Влияние РНК-интерференции Влияние РНК-интерференции на на экспрессию экспрессию гена гена AML1-ETO AML1-ETO Д. В. Посредник Д. В. Посредник научный руководитель В. В. Гринев научный руководитель В. В. Гринев Белорусский государственный университет Белорусский государственный университет кафедра генетики кафедра генетики Цель: Цель: оценка эффективности подавления экспрессии гибридного гена aml 1- eto с помощью РНК-интерференции в клетках ОМЛ линий Kasumi -1 и SKNO -1. Задачи: Задачи: Оценить эффективность подавления экспрессии гибридного Оценить эффективность подавления экспрессии гибридного гена гена aml aml 1- 1- eto eto в клетках ОМЛ линий в клетках ОМЛ линий Kasumi Kasumi -1 и -1 и SKNO SKNO -1 с -1 с помощью РНК-интерференции, запускаемой кшРНК. помощью РНК-интерференции, запускаемой кшРНК. Синтезировать и клонировать последовательность, Синтезировать и клонировать последовательность, кодирующую искусственные анти- кодирующую искусственные анти- AML AML 1- 1- ETO ETO микроРНК. микроРНК. Разработать челночный плазмидный вектор Разработать челночный плазмидный вектор pDsRed pDsRed 1/ 1/ amiAML amiAML 1- 1- ETO ETO , кодирующий искусственные , кодирующий искусственные анти- анти- AML AML 1- 1- ETO ETO микроРНК, и изучить его функциональную микроРНК, и изучить его функциональную активность. активность. Оценить эффективность подавления экспрессии гибридного Оценить эффективность подавления экспрессии гибридного гена гена aml aml 1- 1- eto eto в клетках ОМЛ линий в клетках ОМЛ линий Kasumi Kasumi -1 и -1 и SKNO SKNO -1 с -1 с помощью РНК-интерференции, запускаемой искусственными помощью РНК-интерференции, запускаемой искусственными анти- анти- AML AML 1- 1- ETO ETO микроРНК. микроРНК. Основные понятия: Основные понятия: РНК-интерференция — это механизм подавления РНК-интерференция — это механизм подавления экспрессии гена, то есть проявления данного гена в экспрессии гена, то есть проявления данного гена в организме в форме определенного признака на организме в форме определенного признака на стадии трансляции. стадии трансляции. МикроРНК — класс некодирующих РНК, которые МикроРНК — класс некодирующих РНК, которые имеют длину около 22 нуклеотидов. Эти РНК играют имеют длину около 22 нуклеотидов. Эти РНК играют важную роль в регуляции трансляции и деградации важную роль в регуляции трансляции и деградации мРНК. мРНК. кшРНК – то же, что и микроРНК, но внеклеточного кшРНК – то же, что и микроРНК, но внеклеточного происхождения, то есть, не кодируются геномом происхождения, то есть, не кодируются геномом клетки и не проходят процессинг в ядре. клетки и не проходят процессинг в ядре. wt 5’ LTR y RRE cPPt P SFFV eGFP WPRE SIN 3’ LTR P H 1 смысловая петля антисмыловая терминатор нить нить wt 5’ LTR y RRE cPPt P SFFV eGFP WPRE SIN 3’ LTR Схема строения лентивирусных векторов доставки pHR ’ SINcPPT - SEW (А) и pHR - shAML 1/ ETO (Б). А) Б) Эффективность трансдукции клеток линий Kasumi -1 (А) и SKNO -1 (Б) VSV - G псевдотипированным лентивирусом, основанным на векторе р HR - shAML 1/ ETO . Б) 99.94 % ( 9706.17 ) M1 98.21 % ( 7394.08 ) А) Флуоресценция Искусственное подавление белка AML 1- ETO с помощью anti - AML 1- ETO коротких интерферирующих РНК в клетках острого миелоидного лейкоза линий Kasumi -1 (А) и SKNO -1 (Б). AML 1- ETO ® GAPDH ® Контроль pHR’SINcPP T-SEW pHR - shAML 1/ ETO 130 95 43 A AML 1- ETO ® GAPDH ® Контроль pHR’SINcPP T-SEW pHR - shAML 1/ ETO 130 95 43 Б F _ AML 1- ETO é BamH I ù é перекрывающаяся область ù 5’- AT GGATCC AGTGAGCGCACCTCGAAATCGAATACTGAGA AGGGTGAAGCCACAGATG - 3’ R _ AML 1- ETO é SalI ù é перекрывающаяся область ù 5'- GTC GTCGAC AGTAGGCAAACCTCGAAATCGTACTGAGAAGA CATCTGTGGCTTCACCCT -3' Сиквенс олигонуклеотидов и их вторичная структура, рассчитанная с помощью программного пакета Mfold 3.2 ([ Na + ] = 60 mM , [ Mg 2+ ] = 1.5 mM и +37 o C ). Карта челночного плазмидного вектора pDsRed 1-С1. А) Б) Вторичные структуры DsRed1 mRNA (А) и DsRed1/AML1-ETO mRNA (Б), рассчитанные с помощью программного пакета Mfold pre- mir - 30 a / AML 1- ETO Б) pEGFP-C1 pDsRed1-C1 pDsRed1/amiAML1-ETO 0.5 1.0 1.5 0 20 40 60 80 100 120 Тип челночного плазмидного вектора Положитель ные по репо ртерному бе лку клетки, % Результаты котрансфекции челночными плазмидными векторами pDsRed 1- C 1, pDsRed 1/ amiAML 1- ETO и pEGFP - C 1 клеток линии 293Т НЕК A) Б ) Свет Зеленая флуоресценция Красная флуоресценция В ) A) Б ) wt 5’ LTR y RRE cPPt P CMV DsRed 1 IRES eGFP WPRE SIN 3’ LTR wt 5’ LTR y RRE cPPt P CMV IRES eGFP WPRE DsRed 1/ amiAML 1- ETO SIN 3’ LTR Схема строения лентивирусных векторов доставки pHR-CMV-DRep (A) и pHR-CMV-DRep/amiAML1-ETO ( Б ) Эффективность трансдукции клеток линий Kasumi -1 и SKNO -1 DRep / Control / v .01 и pHR - DRep / amiAML 1- ETO / v .01 VSV - G -псевдотипированными лентивирусами. Стабильность наследования лентивирусных векторов DRep / Control / v .01 и pHR - DRep / amiAML 1- ETO / v .01 в клетках линий Kasumi -1 и SKNO -1, интегрировавшихся в геном. AML1-ETO ® GAPDH ® Mock DRep/Con trol/v.01 , нативный pHR-DRep /amiAML1 -ETO/v.01 , нативынй DRep / Control / v .01 10- кратно сконцентри рованный pHR - DRep / amiAML 1- ETO / v .01 10- кратно сконцентри рованный DRep / Control / v .01 , суперинф екция pHR - DRep / amiAML 1- ETO / v .01 , суперинф екция 130 95 43 Выводы были озвучены по ходу доклада. Выводы были озвучены по ходу доклада. автор благодарен автор благодарен С.В. Глушену за помощь в проведении С.В. Глушену за помощь в проведении микроскопических исследований микроскопических исследований И.Н. Северину за помощь в проведении И.Н. Северину за помощь в проведении цитометрических исследований цитометрических исследований D D . . Trono Trono за предоставленные вектора за предоставленные вектора pCMV pCMV _ _ dR dR 8.91 и 8.91 и pMD pMD 2. 2. G G M M . . Scherr Scherr за базовый лентивирусный вектор доставки за базовый лентивирусный вектор доставки pHR-SINcPPT-SIEW pHR-SINcPPT-SIEW O O . . Heidenreich Heidenreich за векторы за векторы pHR pHR ’ ’ SINcPPT SINcPPT - - SEW SEW и и pHR pHR - - shAML shAML 1/ 1/ ETO ETO сотрудникам лаборатории клеточной и молекулярной сотрудникам лаборатории клеточной и молекулярной биологии лейкозов за помощь в проведениях биологии лейкозов за помощь в проведениях исследований исследований Спасибо за внимание. Спасибо за внимание. вернуться к началу презентации
Автор
1/--страниц