEPC)
Наконец, общий выход углерода (атомы C) определили по общему числу атомов
углерода, направленных в биомассу, и лизин мог бы быть аппроксимирован при R 2=0,956
при использовании только терма дл АТФазы со следующим уравнением.
Уравнение 3) C-атомы=34,3-0,314 (АТФаза)
Эти результаты показали, что выход биомассы положительно коррелирует с потоком
малеинового фермента и что продуцирование лизина положительно коррелирует с
потоками PEP-карбоксилазы и изоцитратлиазы (глиоксалатный цикл). Пригодность этого
регрессионного анализа может быть показана на фиг. 1 и 2. Когда потоки изоцитратлиазы
и малеинового фермента рассматривали отдельно, коррел ции с продуцированием лизина
не наблюдали, как показано на фиг. 1 (а) и (b). Однако если эти потоки рассматривали
как часть уравнени регрессии 2), коррел цию можно было наблюдать, что показано на
фиг. 2, и эффект становилс очевиден. Таким образом, с помощью данного способа может
быть обнаружена невидима св зь между метаболическими потоками. Выход целевого
продукта может быть повышен путем усилени регулирующей поток активности,
про вл ющей положительную коррел цию, и ослаблением регулирующей поток
активности, про вл ющей отрицательную коррел цию. То есть на основании этих
результатов может быть получено руководство дл улучшени бактериальных штаммов и
усилени активности PEP-карбоксилазы или изоцитратлиазы или аттенуации активности
малеинового фермента, про вл ющего отрицательную коррел цию с эффективностью
продуцировани лизина. В действительности, пример создани бактериального штамма,
про вл ющего улучшенную способность продуцировани лизина путем усилени активности PEP-карбоксилазы при продуцировании лизина с использованием Escherichia
coli, был представлен в Международной публикации № WO01/53459, и, таким образом,
была поддержана полезность насто щего изобретени .
Пример 2
Определение метаболического потока в отношении L-треонина
С помощью того же способа, как в примере 1, уравнение, показывающее наибольшую
аппроксимацию дл каждого числа содержащихс в нем термов, отобрали в отношении Lтреонина. Что касаетс выхода биомассы, аппроксимацию R 2=0,986 получили только дл 4 термов - изоцитратлиазы (ICL), малеинового фермента (MEZ), PEP-карбоксилазы (PEPC)
и АТФазы.
Уравнение 4) Выход биомассы=1,260-0,101 (ICL)+0,093 (MEZ)-0,101 (PEPC)-0,009
(АТФаза)
Выход треонина мог быть аппроксимирован с моделью, содержащей те же 3 параметра,
и в результате получили R 2=0,937.
Уравнение 5) Выход треонина=-1,432+1,090 (ICL)-1,080 (MEZ)+1,087 (PEPC)
Страница: 21
RU 2 337 140 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Эти результаты показали, что выход биомассы положительно коррелировал с потоком
малеинового фермента, а продуцирование треонина положительно коррелировало с
потоками PEP-карбоксилазы и изоцитратлиазы (глиоксилатный цикл). Поэтому в отношении
продуцировани треонина также может быть получен руковод щий принцип улучшени бактериальных штаммов, и усиление активности PEP-карбоксилазы или изоцитратлиазы
или ослабление активности малеинового фермента, про вившего отрицательную
коррел цию, вл етс эффективным дл продуцировани лизина.
Пример 3
Конструирование продуцирующей L-лизин бактерии, дефектной по малеиновому
ферменту
В качестве продуцирующего L-лизин штамма Escherichia coli использовали штамм
WC196, который резистентен к AEC (S-(2-аминоэтил)цистеину) (Международна публикаци № WO 96/17930).
К малеиновому ферменту из Escherichia coli относитс фермент, использующий НАД в
качестве кофермента (EC 1.1.1.38) и фермент, использующий НАДФ в качестве
кофермента (EC 1.1.1.40). Эти ферменты кодируютс генами sfcA и b2463 соответственно.
Гены sfcA и b2463 делетировали путем комбинации способа «red-запускаемой
интеграции», который первоначально разработали Datsenko и Wanner (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645), и способа эксцизионной системы, полученной из фага
л мбда (J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18): 5200-3). Взаимодействие между интегразой и
эксцизионазой в фаге л мбда удал ет нуклеопротеиновый комплекс (Cho EH, Gumport RI,
Gardner JF.). В соответствии со способом red-запускаемой интеграции штамм, несущий
разрушенный ген, может быть получен в один этап с помощью ПЦР-продукта, полученного
путем использовани синтетических олигонуклеотидных праймеров, сконструированных
так, что они содержат часть адресного гена на своем 5'-конце и часть гена
резистентности к антибиотику на своем 3'-конце. Кроме того, интегрированный ген
резистентности к антибиотику может быть удален путем дальнейшего комбинировани эксцизионной системы, полученной из фага л мбда, со способом red-запускаемой
интеграции.
(1) Разрушение гена sfcA
В качестве ПЦР-матрицы использовали плазмиду pMW118-attL-Cm-attR (ее получение
описано ниже). pMW118- attL-Cm-attR вл етс плазмидой, полученной путем инсерции
генов attL и attR, которые вл ютс сайтами прикреплени фага л мбда, и гена cat,
который вл етс геном резистентности к антибиотику в pMW118 (TaKaRa Bio). Гены ввели
в пор дке attL-cat-attR. Последовательность attL представлена в SEQ ID NO:11,
последовательность attR представлена в SEQ ID NO:12.
ПЦР проводили с использованием праймеров, представленных в SEQ ID NOS:1 и 2 и
имеющих последовательности, соответствующие на их 3'-концах attL и attR, и
последовательности, соответствующие част м гена sfcA на их 5'-конце соответственно.
Амплифицированный ПЦР-продукт очищали на агарозном геле и вводили в штамм
WC196 Escherichia coli, содержащий плазмиду pKD46, характеризующуюс температурочувствительной репликацией, посредством электропорации. pKD46 (Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645) содержит 2154 п.н. фрагмент ДНК фага л мбда
(GenBank/EMBL инвентарный № J02459, 31088-33241), несущий гены (гены ?, ? и exo),
кодирующие рекомбиназу Red системы гомологичной рекомбинации ? Red под контролем
индуцируемого арабинозой промотора ParaB. pKD46 необходима дл интеграции ПЦРпродукта в хромосому штамма WC196.
Компетентные клетки дл электропорации получили, как описано ниже. Штамм
WC196 Escherichia coli, культивированный в течение ночи при 30°C в среде LB,
содержащей 100 мг/л ампициллина, разбавл ли в 100 раз 5 мл среды SOB (Sambrook, J. с
сотр., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor
Laboratory Press (1989)), содержащей ампициллин (50 мг/л) и L-арабинозу (1 мМ).
Разбавленный продукт культивировали при 30°C в услови х аэрации до тех пор, пока
Страница: 22
RU 2 337 140 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
показатель OD600 не равн лс примерно 0,6, затем концентрировали в 100 раз. Дл приготовлени к электропорации клетки промывали 3 раза 10% глицерином.
Электропорацию проводили с использованием 70 мкл компетентных клеток и примерно 100
нг ПЦР-продукта. Перед электропорацией к клеткам добавл ли 1 мл среды SOC (Sambrook
J. С сотр., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring
Harbor Laboratory Press (1989)). Клетки культивировали при 37°C 2,5 ч, затем помещали на
чашки, залитые L-агаром, содержащим 25 мг/л Cm (хлорамфеникол) при 37°C дл отбора
Cm-резистентного рекомбинанта. Затем дл элиминации плазмиды pKD46 клетки
субкультивировали дважды при 42°C на Cm-содержащей среде из L-агара. Полученные
колонии тестировали на резистентность к ампициллину. Таким образом, получили
ампициллин-чувствительный штамм, не содержащий pKD46.
Делецию гена sfcA в мутанте, идентифицированном с помощью гена резистентности к
хлорамфениколу, подтвердили с помощью ПЦР. Полученный в результате штамм,
дефектный по sfcA, обозначили как WC196?sfcA::att-cat.
Дл элим??нации гена att-cat, который был интегрирован в ген sfcA, использовали
хелперную плазмиду pMW-intxis-ts (ее получение описано ниже). pMW-intxis-ts содержит
ген, кодирующий интегразу (Int) (SEQ ID NO:13), и ген, кодирующий эксцизионазу (Xis)
(SEQ ID NO:15) фага л мбда, и характеризуетс температурочувствительной репликацией.
В результате введени pMW-intxis-ts, рекомбинаци происходит благодар узнаванию attL
(SEQ ID NO:11) и attR (SEQ ID NO:12) на хромосоме, и ген резистентности к антибиотику,
расположенный между attL и attR, вырезаетс , в результате структура, содержаща только
последовательности attL или attR, остаетс на хромосоме.
Компетентные клетки штамма WC196?sfcA::att-cat получили в соответствии со
стандартным способом путем трансформации их хелперной плазмидой pMW-intxis-ts с
последующим культивированием на чашке с L-агаром, содержащим 50 мг/л ампициллина,
при 30°C дл отбора ампициллин-резистентного штамма.
Дл удалени плазмиды pMW-intxis-ts клетки субкультивировали дважды при 42°C на
среде, содержащей L-агар. Полученные колонии тестировали на резистентность к
ампициллину и резистентность к хлорамфениколу. Получили ампициллин- и
хлорамфеникол-чувствительный штамм без att-cat и pMW-intxis-ts. Этот штамм обозначили
как WC196?sfcA.
(2) Разрушение гена b2463
Делецию гена b2463 в штаммах WC196 и WC196?sfcA проводили по способу (1), за
исключением того, что праймеры SEQ ID NOS:3 и 4 использовали как праймеры дл разрушени b2463. Так получили штаммы WC196?b2463 и WC196?sfcA?b2463.
Полученный штамм WC196?sfcA?b2463 обозначили как WC196?mez.
(3) Получение ПЦР-матрицы и хелперной плазмиды
ПЦР-матрицу pMW118-attL-Cm-attR и хелперную плазмиду pMW-intxis-ts получили
следующим образом:
(3-1) pMW118-attL-Cm-attR
Дл конструировани плазмиды pMW118-attL-Cm-attR в качестве исходной использовали
плазмиду pMW118-attL-Tc-attR. Лигировали четыре фрагмента ДНК:
BglII-EcoRI - фрагмент ДНК (120 п.н.) (SEQ ID NO:11), несущий attL, который получили с
помощью ПЦР-амплификации соответствующей последовательности E. coli W3350
(содержащей профаг ?) хромосомы с использованием олигонуклеотидов P1 и P2 (SEQ ID
NOS:17 и 18) в качестве праймеров (эти праймеры содержали вспомогательные сайты
узнавани эндонуклеаз BglII и EcoRI);
2) PstI-HindIII - фрагмент ДНК (182 п.н.), несущий attR (SEQ ID NO:12), который
получили с помощью ПЦР-амплификации соответствующей последовательности E. coli
W3350 (содержащей профаг ?) хромосомы с использованием олигонуклеотидов P3 и P4
(SEQ ID NOS:19 и 20) в качестве праймеров (эти праймеры содержали вспомогательные
сайты узнавани эндонуклеаз PstI и HindIII);
Страница: 23
RU 2 337 140 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
3) большой (3916 п.н.) BglII-HindIII фрагмент pMW118-ter_rrnB. pMW118-ter_rrnB
получили путем лигировани трех фрагментов ДНК:
большого (2359 п.н.) фрагмента, несущего фрагмент AatII-EcoRIpol pMW118, плазмиду
pMW118 переварили рестрикционной эндонуклеазой EcoRI, обработанной фрагментом
Кленова ДНК-полимеразы I и затем переварили рестрикционной эндонуклеазой AatII;
маленького (1194 п.н.) фрагмента AatII-BglII pUC19, несущего ген bla резистентности к
ампициллину (Ap R), полученного путем ПЦР-амплификации соответствующей
последовательности плазмиды pUC19 с использованием олигонуклеотидов P5 и P6 (SEQ
ID NOS:21 и 22) в качестве праймеров (эти праймеры содержали вспомогательные сайты
узнавани эндонуклеаз AatII и BglII);
маленького (363 п.н.) фрагмента BglII-PstIpol терминатора транскрипции ter_rrnB,
полученного путем ПЦР-амплификации соответствующей области хромосомы E. coli
MG1655 с использованием олигонуклеотидов P7 и P8 (SEQ ID NOS:23 и 24) в качестве
праймеров (эти праймеры содержали вспомогательные сайты узнавани эндонуклеаз BglII и PstI);
4) маленький (1388 п.н.) фрагмент EcoRI-PstI (SEQ ID NO:29) pML-Tc-ter_thrL,
содержащий ген резистентности к тетрациклину и терминатор транскрипции ter_thrL, pMLTc-ter_thrL, получили следующим путем:
pML-MSC (2001 #5) переварили рестрикционными эндонуклеазами XbaI и BamHI,
затем большой (3342 п.н.) фрагмент лигировали с фрагментом (68 п.н.) XbaI-BamHI,
несущим терминатор ter_thrL, который получили путем ПЦР-амплификации
соответствующей области хромосомы E. coli MG1655 с использованием олигонуклеотидов
P9 и P10 (SEQ ID NOS:25 и 26) в качестве праймеров (эти праймеры содержали
вспомогательные сайты узнавани эндонуклеаз XbaI и BamHI), продукт этой реакции
представл л собой плазмиду pML-ter_thrL;
затем pML-ter_thrL переварили рестрикционными эндонуклеазами KpnI и XbaI, затем
обработали фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I и затем лигировали с небольшим
(1317 п.н.) EcoRI-Van91I фрагментом pBR322, содержащим ген резистентности к
тетрациклину (pBR322 переварили рестрикционными эндонуклеазами EcoRI и Van91I,
затем обработали фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I), продукт этой реакции
представл л собой плазмиду pML-Tc-ter_thrL.
Таким образом, была получена pMW118-attL-Tc-attR.
pMW118-attL-Cm-attR сконструировали путем лигировани большого (4413
п.н.) BamHI-XbaI фрагмента pMW118-attL-Tc-attR и искусственного фрагмента
ДНК BglII-XbaI (1162 п.н.), содержащего промотор PA2 (ранний промотор фага T7), ген cat
резистентности к хлорамфениколу (Cm R), терминатор транскрипции ter_thrL и attR.
Искусственный фрагмент ДНК (SEQ ID NO:30) получили следующим путем:
1) pML-MSC (2001 #5) переварили рестрикционными эндонуклеазами KpnI и XbaI и
лигировали с маленьким (120 п.н.) фрагментом KpnI-XbaI, который содержал
промотор PA2 (ранний промотор фага T7), полученный посредством ПЦР-амплификации
соответствующей области ДНК фага T7 с олигонуклеотидами P11 и P12 (SEQ ID NOS:27 и
28) в качестве праймеров (эти праймеры содержали вспомогательные сайты узнавани эндонуклеаз KpnI и XbaI), продукт этой реакции представл л собой плазмиду pML-PA2-MCS;
2) далее сайт XbaI делетировали из pML-PA2-MCS, продукт этой реакции представл л
собой плазмиду pML-PA2-MCS(XbaI -);
3) затем маленький (928 п.н.) фрагмент BglII-HindIII плазмиды pML-PA2-MCS(XbaI -),
содержащий промотор PA2 (ранний промотор фага T7) и ген cat резистентности к
хлорамфениколу (Cm R) лигировали с маленьким (234 п.н.) фрагментом HindIII-HindIII
плазмиды pMW118-attL-Tc-attR, содержащим терминатор транскрипции ter_thrL и attR;
4) необходимый искусственный фрагмент ДНК (1156 п.н.) получили с помощью ПЦРамплификации с лигированием с использованием реакционной смеси и олигонуклеотидов
P9 и P4 (SEQ ID NOS:25 и 20) в качестве праймеров (эти праймеры содержали
вспомогательные сайты узнавани эндонуклеаз HindIII и XbaI).
Страница: 24
RU 2 337 140 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
(3-2) pMW-intxis-ts
Первоначально два фрагмента ДНК амплифицировали с использованием ДНК фага ?
("Fermentas") в качестве матрицы. Первый фрагмент содержал область 37168-38046 п.н.
(SEQ ID NO:39) и также содержал ген, кодирующий репрессор cI, промоторы Prm и Pr и
лидерную последовательность гена cro. Этот фрагмент получили с использованием
олигонуклеотидов P1' и P2' (SEQ ID NOS:31 и 32) в качестве праймеров. Второй фрагмент
содержал гены xis-int фага ? и содержал область 27801-29100 п.н. (SEQ ID NO:40). Дл этой амплификации в качестве праймеров использовали олигонуклеотиды P3' и P4' (SEQ ID
NOS:33 и 34). Все праймеры содержали соответствующие сайты узнавани эндонуклеаз.
Полученный ПЦР-амплифицированный фрагмент, содержащий репрессор cI,
переварили рестрикционной эндонуклеазой ClaI, обработали фрагментом Кленова ДНКполимеразы I и затем переварили рестрикционной эндонуклеазой EcoRI. Второй ПЦРамплифицированный фрагмент переварили рестрикционными эндонуклеазами EcoRI
и PstI. Далее плазмиду pMWPlaclacI-ts переварили эндонуклеазой BglII, обработали
фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I и затем переварили рестрикционной
эндонуклеазой PstI. Векторный фрагмент pMWPlaclacI-ts элюировали из агарозного гел и
лигировали с переваренными ПЦР-амплифицированными фрагментами.
Плазмида pMWPlaclacI-ts вл етс производной pMWPlaclacI, котора состоит из
следующих частей: 1) BglII-HindIII - искусственный фрагмент ДНК, включающий ген lacI
под контролем промотора PlacUV5 и RBS гена 10 бактериофага T7; 2) AatII-BglII - фрагмент
ДНК, несущий ген резистентности к ампициллину (Ap R), который получили путем ПЦРамплификации соответствующей последовательности плазмиды pUC19 с использованием
олигонуклеотидов P5' и P6' (SEQ ID NOS:35 и 36) в качестве праймеров (эти праймеры
содержали вспомогательные сайты узнавани эндонуклеаз AatII и BglII; 3) AatII-HindIII фрагмент, содержащий фрагмент AatII-PvuI ранее сконструированной рекомбинантной
плазмиды pMW118-ter_rrnB. Последнюю плазмиду сконструировали следующим образом:
фрагмент ДНК PstI-HindIII, несущий терминатор ter_rrnB, получили посредством ПЦРамплификации соответствующей области хромосомы E. coli MG1655 с использованием
олигонуклеотидов P7' и P8' (SEQ ID NOS:37 и 38), содержащих соответствующие сайты
узнавани эндонуклеаз в качестве праймеров. Перед лигированием плазмиду pMW118 и
ДНК-фрагмент ter_rrnB (комплементарный SEQ ID NO:41) разрезали эндонуклеазами PvuI
и PstI соответственно, обработали фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I дл получени липких концов и затем разрезали эндонуклеазой AatII или HindIII. Дл конструировани варианта pMWPlaclacI-ts фрагмент AatII-EcoRV плазмиды pMWPlaclacI заместили
фрагментом AatII-EcoRV плазмиды pMAN997, содержащим локусы par, ori и ген repA ts
репликона pSC101.
Пример 4
Конструирование продуцирующей L-треонин бактерии, дефектной по малеиновому
ферменту
Из штамма VKPM B-5318 получили sfcA- и b2463-дефектные штаммы. Штамм VKPM B5318 депонировали в Российской национальной коллекции промышленных
микроорганизмов (VKPM), (ГНИИ Генетика) от 19 но бр 1987 г. и присвоили инвентарный
номер VKPM B-5318.
Штамм, дефектный по одному из генов (sfcA, b2463) малеинового фермента (mez),
получили таким же путем, как в примере 3, с помощью способа red-запускаемой
интеграции. То есть выполнили таким же образом с помощью способа red-запускаемой
интеграции, как в примере 3, за исключением того, что дл получени sfcAили b2463-дефектного штамма как мутанта, идентифицируемого по гену резистентности к
хлорамфениколу, вместо штамма WC196 использовали штамм B-5318. Штамм B-5318, в
котором разрушили sfcA, обозначили как B-5318?sfcA. Штамм B-5318, в котором разрушили
b2463, обозначили как B-5318?b2463. Штамм B-5318 с разрушенными
генами sfcA и b2463, B-5318?sfcA?b2463, получили таким же образом, с помощью способа
«red-запускаемой интеграции» и эксцизионной системы, как описано в примере 3. Штамм BСтраница: 25
RU 2 337 140 C2
5
10
15
5318?sfcA?b2463 обозначили как B-5318mez.
Пример 5
Оценка штамма, дефектного по малеиновому ферменту
<5-1> Оценка продуцирующей L-треонин бактерии, вл ющейс b2463-дефектным
штаммом
Каждый из штаммов B-5318?b2463 и B-5318 культивировали на среде с LB-агаром (10
г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl и 15 г/л агара), содержащей 20 мг/л
сульфата стрептомицина и 25 мг/л сульфата канамицина, при 37°C в течение 24 часов.
Бактериальные клетки, вз тые с п той части чашки, вносили в 50 мкл жидкой среды LB
(10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта и 5 г/л NaCl), содержащей 20 мг/л
сульфата стрептомицина и 25 мг/л сульфата канамицина, дл проведени предварительного культивировани при 40°C и 144 об/мин в течение 3,5 часов.
После завершени предварительного культивировани прекультуральный бульон
вносили в 300 мл основной культуральной среды, содержащейс в бродильном
ферментере объемом 1 л, в количестве, составл ющем 10% объема основной
культуральной среды, дл проведени основного культивировани при 40°C и pH 7,0.
Состав основной культуральной среды приведен ниже.
Таблица 4
[Состав основной культуральной среды]
20
Глюкоза
1,8 г/л
FeSO4?7H2O
18 мг/л
MnSO4?4H2O
18 мг/л
25
30
35
100 г/л
Дрожжевой экстракт
KH2PO4
1,0 г/л
MgSO4?7H2O
0,36 г/л
(NH4)2SO4
4,5 г/л
NaCl
0,6 г/л
Стрептомицина сульфат
20 мг/л
Канамицина сульфат
25 мг/л
pH в процессе культивировани поддерживали на уровне 7,0 путем добавлени газообразного аммиака.
После расхода добавленного сахара количество L-треонина измер ли с помощью
жидкостной хроматографии. Результаты представлены в таблице 5.
При использовании дефектного по b2463 штамма B-5318?b2463 выход треонина
повысилс по сравнению с контрольным штаммом B-5318.
Таблица 5
Штамм
40
45
Ферментативный выход L-треонина (%)
B-5318
31,4
B-5318?b2463
32,1
<5-2> Оценка продуцирующей L-треонин бактерии, вл ющейс sfcA-дефектным
штаммом
Штаммы B-5318?sfcA и B5318 культивировали таким же способом, как описано в <5-1>.
После того как добавленный сахар был использован, количество L-треонина измер ли с
помощью жидкостной хроматографии. Результаты представлены в таблице 6.
При использовании дефектного по b2463 штамма B-5318?sfcA выход треонина
повысилс по сравнению с контрольным штаммом B-5318.
Таблица 6
50
Штамм
Ферментативный выход L-треонина (%)
B-5318
31,4
B-5318?sfcA
32,2
<5-3> Оценка продуцирующей L-лизин бактерии, вл ющейс sfcA- и b2463-дефектным
штаммом
Дл получени штаммов WC196/pCABD2, WC196?sfcA/pCABD2 и WC196?b2463/pCABD2
Страница: 26
RU 2 337 140 C2
5
10
15
20
25
штаммы WC196, WC196?sfcA и WC196?b2463 трансформировали в соответствии со
стандартным методом с использованием плазмиды pCABD2 дл продуцировани лизина,
котора содержала гены dapA, dapB и dapC (Международна публикаци № WO 01/53459).
Штаммы WC196/pCABD2, WC196?sfcA/pCABD2 и WC196?b2463/pCABD2
культивировали при 37°C в L-среде (как описано ниже), содержащей 20 мг/л
стрептомицина до тех пор, пока OD600 на среде не равн лс примерно 0,6. Затем в
культуру добавл ли эквивалентное количество 40% раствора глицерина. После
перемешивани соответствующие аликвоты смеси разливали и хранили при -80°C.
Хран щиес аликвоты назвали глицериновыми штоками.
Глицериновые штоки штаммов размораживали и по 100 мкл каждого штамма
равномерно разливали на чашку с L-средой, содержащей 20 мг/л стрептомицина, и
культивировали при 37°C в течение 24 часов. С восьмой части полученного высева
отбирали бактериальные клетки и вносили в 20 мл ферментативной среды (как описано
ниже), содержащей 20 мг/л стрептомицина, и культивировали при 37°C в течение примерно
16 часов на качалке с возвратно-поступательным движением. После культивировани количество накопленного в среде лизина и количество оставшейс глюкозы измер ли с
помощью анализатора Biotech AS210 (Sakura Seiki).
Данные по накоплению L-лизина и выхода продукта за вычетом клеток представлены в
таблице 7. Выход продукта за вычетом клеток, который представл ет собой выход,
рассчитанный путем вычитани количества сахара, использованного дл формировани бактериальных клеток, рассчитывали на основе допущени , что 50% потребленного сахара
использовалось дл формировани бактериальных клеток. Результаты показали, что выход
продукта за вычетом клеток штаммов WC196(sfcA/pCABD2 и WC196(b2463/pCABD2
увеличилс по сравнению с контрольным штаммом WC196/pCABD2.
Таблица 7
Штамм
Суха клеточна масса (г/л) Выход продукта за вычетом клеток
(%)
Плазмида
Хоз ин
30
WC196
pCABD2
2,5
100,0
WC196(sfcA
pCABD2
2,3
101,6
WC196(b2463 pCABD2
2,2
104,7
Среду, использованную дл оценки дефектного по sfcA или b2463 штамма,
продуцирующего L-лизин, описали ниже. Использованные реагенты получили от Wako Pure
Chemicals или Nakarai Tesque, если не указано иное. pH всей среды регулировали с
помощью NaOH или HCl.
35
Таблица 8
(L-среда)
Триптон Bacto (DIFCO)
10 г/л
Дрожжевой экстракт (DIFCO)
5 г/л
NaCl
5 г/л
pH 7,0
40
[стерилизаци вод ным паром при 120°C в течение 20 минут]
(Среда L-агар)
L-среда
Агар Bacto (DIFCO)
15 г/л
[стерилизаци вод ным паром при 120°C в течение 20 минут]
45
(Среда дл продуцировани L-лизина дл бактерий Escherichia)
50
Глюкоза
40 г/л
Аммони сульфат
24 г/л
Кали дигидрофосфат
1,0 г/л
Магни сульфат гептагидрат
1,0 г/л
Железа (II) сульфат гептагидрат
0,01 г/л
Марганца сульфат тетрагидрат
0,01 г/л
Дрожжевой экстракт
2,0 г/л
Кальци карбонат (фармакопейный)
30 г/л
Страница: 27
RU 2 337 140 C2
[доводили до pH 7,0 с помощью гидроксида кали и стерилизовали вод ным паром при 115°C в течение 10 минут, глюкозу и MgSO4?7H2O
стерилизовали раздельно]
5
10
15
20
Пример 6
Оценка штамма, дефектного по малеиновому ферменту (mez)
<6-1> Оценка продуцирующей L-треонин бактерии, вл ющейс дефектным по
малеиновому ферменту штаммом
Каждый из штаммов B-5318(mez и B-5318 культивировали на среде из LB-агара (10 г/л
триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl и 15 г/л агара), содержащей 20 мг/л
сульфата стрептомицина и 25 мг/л сульфата канамицина при 37°C в течение 24 часов, и
бактериальные клетки брали с одной из чашек и суспендировали в 5 мл жидкой среды LB
(10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта и 5 г/л NaCl). 0.5 мл суспензии вносили
в 50 мл жидкой среды LB, содержащей 20 мг/л сульфата стрептомицина и 25 мг/л сульфата
канамицина дл проведени предварительного культивировани при 39°C и 144 об/мин в
течение 4 часов.
После завершени предварительного культивировани прекультуральный бульон
вносили в 300 мл основной культуральной среды, содержащейс в бродильном
ферментере объемом 1 л, в количестве, составл вшем 10% объема основной
культуральной среды, дл основного культивировани при 39°C и pH 7.0. Состав основной
культуральной среды приведен ниже.
Таблица 9
[Состав основной культуральной среды]
25
30
35
Глюкоза
27 г/л
Дрожжевой экстракт
1,8 г/л
FeSO4?7H2O
18 мг/л
MnSO4?4H2O
18 мг/л
KH2PO4
1,5 г/л
MgSO4?7H2O
0,36 г/л
(NH4)2SO4
4,5 г/л
NaCl
0,6 г/л
Стрептомицина сульфат
20 мг/л
Канамицина сульфат
25 мг/л
pH в процессе культивировани регулировали до 7,0 путем добавлени газообразного
аммиака.
После того как добавленный сахар был потреблен и исчерпан, добавл ли 600 г/л
водного раствора глюкозы.
Через 24 часа в основной культуре измер ли количество L- треонина с помощью
жидкостной хроматографии. Результаты представлены в таблице 10.
При использовании дефектного по малеиновому ферменту штамма B-5318?mez выход
треонина повысилс по сравнению с контрольным штаммом B-5318.
Таблица 10
40
45
50
Штамм
Ферментативный выход L-треонина (%)
В-5318
35,9
B-5318?mez
38,3
<6-2> Оценка продуцирующей L-лизин бактерии, вл ющейс дефектным по
малеиновому ферменту штаммом
Дл получени штаммов WC196/pCABD2, WC196?mez/pCABD2 штаммы WC196 и
WC196?mez трансформировали по стандартному методу плазмидой pCABD2 дл продуцировани лизина (Международна публикаци № WO 01/53459).
Штаммы WC196/pCABD2 и WC196?mez/pCABD2 культивировали при 37°С в L-среде
(аналогичной среде, использованной в примере 5 <5-3>), содержащей 20 мг/л
стрептомицина, и культивировали при 37°C в течение примерно 48 часов на качалке с
возвратно-поступательным движением. После культивировани количество накопленного в
среде лизина и количество оставшейс глюкозы измер ли с помощью анализатора Biotech
Страница: 28
RU 2 337 140 C2
5
AS210 (Sakura Seiki).
Результаты по накоплению L-лизина и выхода продукта за вычетом клеток
представлены в таблице 11. Выхода продукта за вычетом клеток рассчитывали на основе
допущени , согласно которому 50% потребленного сахара использовалось дл формировани бактериальных клеток. Результаты показали, что выход продукта за
вычетом клеток штамма WC196?mez/pCABD2 увеличен по сравнению с контрольным
штаммом WC196/pCABD2.
Таблица 11
Штамм
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Суха клеточна масса (г/л) Выход продукта за вычетом клеток (%)
Хоз ин
Плазмида
WC196
pCABD2
5,2
100,0
WC196?mez pCABD2
5,8
103,4
Промышленна применимость
В соответствии с насто щим изобретением ферментативный выход L-лизина и/или Lтреонина увеличилс в способе продуцировани L-лизина или L-треонина путем
ферментации с использованием бактерии Escherichia. Кроме того, насто щее изобретение
может быть использовано дл селекции продуцирующих L-лизин или L-треонин бактерий,
относ щихс к роду Escherichia.
Формула изобретени 1. Способ продуцировани L-лизина или L-треонина, включающий культивирование
бактерии в среде дл продуцировани и секреции указанных L-лизина или L-треонина,
сбор и выделение L-лизина или L-треонина из среды, где указанна бактери представл ет собой бактерию Escherichia, котора обладает способностью продуцировать
L-лизин или L-треонин, и где указанна бактери модифицирована так, что нарушена
нормальна функци малеинового фермента в клетке, и где малеиновый фермент
кодируетс геном sfcA и/или геном b2463.
2. Способ по п.1, где ген, кодирующий указанный малеиновый фермент на
бактериальной хромосоме, мутирован и/или мутирована последовательность,
контролирующа экспрессию этого гена, так что нормальна функци малеинового
фермента в клетке нарушена.
3. Способ по п.1, где указанный малеиновый фермент имеет нарушенную функцию в
результате разрушени гена, кодирующего указанный малеиновый фермент на
бактериальной хромосоме.
4. Способ по любому из пп.1-3, где ген, кодирующий указанный малеиновый фермент,
представл ет собой sfcA.
5. Способ по любому из пп.1-3, где ген, кодирующий указанный малеиновый фермент,
представл ет собой b2463.
6. Способ по любому из пп.1-3, где указанный малеиновый фермент выбран из группы,
состо щей из:
(A) белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID
NO:6; и
(B) белка, имеющего аминокислотную последовательность, включающего замещение,
делецию, инсерцию или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков в
аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:6, и имеющего
активность малеинового фермента.
7. Способ по любому из пп.1-3, где указанный малеиновый фермент выбран из группы,
состо щей из:
(C) белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID
NO:8;
(D) белка, имеющего аминокислотную последовательность, включающего замещение,
делецию, инсерцию или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков в
аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:8, и имеющего
Страница: 29
CL
RU 2 337 140 C2
5
10
15
20
активность малеинового фермента.
8. Способ по любому из пп.1-3, где геном, кодирующим указанный малеиновый фермент,
вл етс ДНК, выбранна из группы, состо щей из:
(a) ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:5;
(b) ДНК, котора гибридизируетс с нуклеотидной последовательностью,
представленной в SEQ ID NO:5, или зонда, который может быть получен из нуклеотидной
последовательности, где указанна гибридизаци происходит в жестких услови х и где
указанна ДНК кодирует белок, имеющий активность малеинового фермента.
9. Способ по любому из пп.1-3, где геном, кодирующим малеиновый фермент, вл етс ДНК, выбранна из группы, состо щей из:
(c) ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:7;
(d) ДНК, котора гибридизируетс с нуклеотидной последовательностью,
представленной в SEQ ID NO:7, или зонда, который может быть получен из нуклеотидной
последовательности, где указанна гибридизаци происходит в жестких услови х и
указанна ДНК кодирует белок, имеющий активность малеинового фермента.
10. Способ по любому из пп.1-3, где ген, кодирующий указанный малеиновый фермент,
включает sfcA и b2463.
11. Способ по п.6, где указанный малеиновый фермент представл ет собой белок,
имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:6.
12. Способ по п.7, где указанный малеиновый фермент представл ет собой белок,
имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:8.
25
30
35
40
45
50
Страница: 30
RU 2 337 140 C2
Страница: 31
DR
RU 2 337 140 C2
Страница: 32
RU 2 337 140 C2
Страница: 33
RU 2 337 140 C2
Страница: 34
RU 2 337 140 C2
Страница: 35
RU 2 337 140 C2
Страница: 36
RU 2 337 140 C2
Страница: 37
RU 2 337 140 C2
Страница: 38
RU 2 337 140 C2
Страница: 39
RU 2 337 140 C2
Страница: 40
RU 2 337 140 C2
Страница: 41
RU 2 337 140 C2
Страница: 42
RU 2 337 140 C2
Страница: 43
RU 2 337 140 C2
Страница: 44
RU 2 337 140 C2
Страница: 45
RU 2 337 140 C2
Страница: 46
RU 2 337 140 C2
Страница: 47
RU 2 337 140 C2
Страница: 48
RU 2 337 140 C2
Страница: 49
RU 2 337 140 C2
Страница: 50
RU 2 337 140 C2
Страница: 51
RU 2 337 140 C2
Страница: 52
RU 2 337 140 C2
Страница: 53
RU 2 337 140 C2
Страница: 54
RU 2 337 140 C2
Страница: 55
RU 2 337 140 C2
Страница: 56
RU 2 337 140 C2
Страница: 57
?етил-кофермент A
AcOH
Уксусна кислота
aIVA
?-кето-изовалерианова кислота
Страница: 17
RU 2 337 140 C2
aKG
5
10
15
20
25
30
35
40
2-оксоглутарова кислота
Ala
Аланин
ALC
Ацетооксикислота
Arg
Аргинин
ASA
Аспарагиновой кислоты полуальдегид
Asn
Аспарагин
Asp
Аспарагинова кислота
CHR
Хоризмова кислота
Cit
Лимонна кислота
CO2
Диоксид углерода
CoA
Кофермент A
Cys
Цистеин
DDP
Дигидродипиколинова кислота
E4P
Эритрозо-4-фосфат
F6P
Фруктозо-6-фосфат
FBP
Фруктозобифосфат
Form
Муравьина кислота
Fum
Фумарова кислота
G6P
Глюкозо-6-фосфат
GAP
Глицеральдегидфосфат
Glc
Глюкоза
Gln
Глутамин
Glu
Глутаминова кислота
Gly
Глицин
Glyox
Глиоксилова кислота
His
Гистидин
Hse
Гомосерин
Ile
Изолейцин
Ind
Индолглицеринфосфат
Isocit
Изолимонна кислота
Leu
Лейцин
Lys
Лизин
Lysext
Продукт лизина (внеклеточный)
Mal
Яблочна (малеинова ) кислота
Met
Метионин
mDAP
meso-диаминопимелинова кислота
mTHF
Метилтетрагидрофолат
NH3
Аммиак
OAA
Щавелевоацетоуксусна кислота
PEP
Фосфоенолпировиноградна кислота
Phe
Фенилаланин
PPA
Префенова кислота
Pro
Пролин
PRPP
Фосфорибозилпирофосфат
Pyr
Пировиноградна кислота
R5P
Рибозо-5-фосфат
Ribu5P
Рибулозо-5-фосфат
SDAP N-сукцинил-L-2,6-диаминогептандиоат
45
50
SKA
Шикимова кислота
Sed7P
D-седогептулозо-7-фосфат
Ser
Серин
Suc
Янтарна кислота
SucCoA
Сукцинил-кофермент A
THDP
Тетрагидродипиколинова кислота
THF
Тетрагидрофолиева кислота
Thr
Треонин
Trp
Триптофан
Tyr
Тирозин
Val
Валин
X5P
Ксилулозо-5-фосфат
Таблица 2
Список использованных формул реакций. Обратимые реакции обозначены буквой r
Страница: 18
RU 2 337 140 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
[1]
Glc+PEP-->G6P+Pyr
[2]
G6P+2НАДФ-->Ribu5P+2НАДФН+CO2
[3] r
Ribu5P-->R5P
[4] r
Ribu5P-->X5P
[5] r
X5P+R5P-->Sed7P+GAP
[6] r
Sed7P+GAP-->E4P+F6P
[7] r
X5P+E4P-->F6P+GAP
[8] r
G6P-->F6P
[9] r
F6P+АТФ-->FBP+АДФ
[10] r
FBP-->2GAP
[11] r
GAP+НАД+АДФ-->3PG+НАДН+АТФ
[12] r
3PG-->PEP
[13]
PEP+АДФ-->Pyr+АТФ
[14]
Pyr+НАД+КоА-->AcCoA+НАДН+CO2
[15]
PEP+CO2-->OAA
[16]
AcCoA+АДФ-->AcOH+АТФ+КоА
[17]
AcCoA+OAA-->Cit+КоА
[18] r
Cit-->Isocit
[19] r
Isocit+НАДФ-->aKG+НАДФН+CO2
[20]
aKG+НАДФН+NH3-->Glu+НАДФ
[21]
aKG+НАД+КоА-->SucCoA+НАДН+CO2
[22] r
SucCoA+АДФ-->Suc+АТФ+КоА
[23] r
Suc+ФАД-->Fum+ФАДН
[24] r
Fum-->Mal
[25] r
Mal+НАД-->OAA+НАДН
[26]
OAA+Glu-->Asp+aKG
[27]
Asp+АТФ+НАДФН-->ASA+АДФ+НАДФ
[28]
ASA+Pyr-->DDP
[29]
DDP+НАДФН-->THDP+НАДФ
[30]
THDP+SucCoA+Glu-->SDAP+aKG+КоА
[31]
SDAP-->mDAP+Suc
[32]
mDAP-->Lys+CO2
[33] r
Glu+ATP+NH3-->Gln+АДФ
[34]
Glu+2НАДФН+АТФ-->Pro+2НАДФ+АДФ
[35]
Glu+5АТФ+НАДФН+Gln+Asp+AcCoA+CO2-->Arg+5АДФ+НАДФ+aKG+Fum
[36]
ASA+НАДФН-->Hse+НАДФ
[37]
Hse+SucCoA+Cys+mTHF-->Met+Suc+КоА+THF+Pyr+NH3
[38]
Hse+АТФ-->Thr+АДФ
[39]
Thr+Glu+НАДФН+Pyr-->Ile+aKG+НАДФ+NH3+CO2
[40] r
3PG-->Ser
[41] r
Ser+THF-->Gly+mTHF
[42] r
PEP+E4P+NADPH-->SKA+НАДФ
[43]
CHR-->PPA
[44]
PPA+НАД+Glu-->Tyr+НАДН+CO2+Akg
[45]
PPA+Glu-->Phe+CO2+aKG
[46]
CHR+R5P+2АТФ+Gln-->Ind+Glu+Pyr+CO2+GAP+2АДФ
[47]
2Pyr-->ALC
[48]
aIVA+Glu-->Val+aKG
[49]
Val+Pyr-->ALA+aIVA
[50]
aIVA+AcCoA+НАД+Glu-->Leu+НАДН+CO2+aKG+КоА
[51]
PRPP+АТФ+Gln+Glu+2НАД-->His+ADP+Glu+aKG+2НАДН
[52]
Ser+AcCoA+H2S-->Cys+AcOH
[53]
SKA+PEP+АТФ-->CHR+ADP
[54]
Ind+Ser-->Trp
[55]
ALC+НАДФН-->aIVA+NADP+CO2
[56] r
НАДН-->NADPH
[57]
2НАДН+O2+2АДФ-->2ATP+2NAD
[58]
2ФАДН+O2+АДФ-->ATP+2FAD
[59] r
Asp+2АТФ+NH3-->Asn+2ADP
[60]
Isocit-->Glyox+Succ
[61]
AcCoA+Glyox-->Mal+CoA
[62]
Mal+НАД-->Pyr+CO2+NADH
Страница: 19
RU 2 337 140 C2
5
[63] r
R5P+2АТФ-->PRPP+2АДФ
[64]
mTHF+НАДФ-->НАДФН+THF+Form
[65]
НАД+Gly+THF-->mTHF+НАДН+CO2+NH3
[66]
АТФ-->АДФ
[67]
Lys-->Lysext
[68]
Синтез биомассы (описан ниже)
РНК (21,33%)
3,47 PRPP+5,02 Gln+-5,02 Glu+3,08 Gly+6,17 Asp+32,41 АТФ+-32,41 АДФ+6,17 mTHF+-6,17 THF+3,09 НАД+-3,09 НАДН+6,17 НАДФ+-6,17
НАДФН+1,16 CO2+-3,47 Fum+-3,86 NH3
ДНК (3,23%)
10
3,37 PRPP+4,88 Gln+-4,88 Glu+3 Gly+6 Asp+31,5 АТФ+-31,5 АДФ+7,12 mTHF+-7,12 THF+3 НАД+-3 НАДН+3,75 НАДФ+-3,75 НАДФН+1,12 CO2+3,37 Fum+-3,75 NH3
Фосфолипид (9,47%)
20,8 AcCoA+-20,8 КоА+1,95 GAP+0,65 Ser+44,2 АТФ+-44,2 АДФ+38,35 НАДН+-38,35 НАД+-0,65 CO2
Пептидогликан (2,60%)
1,94 F6P+1,94 AcCoA+-1,94 КоА+1,94 Gln+-1,94 Glu+2,91 Ala+0,97 PEP+0,97 Lys+6,97 АТФ+-6,97 АДФ+0,97 НАДФН+-0,97 НАДФ+-0,97 CO2
Липополисахарид (3,54%)
15
0,91 R5P+0,91 F6P+0,91 PEP+15,47 AcCoA+-0,91 AcOH+-0,91 Glu+0,91 Gln+32,76 АТФ+12,74 НАДН
Белок (57,23%)
0,77 Gly+0,96 Ala+0,67 Val+0,85 Leu+0,44 Ile+0,44 Ser+0,48 Thr+0,30 Phe+0,26 Tyr+0,01 Trp+0,15 Cys+0,22 Met+0,54 Lys+0,46 Arg+0,16 His+
0,46 Asp+0,52 Glu+0,46 Asn+0,52 Gln+0,34 Pro
Гликоген (2,60%)
F6P+АТФ
20
25
(2) Селекци свободных потоков и получение их случайных комбинаций
Специфические группы потоков определили по способу Reder (Reder C.J., Theor. Biol.,
135:175-201, 1988). Из каждой группы отобрали поток, замыкающий точку ветвлени . В
таблице 3 представлены семь отобранных свободных потоков. Путем спецификации этих
семи потоков может быть получен уникальный раствор дл баланса потоков.
Таблица 3
Список свободных потоков дл получени случайного распределени потоков
30
35
40
45
50
Номер реакции
Наименование фермента или пути реакции
2
Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа
15
PEP-карбоксилаза
16
Секреци уксусной кислоты
60
Изоцитратлиаза (глиоксилатный цикл)
62
Малеиновый фермент
64
Секреци муравьиной кислоты
66
АТФаза
Из почти 300000 комбинаций значений дл 7 случайных свободных потоков исключили
те, которые нарушали любое ограничение, касающеес обратимой реакционной
способности, и те, которые показывали значени как дл лизина, так и дл биомассы, не
превышающие в совокупности пороговые уровни на 20% каждого максимального значени .
В результате получили совокупность данных распределений 5000 метаболических потоков
в биологически значимой специфической области. Результаты представили с помощью
значений, основанных на 10 мМ поглощени глюкозы, и получили матрицу, содержащую
5000 строк, соответствующих распределению случайных потоков, и 68 столбцов, каждый из
которых соответствует реакционному потоку.
(3) Коррел ционный анализ с помощью мультивариантного анализа и определение
метаболических потоков, вли ющих на продуцирование вещества
Провели мультивариантную линейную регрессию конденсированной матрицы,
включающей Z-меток только столбцов, соответствующих 7 свободным потокам. Дл мультивариантной линейной регрессии использовали ступенчатую регрессионную функцию
статистической прикладной программы MatLab. С помощью этого метода биомасса или
продуцирование лизина может быть выведена из линейной функции 7 свободных потоков.
Идентификаци этих 7 свободных потоков показывает уникальное определение состо ни системы. Поэтому, если все 7 термов использовали в качестве параметров, коэффициент
коррел ции равен 1, что указывает на полную аппроксимацию. Однако, как правило, можно
Страница: 20
RU 2 337 140 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
получить относительно благопри тную аппроксимацию с меньшим числом термов, чем в
уравнении. Дл проверки различных комбинаций термов уравнение, показывающее
наилучшую аппроксимацию дл каждого числа содержащихс термов, отбирали с помощью
ступенчатой функции программы MatLab. Дл выхода биомассы аппроксимацию R 2=0,980
получили только с 4 термами - изоцитратлиазой (ICL), малеиновым ферментом (MEZ), PEPкарбоксилазой (PEPC) и АТФазой. Когда число термов в дальнейшем снижали,
значение R 2 заметно уменьшалось, и люба приемлема аппроксимаци не могла быть
получена. Когда реакционные потоки нормализовали по значению на 10 мМ глюкозы и
использовали как исходное, точное уравнение представили в следующем виде:
Уравнение 1) Выход биомассы=1,552-0,194 (ICL)+0,184 (MEZ)-0,194 (PEPC)-0,011
(АТФаза)
Выход лизина мог бы быть аппроксимированным согласно модели, содержащий 4
параметра, и в результате получили R 2=0,997. Далее, даже когда терм дл АТФазы
исключили, R 2 снизилс лишь до 0,856, и аппроксимаци была еще положительной.
Поэтому в модели лизина использовали следующие 3 параметра.
Уравнение 2) Выход лизина=-1,694+1,176 (ICL) - 1,095 (MEZ)+1,162 (PEPC)
Наконец, общий выход углерода (атомы C) определили по общему числу атомов
углерода, направленных в биомассу, и лизин мог бы быть аппроксимирован при R 2=0,956
при использовании только терма дл АТФазы со следующим уравнением.
Уравнение 3) C-атомы=34,3-0,314 (АТФаза)
Эти результаты показали, что выход биомассы положительно коррелирует с потоком
малеинового фермента и что продуцирование лизина положительно коррелирует с
потоками PEP-карбоксилазы и изоцитратлиазы (глиоксалатный цикл). Пригодность этого
регрессионного анализа может быть показана на фиг. 1 и 2. Когда потоки изоцитратлиазы
и малеинового фермента рассматривали отдельно, коррел ции с продуцированием лизина
не наблюдали, как показано на фиг. 1 (а) и (b). Однако если эти потоки рассматривали
как часть уравнени регрессии 2), коррел цию можно было наблюдать, что показано на
фиг. 2, и эффект становилс очевиден. Таким образом, с помощью данного способа может
быть обнаружена невидима св зь между метаболическими потоками. Выход целевого
продукта может быть повышен путем усилени регулирующей поток активности,
про вл ющей положительную коррел цию, и ослаблением регулирующей поток
активности, про вл ющей отрицательную коррел цию. То есть на основании этих
результатов может быть получено руководство дл улучшени бактериальных штаммов и
усилени активности PEP-карбоксилазы или изоцитратлиазы или аттенуации активности
малеинового фермента, про вл ющего отрицательную коррел цию с эффективностью
продуцировани лизина. В действительности, пример создани бактериального штамма,
про вл ющего улучшенную способность продуцировани лизина путем усилени активности PEP-карбоксилазы при продуцировании лизина с использованием Escherichia
coli, был представлен в Международной публикации № WO01/53459, и, таким образом,
была поддержана полезность насто щего изобретени .
Пример 2
Определение метаболического потока в отношении L-треонина
С помощью того же способа, как в примере 1, уравнение, показывающее наибольшую
аппроксимацию дл каждого числа содержащихс в нем термов, отобрали в отношении Lтреонина. Что касаетс выхода биомассы, аппроксимацию R 2=0,986 получили только дл 4 термов - изоцитратлиазы (ICL), малеинового фермента (MEZ), PEP-карбоксилазы (PEPC)
и АТФазы.
Уравнение 4) Выход биомассы=1,260-0,101 (ICL)+0,093 (MEZ)-0,101 (PEPC)-0,009
(АТФаза)
Выход треонина мог быть аппроксимирован с моделью, содержащей те же 3 параметра,
и в результате получили R 2=0,937.
Уравнение 5) Выход треонина=-1,432+1,090 (ICL)-1,080 (MEZ)+1,087 (PEPC)
Страница: 21
RU 2 337 140 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Эти результаты показали, что выход биомассы положительно коррелировал с потоком
малеинового фермента, а продуцирование треонина положительно коррелировало с
потоками PEP-карбоксилазы и изоцитратлиазы (глиоксилатный цикл). Поэтому в отношении
продуцировани треонина также может быть получен руковод щий принцип улучшени бактериальных штаммов, и усиление активности PEP-карбоксилазы или изоцитратлиазы
или ослабление активности малеинового фермента, про вившего отрицательную
коррел цию, вл етс эффективным дл продуцировани лизина.
Пример 3
Конструирование продуцирующей L-лизин бактерии, дефектной по малеиновому
ферменту
В качестве продуцирующего L-лизин штамма Escherichia coli использовали штамм
WC196, который резистентен к AEC (S-(2-аминоэтил)цистеину) (Международна публикаци № WO 96/17930).
К малеиновому ферменту из Escherichia coli относитс фермент, использующий НАД в
качестве кофермента (EC 1.1.1.38) и фермент, использующий НАДФ в качестве
кофермента (EC 1.1.1.40). Эти ферменты кодируютс генами sfcA и b2463 соответственно.
Гены sfcA и b2463 делетировали путем комбинации способа «red-запускаемой
интеграции», который первоначально разработали Datsenko и Wanner (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645), и способа эксцизионной системы, полученной из фага
л мбда (J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18): 5200-3). Взаимодействие между интегразой и
эксцизионазой в фаге л мбда удал ет нуклеопротеиновый комплекс (Cho EH, Gumport RI,
Gardner JF.). В соответствии со способом red-запускаемой интеграции штамм, несущий
разрушенный ген, может быть получен в один этап с помощью ПЦР-продукта, полученного
путем использовани синтетических олигонуклеотидных праймеров, сконструированных
так, что они содержат часть адресного гена на своем 5'-конце и часть гена
резистентности к антибиотику на своем 3'-конце. Кроме того, интегрированный ген
резистентности к антибиотику может быть удален путем дальнейшего комбинировани эксцизионной системы, полученной из фага л мбда, со способом red-запускаемой
интеграции.
(1) Разрушение гена sfcA
В качестве ПЦР-матрицы использовали плазмиду pMW118-attL-Cm-attR (ее получение
описано ниже). pMW118- attL-Cm-attR вл етс плазмидой, полученной путем инсерции
генов attL и attR, которые вл ютс сайтами прикреплени фага л мбда, и гена cat,
который вл етс геном резистентности к антибиотику в pMW118 (TaKaRa Bio). Гены ввели
в пор дке attL-cat-attR. Последовательность attL представлена в SEQ ID NO:11,
последовательность attR представлена в SEQ ID NO:12.
ПЦР проводили с использованием праймеров, представленных в SEQ ID NOS:1 и 2 и
имеющих последовательности, соответствующие на их 3'-концах attL и attR, и
последовательности, соответствующие част м гена sfcA на их 5'-конце соответственно.
Амплифицированный ПЦР-продукт очищали на агарозном геле и вводили в штамм
WC196 Escherichia coli, содержащий плазмиду pKD46, характеризующуюс температурочувствительной репликацией, посредством электропорации. pKD46 (Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645) содержит 2154 п.н. фрагмент ДНК фага л мбда
(GenBank/EMBL инвентарный № J02459, 31088-33241), несущий гены (гены ?, ? и exo),
кодирующие рекомбиназу Red системы гомологичной рекомбинации ? Red под контролем
индуцируемого арабинозой промотора ParaB. pKD46 необходима дл интеграции ПЦРпродукта в хромосому штамма WC196.
Компетентные клетки дл электропорации получили, как описано ниже. Штамм
WC196 Escherichia coli, культивированный в течение ночи при 30°C в среде LB,
содержащей 100 мг/л ампициллина, разбавл ли в 100 раз 5 мл среды SOB (Sambrook, J. с
сотр., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor
Laboratory Press (1989)), содержащей ампициллин (50 мг/л) и L-арабинозу (1 мМ).
Разбавленный продукт культивировали при 30°C в услови х аэрации до тех пор, пока
Страница: 22
RU 2 337 140 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
показатель OD600 не равн лс примерно 0,6, затем концентрировали в 100 раз. Дл приготовлени к электропорации клетки промывали 3 раза 10% глицерином.
Электропорацию проводили с использованием 70 мкл компетентных клеток и примерно 100
нг ПЦР-продукта. Перед электропорацией к клеткам добавл ли 1 мл среды SOC (Sambrook
J. С сотр., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring
Harbor Laboratory Press (1989)). Клетки культивировали при 37°C 2,5 ч, затем помещали на
чашки, залитые L-агаром, содержащим 25 мг/л Cm (хлорамфеникол) при 37°C дл отбора
Cm-резистентного рекомбинанта. Затем дл элиминации плазмиды pKD46 клетки
субкультивировали дважды при 42°C на Cm-содержащей среде из L-агара. Полученные
колонии тестировали на резистентность к ампициллину. Таким образом, получили
ампициллин-чувствительный штамм, не содержащий pKD46.
Делецию гена sfcA в мутанте, идентифицированном с помощью гена резистентности к
хлорамфениколу, подтвердили с помощью ПЦР. Полученный в результате штамм,
дефектный по sfcA, обозначили как WC196?sfcA::att-cat.
Дл элим?
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
2 557 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа