close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Практикум-Мокроносова-Физиология-растений-1994

код для вставкиСкачать
МАЛЫЙ
ПРАКТИКУМ
по
ФИЗИОЛОГИ
И
РАСТЕНИЙ
оо
420
МАЛЫЙ
ПРАКТИКУМ
по
ФИЗИОЛОГИИ
РАСТЕНИЙ
Под редакцией академика А. Т. Мокроносова
9-е издание, переработанное и Дополненное
Рекомендовано Государственным комитетом Росснйской
Федерацни по высшему образованию в качестве учебного
пособия для студентов ВЫсШИХ учебных заведений,
обучающихся по направлению «Биология», специ альности
«Биология».
Издательство Московского университета
1994
ььк
28,57 м
20 удк
ред. А. Т. Мокро1994.— 184 с. lSBN
В «Практикуме. представлены Теоретические
основы арактиче— скве методики по основнну
разделам физиологии растениђ_ В настоящем
«здании (8-е— 1992 г.) приведены последние
научные сведенИТ по различным направлениям
этой науки, Задачи рассчитаны на инда•
внлуал,ную габпту студентов с использованием
современных методов исследования, а также с
применением
ЭВМ.
Авторы.
т. А. ВЛАСОВА В Ф. ГАВРИЛЕНКО. И, П, ЕРМАКОВ Т. В. ЖИГАЛОВА.
Г.
Н.
Н
П.
МАТВГГВА.
М.
притоношви.ли
И.
Рецензенты:
кафедра
физиологии И биохимии растений
госуда ственј•огг, универсятета
(зав, кафедрой проф. В, Полевод»; кафедра физиологии
и Смохимиа растений
Воронежскою гог дарственного унии,ерснтета (зав.
кафиро доц_ В. В, Чурикова)
федеральная программа книгоиздания России в 1994
году
собне.—
Малый практикум по физиологии растений: учеб. поМ 20
9-е изд., перераб. и доп. / Под
из д - в о
мгу,
100—
Коллектив штора,
1994
Издательство Московского уни— верс•тетз. 1994
предисловиЕ
Девятое издание малого практикума По физиологии
растений существен«о переработано: Пно сф
держит не Только новые задачи. но н новый раздел
«Полифункционале,носп,
атаетиыл
реакций
растТельного организма», Практикум полностью
соответ• ствует программе общего курса физиологии
расте
дая биологичесю*к специальностей унтерснте•
Тов. Несмотря нг огрзннчгнннй объем книги, веторы
постарались не только прелстзвн:ь различные истоды.
применяемые в физиологи растений, но лгежле всем
углубить знания. полученные студентз• ми при
изучении теоретического курса.
Программа практикума предлагаемые методы
последние требуют
гриборој сложных
установок, многне из которых при уотерннзаиии
практикума соб• раны инженером кафедры Ь, Х.
Соловьевым. Знача. тельно расширен ряд объектов,
включающих изоди
культуры н
различных звоаюииоииых И зкМо• гических групп.
также р.стеная
Аагоры
Раздел
Физиология РАСТИТЕЛЬНОИ КЛЕТКИ
Эволюция растительного и животного царства шла по путт
создания органических форм, которые состоят из большого числа
специализированных органов и тканей, Последние, в свою очередь,
содержат сложные наборы отличающихся друг от друга клеток,
Увеличение разнообразия клеток, составляющих организмы,
происходило одновременно с разграничением функций, которые
выполняют эги клетки, Каждая клетка многоклеточного организма
является потомком единственной зародышевой клетки —
образуется в результате ряда последовательнцх делений,
Поэтому Ола обладает тем же генетическим материалом, что и
исходная зигота, Между тем каждая клетка реализует лишь
пезпачительнуло часть своих генетических по. тенциЙ, что
определяется лоложснием клетки внутри организма и временем ее
функционирования.
Структурные
и функциональные
особенности клеток
многоклеточного организма связаны с их специализацией, однако
любая клетка способна осуществлять многие фулкдии и имеет ряд
свойств,
которые
присущи
также
свободноживущим
одноклеточным организмам, К ним должны быть отнесены такие
фундаментальные явления, как взаимодействие клетки с впеш• ней
средой (поглощение и выделение различных веществ, рецепПия
сигналов различной природы — температурных, световых,
Химических, электрических), взаимодействие клеток друг с другом
(в ассоциациях одноклеточных орган взмоз, симбиотических
комплексах, в тканях многоклеточного организма), подвиж• ность
клеток и Цитоплазматического содержимого, раздражимость,
размножение, изменчивость, использование и трансфорМадия
энергии, временная и пространственная организация работы
биохимических
систем
внутри
клетки
за
счет
их
компартментализацин,
Реализация многих из названных процессов связана с нали•
чием в клетке сложных мембранных комплексов, обеспечивающих
пространственную упорядоченность ее работы. Разделение клетки
мембранами на компартменты дает возможность увелинить
эффективнос•п, метаболических процессов, разделить заряды,
реакции, создать локальные условия среды. В мембранах
обнаружены многочисленные мультифермгнтные комплексы
(например, цепи переноса электронов в митохондриях и
хлоропластах), транспортные системы, рецепторные молекулы.
Между отдельными мембранами клетки существует временн5я
нгпрерывность, они находятся н сослоянии функционального и
морфологического динамического равновесия. Всем мембранам
живой клетки присуще свойство избирательной проницаемости,
которое. ону теряют, когда происходит биохимическая деструкцня
клетки при ее гибели. Мембраны образуются, развиваются и
разрушаются на протяжении всей жизни клетки. Состав, структура
и свойства мембран определяются их природой и зависят от
условий окружающей среды. Изменчивость мембран играет
важную роль в жизнедеятельности клетки.
Пространственная и временнйи организация деятельности
клетки
обеспечивается
также
существованием
такой
морфологической структуры, как цитоскелет, Клеточные
органе.ллы определешпым образом ориентированы и находятся з
состоянии
гаправлгнного
движения.
Белки
цитоскелета,
взаимодействуя друг с другом, образуют сложные динамические
структуры, которые отвечают за согласованное поведение частей
клетки. 1 (итоскелет участвует в движении клеток и цитоплазмы
внутри них, в транспорте вещесгв н частиц, в митозе, обеспечивает
форму проч. ность клеток, локализацию ферментных систем з
шитоплазме
т. д. Любой тип движения приводит к постоянным изменениям
пространственной организации клетки, которые не влияют на
постоянство биохимических реакций в функций, Измерение
скорости движения цитоплазмы позволяет оценивать уровень
жизнедеятельности клетки,
Универсальность морфологических блоков, из которых
построена клетка, является основой для процессов специализации,
происходящих у растеиий в определенных апатомических 30пах. В
многоклеточном растительном организме существуют небольшие
участки— меристемы, внутри которых протекает постоянныЙ
процесс пролиферации, Специализация клеток связана е выходом
из меристематических зон.
Специализация клеток растений (и животных) — это появление
качественных
различий
между
ними
в
результате
дифференииальпой активности генов. В составе организма клетка
реализует только часть своей генетической информации, сдиако
изоляция соматической растительной клетки или кусочка ткани, а
также создание определенных условий литания, освещенности и т,
л. могут привести к самым различным типам морфогенеза. Это
означает, что растительная клетка обладает тотипотен•гносгью.
Растительная клетка окружена жесткой оболочкоЙ—
клеточной стенкой, которая защищаег содержимог клетки,
определяег ее форму и размер, является одним из путей транспорта
различных веществ по растению (апопласт), играет важную роль в
росте и дифференцировке н их регуляции, Клеточные стенки
пронизаны порами, через которые проходят алазмодесмы,
соединяющие цитоплазму соседних клеток. Клеточную обо, лочКу
можно разрушить (например, с помощью ферменлов). В этом
случае образуется клетка без оболочки— протопласт, сразу
приобретающий округлую форму,
Подбором спелиальных условий получают протопласты, со.
Храняющие жизнеспособность довольно длительное время. С
110терей оболочек и связей с другими клетками протопласты
утрачивают ряд свойств, присущих клетке как части целого
организма; в то же . время их можно использовать для регенерации
целых растений, что ярко свидетельствует в пользу
тотипотентностн растительных клеток,
Наиболее широкое лрњменение нашли протопласты в
генетической
и
клеточной
инженерии
растений
(для
тратсформаиии растений путем введения клеточных органелл или
для слияния протопластов, полученных от представителей
различных таксономических грулл, и т. п.). Протопласты —
удобный объект для изучения некоторых физиологических,
биохимических
и
биофизнческнх
вопросов.
Например,
свежевыделенные протопласты используют при определении х
ьтмнческой структуры и свойств Плазмалеммы, для получения
интактлых клеточных органоидов. Так как Протопласты способны
регенерировать клеточную стенку, их используют для
исследования биохимических н ультраструктурных изменений,
сопровождающих этот процесс,
Предлагаемые в настоящем разделе задачи иллюстрируют
такие свойства и признаки живой клетки, как избирательная
проницаемость клеточных мембран и движение цитоплазмы,
изменчивость этих свойств под влиянием различных факоров
внешней среды и связь их с жизнеспособностью клетки. Эти
работн проводят на разных объектах, в том числе получаемых
искусственно, например протопластах.
ЗАДАЧА ВЫХОД ВЕЩЕСТВ из КЛЕТКИ КАК ОТРАЖЕНИЕ
СВОЯСТВ ЕЕ МЕМБРАН. ПРОНИЦАЕМОСТЬ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН
Цитоплазматическая мембрана (плазмалемма) первой вос•
принимает информацию о внешней среде н перелает ее внутрь
клетки. Она выполняет защитную функцию, участвует в узнаванна
клетками друг друга. обмене информацией между Ними,
агрегации. адгезии, восприятии различных химических и
физическнх воздействий. на ней протекают биоэлектрические
реакПии. Плазмалемма, как и мембраны других компартментов,
личается высокой лабильностью, ее лолное обновление может
произойти за несколько минут,
Плазмалемма обладает избирательной проницаемостью, она
Контролирует поступление веществ в клетку и выход их из нее.
Определить влияние каких-либо веществ или условий на
пронипаемость клеточных мембран можно, измеряя выход
различных метаболитов из клетки. Различными методами
(электронного парамагнитного резонанса, ядерного магнитного
резонанса, поляризацией флуоресценции) показано. что изменения
в скорости выхода вещест связаны с изменениями свойств
мембран.
Предлагаемые ниже работы направлены на выяснение
повеДенин мембранных систем клетки. Однако необходимо
помнить, что получаемый эффект может зависеть не только от
свойств
плазмалеммы
и
тонопласта,
мо
и
от
структурно•функциональ• ных особенностей цитоплазмы данной
клетки.
Каждую задачу практикума описывают в следующем торядке:
1. Цель работы.
2. Объект исследования.
З. Ход работы.
4. Результаты.
5. Выводы.
рльотл 1. ВЛИЯНИЕ РАЗ.личных ФАКТОРОВ
НА ВЫХОД эл;ктролитов ИЗ КЛЕТОК
Изменение проницаемости мембран под влиянием какогзлибо
фактора внешней среды можно определить По выходу
электролитов из клеток в окружающий раствор. Метод основан на
измерении удельной электропроводности раствора [Три помощи
кондуктометра (блок-схему установки см. в Приложе• нии 11).
Использованный в данной работе метод широко приме— няют в
практических исследованиях при изучении разнообраз• пых
воздействий на целые растения, кусочки тканей. отдельные органы,
суспензии клеток и протопластв.
опыт
влииник виотических (Фитолдтогены. и Абиотических
сгкмпгрдтурнып. ВОДНГ;П стресс. ФАК торов НА ВЫХОЛ
электролитов из
Одной из первых и неспецифических реакций растений на
действие различных стрессов является повреждение клеточных
мембран, которое ведет к изменению их проницаемости. Характер
изменения проницаемости мембран зависат от устойчивости
растения к действующему факто у. Этот показатель может служить
тестом при отборе усто чивых форм з селекционной работе.
Объектом могут быть растения, инфилированные разными
латогенами; растения, выращенные в разных условиях снабжения
водой; разные органы растений, подвергшиеся действию
температурного стресса, и т. д.
Цель работы. Определить влияние заражения растения фитопатогеном на
выход злектролитов из клеток растения. реактивы И оборудование: бюксы
Объемам 10—20 мл; пипетки: лезвия; пинаеты; торсионные весы: линейн Капрон
или марля: термостат с теупе— ратурой 25' С: водяная баня с температурой НУРС;
иоадуктометг.
Объект исследования: днсТьИ хлопчатника здоровых и инфицированных
вилтом растения,
7
Ход работы. Листья растений промывают водопроводной водой в
течение 15 мни, обсушивают фильтровальной бумагой. удаляют
крупные жилки и лезвием нарезают на кусочки Х 1.5 мм (размер
кусочков может варьировать в зависимости от объекта). Навески по
200 мг помещают в бюксы, закрывают капроном, который укрепляют
резинкой, промывают под краном холодной водопроводной водой в
течение 30 мин, затем Три раза ополаскивают дистиллированной
водой. сливают воду и слегка обсушивают навеску, переворачивая
бюксы на чистую фильтровальную бумагу.
В бюксы прџ.лиаают по 4 мл дистиллированной воды и помешают по гри бюкса с листьями здорового и зараженного растеная
(варианты) в кипящую водяную башо На [5 мил, По три других
бюкса—в термостат с температурой С на 1 ч, После
термосгатнровання жалкость из бюксов фильтруют Через кал. рон и
измеряют электропроводность фильтрата. Все растворы должны
иметь одинаковую температуру перел измерением. так как
электропроводность раствора зависит не только от концентраиин в
нем электролитов, Но и от подвижности ионов. которая, в свою
очередь, зависит от температуры. Определяют выхол электролитов
из клеток с помощью кондуктометра. (По. рядок работы на
кондуктометре см. в Приложении 11.) Необходимо помнить, что для
каждого нового объекта величина наве• ски и объем приливаемой
воды могут варьировать.
Оформление работы. Определите коэффициент повреждаемости
(КП) по формуле
где [п — выход электролитов из листьев зараженных (опытныл)
растений в процентах от полного выхода электролитов в этом
варианте (после кипячения, е 1003 С); [т— выход электролитов из
тканей контрольных растений в процентах от полного выхода
электролитов. Полный выход электролитов определите Ло
электропроводности фильтрата после разрушения мембран
кипячением и примите за 100%. Результаты представ№ Те в виде
таблицы. Сделайте выводЫ.
Таблица
Л
Тея
1,
ОПЫТ
25
нстья здорового
РЗСГС•
Листья зер•женжогп Ия
ДЕЙСТВИЕ
ШОК* НА
Лла ЭЛЕКТРОЛИТОВ
КЛЬ-ГОК
Исследование самых разных организмов (ог бактерий и
ранений до человека) показало, что при стрессовых воздействиях
во всех клетках (за искл юченнем пылькы) изменяется спектр
синтеза белков: синтез обычных белков прекращается и
индуаируется синтез так называемых шоковых белков,
Преллолага• ют, что шоковые белки выполняют защитную
функцию, предохраняя от повреждения м РНК, мембраны,
органеллы иетка. Наиболее изучено воздействие на синтез н
функции шоковых белков теплового стресса.
Существует положительная корреляция между наколленлем
белков теплового шока (БТШ) н термоустойчивостыо растений.
Так, длительная инкубация проростков сон лрн температуре 45' С
приводит к их гибели: выход электролитов из клеток при этом
возрастает лилейно во времени. Если проростки преднаригельно
инкубируют при 400 С, то выход электролитов при дальнейшей
летальной обработке (45' С) значительно снижает“
Снижение воздействия теплового шока в этом опыте связано с
синтезом и накоплением БТ Ш, которые появляются при
длительном воздействии температуры 40' С или при
кратковременном действии температуры 45“ С н послелуюпте•й
инкубации при 280 С. Показано, что Олин из БТИ] массой 15 кДа
связывается с плазма.леммой при действии стрессовой
температуры, Вилимо, это взаимодействие каким-то образом
стабилизирует мембрану, сохраняя жизнеспособность клеток при
стрессе (Litl et аГ., [985).
Цель работы. Определить влияние теплового шока на выход
электролитов аз проростков сои.
Реактивы и оборудование: бюксы обыном 20—50 мл; пипетки: термостат На
С; тве во.“ане бани с температурой 40 и 450 С; кондуктометр.
Объект
двухл*евне'е проростки сон, вырешенные ид
н-а>
фильтровальной бумаге в темноте при температуре
С.
Ход работы. Для каждого варианта опыта берут десять
проростков сои, отделяют семядоли, промывают водопронолной
водой, ополаскивают три раза дистиллированной водой,
помещаот в бюксы, заливают 10 мл дистиллированной воды и
проводят пять вариантов исследования:
— инкубируют в термостате с температурой 280 С.
2— инкубируют в течение 7 мин н водяной бане при 450 С, а
затем в термостате при 280 С.
З— инкубируют в зодяноЙ бане мри
С.
4— инкубируют в водяной бане при
С,
5— инкубируют в течение 30—60 мин в водяной бане яри 400
С. затем 7 млн при 450 С и далее з термостате при 280 С.
Время окончательной инкубации во всех вариантах З ч. Через
каждые 30—60 мин берут пробу для определения элентро.
проводности. Для этого встряхивают бюкс и отбирают пипеткой
9
по мл жидкости, охлаждают ее до комнатной температуры и
измеряют электропроводность с помощью кондуктометра. Жиз•
кость После измерения выливают з тот же бюкс,
Оформление работы. Полученные результаты Представьте в виде
графика зависимости электропроводности (в уел. ед.) от времени.
Сделайте выводы.
РАБОТА 2 ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА прониц№мость
КТ,ТоЧНЫХ МЕМБРАН ДЛЯ БЕТЛЦИАНИНЛ
Ьетацианин — пигмент столовой свеклы — относительно
боль[Мая, хорошо растворимая в воде молекула, находящаяся в кле
точном соке. Чтобы попасть во внешнюю среду, молекула
бегацианина
должна
пройти
через
тонолласт.
основной
цитоплазматический матрикс и плазмалемму. Диффузия бетаиианина
из вакуоли в среду может проходить достаточно быстро ПРИ
дейстВии различных факторов или агентов, вызывающих изменение
проницаемости мембраны. Измеряя оптическую плотность
инкубационной среды через определенный лромежуток времени.
можно оценить стелень воздействия данного фактора на прони•
цаемость Мембран. Этот простой и быстрый метод используют
обычно в прикладных исследованиях при изущении действия какоголибо вещества или фактора ма биологические объекты.
Цель работы. Определить влияние температуры на проницаемость
мембран для бетааканина по выходу его в различные инкубационные
среды.
реактивы н оборудование: М водный раствор сверло «пробказое' лив метром 5
мм; лезвие. линейна; во Еюхнср•; про•. бирки; пнгетм; термостаты г температурой 35
юС, ФЭК.
Объект исследования: корень столо.оП стеклы (Bcta
Ход работы, Из корня столовой свеклы сверлом вырезают
столбики ткани диаметром 5 мм, с помощью лезвия и линейки
разрезают их на миллиметровые кусочки, Стараясь выбирать
одинаковые по цвету, отсчитывают 60 дисков, которые для удаления
остатков клеток в течение 15—20 мин промывают водопроводной
водой на воронке Бохнера.
В три пробирки наливают ао 10 мл воды, в три другие— по мл
сахарозу, В каждую пробирку ломегПают по десять дисков свеклы.
Дзе пробирки (одна с водой, другая с сахароЗой) оставляют при
комнатной температуре, две другие ставят в водяную баню с
температурой 35' С, замечают время. две оставшиеся пробирки (с
водой и сахарозой) помещают в водяКую баню при 460 С н также
отмечают время.
В течение ч через каждые [0—15 чин в пробирках измеряют выход
бетациакина в раствор, Для этого из опытной пробирки пипеткой
отливают раствор в чистую пробирку и после измерения оптической
плотности выливают раствор в ту же опытную пробирку, стараясь не
терять жидкость. Измерение плотности проводят на ФЭКе с зеленым
светофильтром (кюветы см) или спектрофотометре нм.
Оформление работы. Постройте график зависимости оптической
плотности раствора от времени. Сделайте выводы.
РАБОТА З. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЫХОДЯ ВЕЩЕСТВ ИЗ пыльцы при
прорлсТАнии
Пыльца во время опыления распространяется в воздушно. сухом
состоянии. При попадании на рыльце пестика она быстро
увлажняется, после чего набухает и прорастает. Хотя поверх. нос.гь
рыльца и сам столбик являются источником литательных веществ для
прорастающего зерна и растущей пыльцевой труб. ки, последние сами
выделяот наружу экссудат сложного химлческого состава, Этот
экссудат играет олределенную роль в ре. акциях взаимодействия
пыльцы и рыльца. ответственных за узнавание пыльцы при
несовместимости.
Большинство исследований веществ, выделяемых лыльдой, было
дронелено при лроращлзании ее in vitI-o. В этих условиях между
пыльцой и средой культивирования устанавливаются опрелеленнце
взаимоотношения:
для
того
чтобы
пыльца
прорастала,
первоначальный состав среды должен отвечать требованиям, которые
изменяются в зависимости от вида или сорта растения: в то же время,
сама пыльца действует на среду кут— тивирования, изменяет ее, не
только поглощая минеральные элементы и углеводы, но и выделяя в
нее различные вещества подобно тому, как это происходит на рыльце
лестлка. Выделение лиффузатов зависит от работн плазматической
мембраны.
Известно. что проницаемогте, клеточных мембран для различных
веществ может быть критерием жизнеспособности клеток. Полагают,
что динамика образования диффузатпв лрн прорастании пыльцы
отражает ее жизнеспособности, Действительно, показано, что
динамика выхода ионов. белков. аминокислот и т, л, различна для
жизнеспособной н нежизнеслособной Пыльцы.
Выход веществ начинается сразу при попадании пыльцы в среду
роста. Наиболее интенсивный выброс происходит в Лер. вые мичуты.
Быстрота пропесга свидетельствует о том. что значительная доля
веществ высвобождается из оболочки пыльцевого зерна. Кроме того.
предполагают. что ирн легидратапин липиды мембран из ламе:лярного
состояния лереходят в мипеллярное, Это сопровождается увеличением
пор в мембране соответственно повышением ее пролилаемости. При
попадании во влажную среду в мембране таких клеток происходит
обратная перестройка. Однако Первые минуты, когда структура
мембран, ло•видимому, еще не успела измениться, наблюдают
повышенный выход веществ в окружающий раствор, Подобные
явления обнаруживают также в сухих семенах и спорах грибов. Выход
различных веществ из нежизнеспособной пыльцы после резкого
подъема в первые минуты возрастает линейно во времени, тогда как у
живой пыльцы наступает фаза замедления их выхода.
Цель работы. Определить выход электролитов н белков из
жизнеспособной и нежизнеспособной пыльцы.
Реактивы и оборудование:
раствор сахарозы• свежеприготовленВтапте
киетого': реактив Фолина: ЭрленмгПера объемом 50 мл; пипетки, иснтрзфужныс
пробирки; стекдннныс пробои; секундомер; центрифуга; конлчктометр; ФЭК,
Объект исследования: пыльца paIudosa, различающаяся по жизнеспосо(аости.
Ход работы. 30—10 мг пыльцы помещают в колбу, приливают 22
мл раствора сахарозы, энерсично встряхлвают в течение 1 мин и берут
пробу (2 мл). Последнюю центрифугируют для удаления пыльцевых
зерен при 4000 об!млн в течение 2 мин фильтруют через бумажный
фильтр, предварительно промытый раствором сахарозы. Оставшуюся
суспензию пыльцы разливают в шесть проберок по З мл в каждую и
ставят в термостаг ирл 250 С для проращивания, Затем через каждые 10
мин отбирают пробы. К каждой из полученных проб приливают по мл
раствора сахарозы. перемешивают жидкость и определяют ее
электропроводность кондуктометр ическнм методом,
Количество белка определяют по методу Лоури. Для этого в
пробирку наливают мл исследуемого раствора н 5 мл раст• вора А.
Через 10 мин добавляют мл реактива Фолина и через 30 мин
производят измерения на фЭКе с красным светофильтром. Количество
белка вычисляют по калибровочной Крнной, построенной с
сывороточным альбумином.
Оформление работы. Постройте графики выхода электролитов н
белков из клеток пыльцы во времени. Сделайте выводы.
ЗАДАЧА 2. ДВИЖЕНИЕ цитоплАзмы
et
куоль;
аи,
1 9 7 !):
направление
—
ядро.
показ но
пот ков
стрелка ми
Быстрое или почти незаметное движение цитоплазмы. кото. рое
происходит в клетках в естественных условиях, называют первичным.
Движение же. индуцированное каким-либо фактором внешней среды
(светом, температурой, хичическим или механическим воздействием и
т. л.) Вторичным. Скорость
движения щитоплазмн увеличивается с повышением температуры до
определенного предела последней (чаще 27—370 С). При дальнейшем
увеличении температуры
движение
замедляется, а затем
прекращается, Свет может либо ускорить движение (фогоДинез), либо
замедлить и остановить его. Характер реакции зависит от количества
светоноП энергии и качественного состава света, Различные
химические агенты, физические факто. ры также влияют на движение
цитоплазмы.
Выделяют несколько типов Движения цитоплазмы. Наиболее
12
Рис. .
(по W.
широко распространено колебательное движение. Его считают
наименее упоридоченным, так как при этом одни частицы находягся в
покое, другие скользят к периферии. третьи— к лентру клетки.
Движение
имеет
неустойчивый,
случа
йныЙ
характер.
Циркуляционное движение характерно для клеток. которые и ме. от
шитоплазматические тяжи, пересекающие центральную вакуоль.
Направление и скорость движения частиц. находящихся внутри или на
поверхности слоя цитоплазмы. а также в цитоплазматических тяжах,
непостоянны (рис. 1). При ротационном движении цитоплазма
находится только на периферии клетки и движется подобно
приводному ремню. Движение этого типа, в отличие от
циркуляционной), имеет более или менее постоянный н
упорядоченный характер, поэтому удобно для количест• венного
изренля. Оно часто встречается в клетках листьев водных растений
(элодея, валлиснерия и др.).
Помимо перечисленных выделяют еще ряд типов движения,
например фонтанирующее и челночное. Типы движения раз.лн•
чаются между собой условно и в одной и той же клетке могут
переходить из одного в другой.
В организации движения цитоплазмы участвуют белки, образующие
дитоскелет клетки. Структуры цитоске.лета подраз13
делят на микротрубочки. толстые, тонкие н промежуточные
микрофила.ненты н микротрибекулы, Цитоскелет — очень
лаПильная. постояннО меняющаяся система. Его элементы способны
быстро распадаться (деполимертзоваться) и вновь собиратг„ ся в
структуры (полимеразозаться)
Внутриклеточное движение или движение самой клетки заВисит
глазным образом от скольжения одного структурного элемента по
другому. Это скольжение происходит за счет взаимодействия белков.
Два основных белка. ответственных за двигате.льную систему.
существуют во всех клетках. Это актин и
Актин— глубулярный белок: встречается в двух формах:
Мономер ной — н агрегированной (фибрилл ирной) — Ьактин. При
полимеризация
(Гактина
расходуется
АТф
и
образуется
двуспиральная ('юрма. В цитоплазме немышечных клеток актин
находится в равновесной смеси Сл, я Юформ. Актино• вые
филамемты обычно сруллируютгн в ттткие лучки. пронизывающие
всю цитоплазму, Актин относится к структурным белкам клетки.
которые возникли на очень ранних этапах эволюции и в процессе
филогенеза претерлелн лишь незначительные из. менения, что может
быть связано с унжверсальностью той функПии, которую они
выполняют а клетках всех организмов. Актин участвует в
сгабнлизаиин н изменения формы клеток, митозе. движении клеток,
движении питоллазмы внутри них,
Миозин представляет собой молекулу, состоящую из двух
длинных полипептидных цепей. закрученных п а. спираль. К №концу
этих цепей присоединяются дзе глобулярные струкТу ы — головки.
которые реагируют с актином и обладают
ходит Предполагают. следующим что образом, взаимодействие
Головка миозина актина в и результате миозина при:•гид. ролиза
АТФ получает энергию и связывается с актином. Это связывание
одновременно катализирует высвобождение продуктов гидролиза
АТф изменение усла между головкой Н
нитью актина от 90 до 45'. Движение головок миозина может
рассматривался как усилие, которое ведет к сдвигу нитя актина
против миозина на 7—8 нм В конте этого усилия АТф вновь
связывается с чнознновой АТФазой, это отделяет головку миовина конфигурацию, ог актина готовая н головка связываться опять
возвращается с актином. в Таким прямоугольнуюобразом химическая
энергия превращается в механическую (Wagner.
Наряду с актин. и мнозннсодержащими микрофиламентамн 30
всех
эукариотаческих
клетках
найдены
микротрубочки
Микротрубочки растительных животных клеток одинаковы по
морфологии. Основная единяца конструкции микротрубочек—
протофиламент. который состоит из цепи субъединиц тубулина.
Тубулин гетеролнчер, он представлен а и субъединицами, является
консервативным белком и имеет сходную структуру в.
14
газлНЧНЫХ длясь друг организмах. вокруг друга. Тринадцать
образуют протофиламентов. трубочку. Одна из закручи•улнви•
тельных особенностей микротрубочек — способность выеграи. ваться
в геометрически правильные комплексы. где они связаны тонкими и
полеречнымн
Микротрубочки
ресничках
типа
9+2.
эукариот
образуют
мостиками.
л
жгутиках
структуру
в
скл-тав
микротрубочек вхолчт ряд белков.
Кроме тубулина
СВОЙСТВа которых в полимеризованной изучены недостаточно, и
неполимернзованной Как и актин, гумулннформах. существует
СТФ или АТФ увеличивают долю полимеризованлого ионы Са2+
тубуускоря•линз, а колхицин, низкая температура, давление, ют
деполимеризацию.
Микротрубочки выполняют в клетке различные функпии. Они
включены в образование препрофазной полосы. митотиче ского
веретена. фрагмотляста, Центриолей, жгутиков. участвуют
в движении хромосом. передвижении каркаса клетки. клеток.
образовании внутриклеточномклетранспорте, з формировании точной стенки. в секреции. Движение,
регулируемое микротру бочками. (_ж•новано на процессе
полтмеризаизн— деполимеризацин трубочек, или скольжении между
ними, тли взаимодействии с другими структурами клетки (Нуап1$,
1982),
Объектом многих исслелованнй по движению цитоплазмы являются
клетки междоузлий хароаык водорослей,
Японские исследователи Х. kamiya н К. kuroda (1962), ана,лизируя
распределение скоростей движущейся цитоплазмы клеток харовой
водоросли нигеллы, пришли к заключению. что механизм,
приводящий в движение литоллазму, находится ла потности раздела
эктоплазмы и эндоплазмы.
ктоплазма. или кортикальная цитоплазма (Кортекс),— это
наружный слой цитоплазмы. стационарный гель. Эндоплазма—
внутренний жидкий золеобразный слой, В очень тонком слое.
близком к внутренней поверхностн коркового геля, обнаружен
резкий градиент скорости цитоплазмы; фактически же вся
эндоплазма течет с одной и той же скоростью, Описываемый
механизм Получил название активного сколЬЖёНИЯ. Поскольку
эндо• плазма
как целое. по внутренней поверхности
коркового слоя, Текущая эндоплазма сдвигается вдоль нелодвижной
эктоплазмы, запускаемая молекуллмн миозина, которые данжутся
вдоль пучков актиновых микрофиламентов, локализован.
ныл в эктоплазме.
Другим объектом, удобным для изу.еняя движения цитоплазмы.
являются морские сифоновые зеленые водоросли и ксантофиты. С
помощью
иммуноцжтохимнческнх
методов
показано,
что
кортикальная цњтопла.зиа клеток содержит сотни взаимосвязанных
пучков микротрубочек. выстроенных вдоль длинной ося клетки,
Вбля.1и этих пучков расположены актиновые микрофиламснты,
Хлоропласты двигаются пл раллельно пучкам. Применение ядов.
действующих либо на актин. либо на микротрубочки, показало, что
взаимодействие последних меобходимо для организации цитоскелета
и движения хлоропластон.
Источником энергии для движения протоплазмы является МФ.
Поэтому свет может влиять на скорость этого движения, изменяя
уровель АТф, образованной в процессе фотосилтетиче• ско1о
фосфорилирования.
Различные ингибиторы и разобщителн дыхания тормозят
движение цитоплазмы во многих растительных клетках, что также
свидетельствует об энергозависимости процесса, Так, 2, 4динжтрофенол (ДНФ) —широко применяемый разобщитель дыхания
и фосфорилирования — Тормозит движение цитоплазмы з
коллентралиях — М. Его действие обратимо: После удаления
реагента скорость движения восстанавливается. Олигомицнп—
ллгибитор о кислительлого фосфорилировалия—
заметно замедляет движение цитоплазмы и снимает ускоряю. шее
действие АТФ н АДФ. Этот антибиотик ингибирует не только
процесс образования АТФ, но н активность АТФазы, оче• ВИЛ но,
подавляя образом деятельность сократительных бел ков.
Биологическое значение Движения цитоплазмы состоит в том, что
оно способствует Переносу веществ от одной части клетки к другой.
Помимо этого, у некоторых водорослей с процессом движения
связано размножение, с движением связан у грибов рост гиф. у
миксомицетов, амеб. диатомовых водорослей движение цитоплазмы
передвижение организма— два неразрывных процесса. Движение
цитоплазмы имеет большое значенне для поглощения и выделения
веществ путем элло• и экзоцитоза. Перемещения в клетке
окруженных мембраной лу• зырьков, образованных в результате
деятельности эндоплазма— тической сети и аппарата Гольджи.
зилимо, также осуществ• ляется с помощью движения цитоплазмы,
Различные внешние воздействия способны изменять скорость
движения цитоплазмы. Ускорение движения пол влиянием хи.
мических веществ называют хемодинезом. Большой интерес
представляет тот факт, что хемодинез возникает При действии
минимальных физиологических концентраций метаболитов ра•
стительных
клеток.
гормонов,
некоторых
аминокислот.
Следовательно, скорость передвижения цитоплазмы может
регулироваться продуктами метаболизма клетки.
Усиление движения цитоплазмы служит показателем особого,
состояния клетки, Так, проникновение фитофторы, гриба-гаразига, в
клетки листьев картофеля вызывает бурное движение цитопл:Вмы,
которое свидетельствует о перестройках. происходящих з клетках,
Движение цитоплазмы в замыкающих клетках устьлц тесно связано с
регуляцией изменения ширилы устьЯчной щели.
Несмотря на то что остается много неясного в понимании
физиологического значения движения цитоплазмы, несомненно»
16
оно играет важную роль в осуществлении обмена и распределе— лия
веществ клетки. реакциях раздражимости.
Движение цитоплазмы можно охарактеризовать, определив его
скорость. Однако нельзя забывать о том, что последняя зависит не
только от лзижущеЙ силы. но и от вязкости цитоплазмы, Скорость
движетия антоллззмы можно измерить лод Мяк. роскопом, наблюдая
за передвижением ее частиц_
Цель работы. Показать, что скорость движения цитоплазмы
неразрывно связана с уровнем Жизнедеятельности клетки, с за. тратой
ее энергии. Изучить влияние различных концентраций фитогормонов
(цитокининов, фузикок1(ина) или синтетических регулњторов роста
Ла скорость движения цитоплазмы.
Реактивы и оборудование: 5, 10—3 М раствор АТФ; 5• М раствор ДНО: ббензилауинопурин (В•ЬАПј в концентращИН\ 10 и мг!л: ножнаци: лезши: секундомеры; капилляры; предметные покровные стекла; пробирки;
Термостат с температурой 37' С; микроскопы.
Объект исследования; листья злодеи Etodea ca.qadensis или валлиснерии
Ход работы. Недалеко от верхушечной Почки стебля отделяют
лист (у элодеи) или отрезают кусок листа (у валлиснерви). кладут ла
предметное стекло в каплю золы, взятой из сосуда, в котором было
растение. Через 10 мил, Когда установится стационарный уровень
движения цитоплазмы, клетка листа рассматривают пол микроскопом.
Выбирают наиболее легко просматриваемые участки (у элодеи это
чаще всего клетки сред. ней жилки) и по движению хлоропластов
следят за движением цитоплазмы.
Определяют скоромь движения хлоропластов. измеряя путь,
который проходит органелла в единицу времени. Для большей
точности измерения желательно взять относительно короткий участок
пути, например, разный десяти делениям окуляр. микро. метра.
Подсчет проводят для пита органелл в пяти клетках, полученные
данные
обрабатывают
статистически,
вычисляя
среднее
арифметическое М, среднее Квадратичное н среднюю ошибку т:
где
сумма отдельных измерений, п — число измерений.
Каплю раствора АТФ ломеп(ают с одной сторонн покровного
стекла н одновременно оттягивают фильтровальной бумагой воду изпод стекла с другой стороны. Через 10 мин определя1от скорость
движения цитоплазмы. Подобный опыт проделывают с раствором
ДНф.
Веточку элодеи (или лист валлиснерии) ошускаюг в стакан с водой,
который находится в термостате при 370 С, и оставляот
17
там на 20 мин. Затем отделяют лист 'и. положив его на предметкое
стекло в каплю воды, быстро определяют скорость дзиження цитоплазмы,
Контрольное определение скорости движения шитоплазмы (без
обработки) проводят так же, как описано выше, Затем оттягивают
воду фильтровальной бумагой и приливают раствор 6.БАП в
контентрации 10 мг{л. Через 10 мин определяют скорость движения
цитоллазмы. Олределение действия другой концентрации — 100
мг/л проводят на новом кусочке листа, также предварительно
оттределии скорость движения ци• топлазмы в контроле.
Оформление работы. Представьте результаты в виде таблиц.
Сделайте выводы.
Таблиаа 2
Таблица З
С«ором Ь
н,о. 20' с н,о.
37'С 5,10-3 М
5.10-4 м дно
6.ЬАП,
иго
6-ьлп,
мел
«л
ЗАДАЧА З. ВЫДЕЛЕНИЕ ПРОТОПЛАСТОВ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ
их жизнеспоСог,НОсти
Протопласты— это растительные клетки, у которых удалены
клеточные стенки. Протопласты слособны восстанавливать
клеточные стенки, после чего при определенных условиях может
произойти регенерация нового растения. В протопласты
сравнительно легко можно ввести микроорганизмы, чужеродные
плаСтнды, метафазные хромосомы, а также выделить интактные
органеллн, Внесение чужеродной ДНК в протопласты с помощью
векторных систем или путем прямого переноса генов лозноляет
получить трансформированные растения. обладающие новыми
свойствами (например, устойчивостью к гербииидам, токсинам
патогенов и т. л.)
Протопласты
способны
сливаться,
При
этом
могут
образовываться соматические гибриды между видами н родами, не
спо• собнымн скрещиваться половым путем, Из протопласта можно
удалить собственное ядро и образующийся цитопласт слить с
протопластом другого гибриду), Вида. При язЛя:ощнЙся этом
формируется хорошим объектомцибриО (противоположность для
изучения взаимодействия ядерного н гтитоилазматнческого
геномов,
Протопласты удобны для изучения целого ряда физиологическнх
проблем. Прежде всего, удаленне клеточной стенки де. лает
возможным прямой контакт с плазмалеммой, измерение ее
поверхностного заряда, определение проницаемости, работы нон
насосов н т. д. С лособность протопластов регенериродать
клеточную стенку используют для исследования этого процесса, С
помощью
протопластов
можно
изучать
способы
компартментализации метаболитов в клетке и их внутриклеточного
транспорта,
Протопласты растительных клеток можно выделить Механически
ила с помощью ферментов. Обычно наибольшее число жнвых
протопластов выделяют из молодык полностью развернувшихся
листьев и суспензий клеток в фазе логарифмического роста.
Стандартных методов для изоляции И культуры протолластов нет, так
как на эти процессы влияют вид растения, его возраст, фаза развития,
особенности тканей. условия роста растеная,
Механически“ метод выделения протопластов лримепяют
ограниченно, так как он дает малый выход протопластов и их можно
получить только из вакуолизнрованных клеток. Наиболее шароко
используют
энзиматаческиГ'
метод,
ара
котором
клетки
последовательно Ила одновременно обрабатывают пектина3оЙ (для
разделения клеток) н целлюлъзой (для разруше• нин клеточных стенок),
Выделение протопластов следует проводить в жидкой среде с
осмотическим потенциалом, близким потенциалу протопластов. иначе
может произойти их чрезмерное набухание или, наоборот,
сморщивание и повреждение. Осмотическим стабилизатором чаще
всего служат маннит или сорбит. Среда для выделения протопластов
должна содержать буферный раствор. РН Кроме того, в среду
выделения добавляют некоторые макроэлементы. Среда для
культивировапия протопластов сложнее по составу н включает макрон микроэлементы, сахара, витамины, органические кислоты, амнно•
кислоты, гормоны, Температура и время выделения протопластов
варьируют в зависимости от объекта.
Цель работы. Получить протопласты из листьев злаков и определить
их жизнеспособность.
щая реактивы 90 «л и оборудование: 190 мг\л среда для выделения 147 мг!л
протопластов, СаСЛ' • 21110. содержа-37
17 КН,РО, и ферменты (25'-й раствор целлюлазы [Г 10. распир
лектанззц' РН 5.7; раствор нейТрального красного, РН 7,0. приготовленного на среде
выделения без ферментов; раствор синего Эванса, ГГ] 7,0, приготовленный нз среде
выделеная без ферментов: раствор флуоресцеиндиаиетата (ФДА) —2,5 мг на мл
ацетона, хранящийся при С С в темноте; ...вия: ланпеты; бюксы или чашки бирки;
Петри; сита с пипетки; лиам?троч покровные пор ВО и н ЛОО предметные мкм; весы;
стекла.
цежтрифуга:
щентрифужны•е
МикроскопыПростуденческие;
стат.
флуоресцентный микроскоп; камера Фукса—розенталя; терио•
Объект
листья
проростков пшеницы пли
Ход работы. Работа состоит из двух этапов. 1. Выделение
протопластов, Ласт злака, такого, как .пшенитта, состоит из трех
главных тнпоа клеток: мезофилла (40%), проводящих (37 Ъ) и
эпидермальных '(23%) тканей. Протопласты мезофилла азо,лн• руются
из листьев легко. быстро и с большим выходом. Суслензия
протопластов мезофилла достаточно гомогенна, но ней могут также
Присутствовать з небольшом количестве лротоплз•
сты из других типов клеток.
Молодые полностью развернувшиеся листья обрезают по 1 см с
обоих концов и берут навеску 0,2 г. Каждый лист разрезают на кусочки
длиной около 1 см. Кусочек разрезают вдоль жилок Йа полоски
шириной менее 1 мм таким образом, чтобы небольшой кусочек листа
остался неразрезанным н из Всего куска образовалась «гребенка». Эти
«гребенки» помещают ма поверхность среды лыделення (5 мл), и сосуд
с нами ставят з термостат при температуре 300 С. Время инкубации
2,5—4 ч, После разрушения клеточных стенок суспензию протопластов
пропускают через сита или капрон для удаления остатков клеток. затем
протопласты центрифугируют при 100g в течение 5 мин. Осадок
Протопластов промывают 3 раза раствором среды, не содержащей
ферментов, суспенднрулот в 1 мл этой же среды.
2, ОпреДеленне жизнеспособности протопластов. Жизнеспо•
собность протопластов оценивают по их способности накапливагь
нейтральный красный в вакуолях, Для этого суспензию протопластов
смешивают с раствором нейтрального красного, который приготовлен
на среде выделения лротопластон, ке содержащей ферментов,
Разбавление красителя долж• но дать конечную концентрацию
Через 5 мин после окраски протопласты рассматривают лод
микроскопом и с ломошью камеры фукса—Розенталя лодсчи• тывают
количество жизнеспособных протопластов: их должно быть не менее
200, Для окраски можно также использовать
раствор синий
Эванса (конечная концентрация
или 0,01 растзор фенасафранана.
Эти красители не окраши• ватт живые клетки,
Определение жизнеспособности протопластов по окрашивз•
фДА основано на том. что молекулы красителя легко проНиклют в
клетку через плазмалемму, в живых протопластах расщепляются
«•теразами с образованием флуоресиеииа (флуорохрохагический тест).
флуоресцеин накапливается внутри протопластов с антактными
мембранами, Благодаря возбуждению накопленного флуоресненна
жизнеспособные протопласты становятся различимыми по зеленому
свечению в люминесцентном микроскопе.
Для определения жизнеспособности протопластов смешива• ют
раине объемы суспензии протопластов и разбавленного раствора ФЛА.
Разбавленный раствор Готовят. добавляя одну каплю исходного
хранящегося раствора к 10 мл среды выделе20
19
Ния протопластов. Через 5 мкн анализируют лод флуоресцент-
ным микроскопом окрашенную суспензию протопластов.
Оформление работы. Рассчитайте процент жизнеспособных
протопластов от их общего количества. Зарисуйте внешний вид
протопластов.
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
Бергельсон Л, Д Мембраны. молекулы. Клетки, М.. 1982.
Де Дюв К. Пујешестзие з мир живой клетки. М., 1987,
Гэлсгон А- Детс (>rrep Р, Жизнь *леного растения. М. 1983.
Камил Н. Дзаженае протоплазмы, ЛТ_ 1962,
Палевой В. В. фюио.-:огин растений. М. l9•S9.
Силаматова Т. С. фюлолпгдя рзстнтельиой Клетка. Л.. 1983.
Л S MicrotubuIes, The су1о4е1е{оп [п plant growth develop. Acad. рте“.
l.rviit Hesponse [0 enyironmental St:ess, Che11i1tg. freezing high tempe:ature
stresses, Ac*d, press.. Х.-У_, 1980, V01.
пп С. У., (Леп у. М.. Кеу 1, L, Soh1te 1&kage ir: Soybean seedlin ип"ег va,-ious hezt
shock
— Р1ап1 Се] Physi01„ 1985. VQl. 26. Р. 493—
aS з hasic mechanism movement in апјпа1ч aad plantg.
Physiology of movements, Encyclopedia ог р1ап\ physio'ogy. Наг
1979. vo:. 7.
последовательность биохимических реакций, конечным проявлением
которых является изменение морфологии н (или) физиологии ткани
или органа. Например, ауксан подавляет рост
22
Раздел l l
РОСТ И РАЗВИТИЕ РАСТЕНИИ
Развитие организма представляет собой процесс реализации
генетической информации, имеющейся в зиготе. и ЗКЛЮчаег стО
новленне
многоклеточностп,
дифференциацию
клеточных
комплексов в многоклеточной системе их последовательные
морфогенетические изменения.
Процесс развития подразделяют на следующие этапы:
формарование зародыша, превращение его в юзеннльвое растенне„
образование взрослого растения. которое может переходить к
генеративной стадив (этот этап завершается формированием половых
клеток— еимет, сливающихся при оплодотворении с образованием
змхљты). У однолет растений далее следуют процессы старения м
гибели организма, У многолетних структур& отдельных эталон
развития сложнее: они протекают более лрололжительное время. и
лерехол в генератив .ую фазу развитая осуществляется многократно
ла протяжении жизни растения,
Программа развития организма включает большое число
относите."ьно автономных подпрограмм, например формирование
листа, корни, цветка и т, д. Реализацию от;щмьных взятых
подпрограмм можно наблюдать в опытах ло культуре тканей и
оргамов, а также в естественных условиях „в лрощессе вегетативного
размножения с помощью черенков ила листьев. в случае
«живорождения», например у бриофаллюма, и др.
рост представляет собой одну из составляющих процесса
развития а проявляется в необратимом узеличелиа размеров и массы
клетки, органа или всего организма, которое связано с
новообразованием элементов их структур,
Каждый переход от одного этапа к друтму, а также про. цесс
развития з целом контролируются факторами внешней среды, одним
из которых является свет (например, светозависн• мая индуклия
генеративного развития). н внутренними факторами, в первую
очередь фитогормонамњ
Фитогормоны — относительно низкомолекулярные орга нические
соединения природного происхождения, запускающие сложкую
„боковых почек, влияет на ориентацию боковых побегов,
процес корнеобразования. Цитокнннн индуцирует образование
стеблевых Почек, тормозит образование боковых корней. стимулн•
рует рост листьев, семядолей. Цитокиннн и абсцизовая кислота
(АБК) регулируют изменение шарнны устьичной щели: АБК
закрывает устьица, цитокинин открывает их, Как правило,
фитогормоны образуются в одних клетках или тканях, а действу з
других, причем в очень низких концентрациях
10—10 М).
Однако они морут действовать и н той ткана, где синтезируются. В
регуляции того или иного физиологического лро• цесса участвует
несколько типов гормонов (как в рассмотренном примере с
устьицами).
Фито:тјрмокь! влияют ла клетки, которые обладают компе
тенгностью к ним. Компетентность, т, е. способность специфиче ски
отвечать на воздействие гормона, определяется прежде зсе• го
наличием клетках рецепторов фитогормонов. Предполаса. ют, что
первый этал взаимодействия гормона с кликой включает
образованне гормонрецепторного комплекса. Выделение н
исследование
ределторов
фитогормонов
и
определение
функциональноЙ роли гормонрецелторного комплекса составляют в
ластоящее время одно аз наиболее актуальных направлений в
изуЧенни механизма действия гормонов.
регулирующее действие гормонов может быть продемонстрн•
розано в опытах по культивированию клеток, тканей и органов на
Искусственных питательных средах. Исполызуя разные ko\I•
бинации гормонов и варьируя их концентрации, можно заставить
соматическую клетку реализовать программу развития зиготы с
образованием зародышелодобной структуры, которая разовьется ао
взрослое растение: можно также вызвать образованне отдельных
органов (корней, цветков и т, д.) либо отдельных тканей, например
ксилемных элементов.
Развитие— ауорегулируемый процесс реализаиии генетическоЙ
информации. Однако морфогенез у растений очень пластиЧен, что создает основу для их адаптации к изменениям усло•
окружающей среды широком диапазоне. Важную роль в
формировании способности растительного организма к адаптацин
играют фитогормоны. Именно они осуществляют коорди• надаю н
интеграцию физиологических и морфогенетических функций
растения, обеспечивая существование организма как целого,
ЗАДАЧА 1. Фитогормоны
В настоящее время выдемяют шесть грулл фитогормонов.
1. Ауксины. Основной природный аукснм — индолил-3-ук•
сусная кислота.
2. Гиббереллины. В растениях встречается большое количество
близкородственных соединений (около 70) , относящихся к
23
классу дитерпенов. Разлњчные гиббереллины обозначаются
соКращением ГК с соответствующим индексом,
3. Цитокннинц. Производные 6-амннопурина с замещением в
аминогруппе при 6-м углеродном атоме пуринового кольца. Природные
цитокиннны — зеатен, его аналоги и производные.
4, Абсци.зовая кислота (АВК). Оптически активный
сесквитерпеноил. В растениях содержится в основном (+) —
2•дисЛБК.
5. Этилен.
6. Брассины. Гормоны стероидного типа.
роле. ряда других биологически активных веществ
растительного происхождения еще мало изучена н вполне
вероятное что они смогут дополнить Слисок фитогормонов. Ниже
перечислены общие черты Действия фитогормонов (Кулаева, ,
1.
Каждый из фитогормонов полифункционален, т. е.
участ-вует в регуляции многих фазиологическах процессов у расте-
2.
Характер действия каждого фитјгормона зависит от
специфнкн как гормона, так и объекта.
3, В регулянИи одного н того же физиологического Процесса
может принимать участке не один, а несколько гормонов, т, е.
система гормональной регуляции жизнедеятельности растений
многокомпонентна.
Фитогормоны а отличие от веществ субстратного действия
влияют на все стороны метаболизма клетки, регулируют протеканне
в ней физиологических процессов, интегрирующих в себе многие
биохимические, биофизические и структурные измененая.
З. Действие фитогормонов Находится в строгой зависимостЊ
от их концентрации.
6.
Действие
фитогормонов
проявляется
в
тесном
взаимодей
с факторами питания н зависит от условий, в
которых находится растение,
Гормональную систему растений можно изучать различны— ми
способами. например, использовать меченые гормоны и следить за
Их превращениями внутри организма. Количество
состав
фитогормонов
в
растительном
материале
определяют
биохимическими методами с применением спектрофотометрнн.
газовой или ж вдкостной хроматографии в сочетании е
массспектрометрией.
В
последнее
время
для
изу'ении
фитогормонов, их действия и обмена успешно исптльзуют
иммунохимические методы.
В то же время классическим способом изуения фитогормонов,
не потерявшим значение н сегодня, являются различные
биологические методы (биотесты). которые Позволяют оценить
количество гормона ло его физиологическому действию. Биоте• сты
обычно не требуо•г сложной аппаратуры, обладают высокой
чувствительностью. однако не все они достаточно специфичны,
Например, биотестом на ауксины является рост отрезков
колеоптилей злаков, на цитокянины — рост этиолированных
листьев
24
фасоли. семядолей тыквы ила индукция цитокинннами деления
клеток в культуре каллусов сердцевины табака, семядолей сои или
флоэмы моркови, на гиббереллины — рост карликовых мутанов
кукурузы или гороха н т. д.
РАБОТА 1. ВЛИЯНИЕ Фитогормонов
изолировднных СЕМЯДОЛГП тыквы
НА
МЕТАБОЛИЗМ
Прорастание семян сопровождается активизацией в них
метаболизма, В семядолях при прорастании происходит актива. цин и
новообразование ферментных систем, необходимых как для
обеспечения использования запасных веществ, так и для
превращения семядолей из запасающего органа в зеленый лист. Этн
процессы протекают под контролем осевых частхй зародыШа.
Большая роль в этом контроле принадлежит фитогормонам
(интегративная функиня). При прорастаннн семян фитогормо• ны
лостулают в семядоли из осевых частей зародыша и влияют на
развитие активности ферментов, участвующих в распаде запасных
веществ, Образующиеся при этом продукты распада поступают в
осевые часта зародыша и обеслечиваот их ' рост.
Высокой чувствительностью к экзогенным фитогормонам
облалают изолированные семядоли ттыкны, так как после изоляции в
них происходит быстрое истощение запаса эндогенных горМонов.
В работах О Н. Кулаевой л сотрудников (1975. 1977. 1982)
было показано, Что экзогенный цитокинин значительно активизнрует
рост семядолей. При этом влияние интокинина распространяется на
все стороны формирования внутриклеточных структур и обмен
веществ семядолей, Цнтокиннн резко ускоряет ас. пользование в
клетках семядолей заласных веществ, ускоряет н усиливает
формирование мембранного аппарата хлоропла• стон— гран н
ламелл стромы. рост хлоропластов и их деление. Цитокинин
стимулирует формирование митохондрнального аппарата клеток
семядолей, развитие эндоплазматического ретиКулума (в основном
шероховатого)
В соответствии с активизалией роста семядолей и процессов
внутриклеточной дифференгтиацаи, связанной с их превращением н
зеленый лист, цитокиннны запускают в семядолях синтез самых
разных ферментов, необходимых для развертывания указанных
физиологических программ. Цитокинин увеличивает в семядолях
активность энлппептилазы, участвующей в гидролизе белков,
щелочной и кислой пирофосфатаз, которые разрушают пирофосфат,
образующийся при синтезе различных биополиме• ров. Н тем самым
способствуют протеканию этих синтезов. Ци• Токиннн активирует
малик-энзим, участвующий в обмене орга• нических кислот. и
рнбулезобасфосфаткарбпксилазу — ключевой фермент фотосинтеза.
Инклогексимнд (имгибнтор синтеза белка на цитоплазматических
рибосомах) подавляет вызванный
25
рис. 2, Профили седиментации градиенте концеприцин сахарозы) рибосо• семядолей
тыквы. находившихся в различном физиологическом состоянии (по. О, Н, Кулаевой.
1982): 1— семядоли сухих семян, П— семядоли, изолиро• ванные из 4-дкеанзх
этиолированных проростков. Ш — семялгп“.и после 48 ч инкубатџти в темноте на
воде, —то же. (43•10—• с Послед МЗ; юШНМ переносом из З
п раствор
М— моносомы
цитокинином рост активности ферментов. Следовательно, этот
процесс связан с синтезом белка. Ферменты по степени их активацаа
цитокиннном можно разделить на две груллы: одна По своему ответу
на фитогормон коррелирует с ростом семядо• лей, другая —с
накоплением в ших хлорофилла. ферменты пер• вой группы более
тесно связаны с программой роста, второй— с биохимической
дифференциацией хлоропластов.
Латокинин стимулирует синтез белка в клетках, действуя на
разных уровнях этого лроаесса. Гормон активирует синтез РНК,
увеличивает число рибосом л клетке, Повышает их активность в
синтезе белка. значительно увеличивает долю полисом в преларате
рибосом (рис. 2).
Антагонистом цитокинина во всех описанных выше процессах
является АВК, Ока прекращает рост изолированных семядолей
тыквы, ингибируя как рост клеток. так н ну. деление, подавляет
прошессн внутриклеточной дифферештнапнн, формнро— взние
мембранного аппарата хлоропластов, угнетает синтет ферментов,
связанных как с ростом семядолей. так и с диффе— рендаанией в
них хлоропластов. Между АВК а цитокиннном проявляется четкий
антагонизм: интокинин снижает ингибиру• Ющее действие АВК,
АБК аодавляет вызванную щитокакином стимуляцию
процессов.
Угнетение синтеза белка в изолированных семядолях тыквы: лод
действием АБК происходит как за счет подавления синтеза РНК, так
н путем торможеная формирования полисом. АВК
тормозит синтез хлорофилла. действуя ла образование и трансПорт
б•амиуолезулиповой Кислоты н нз ферменты, участвующне• в ее
синтезе. Действие и цитокинана, и АВК, как любого фитогормона, зависит от их концентрации.
Цель работы, Определять влияние фитогормонов: б•бензн—
ламинолурина (б.БАП) и АВК— на рост семядолей, количест“
26
„во хлорофилла. проницаемость клеточных мембран, активность
ферментов (амилазы и малик-энзима) в изолированных семядолях
тыквы.
Реактивн в оборудование: б•БАП в кориентращинх 10 я 100 мг[л; АВК
В концентрапия ег!л; С.зС.О,: гаствор 91 анода; М 0 • буфер. РН 7.4;
свежеприготовленный 1 % „Й раствор крахн•х• е О, ао фатом буфе;.е; 35динитросадиииловая кислота (пригото•ленле см. в дажеињи 1); 50 мм триг•НО
буфер. РН 75. содержащий 5 мм дитиотрейтола (ДТТ); реакпионная смесь для
опрелеления активносјя малак-знзнма. содержащая 50 мм трас•НС1 буфер, РН 7,5; 2
мм раствор ДЛ; 5 мм раствор MzC1,: 003 мм раствор НАДФ; мм расавор яблочной
кислоты: ступс пестиками; стеклянный фильтр № З: мерные колбы объемом 25 мл:
цп• днидры обымоу 25 мл; колба Бунзена; стеклянные б»к• сы объемом 20 мл;
центрифужные пробои: мерные пробирки обы•моц 10 мл; чалгки Петр“; све до
(пробковое) дизуезром 0,5 см; флотермока•
•мера с Температурой
и освещенностью 750 лк; вакуумный илН водо„струйный
насос; термостаты с шемаературой 25 и 37' С; водяная баня с температурой 100' С;
Технические весы: торсионные весы; пентгафужные н• . св. центрифуга:
спектрофотометр: кондуктометр: ФЭК: колодная камера.
Объекв иссдедования: изолированные Семядоли ТНКвЫ. СОРТ Мозолев-
Подготовка растительного материала
Семена тыквы проращивают в Течение 96 ч на влажной
• фильтровальной бумаге в темноте при температуре 25' С, затем
, отделяют семядоли от растения и помещают в чашку Петри на
,воду, ставят чашку в термостат при температуре 253 С. В
изолированных семядолях в темноте происходит быстрое истощение
эндогенных гормонов. Через 24 ч семядоли переносят на
Исследуемые растворы помещают в фототермока меру ПРЯ
Температуре 28' С и круглосуточном освещении на 48 Ч.
Исследуемые растворы: контроль— дистиллированная вода; АВК—
1 мг(л; б-БХП — 10 мг!.л; 6-БАП — 100 мг!л,
опыт определгннг РОСТА семядолгг
Развитие семядолей представляет собой процесс, в течение
:которого одновременно идет новообразование структурных
элементов клетки м расходование ее запасных веществ. Сухая мас' са
при этом практически не меняется. В связа с этим рост изо,
лированных семядолей тыквы удобно определять По изменению НХ
сырой массы.
Ход работы. Взвешивают на технических весах все семядоли
каждого зарианта. подсчитывают их количество н определяют
среднюю массу каждой семядоли,
опыт определение
хлорофиллА в семядолях
Ход работы. Навеску семядолей (200 мг) растирают в стулхе с
небольшим количеством леска и (на кончике скальЛеля).
экстрагируют пигменты раствором этанола, фильтруют экстракт
через стеклянный фильтр и доводят объем в мерной колбе до 25 мл.
Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре i=6G2 и 642
нм. Количество хлорофилла (а и Ь) определяот По формуле
мг;л.
Пересчитывают количество хлорофилла на 1 г сырой мас-
опыт З. ОПРЕДЕЛЕНИЕ проницАЕ,мости КЛЕТОЧНЫХ МЕМЕРАН
Ход работы. Сверлом вырезают 60 дисков из семядолей каждого
варианта, помещают по десять Лисков в бюкс, который закрывают
марлей. Последнюю закрепляют резинкой и ставят боксы под
холодную водопроводную воду на 15 млн, чтобы отмыть
содержимое разрушенных клеток. После этого бюксы с дисками
промывают 3 раза дистиллированной водой н перево• рачивают на
чистую фильтровальную бумагу для удаления остатков воды. Затем
с них снимают марлю, наливают по
дистиллированной воды,
закрывают крышками н помещают Три бюкса в термостат гол
температуре С из ч. Для опреде• ления общего количества
электролитов в дисках три других бюкса помещают в кипящую
водяную баню на 15 мин. После инкубации содержимое бюксов
фильтруют через марлю в
стые бюксы, остужают фильтраты до
комнатной температуры и определяют их электропроводность
кондуктометрическим методом. Рассчитывают выход электролитов
в каждом варианте процентах от общего их количества.
опыт 4, ОПРЕДЕЛЕНИЕ Активности
Малик.энзим осуществляет лекагбоксилированне малата в
присутствие 1 ЛДФ и ионов .Mg2+ с образованием лигувата
восстановленного НАДО):
НАДФ. М;'+
Малат
П ируват
Фермент играет важную роль в регуляции уровня малатз
обеспечении НАДФ.Н многих биосинтетических процессов в
клетке.
Активность фермента Не обнаруживают в сухих семенах, она
появляется при их прорастании.
Ход работы. Взвешивают ло пять семядолей каждого варианта,
растирают Их в ступке с небольшим количеством песка,
гомогенизируют в 5 мл раствора
буфера с ДТТ. Работу
проводят в холодной камере при температуре 2—1' С. Гомогенат
центрифугируют 30 мин пра 20 000 g; лолученныЙ сулернатакт
используют для определения ферментативной ак28
тивности. Для этого к 0,2 мл реакционной смеси приливают
мл
раствора фермента. Реакцию начинают прибавлением 2,5 мм малата.
В контрольную кювету помещают те же реактины, кроме малата.
Измеряют оптическую плотность раствора последовательно з одних и
тех же кюветах через каждую мннуту в течение 5—7 мин при —340
нм,
За единицу активности фермента принам,тот количество
фермента, которое вызывает увеличение оптической плотности
раствора на 0.01 за 1 мин, За удельную ферментативную эк. тивность
принимают количество фермента, которое вызывает увеличение
оптической плотности раствора на 0,01 за 1 Мин на мг белка.
Определение количества белка см. выше (разд. 1, задача 1 , работа 3).
Активность фермента рассчитывают для каждого варианта.
опыт ь ОПРЕДЕЛЕНИЕ Активности
Ход работы. Навеску (1 г) семядолей тыквы измельчают и
растирают охлажденной ступке на оду, К гомогецату пгн. ливают 40
мл фосфатного буфера и центрифугируют 15 мин при 10000g или
фильтруют через плотный складчатый фильтр. Надосадочную
жидкость илн фильтрат сливают в чистую пробирку и используют
для определения активности фермента.
В результате действия Р-амилазы ма крахмал образуются
главным образом мальтоза а незначительное количество
высокомолекулярннх декстранов. Последние в дальнейшем
гидролизуются и-амиллзоП, Мальтоза лги взаимодействии с З, 5•ди•
Нитросалицнлоной кислотой (ДПС) дает окраску, которая находится
в прямой зависимости от содержания сахара,
Огттамальная температура действия фермента 370 С поэтому
исследуемую вытяжку и раствор крахмала предварительно
термостлгируют при мгой температуре. Для определения актив•
ности фермента проводят следующие варианты подготовки. 0.5
”Ракмала;
2. Контроль: 0,5 мл буфера; 0,5 мл вытяжки; мл ДПС.
З. Опыт: 0,5 мл 1 раствора крахмала; 0,5 мл вытяжки; смесь
перемешивают и помешают в термостат при 370 С на 5 мин, затем
сразу лрнлива:от мл ДПС.
Все пробирки нагревают на кипящей водяной бане 5 мин, затем
объем доводят до 10 мл водой, ()лгическую ллотность опГеделяот
при Х —535 нм. Количество мальтозы зычнс„зяют по
калибровочной кривой. Активность фермента выражают в
миллиграммах мальтозы ца 1 г сырой массы за Ман,
Оформление работы. Данные всех опытов представьте в виде
сводной таблицы. Сделайте выводы. 29
Таблица
ср ЬАП
Сырая
доли. г
масса
в.ьхп.
АПК.
семя.
Количество хлороф лла,
мг,'г снрой массы
Пр ониа•емосп, клеточ•
них меубран. о: лолного
выхода эх,кгрсми•
Активность
иялик•Эн•
зима. ед. НЗ 1 г сырой
Массы или 1 мг белка
Актинкость амилаз, мт
Мальтозн на 1 г сырой
массы за мин
РАБОТА
2.
ВЛИЯНИГ АУКСИНОВ
КОЛЕОПТИЛГП ЗЛАКОВ
НА
рост
ОТРЕЗКОВ
Среди многочисленных эффектов, которые вызывают ауксн• ны,
наиболее изученным является их действие на рост растяжеНием у
отрезков колеоптилей или стеблей. что и используют как
чувстлительный биотест на этот гормон. Установлено, что ауксины
вызывают выделение ионов Н+ из клетки, гипер поляризацию
мембра иного потенинала, усиление поглощения К+, Понншение
РН цитоплазмы, накопление Малата или лругнх орГанических
кислот.
Во время растяжения в клетке появляется центральная вакуоль.
занимающая 56льшую часть ее объема. Образование вакупли
связано с увеличением поступления воды яра Понижении водного
потенциала клетки, пра этом осмотический потенциал
поддерживается на постоянном уровне в результате гидролиза
полимеров н накопления в клетке осмотически активных
ществ.
Потенциал давления снижается, так как лод влиянием ауксина
увеличивается растяжимость клеточной стенки.
Ряд исследователей объясняют действие ауксина на рост
Подкислением клеточных стенок. Эго приводит к разрушению
кис*отолаби.льных связей компонентов стенки активации кислых
гидролитических ферментов, также разрыхляющих клеточную
стенку. Такое представление подтверждают факты выброса ГР в
окружающую среду под влиянием ауксина и существования так
называемого «кислого роста». Последний представляет собой рост
отрезков растений в кислом буфере. Однако имеется ряд различий
между ростом растяжением, индуцируе• мгь•м ауксином и кислыми
средами. Прежде всего различна кн, нетика роста (рис, З). Имеются
а другие отличия этих двух типов роста.
30
Ауксинзависимый рост
связан с синтезом рНК
белков. Ингибиторы
синтеза этих веществ
устраняют депсгвие
ауксина на рост клеток.
Особое значение имеет
продолжительность
лаг-пернода действия
ауксина на синтез РНК и
происходит в течение
10 мин после действия ауксила, т. е. этот процесс про.
текзет з течение лаг•фазы
ауксининдуцируемого роста.
Рис, З, Влияние индолилуксусной кисету
тн и цитратногосфатного буфера
ни скорость роста
талей (По И. Е. Шаровой, В. В. Поленому,
1985): — концентрация 10 «мл,
2— концентрация 1,5 ммпль/л. РН 32
белка. В ряде работ показано.
что образование определенных
м!) НК
Таким образом полтвержда• ется точка зрения, что первичным
действием ауксина может быть активация генов.
Действие ауксина на рост уже на первых этапах включает
Механизм восстановления клеточных стенок, что отличает его от
«кислого роста» (Полевой, 1982),
Действие ауксина, как и других фитогормонов, зависит от
концентрации.
Увеличение
ауксина
выше
оптимальмоЙ приводит к замедлению роста. [Тл некоторых объектах
показано, что увеличение количества ауксина стимулирует
образование этилена, который вызывает задержку роста в длину.
Цель работы. Изучить влияние ауксинов на рост отрезков
колеоптилей.
Реактивы и оборудование: 5 мм калийфосфатны> буфер, РН 6,0; раст— вор
р•индолилуксусной ккготн МУК) кислоты (2.4 5 УМ калийфосфзгном буфере. ГН
6.0 в концентрация
уг/л; лезвия; чашки Пет Стеклянные ка1илляры: «ло.
— узкие стеклянные кюветы,
Объект исследованни: отрезки кодеоптидей пшеницы (овса, кукурузы) В фазе
растяжения.
Ход работы. Выбирают проростки пшеницы (выращенной в
темноте в течение трех дней) одного размера, отделяют колеоп• тили
(нужно брать только цепне колеоптила). укладывают их на линейку
н отрезают лезвием сегмент длиной 5 мм, отступая от верхушки 4
мм. Из отрезки колеоптнля капилляром удаляют первичный лист и
помещают отрезок в чашку Петри с водой. Набрав достаточное
количество отрезков. нанизыват их по 5 на стеклянный капилляр и
налева:от на кончики капилляра шарики из пластилина (чтобы
удержать отрезки на калилляре).
Приготавливают набор концентраций ауксина (100. 20. 10. 5, 1,
мг,'л) на калийфосфатном буфере. КонтрольныЙ буфер не содержит
ауксина. Измеряют на капилляре длину всех
31
отрезков колеоптилей, сложенных вместе, записывают и
поме„щакуг капилляр в лодочку с олределенной концентрацией
ауксина. Лодочку ставят в термостат с температурой 2,5' С и
отмечают время. Через 2,5—3 ч с помощью пинцета вынимают
ка,пллляр и измеряют длину динамики всех отрезков роста
колеолгилей,отрезков колеоптилей Для определения злаков под
влиянием ауксинов проводят измерения прироста через каждые 10
мин в течение 60—80 мин, Чувствительность метода повышается,
если прирост отрезков измерять в аппарате для чтения
микрофильмов Полученные с увеличением результаты в lfi
раз.занесите в табОформление работы. лицу. Сделайте выводы.
При определении динамики роста отрезков колеоптилей
постройте график зависимости скорости роста от времени при
оптимальной концентрации ауксина.
Таблица 5
ау
а,
прирост
р НК. Действительно, ингибиторы синтеза РНК „подавляют синтез
(!-амилазы, индуцируемый ГК в алейроновых клетках. Опыты,
которые проводили на бесклеточной системе синтеза белка с
использованием мРНК, образованной лод влиянием ГК в качестве
матрицы показали, что вновь синтезируемый белок — срамилаза„
Кроме действия на синтез белков и р НК ГК вызывает
изменение ультраструктуры клеток алейронового слоя. В
присутстваи
эндогенного
или
экзогенного
гиббереллина
происходит леренарлвание белкового материала алейроновых
зернах, быстрая активация синтеза фосфолипидов мембран, общего
синтеза мембран. особенно шероховатого эндоплазматического
ретику ј1ума (ЭР), возрастает доля связанных с ЭР рибосом,
стимулируется образование секреторных пузырьков.
Цель работы. Определить влияние Г Кз на активность
гидродитических ферментов в зерновых злаках,
Объект исследования: зерновки лшенищы„ ячменя, овса,
Пр ир
ИННУ.
РАБОТА З. ВЛИЯНИЕ ГИББЕРЕЛЛИНА НА Активность
ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ В згрновклх ЗЛАКОВ
Одной из наиболее изученных реакций растения на гиббере.лллн
является инДукция гиДролитических ферментов з семенах злаков. В
1960 г. впервые было показано, что после набухания зерен злаков,
через 12—24 ч, зародыш начинает выделять тиббереллины, ГК,
которые диффундируют в алейроновый слоЙ.
Там они индуцируют синтез или активируют гидролитические
ферменты (и-амилазу, РНКазу, кислую фосфатазу, протеазу и др.) н
стимулируют секрецию этих ферментов в эндосперм, где
происходит распад запасных лолимеров. Растворимые продук• ты
распада поступают затем для литания зародыша, При уда.лении
зародыша из семян индукции ферментов не наблюдается.
Обработка таких беззародышевых семян экзогенным ги55ере.л•
.лином приводит к появлению ферментативной активности,
Наиболее детально проанализирована индукция срамилазы—
фермента, гидролизирующего крахмал. С ломощью метки и
ингибиторов белкового синтеза показано, Что п- амилаза под
влиянием гиббереллина не просто переходит из неактивной формы
в активную, а синтезируется заново. Индукция ГК синтеза
фермента de novo лозволяет предположить, что механизм действия
фитогормона связан с регуляцией экспрессии генов л образованием
Подготовка растительного материала
Зерновки разрезают та половинки и отделяют сегменты с
зародышем ог сегментов без зародыша, Те а другие части зерНовки
стерилизуют 5 %-раствором гипохлорита кальция в течение 30 мин,
отмывают З раза стерильной водой и замачивают в стерильной
воде. Через 12 ч половинки зерновок с зародышем ломещают в
стерильные чашки Петри (в свежую дистиллированную воду),
половинки зерновок без зародыша деляг на две части, одну из
которых помещают з воду, другую— в водный раствор ГКз в
концентрации 25 мг [л. раствор стерилизуют, пропуская через
миллзпоровый фильтр (0,22 мкм). Все варианты ставят в термостат
при температуре 26' С, Время инкубации 24 и 48 ч.
Реактивы и оборудование; 50 мм натрийацетатжый буфер, РН 3.3,
содержащий 20 мм CaCl,; свежелриготовленный растзпр крахмала в 50 мм
натрийащетатном буфере. РН 5,3; лоткисг,енный раствор l,kl (90 мг и 1.59 г
растваряот а 400 мл 0,26 н. НС[); раствор атара, спдер• Жиший 1 расгвгримгго
крахмала; 10%-й водный раствор 12kI (пригоТозление см, в Приложении ступка с
сплиндр объемом 25 мл; центрифужные пробирки; чашки Петри; стеклянные
лргблрки; пиле гни; те Мостаты с температурой 70 37 0 С; водяная баня с
температурой
центрифуга тала ЦУМ-1; ФЭК или мектрофотометр,
Ход работы. Работу можно проводить в двух вариантах.
Вариант 1. Пять лоловннок семян пшеницы взвешивают, растирают
в охлажденной ступке на льду, постеленно прибавляя 10 мл
натрийадетатного буфера, содержащего CaC12. Гомогенаг
центрифугируют при 10 000g в течение 10 мин, Супернатант
с.мвают в колбу и помещают на 15 мин в термостат лри 703 С, затем
охлаждают в течение 10 мин при 4' С, Эта процедура подавляет
активность Р-амилазы и мало влияет на активность (1-амилазы, так
как последняя более термоустойчива, После этой обработки
супернатант центрифугируют вторично при
10000g в течение мин
Активность а-амилазы определяют по гидролизу крахмала.
Для этого 2 мл раствора крахмала в натрийацетатном б\'фере
разливают в контрольные и опытные пробирки, помещают их в
термостат с температурой 37' С ка 10 мин, затем прибавляют 0,5 мл
надосадочной жидкости в опытные пробирки и 0,5 мл
натриПацетатного буфера в контрольные пробирки. Через 15 мин
реакцию останавливают, прибавляя 2 мл подкисленного раствора
I:kl, добавляют 10 мл воды и определяют оптическую плот. кость
растворов при 7-—520 нм.
Оформление результатов. Расечппайте активность фермента
в величинах нзмеиенпя оптической плотности за мин на 1 г сырой
Массы. Результатн оформите в таблицу. Сделайте выво— Таблица б
Без ордыша
11,0
24
48
48
Вариант 2. Приготавл«вают 1 % •Й водный раствор агара иI % -Й
водный раствор агара, содержащий 106 растворимогокрахмала. Для
этого добавляют агар н крахмал в воду, нагреватт и кипятят до полного растворения агара_ По З «л теплого
раствора агара наливают в чашки Петри диаметром 3,5 мд—
Схем. ныта
Агар без крахмалаГК,
промывают водой. Выход амилазы из клеток вызывает гидролиз
крахмала в среде. что определяют по присутстзию чистых круглых
зон вокруг сегментов зернозок_ В от. сутствие амилазы чашки
окрашены равномерно в синий цвет. В чашках без субстрата (агар
без крахмала) окраска отсут— ствует.
34
Оформление работы. Зарисуйте наблюдаемую в чашках кар.
тину после их обработки раствором Йода, Сравните опытные и
контрольные варианты. Сделайте выводы,
ЗАДАЧА 2- метод культуры КЛЕТОК И ТКАНЕВ высших
РАСТЕНИИ
Растительный организм, существующий как шелое, объединяет
множество клеток. Интеграция клеток в организм обеспечивается
благодаря
действию
сложных
механизмов.
включающих
межклеточные взаимодействия и форм нрозан1.е единой системы
метаболических потоков. В то Же время клетки растений
потенциально способны к выполнению разнообразных про. грамм
дифференциации. представленных в их Геноме. Эту особенн(хть
растительных Клеток обозначают термином омнипотентность, л
реализлди:о одной клеткой программы знгогн называОт
тотапотентностью. Тотилотемуносуь клеток лежит в ое нове
высокой пластичности морфогенетических процессов у растений.
которая Проявляется. в частности, При нх вегетативном
азмноженнн. Это свойство обнаруживается л в условиях п viiro,
Различные варианты культивирования клеток н тканей растений на
Искусственных питательных средах представлены на рис. 4.
В культуре ir1 vitro можно поддерживать в жизнеспособном
состоянии практически люЬП изолированный орган растения или
часть органа, В одних условиях такой эксплант продолжит свое р
аза атие, в других — станет источником каллуса — бесформенной
массы пролиферирующих паренхнмных клеток. ПересаЖивая
каллус на среды с определенным соотношен нем горМонов, можно
Агар С крахяаткгку
2' ч Н,О
ч н,о ГК,
После застывания агара на его поверхность помещают лоловинкн
семян пшенипы без зародышей, инкубированные в воде или
растворе ГК. в течение 24 или 48 ч. Сегменты зерновок, ставят
срезом на агар ло 4 шт. на чашку. Чашки Петри лерено• сит в
термостат с температурой 260 С и оставляют там на 24 ч. После
инкуОаинН половинки семян даляот. а лоаерхность ч зшек заливают
lO%.M раствором на 2 мин. Затем раствор сливают н чашки
ткани
каллуса рис. 4. Варианты культивирования
начнут дифференцироваться н
клеток, тканей и огг3пов растениј
искусственных питательных средах:
будут формировать в зависи•
— суспензия клеток. П • калл с,
мости от условий различные
— изолированные органы:
Части растения (корни. побег],
протопласт;
стрелками
о(тначеиц
Цветковые почки, сосуды) ила
морфогенетические иотеации
целое растение (рис. 3).
индуцировать морфогенез:
Из любой части растения (или из каллусной ткани) с помощью
механических или ферментативных методов можно полу in чить
vitro суспензионную способны длительное клеточную время
культуру, сохранять Клетки жизнеспособ-в условиях
35
Рис. З. Типы зксаеримгптальлого клеток морфогенеча (по р. в Г, Бутенко, культуре
1975'неорганизованно
расгущлх каллусжых
ность и даже развиваться в так называемые сомагимеские
зароДыши (подобные зиготнческнм) и далее в растениярегенеранты.
Процесс дезинтеграции растите-льного организма может бить
более глубоким и включать не только разъединение клеток, но и
растворение их оболочек. Пру, угом образуются протопласты,
которые восстанавливают клеточные стенки и далее, при созДании
определенных условий, регенерируют растения,
На рис. 4 показаны различные морфогенетические взаимосвязи
между структурами различной степени дезинтеграции. Такие
структуры в физиологии растенлЙ используют для изучения
фундаментальных процессов, которые трудно вычленить в целом
растении, В то же время культивируемые клетки, органы и ткани
являются объектом биотехнологических исследований. Например,
суслензиозане культуры позволяют лрозодить отбор на
устойчивость к неблагоприятњым факторам на уровне клеток, а ме
организмов; как клетка, так и протопласты являются объектом
генетической трансформации; массовое культивирова клеток н
тканей используют для получения веществ вторичного
метаболизма; протопласты могут сливаться с образованием
соматических гибридов; культуру органов и тканей используют для
оздоровления растений; метод культуры клеток и тканей лает
возможность быстро размножить пенные растения, получить
большое количество потомков трудно размножаемых растений.
Процесс Получения культивируемых клеток состоит из
нескольких этапов.
Первый этап — предварительная стерилизация исходного
растите-льного материала, Условия обработки матгрнала варьируют
в зависимости от объекта, Хранящиеся органы (например, клубни
картофеля) промывают тшатмьно додолроводной водой, фрагменты
стебля, корня ила листа также промывают проточной
водопроводной водой н помещают в спирт (7006-й раствор. в
течение [ мни). Предварительная стерилизация семян— 60лее
длительная Процедура, зависящая от степени их загрязненмости,
Семена можно промыть в мыльной воде, в растворе
в слнрте;
некоторые семена обрабатывают гипохлоритом натрия или кальция
с последующей отмывкой стерильной водой, Все процедуры,
связанные с использованием стерилизу :оших веществ, проводят в
асептических условиях (в боксах микробиологическпгп типа или в
ламинар-боксах).
Второй этап — стерилизация. Предварительно простерилизпванные ткани или органы погружают в стерилизующий раствор.
Стерилизующий агент н время стерилизации подбирают в
зависнмости от объекта. Пра этом важно не только обеспечить
достаточную степень частоты объекта, но и сохранить егп жиз•
неспособность. Одним аз :гаиОо.тее безвредных и эффективных
агентов считается гипохлорит кальция (обычно используют
раствор, в котором концентрация активного хлора составляет
Наряду с ним применяют также растворы гипохлорига натрия м
другие 86-е, п епараты, содержащие активный хлор; растворы
сулемы О 1— 5 % -й раствор формалина: 10 06-1 раствор CUS(),;
50К„й раствор фенола; 7004-й раствор этанола и т, п, Семена могут
быть обработаны также газами (оксидом пропилена и
формальдегидом)
Третий этап— отмывание объекта от стерилизующего раствора
(постстерилнзация)_ При этом растительный материал промывают
3—4 порциями стерильной дистиллированной воды.
Четвертый этап— перенос стерильного растительного материала
на среду для индукции каллуса, Из клубня обычно вырезают маленькие диски стерильным пробковым сверлом и
скальпелем, предварите.льно срезая кожуру. Эти диски переносят
на агарнзозанную среду, Стебли и корни во время стерилизацик
разрезают На маленькие кусочки скальпелем и лосле промывки
высаживают на питательную среду Из стерильных семян
выращивают стерильные растения. [43 крупных семян после их
стерилизации могут быть выделены зародышевые корешки,
почечкн или целые зародыши для эксплантации и индукцин
каллуса,
37
Каллусы обнчно выращивают поверхностным способом на
полутвердой агари:тонанпой среде- При переносе их на жидкую
Питательную среду и культивировании на качалке рыхлый каллус
разбивается на мелкие агрегаты из клеток или отдельные клетки.
Таким способом получают суспензионные культуры.
РАБОТА 1. СТЕРИЛИЗАЦИЯ СЕМЯН И ВЫРАЩИВАНИЕ
СТЕРИЛЬНЫХ РАСТЕНИЯ
Процесс получения стерильных растений начинают с выбора и
обработки
семян,
По
степени
загрязненности
семена
классифицируют на три группы: 1 —с очень незначлтельной
заражен ностью поверхности микроорганизмамл, 2 —с
зараженностью только наружной поверхности семян: 3 —с
присутствием микроорганизмов на поверхности и внутри семени.
Первую группу легко обеззаразить любой стерилизующей
обработкой. Чаще всего это семена пшелицы. сорго, капусты.
которые могут быть так незначительно загрязнены. что для очистки
их достаточно промыть стерильной водой, Вторая группа семян
требует более тщательной поверхностной очистки с по. мощью
стерилизующих агентов, Эта группа включает латук, шпинат,
редис, томат, кукурузу, морковь и т. п. Наконец, третья группа нс
может быть очищена до тех лор, пока внутренние ткани не будут
также обеззаражены „ Это семена риса, подсолпечника, соевых
бобов, сосны и некоторые другие, Семена соспы и подсолнечника
можно простерилизовать, если удалить наружную кожуру, У
огурцов бывает загрязнена пнутренняя стоРона плотно прижатого к
семени околоплодника. Процеит семун с внутренним заражением
микроорганизмами варьирует в зависимости от вида растения,
набора семян. продолжительносги и условий их хранения,
Цель работы. Полнить стерильные семена моркови и вырастить
из них стерллг,ные растения.
реактивы и оборудование: мильный раствор; раствор К,МлО, (слабоозоны#ј;
гастзор спирта; стерильная раствсг сулемы;
рястнар гипохлорица кальция.
сохржас:нй Твин-80 (прагстомеиае см_ в Приложении грабирки (18Х200 мм).
зап№ненече. на одну треть агагазонзнной средой МС (состав среды см, в
Приложении нестерильные бюксы; лбПЭТКа; стерельные пиниети. бюкса. чаПIК7
Петра с фильтровалы ной бумагой.
Объект исследования: семена моркови Daacus caroia. сорт Нантская.
Ход работы. Семена моркови промывают мыльной водой; все
ду сливают, а семена помещают н дна бюкса л заливают расе
вором КМпО,. Бюксы должны быть целиком наполнены любым
стерилизующим раствором. Через 20 мин сливают раствор и
заливают семена раствором спирта на 1 мин, Все проиедуры с
исполюонанием стерилизующих агентов проводят в ламинар•
боксе, После обработки спиртом н один бюкс наливают раствор
сулемы, в другой — раствор хлорной извести. Бюксы закрывают
крышками. Время стерилизации в сулеме 15 мил (выдерживать
точно!), в гипохлорите кальция 30 мин. По истечении указанного
времени стерилизующие растворы сливают, наливают в бюксы
немного стерильной воды и вместе с водой переносят семена в
стерильный сухой бюкс, Затем поду слипают и палипают новую
порцию поды. Промывка водой продолжается н те. чс11ие 1 ч со
сменой воды через каждые 15 мин.
Проращивание семян можно проводить двумя способами. 1.
Семена прорастают на питательной среде, где затем продолжают
свой рост, В этом случае работу выполняют следующим образом.
Лопатку прокалила.от па ло красного калении, остужают и с ее
помощью перелосят стерильные семена (около 10 шт.) п пробирки,
содержащие агаризованную среду МС без гормонов. Пробирки с
семенами момегцают в термостат При температуре С. Через сут
проверяют чистоту посева н всхожесть семян. После прорастания
семяп пробирки переносят п термостат с освещением 400 лк и
температурой 250 С. Молодые рас:генин моркови растут до
появления второго листа в течение одного месяца со временн
посева,
2. Семена проращивают па фильтровальной бумаге, смоченной
водой. затем их переносят па питательнууо среду, Для этого
смачивают стерильной водой фильтровальную бумагу в сгерильлой
чашке Петри, затем прокаленной и остуженной лопаткой переносят
семена н чашку, размещают их болееленее равномерно, закрыла:от
чашку и герметизируют ее клейкой лентой для уменьшения
испарения, Чашку с семенами помещают з термостат при
го,млоратуре 259 С, Через 4—5 сут после прорастанин семена
стерильным пинцетом переносят в пробирки с агаризопаплой
питательной средой МС без гормонов и помещают в термостат с
освещением.
Второй способ дает возможность выращивать в пробирке
одно•два растения, обеспечивая их нормальное литанме, однако
дополнительные операции по проращиванию семяп и пересадке
растений увеличивают вероу•гнос-т'. заражения.
Оформление работы. Опишите всю процедуру получения
стерильных семян, Сравните эффективность двух способов
обработки и проращивания семян. Определите процент зараженин
м процент прорастания семян,
РАБОТА ПОЛУЧЕНИЕ кдллусов МОРКОВИ И ИХ
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ
Самые разные специализированные ткани и клетки. растеНия
при помещении их на искусственную питательную среду,
содержащую минеральные соли, сахар, витамины и гормоны,
ДеДифференцирунзгся, начинают делиться и образуют массу
каллусных клеток, Такое превращение сопровождается потерей
физиологлческого и биохимического статуса исходной ткани.
В ходе дсдифференциронки изменяются ультраструктура и
метаболизм клетки. При этом увеличивается число полисом,
39
элементов эндоплазматического ретикулума, аппарата Гольджи,
одновременно интенсифицируется синтез РНК и ДНК, изме•
няется состав белков.
В процессе дедифференцирозки клеток особую роль игратот
фитогормоны — ауксины н цитокнниаы. Если в среде
присутетвуе•г только ауксин, клетки, пройдя этап активации
теза РНК к начало синтеза ДНК, не переходят к делению, а
вместо этого через какое-то время начинают расти растяжением.
Если же н среду добавлен только цгџокинин то в клетках не
происходит активация синтеза ДНК и P[ik и также не начинается
деление. Таким образом, л клетке существует двойной
гормональный контроль делении: ауксин подготавливаег клетку к делению, которое затем запускается цитокини• ном.
Ауксин необходим для перехода специализированной
клетки из фазы (Й) в .S4&3y клеточного цикла, цитокинин — для
завершения этой фазы и прохождения последующих фаз
Ми
цитокинеза (Бутенко, 1975. 1987).
Первичный каллус, возникший на экспланте. после того как он
подрастет, переносят на свежую питательную среду. Такие
регулярные пересадки в дальнейшем дают возможность
поддержизать культуру достаточно долго.
Материал для эксплантации и получения каллуса Можно
Орать из разных частей растения, однако п каждом случае
приходится подбирать условия культивирования. Состав
некоторнх часто применяемых питательных сред приведен в Приложении
При определвгјннх услолиях н каллусах можно индуштро•
вать морфогенез с образовали ем листьев, корней, побегов,
цветков или зародышей, из которых могут развиваться целые
растения (см. рис. 5). Такой изменяя переход баланс к
фитогормонов. организованному Инициа-развитию можно
вызвать,
Иня морфогенеза сопровождается изменением типа клеточных
делений. Клетки вступают п деление внояь вновь, не переходя к
росту центры растяжением. организованной В результате
меристемы. этих процессов Они состоят закла-из
дываются
клеток. отлнчающихся от каллусных значительно меньшими
размерами, более л.лотноЙ цитоплазмой И большим
ядерноПлазменным отношен.ием (Бутенко. 1975).
Образование организованных меристем и натранление их
развития также завлсят от соотношения ауксинов и цитокининов.
Если в среде преобладают ауксины, формируются корневне
меристемы, при обратном соотношении фитогормонов
образуются стеблевые почки и побега. Ре! улиторное действие
зависит от ряда факторов, например концентраили и вида сахаров. включенных в состав среды, источника азота
и фосфатов и т. п,
Цель работы. Полушть первичный каллус из листьев и
черешков моркови. Пересадить каллус для поддержания
культуры.
40
реактивы в оборудоваиие: стерильные чашки Петри; скальпели; Нажни. цы•.
пинцеты: лопатка или ложема; банки объемом 50—150 «л, содержащие
а:аризоианиую среду МС с добавлением горцоаов (объем среды 20—40 мл).
Объект •с-сж•довании: стерильные проростки и каллус морковн Паисцз спро\а.
сорт Нантсная.
Ход работы. Работа требует стерильных условий и ее про.
[юлят я ламинар-(јоксе. Из пробирки достают стерильное растение
пинцетом и помещают его в чашку Петри, С помощью пинцета и
скальпеля или ножниц отрезают ;гнстья моркови а разрезают
черешки листьев на части, длиной ооло 1 см. Во время этой
процедурн необходимо следить за тем, чтобы руле находились Над стчнльной поверхносјыо чашки или
растением. Затем открывают баночку со средой и пинцетом
переносят на среду листья или кусочка черешков. В баночку
вносят по три экслланта. Закрывают банку обожженной крышкой
аз фольги. сверху накрызакуг целлофаном, подписывают и
помещают в термостат с освещением ЛОО лк и температуроГ' 25)
С. Через недель лроизаоднт пересадку образовавшегося каллуса на
свежую питательную среду.
Для пересадки первичного каллуса или поддержания культуры
используют лопатку, с ломощью которой каллус переносят банку
со свежей средой. На 50 мл питательной средн обычно переносит
мг каллуса, Срок переноса каллуса на свежую среду
зависит от скорости его роста; обычно эху процедуру повторяют
каждые неделы
Оформление результатов. Опишите все проделанные операЦин,
обращая внимание на характеристику объекта.
РАБОТА З, ГЛУБИННОЕ КЛГТОК
РАСТЕНИЙ (СУСПЕНЗИОННАЯ КУЛЬТУРА)
Суспензионная
культура
—
это
культура
клеток.
вытащиваемых в перемешиваемой жидкой питательной среде,
(„Пособы вьгращ•лпаиия, применяемне п микробиологии.
используют н для культивирования растительных клеток. Клетки
разных видов растений в этой культуре ведут себя сходным
образом и существенно отличаются от клеток исходной ткани.
Обычно культура состоит из отдельных клеток и агрегатов
различной велачины (от 2 до 50 клеток более).
В суспензионной культуре моркови встречаются следуюн(ие
типы клеток: (к]иночные растянувшиеся клетки. част „изогнутой
формы, содержащие огромную вакуоль и пристеночный слой
цитоплазмы с крупным ядром; клетки меньшего размера,
округлые или овальные. в той или иной степени вакуолизиро•
ванные, с более плотной цитоплазмой, одиночные или деЛящиеся
и образующие агрегаты. Степень агрегированности Клеток з
суспензии зависит от условий культивирования.
Для
суспензии клеток кусочки каллуса Лереносят с
полутвердой средн в жидкую и культивируют при
перемешиВанин на качалке со скоростью 90—120 об/мин.
Кривая роста клеток в
культуре имеет S•06pa3ay10
форму (рис. 6). В начале
кыльтивироаания при резком
изменении условий существования клетки испытывают
стресс.
В
этот
момент
наблюдают резкое усиление
дыхания,
Затем
наступает
лагфаза,
которую
рассматривают
как
адаптационную к но вым условиям роста. Ее
Время
длительность зависит от
обт,ема
и
состояния
инокулюма, а также условий
Рис. 6, Кривая раста клеток в куль
туре: — ларфаза, 2— экслонеиии• культивирования. В этот пеальная фаза, З — фаза замедления
риод клетки активно меняют
РН среды до оптимального
для
данной культуры; они
хар актер изуются высокой
интенсивностью дыхания, высоким энергетическим уровнем,
активно синтезируют ДНК, РНК и белки. Митотический индекс
оста, 4 —стадионарная фаза, 5—
аза отмирания популяпии клеток
низкий. Максимальный экспоненциальной рост клеточной фазе,
когда популяции мжтотическая происходит ак-в
следующей
тивность достигает наибольшей величины. Удельная скорость
роста снижается при переходе в следующую фазу— замедлечия
роста, В это время уменьшается интенсивность дыхания.
увеличивается синтез веществ вторичного метаболизма, возрастает
РН культуральной жидкости. Часть клеток дифференцируется,
увеличивается число крупных вакуолизированных клеток. Затем
наступает стационарная фаза, когда деградация клеток и их
образование происходят с одинаковой скоростью и, наконец,
следует фаза отмирания популяции клеток (Липский, 1981;
Бутенко. !987).
Основные требования Для роста и поддержания культуры
следующие: постоянные температура, режим перемешивания и аэрац
период субкультивирования, количество и физиоло- гическое состоя
инокулюма_ Для большинства культур необходима температура 20—
С, скорость качаний 90— 130 об/мин, период субкультивирования 1
14 сут (в зависимости от объекта и скорости его роста). Минимальн
отъем инокулюма, необходимый для роста культуры, зависит от ви• да
объекта, фазы роста и состава культуральной среды, При использовании
слишком большого объема инокулюма рост клеток может быть угнетен
муза недостатка субстратов или накопления токсических продуктов
обмена. Для суспензионной культуры моркови оптимальная
концентрация Х 105 клеток/м.л.
Цель работы. Полущить и субкультжвировать суспензионную
жультуру клеток моркови.
реактивы и оборудование: стерильные колбы со средой МС. содержащей
гормоны. Объем среды составляет ст Объема кплПи. Лтшатка или ложечка,
42
пинцет; стеоильаьзс пипетки объемом 5—10 мл; стерильные ши, ландрЫ
объемом 10—20 и мл; воронки; сита с диаметром лар 500 мкм,
Объект исследовании: каллус и суспензионная культура моркови Daucws carota,
сорт итская,
Ход работы. Работу проводят в асептических условиях. Для
получения первичной суспензии кусочки каллуса переносят
прокаленной и остуженной лопаткой в колбу с жидкой средой МС:
1—3 г ткани на 50—100 мл среды, Используют только молодой,
активно растущий, светлый каллус, отбрасывая Побуревшие старые
ущастки, Рыхлые каллусы легче переводятся в суспензионную
культуру, чем плотные. Плотную каллуснуо ткань предварительно
разделяют ма небольшие кусочки диа метром 3—4 мм. Колбу
после переноса каллуса закрывают предварительно обожженной
крышкой из фольги, крышкой из целлофана, подписывают м
помещают на качалку с темпе- ратурой 260 С, скоростью
перемешивания 120 об/мин, при освещенности 700 лк. Если в
течение первых нескольких суток среда становится мутной, это
признак бактериального зара• жения во время инокуляции,
Первичную суспензию обычно культивируют 7—10 сут и
перед пересевом фильтруют через два слоя марли али сито, чтобы
удалить крупные нераспавшиеся куски каллусной ткани. В
большинстве с.лучаев при субкультивировании используют
культуру клеток в конце экспоненциальной фазы роста. Пря
культњвировании в колбах на качалке это примерно приходится на
14-е сут_ Объем инокулюма составляет
от общего объема
суспензии в начале культивирования,
Для пересева первичной суспензии сначала освобождают от
фольги стерильную воронку и сито (руки не должны касаться
воронки и сита, необходимо пользоваться линцетом), помещают
воронку в цилиндр (объемом 50—100 мл), на воронку ставят сито
или укладывают два слоя стерильной марли и затем фильтруют
суспензию клеток, После этого 5—20 мл (з зазисимости от объема
колбы со свежей средой) отфильтрованной суспензии переносят
пипеткой или цилиндром в колбу со свеЖей питательной средой,
При субкультивировании суспензию Клеток пересевают без
фильтрования. Однако если, необход•л• мо получить более
однородную культуру, фильтрование Прово. дят регулярно с
использованием сит с диаметром пор 30 л 90 мкм — «просеянная
культура» (0zeki, komamine, 1981) , После пересева колбу
закрывают, подписывают и помещают На качалку. Суслензию
клеток исходной культуры анализируют с помощью микроскопа.
Оформление работы. Опишите проделанную процедуру,
обращая внимание на характеристику каллуса (цвет, плотность,
возраст и т. д.). Зарисуйте клетки моркови в суспензионной
культуре,
43
РАБОТА 4, СОМАТИЧЕСКИЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ
формирование зародышей из соматических клеток в условиях
in vttco впервые наблюдали в суспензионной культуре клеток
моркови Ф. Стюард с сотрудниками (.Steward et а , 1958). Такие
зародыши переносе на соответствующую сре• ду развивались в
целые ? астения. Данное явление получало название
соматического эмбриогенеза, а зародыши, образующиеся таким
путем,— эмбриоиДов. Этот процесс наглядно де, молстрирусу•г
тотилотентность растительных клм•ок.
Соматический эмбриогенез включает стадии развития,
аналогичные стадиям при зиготическом эмбриогенезе: ттобу•лы,
сердца, торпеды, молодого проростка (рис. 7).
В
некоторых
случаях
эмбриоиды образуются
непосредственно
из
клеток ткани, введенной
в культуру, — это гак
„называемый
прямод
эмбриогенез. В других
случаях
происходит
непрямой эмбриогенез:
але формируется каллус,
а
уже
из
него
развиваются
за.
родыши_
Эмбриоиды образуются из
— одиночных клеток. расположен лых з основном на поверхности
каллуса, Окружающие вакуолнзированные клетки могут
выполнять По отношению к эмбриогенным клеткам функцию
«ткани.няньки».
В суспензионных культурах выделяют два основных этапа:
сначала из одиночных клеток в результате многократных делений
формируются компактные лроэмбрногенные комплексы, затем из
такого комплекса развивается один или несколько эмбриондов.
Клетки, дающие начало эмбриоидам, отличаются более плотной
цитоплазмой, относительно большим ядром с увеличенным
ядрышком, в них присутствуют крупные крахмалг,ные гранулы и
мелкие вакуоли, Это клетки метаболически активны; они богат“
белками и РНК_
Потребность в гормонах на каждом из этапов эмбриогенеза
различна. Образование лроэмбрногс•нпых комплексов происходит
в Присутствии ауксина, однако переход к формированию
эмбриоидов этот гормон инглбирует. Поэтому на втором этапе
соматического эмбриогенеза ауксин или исключают из средт„, или
используют его в очень низких концентра[1ннх.
Предполагают, что прямой эмбриогенез в культуре происходит
из клеток, которые уже детерминированы для эмбриогенного
развития перел эксплантацией, т. е, являются превм• бриоренно
детерминированными. Поэтому для того чтобы произошла
эксарессия эмбриогенеза, требуются только благоприятные
условия. Непрямой эмбриогенез проходит путем реОе44
(повторной детерминации) дифференцированных
клеток, пролифераини каллуса и развития эмбриогенло детер•
минированного состояния. В этом случае необходимы гормоны
как для иетдукиин деления клеток, так и для детерминации
эмбриогенного состояния,
Планируя эксперимент по индукции соматического эмбрио.
генеза, важно лрањильно подобрать объект. Например, эм
бриосенный каллус легче образуется из незрелых зародышей.
Эмбриональные клетки, клетки молодых проростков. особенно из
эаилермнса
гипокотиля.
представляют
собой
наиболее
удоб
материал для получения соматических эмбркоидов.
Эмбриогенез легко происходит в мо.полнх культурах, эта слособ•
ность клеток уменьшается Ло мере удлинения срока от начала
культивирования. у моркови эмбриоиды начинают образовываться
через 4—6 недель посте получения каллуса, оптималь• ныЙ
возраст культуры для иллукиии соматического эмбриогенеза —
15—20 педель: 30—40.недельная культура Часто теряет свой
эмбриогенный потенциал,
Цель работы. Получить соматические эмбриоиды в стадии
торпед.
реактивы колбы со средой МС, Не содержащей горМонов; стерильные
цилиндры объемом 50—lfN мл; стерильные •оронки: нейлоаовНе сита с
диаметром пор 120 мкм; пипетки объемом МЛ; шгр“,•:; о мерз Подсчета
Мн«роскоп; сосуд для слива
Объект исследовано: суспензионная культура моркови, сорт Нантсхая.
Ход работы. Всю работу проводят в ламинар•боксе. Для
получения эмбриондов используют просеянную культуру, так как
индукция эмбриогенеза возможна с клеточными агрегатамн
определенного
размера.
Подготавливают
систему
для
фильтрования, состоящую из цилиндра, воронки и сита (см.
описание в работе № 3) и фильтруют суспензию клеток.
Обязательмо обжечь на горелке горло и бок колбы, из которой
будет перелита суспензия на сито! После фильтрования пилиндр
закрывают крышкой оставляют на 30 мин для осажделлн клеток_
Затем соединяют шприц с пипеткой (10 мл) и с его по. Мощью
осторожно отсасывают налосадочную жидкость. НеобХодимо
удалить максимально возможное количество жидкости. Эту
процедуру можно заменить центрифугированием суспензии
Поскольку эмбриогенез зависит не только от соотношения
фитогормонов. но от плотности Лосева. необходимо контро•
лиров:'.ть количество вкослмењх клеток и агрегатов. Осадок
клетак разбавлнют небольшим количеством среды, не
содержатией гормоны, определят число клеток н ме.лких агрегатов
в этой суспензии (см. в Приложении о подсчете числа клеток) и
пипеткой пересевают клетки в колбу со свежей средой, не
содержащей гормоны, так, чтобы концентрация клеток в колбе
45
была 105 клеток на 1 мл. Колбу закрывают, подписывают н
помещают на качалку с температурой С, скоростью качаний 130
об/мин, освещением 700 лк.
Через 14 сут анализируют суспензию, определяя с Ломощью лупы
стадн эмбриогенеза,
Оформление работы. Опишите Проделанную процедуру.
Зарисуйте эмбриоиды на различных стадиях развития.
РАБОТА АНДРОГЕНЕЗ В культурс
пыльников И получение гмл.лолдных
РАСТЕНИП тлг.дкл в условиях VITR0
Покрытосеменные растения па протяжении своего жизней. ного
цикла реализуют две неравные ло продолжительности программы
развития: спорофигную, занимающую большую часть их жизни
(даллофаза), и короткую, гаметофитную (саплофаза) В некоторых
случаях возможно переключение с гаметофитного пути разлития на
спорофитный, Сравнительно летно такое переключение может
быть лроизведено в условиях культивирования vi1ro Пыльников
илл микроспор (андрогенез) с помощью факторов внешней среды. в
том числе концентрацни гормонов.
В результате изменения программы развития гаплоидной
микроспоры прекращается формирование пыльцевого зерна
(мужского гаметофита), идут процессы пролиферации клеток,
трњводящие к образованию либо эмбриоида, который разозьее ся п
гаплоидное растение— спорофит, либо каллуса. В соотвегствии с
этим различают два пути регенерации гаплоидов vitro — прямой
и непрямой,
Явление андрогенеза з культуре пыльников впч.зые описали
середине GO.k содол индийские ученые (juha. .Maheshwari, 33
прошедшее время разработаны метолы культивирования пыльников
и микроспор более чем у 170 видов растений, п чл. сле которых
немало хозяйственно ценных культур. Интерес исследователей к
данной проблеме обусловлен ее значимостью для решения задач
практической селекции и генетики_ Получая гомозлготне,'е
диплоидные растения на основе гаплоидных ре, генерантов (так
называемых «пыльцевых гаплоидов»}, удается в 2—3 раза
сократить сроки выведения новых сортов риса, табака, пшеницы и т,
л,
Вместе с тем культуры пыльников или изолированных
микрослор — удоблый объект для исследования фундаментальных
проблем физиологии развития, генетики и биохимии растений.
Для успешной ил аукали андрогенеза iII vitro (переключеНия
развития с гаметофитной программы на слорофитну:о) важное
значение имеют условия пыра:инпання растения.доно• ра и его
генотип, состояние пыльников н момент инокуляции н условия их
культивирования.
Временной интервал в развитии микроспор. оптимальный для
индукции андрогенеза,— критический этап— у большинства видов
начинается накануне митоза и замер:иается вскоре пос.ле него.
Отбор материала для культивирования существенно упрощается,
если ориентировочную оценку стадии разви• тия микроспор
проводить по внешним признакам, например, взяв за основу длинк
бутона ила соотношение длин чашелистиков и лепестков. этом
случае
используют
предварительно
составленную
шкалу
соответствия стадии развития микроспор и изменения выбранного
лараметра.
Эффективность индукции андрогенеза можно существенно
лопнст-гь. подвергая микроспоры накануне культивирования
стрессорному воздействию, Наиболее распространенаел(й способ —
обработка бутонов или соинетнй холодом, Иногда сни• жают
температуру выращивания растений, изменяя однолременно
световой режим. Условия обработки определяют экспериментально.
Питагельние среды для культур пыльников в большинстве
случиаеа составляют на основе прописей Мурасиге—Скуга (среда
МС), Линсмайера—Скуга, Уайла или Нач (Т, Murachige, Е. Skoog, Е.
М.
н. White, Л. р, Nitsch, С. Nitsch). включая в
качестве добавок Зазллчные соединения (гормоны. аминокислоты,
витамины) илл экстракты например, каргофельннй). Состав н
концентрации добавок, так же как н ко,]• центрация сахаров.
видоспецифичны.
Культивирование пыльников проводят на жидких, полутвердых
и комбинированных средах — двуслойных (нижний слой образован
агарнзозанной средой, часто с добавлением активированного угля,
верхний слой — жидкий)
Хорошие результаты дает метод плаваю1днх пыльников
Сандерленда: пыльники. помещенные на жидкую или комби•
ниронанну:о среду. через некоторое лремя раскрннтотся„ н
микроспоры высыпаются наружу, т. е. фактически мнкроглоры
культивируются в присутствии пыльников, что положительно
сказывается на ранних этапах иидукиил андрогенеза, (Заме. тим, что
состав среды для культур изолированных микроспор существенно
сл»жнее, чем для культур мвльннкоп.)
Важное значение при работе с культурами пыльников и
микроспор имеют также физические условия инкубации: тем,
Лература. освещенность, число пыльников (или микроспор),
приходящееся на объем питательной среды, и т. л.
Формарозание эмбрноида из микроспоры длится от З до 10
недель в зависимости от пила растения. В результате после,
донате.льных делений эмбриогенной клетки, троисходящих внутри
оболочки лыльлепого зерна. формируется шарик из множе• ства
мелких клеток (размеры клеток у пыльцевого эмбриоада табака н
зиготического зародыша примерно одинаковы). НаКонец экзи•на
(оболочка пыльцевого зерна), окружающая эм. браоид, разрывается,
ж он высвобождается. После этого средний размер клеток начинамувеличиваться. Далее эмбриона развивается вполне аналогично
зиготическому зародншу_ ДифФеренцнруюхся корневой и
стеблевой конин, развиваются се. мялоли, образуются маленькие
проростки, которые после пере. несения на свет зеленеют. Эти
растеньица дересажива:от на атаризонаннуо среду для укоренения,
где у них развиваются первые листья. Когда растения достигают 3—
5 см, их можно переносить п горшки с землей.
Иногда п культуре пыльников образуются иегаплоидные растения.
которые возникают по разним причинам: из-за слияния ядер во время
первых делений микроспоры, из-за образованин регенерантон из
негаплоидных клеток стенки пыльника и т. д. Поэтому нДенгификация
галлоиДоа — важный и необходимыЙ этап работы. С этой целью
используют различные метолы: подсчитывают число хромосом в делящихся
клетках кончика корня, число хромоцентров, приходящееся на ядро н
клетках листа, число ядрышек н их ядрах, число пластид в замыкающих
клетках уст Нил. Последний метод отличается наибольшей простотой, Он
основан ла том. что у галлондон число хлоропластов в замыкающих клетках
устьиц (которые очень легко идентифицнроаать) почти в 2 раза меньше, чем
у диллоидов.
Гаалои,1ы, предназначенные для селекционной работы,
приходится диллоидизировать н таким образом получать гомози.
готные диплоидн (их часто называют Дигаплоиди.ми). С этой целью
используют колхицинирование гаплоидных мер истем (колхиинн
останавливает митоз п метафазе. инактивируя механизм веретена)
или получают каллус н культуре ткани гаплоидного растелия н
после его спонтанной или индуцированной полиплоидизации
регенерируют диплонды,
Цель работы. Индуцировать андрогенез в культуре пыльников
табака. Получить галлоиды и идентифицировать их.
Реактивы и оборудование: флаконы с питательной средой (см. Прнложенке 1);
70%-а раствор этанола; 0,01 раствор тяпмерсала стерилизании бугоноа: «раси:ель
ацетокзртн (су. Приложение стерильная
вода: пинцеты;
препаровальные иглы: лезвие бритвы; стаканн для стернлнзапии материл ла:
прел,метпые и покровные стеклл•. «•льгл для закрыаллия флауомов н выделения
пыльников; ламинар• бокс, термостз: 25“ С. микроскоп. спиртовка.
Объект исследовано: бутоны табака сорт Стмсуа, собранные за 7 сут до начала
ОПЬГТа и выдержанные в холодильнике при Температуре 4—6' С,
Ход работы. Работа состоит из трех этапов, Установление
соответствия межДу Длиной бутона и стадией развития пыльников_
Отбор бутонов, в которых пыльники находятся на Крнтическом
этапе развития: накануне, во время непосредственно после митоза
микроспоры.
48
Длину бутона измеряют в миллиметрах с помощью линейки.
Затем определяют стадию развития микроспор в данном бутоне на
врёменном мреларате после окраски ацетокармином. Окрашнпалие
проводят следующим образом: содержи мое лыльнина
«антрякилтог» с помощью препаровальннх игл н каплю
ацетокармина на предметное стекло. Обрывки
удаляют
пинцетом. Препарат накрывают покровным стеклом м осторожно
нагрентот на пламени саиртовки. С ломощыо микроскопа
определяют стадию развития микроспор. Длину исследуемого
бутона заносят н соответствующую графу табл. 7. Определяют
диапазон оптимальных значений длинн буто• на, Отбирают бутоны
для работы,
2. Стерилизация поверхноеги бутонов и инокуляция
пылькиков на пигагельную среду. В ламинар-боксе готовят ляп,
стерильных стаканов; налипают п первый из них раствор эта. нала,
во второй — раствор тиомерсала, в три остальных — сте. рильную
дистиллированную воду. Стерилизуют бутоны (1 мин в растворе
этанола и 7 мин в растворе тиомерсала) и отмывают их п трех
порциях воды. Вынув бутоны на стерильную ловерхмость фольги,
стерильными лреларовальннми мглами разрывают покровы и
пинцетом переносят пыльники во флакон со стерильной
питательной средой.. Закрывают флакон новой стерильной
фольгой и надписывают. Аналогичным образом высаживают
пыльники в остальные флаконы: ио дна бутона на флакон.
Стерильную фольгу для препарирования бу. тонов нужно каждый
раз брать новую,
Флаконн с пыльниками ставят в термостат и инкубируют при
25 •С в темноте в течение 8 недель. По прошествии этого времени
анализируют результаты опыта и заносят их в табл. 8. Суммируют
данные, полученные всей группой, и оценивают *ффектинность
индукции андрогенеза (ароцент флаконов, в которых прошел
эмбриогенез или каллусогенез).
3. Определение плоидности растений посредством подсчета
числа хлоропластов о з..иыкающих клетках устьиц. Необходимо
определить плоидность двух листьев, из которых один
гаплоидный, другой диплоидный.
Готовят предметное стекло С каплей воды на нем, С лоМощью
лезвия бритвы снимают с нижней поверхности листа Кусочек
элидермиса. Аккуратно переносят эту пленку на по-
Верхностт. капли и расправляют. Накрывают покровным стекЛом и с Помощью микроскопа (увеличение Х 40) подсчитывают
Число хлоропластов в замыкающх клетках десяти устьиц. Ре.
Зультаты заносят табл. 9. Подсчитывают средиме значения
Члс.ла хлором.ламон для каждого из листьев н сравнивают их
между собой.
Оформление работы. Представьте результаты в виде таблиц.
Сделайте выводы.
Таблица 7
Полевой В, Физиолпгия растений, М., 1989, уоринг ф, Филлипс Н_ Рост
растений и дифференцировка. М,, 1984,
Длили
Раздел
Тетрадн микрослпр (завершение мейоза)
О.тнбЩ(ерная микроглора с ядром н центре
Критический лал:
ФОТОСИНТЕЗ
одноядерная икраглора накануне
деления деление микгсгјлоры ранндя
двухъядернаа микроспора
Двухклеточпое
зерно с интенсивно
окрашенной цитоплазмой, заполненной заласны•
мн веществами
фотосинтез — процесс синтеза органических веществ р а.
стениями и бактериями за счет элергии света, Суммарное
уравнение фотосинтеза:
Таблиц з
СОМ- '2Н2А
9едуаьтат
р — растеньица;
(СН2())
где Н2А — донор водорода, (СН,О) — фрагмент молекулы
углевода.
Источником водорода лр•и фотосинтезе у высших растений,
водорослей и цианобактерий служит вода, поэтому в результате
фотосинтеза этих организмов выделяется кислород:
— каллус; О — отсутствие Признаков андрогенеза.
Таблица
9
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
Биотехнология растений: культура клеток.
1989.
Р. Г. Экгјлериментальнцй морфогенез и диффереааиация в кул№ туре
клеток растениь* 35-е Тимиргзевккое чтение, М 1975.
Гзлсгом Д.. Дезис П., Сэгтгр Р. Жнзнт, зеленого растения. М., 198,4
Дерфлинг К, Гормоны растений. М.,
Клетоешая инжеперля Р, Г, Бутенко, М, В. Гусев, А, Ф. Киркин н др. м., 1987.
Кулаева О. Н. Гормональная регуляииж физиологнческих Процессов у
растений на уровне синтеза РНК и бейка 41-е Тимирязевгкае чтение. М., 1982,
Либберт Э, Физиология растений. М., 1976,
Литгюјк А. Х, Глубинное культизиризание клеток высшНУ, растензй
Сб. Кул,тура клеток растений, М., 1981, С. 51—58,
Палевой В В, фитогормоны. Л.. 982
Полевой В. В, роле, ауксина в сустеМаХ регуляции растений 44-е
Тимирязезское чтение, Л., 1986.
(сн2()) +02.
Фотосинтезирующие микроорганизмы в качестве донора
Водорода могут использовать как неорганические соединения
(палрнмер, H2S), так и органические (например, органические
кислоты), Фотосинтез у этих организмов Пескаслородный,
В химическом аспекте фотосинтез — процесс синтеза
сложНЫх органических веществ из простых соединений — воды и
диоксида углерода, однако в отличие от других б.тохимических
реа кциЙ синтеза источником энергии в этом случае является свет,
С термодинамической точки зрения этот процесс . идет с
Запасанием энергии (41-1—469 кДж/моль СН2()).
В
основе
фотосинтеза
лежит
окислите.ђьио,восстановите.лнНыЙ процесс переноса электронов
от воды к НАДФ против Термодинамического градиента, при этом
преодолевается разГость потенциалов лорядка В. Движущей силой
Мри этом служит энергия света.
Преобразование эмергии спета при фотосинтезе осущестВлястся серией последовате.льпых реакций и может быть
подРазделено па три этапа. 1. Поглощение света лигментами и
Образование
возбужденных
молекул.
2.
Первичные
фотохимиЧескде реакции, я которых принимао•г участие
возбужденные
Молекулы пигментов. На этом этапе происходггг трансформация
энергии, преобразование энергии возбужденного состояния в
химическую. З. Химические темноте реакции, в которых участвуют
продукты
фотомтмических
реакцлЙ.
На
этой
стадии
осуществляется дальнейшая стабилизация первичных фото.
продуктов и преобразование кх в стабильные химические
соединения_
Поглощение энергии света и преобразование ее в форму
НАДФ•Н и АТФ составлят световую стадию фотосинтеза.
Дальнейшие реакиии фиксации СО, и синтеза органических
соединений с использованием продуктов световой стадии
фоТосинтеза (НАДФ.Н и АТФ) составляют темповую стадию
фотосинтеза.
Организация и работа фотосинтетического аппарата
расте находится иол контролем эндотенных (генетических. гор.
мональных) и экзогенных (освещенность, концентрации СО, и 02.
температура н др.) факторов. Регуляция фотосинтеза затрагивает
все уровни организации фотосинтетических реакпий, начиная с
молекулярного и кончая организменным у оз. нем и уровнем
биогеоценоза. Важнейшим регуляторным актором на уровне
Целого растенля являются Донорно-акцепгор• Ные отношения.
Характеристика органнзащии н функционирования фотосин•
тетического аппарата и механизмов регуляция фотосинтеза
включает как ннтетральные показатели (общая интенсивность
фотосинтеза, накопление биом ассы, содержание пигментов и их
набор в листьях и др.), так и показатели активности от, дельных
реакций фотосинтеза (фотохимическая активность хлоропластов,
активность
фотофосфорилированяя,
обр
азование
фотоиндуцируемого
электрохимического
лотенциала
нг,
каталитическая активность отдельных ферментов н др.). Важным
условием
проведения
исследований
является
учет
физиологического состояния растений и условий их
выращивания,
ЗАДАЧА 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНТЕНСИВНОСТИ ФОТОСИНТЕЗА
РАСТЕНИИ
Для характерис“гжин интенсивности фотосинтеза могут быть
использованы различные показатели: интенсивность газообмена.
учет накопления ассимилятов п растениях. энергетическая
эффективность фотосинтеза. активность отдельных звеньев фо•
тссин•геза и др. Наиболее распространенными методами оценКи
суммарной интенсивности фотосинтеза являются газометри.
четкие, основанные на учете количества поглощенного
углекислого газа иди выделенного кислорода,
В застоящее время для исследования фотосинтетического
газообмена растений широко применяют инфракрасную спею
троскопию (подробнее см. «Фотосинтез и биопродуктивность:
методы определения»). используют также радиоуглеродный и
электрохймический
(полярографический)
методы,
манометрическиЙ метод Варбурга и др. Выбор метода зависит от
цели работы, а также наличия конкретной лабораторной техники.
РАБОТА ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНТЕНСИВНОСТИ ФОТОСИНТЕЗА
И ДЫХАНИЯ ЦЕЛЫХ РАСТЕНИЙ ПОЛЯРОГРАФичгским МЕТОДОМ
Полярографическии метод основан на анализе зависимости
между силой тока, характеризующей скорость электрохимическоро
процесса, н напряжением, приложенным к электроду.
Метол может быть использован при условии. что определяемое
(или ион) способно электрохимически восстаЯанливаться
или окисляться на поверхности электрода.
В опытах используют закрытый электрод Кларка. в котором
катодом является платила, анодом — серебро (погруженное в КС:
или в какой-либо другой электродный буфер). ТонКая тефлонозая
пленка, проницаемая для газов, защищаем электрод от загрязнения.
Кислород на электроде восстанавливается в две стадии.
Начальная реакция кислорода протекает на платиновом ка. тоде:
Затем ионы ОН— диффундируют к электроду сравнения н
взаимодействуют с серебром;
Реакция. проходящая на электроде, выражается суммарным
уравнением:
02+4Н++4В2Н1О.
Проведенно опыта предшествует снятие вольт-алперной
характеристики электроДа. Это необходимо, чтобы установи кь
значения потенциала, прилагаемого к электролу, в пределах
которого сила тока. проходящего через электрод, остается
постоянной. Такой ток называют преДельным, Величина предель•
ного тока пропорциональна концентрации вещества. восста•
Наплиаощегося на катоде. Пропорциональная зависимость Между
предельным током и концентрапией восстанавливаемоГо нетества
растворе н является основой полярографическо• го анализа,
В опытах проводят измерение значения силы тока при
потенииале. равном потенциалу полуволны (для используемаго в
опыте электрода (т; —650 мВ), Подробнее теорию лоляро. гр ии см.
п разд. 1 V, задача 4.
ель работы. Олределить интенслнность фотосинтеза л дыХания на целых растениях или отдельных листьях Ло выделеНию
али поглощению кислорода соответственно.
53
и оборудование: гра неская уттзновка с закрытым злектротм Кларка;
сушильныеи 80' С): аналитческие весы; эксикатор: миллиметровая бумага,
Объект исследования: проростки растений (пшеницы, «ухурузы и др.).
выртпеиных в
углоззях тодособжениу, Освещения. минерального
питании; листья растений разного возрзгтл.
Ход работы. Определения лолнрографическим методом Про.
водят на специальной установке (блок-схему см. на рис. 29.
Приложение lt)_ Установка позволяет параллельно проводить
измерения в двух независимых герметичных камерах с растениями,
Канал регистрации для каждой камеры содержит ячейку с
закрытым
электродом
Кларка,
усилитель
ЛПУ-01
и
микровольтнаноампермегр Ф-136.
Растения различных физиологических вариантов (см. Объект
исс*едовалия) помешают в камеры так, чтобы там бы. ли только
листья; стебли и корни остаются снаружи. Камеры герметично
закрывают, после чего их подсоединяют одним отводом к
компрессору, а другим— к ячейке с электродом. Определение
интенсивности фотосинтеза производят при освещении растений
лампой накаливания. Интенсивность дыхания определяют в
темноте, выключив свет и закрыв камеры темной ткань:о. Запись
фотосинтеза и дыхания одних и тех Же растений повторяют лва•трн
раза.
После регистрации фотосинтеза и дыхания растения изялекают
из камер и азаешивают лис—гья отдельно каждого лари. анта.
Затем определяют площадь листьев весовым способом. Для
однодольных растений замеряют длину и ширину лисгьењ и затем
вычисляют площадь листьев Ло формуле
Начальный ток для каждого канала и всякий раз необходимо
отмечать,
2, Известна калибровка цены деления диаграммной ленты в
единицах тока (определить заранее!).
Таким образом. зная величину начального тока. количество
кислорода, обусловливающее этот ток, н цену деления для мкА в
миллиметрах диаграммной ленты, можно определить цену деления
диаграммной ленты в миллилитрах 02.
Пример. Начальный ток 1, — мкА. В канале 1 содержит. ся 75,85
мл 02; мкА соответствует 24 мм диаграммной
ленты.
Тогда 24, : 0,1—384 мм диаграммной ленты соответствует 75,85
мл 02, Отсюда 1 мм диаграммной ленты равен 75,8 : 384— —0,198
мл Оммм.
Расчет интенсивности фотосинтеза
и дыхания по диаграммной записи
(рис. 8) проводят следующим образом,
1. Соединяют на диаграммной
ленте прямой линией точки от од-
ного канала.
2. Опускают перпендикуляр «а»
из любой точки этой линии на
продолжеаие «нулевой» линн:т и
изме•
ря1от
его
величину
в
миллиметрах,
Эта
леличина
соответствует
измененик)
концентрации 02 в канале за время, прошедшее с момента нача• ла
регистрации (измеряется отрезРис. 8. И•уеиення концентраЧин
ком
Исходя из калибровки
кислорода а среде при по-
где 1— длина листа, — ширина листа в наиболее широкой его
части.
Для определения сухой массы листья высушивают з термостате
при 1050 С до постоянной массы,
Расчет интенсивности фотосинтеза и Дыхания. Для расчета
интенситщкти фотосинтеза и лыхатия необходимо осуществить
перехол от значений диаграммной ленты самописиз к количеству
кислорода, выделившегося или поглощенного за определенное
время. При этом исходят из следующего,
Начальный ток, который проходит через электрод в ор
сутстнне растений, обусловлен кислородом, находящимСЯ в
замкнутом объеме камеры. компрессора и отводящих шлангов
(далее называем «канал»). Объем кислорода рассчитывают, исходя
из его содержания в воздухе— 21
измереннук с
цены деления диаграммной ленты,
помощью электрода Кларка
определяют эту величину в мл 02.
(объысиенне см. в тексте!
3. Измеряют величину отрезка
«б» з миллиметрах н, исходя из
скорости дниженни диаграммной ленты, выражают его н единицах
времени (часах).
4. Зная количество кислорода (мл), выделившегося ила
поглощенного за время «б», рассчитывают количество кислорода за ч.
5. Пересчитывают количество кислорода, выделившегося Или
поглощенного за 1 ч на единицу площади или на единицу сухой
или сырой массы растений (мл 02 •см,—' или
Оформление результатов. См. разд. 1, задача
ЗАДАЧА
2.
ИЗУЧЕНИЕ
ПИГМЕнтного
фотосинтезирующих ОРГАНИЗМОВ
АППАРАТА
Необходимыми компонентами фотосинтезирующих систем
Являются пигменты. Они служат первичными фоторецепторами в
„процессе фотосинтеза. Пигменты — эго соединения, избира55
темно поглощаюстп.е свет в видимой части солнечного спектра.
При освещении белым светом их окраска определяется теми
лучами, которые они отражают или пропускают, Погло11(ение
пигментами светозой энергии обусловлено наличием их Молекуле
хромофорных групп. Хромофорные группы, представляющие собой
систему сопряженных двойных связей, содержат большое число
легко возбуждаемых светом л-электро. нов, Для их перехода а
возбужденное состояние достаточло энергии квантов видимой
области спектра. Все пигменты фотосинтезирую11№х организмов
обычно
подразделяют
на
три
группы:
хлорофиллы.
фикпбилиарогеины (пнгмеаты тетр апнр. рольной природы) и
каротиноиДы.
у всех эукариотных растений пигменты локализованы в
хлоропластах — органоидах клетки, я яляощихся центр а ми
превращения солнечной энергии. у прокариотных водорослей и
фотосинтезирующих бактерий хлоропластов нет. Пигменты,
принимающие участие в фотосинтезе. локализованы у них в
мембранных структурах — гилакощ)ах в ламсллах.
Хлорофи.ллы. Все фотосинтезирующие организмы содержат эти
зеленые пигментн_ По своей природе хлорофиллы
отсн
Мепорфнрин ами. Центральным атомом, связыла:отиим четыре
пирролонщх кольца (l—lV), служит Mg. В результате образуется
большое порфиринодое кольцо с сопряженными по кругу
двойными связями, Чередующиеся одинарные двойные связи
включают делокализопанные л-электроны, которые при. нимают
участие п поглощении спета, Кроме того, в структуре хлорофилла
имеется
одно
циклотентановае
кольцо
вклю
чающее
высокоактивную з химическом отношении кетогругпу. Последняя
участвует в образовании ассоциатов молекул хлорофилла и
комплексов пигмента с молекулами ноды_
Длинная
углеводородная
цепь
(остаток
фитола),
присоедиленная к порфирилопой части молекулы хлорофилла,
обладает липофи,льными свойствами. Фитольный остаток служат
своего рода неполярным якорем, с помощью которого молекулы
хлорофилла взаимодействуют с гидрофобными зонами белкоя. Все
это Имеет злаченнс для создания определенной лрос:ранствел. ной
ориентаиии молекул хлорофилла поддержания структуры
хлоропластов.
В настоящее время известно около десяти Пигментов,
входящих н группу хлорофиллов и ог.мчающихся друг от друга
некоторыми
структурными
особенностями,
Наиболее
распространены среди них хлорофиллы а. и бактериохлорофилл а.
Хлорофилл а яходит в сттав пигментного аппарата всех
фототрофов, кроме фотосинтезирующих бактерий, содержащл.х
бактериохлорофнлл а. Хлокофилл Ь, который находится н хлороиластах высших растели и а зеленых лодорослях. отличается ог
хлорофилла а тем, что вместо — СНз-группы у 3-го углеродного
атома (в 11 кольце) имеется — СОН-группа:
56
Порфирнновое мульцо хлорофилла поглощает красные и
силе•фиолетоные лучи, пропуская значительную часть зеленых
(рис. 9). Этим объясняется зеленый цвет хлорофилла. Именно
молекулы хлорофилла а (у растений) и
бактериохлорофилла
а
(у
фотосинтезирующих
бактерий)
являются теми пигментами, коллргые
непосредственно яходят в реакпион•
ный центр фотосинтеза и принимаКуг
участие п преобразовании свето• вой
энергии.
Остальные
хлорофиллы
служат «антеннами», Они логло• Щают
энергию света и передают ее к
хлорофиллу а или бактериохло• рофнллу а, фикобнлнлротенны
(били хромопротеины). Это водораст•вори ные пигменты
красного или голубого
рис. 9. Спектры лог.лтцеиня
цвета. Они входят в состав
Хлорафнл.тов а и Ь в эфире;
пигментПых систем наанобактерий н
— хлорофилл а.
2— хлорофилл Ь
краспых водорослей, а также крнп•
тофатов.
Хромофорами
фикобилипротеинов
являются
фикоцианобилин и фикозритробилин, состоЯщие из четырех
пирролы.ых колец, которые образуют открытую, не содержащую
металла цепь. [10 химической структуре фикобиЛины близки к
желчным пигментам. Хромофорные группы
сня
сн: — с — сн— сна.
Большая часть каротиноидов имеет молекулу, состоящую из
восьми изопреновы.х остатков, которые соединены н длин. Нуо
цепь. Хромофорная группа каротиноидов представлена системой
конъюгированных двойных связей, Карогнноиды быиз ют
ациклическими, моноциклическими (имеющими одно замкнутое
кольцо) и бициклическими (амеютими два кольца). Кольца можно
рассматрвать как производные ионона двух тиПов — р•иононовые
н а-иононовые:
57
фикобилинов очень прочно связаны с белком, и для их
отщепления требуются жесткие воздействия, приводящие к
разрушенно ковалентных связей между белком и хромофором,
Кон. фнрурапия л•электронной сњстсмы фикобн.чннов отличается
от циклической системы хлорофилл з, что определяегт отличие
спектров поглощения у данных групп пигментов, Фикобилины
поглощают световую энергию в зеленой и желтой областях
спектра,
58
кольцо
формулы некоторых каротиноидов приведены ниже:
Поглощенную световую энергию они с высокой эффектившхтью
передают фотохимически активным формам хлорофилла а.
Каротиноиды. Это большая группа пигментов Желтого, оран.
Жевого и красного цветов. В настоящее зремя их найдено 60. лее
трехсот. Однако непосредственно з фотсинтезе участвуют лишь
некоторые из них. физиологическая роль многих карогннолдов еще
не выяснена. [10 химическому строению каротаноиды могут быть
разделены на две группы: 1) каротины — ненасыщенные
углеводороды, содержащие только углерод л водород: 2)
ксантофиллы. кото не кроме углерода и водорода содержат еще и
кислород. се каротиноиды представляют собой производные
изопрена:
яд— —Сн
зги
Каротнноиды
поглощают
свет
преимущественно
в
синефиолетовой области спектра, чем и объясняется их
желтокрасная окраска. Основными каротинондами пластид
высших растений и зеленых водорослей являются р.кпротин и
ксантофиллы лютеин. виолаксантин и неоксангин. Эти четыре
пигмента составляют —98% от общего количества каротинокдоз
зеленых листьев. Большое разнообразне каротиногтдных лиг.
Ментов характерно для
которые являются пер.
вымя фотосинтезирующими организмами, перешедшими от
фоторедукции к фотосинтезу с выделением кислорода.
Состав каротиноидов цианобактерий заметно отличается от
пигментного состава высшах растений. Из каротиноидных
пигментов у них преобладают
эхикенон и миксаксанго.
филя. Два последних не обнаружены у других представителей
растительного мирз. Многообразие каротилондов у цнзнобактерий
связано с их филогенетическим происхождением, со способностью
к существованию при очень разнообразных, порой экстремальных
условиях внешней среды, с чрезвычайной эврибионтностью.
Роль каротиноидов при фотосигпезе полностью ме раскрыта.
Доказано. что они и:рзют роль вспомогательных пигменТов,
передающих энергию поглотенных квантов хлорофиллу или ба
ктериохлорофиллу. Благодаря этому более полно кс, пользуется та
часть видимого слектрз. которую не логлоглает
59
хлорофилл. Кроме топ), существенное значение в ре5кциях Фо.
тосннгеза лмеет защитная функция каротинонлов, которые,
дезактивируя образующиеся на свету активные формы кисло.
рода, предохраняют хл»офилл и другие соединения клетки от
фотодеструкдии. Возможно также, что каротинонды принимают
участие з процессах выделения кислорода растениями на свету.
Предполагают, что светонндуцированные взаимопревращекия
зеаксантнна и виолаксантина (так называемый виолаксангиновый
цикл) могут игратт, роль выделении О. при фото. синтезе.
Механизм этого процесса в „настоящее время не вы. яснен.
Таким образом, наличие различных пигментов обеспечивает
поглощение р астениями солнечного света в широком
снектральном диапазоне, эффективную миграцию и локализацию
знергин возбуждения на активных центрах, Набор и содержа. ние
пигментов в растенннх зависят пт систематического полз жения
фототрофов, их онтогенетического состояния н условий
существования. В процессе эволюции растения разных
местообитаний вырабатывали свой характерный набор пигментов.
позволяющих им при различных условиях существования
ланболее эффективно использовать доступный свет.
РАБОТА
1.
ПИГМЕНТОВ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
СОДЕРЖАНИЯ
ОСНОВНЫХ
ФОТОСИнтгтичгского АППАРАТА в ЛИСТЬЯХ ВЫСШИХ
РАСТЕНИИ
Лля извлечения пигментов из растительных тканей и Их
разделения обычно используют полярные растворители 1 али
смесь полярных (спирт. ацетон) н неполярных (петролейный эфир,
гексзн, бензин) растворителей, Так как лмгменты быстро
выцветают аз свету, их экстракцию уроводят в затемненном
помещении с предварительно охлажденными растворителями.
Чтобы предотвратить изомеризацию пигментов, экстр акцию
следует осуществлять возможно быстрее, Пигменты извлекают
последовательно несколькими порциями растворителя, фильт• рун
каждый раз раствор через стеклянный фильтр. При растяранни
листьев добавляют небольшое количество MgC03 или СаС(), для
нейтрализаинн кислот клеточного сока и предотВращения
феофитинизаини пигментов.
Количественное определение пигментов основано на их сло
собности поглощать лучи определенной длины волан.
реглстраиию оптической плотности раствора пигментов проводят
на спектрофотометре. Отределение концентрации хлорофиллов с и
Ь в растворе без их разделения затруднено, гак как спектры обоих
хлорофиллов сильно перекрываются. и невозможно на“.
Все работы с органи•ЕСКИЦИ растворителями и летучим“ веществами
производить иод тягой!
60
тв де длины волны, в которых поглощение обусловливалось бы
полностью одним пигментом, Однако имеющиеся различия в
спектрах поглощения хлорофиллов а и Ь позволяют выбрать
точки, где поглощение одного пигмента заметно превышает
поглощение другого, Это обстоятельство и исполычуют при
проведении количественного определения обоих хлорофиллов без
их разделения.
В зависимости от природн растворителя. используемого для
извлечения лигментов. их концентрации рассчитывают по
гледующим формулам (С— концентрация, D — оптическая плот.
ностьђ :
1) в 80%-м растворе ацетона (Уегпоп, 1960):
1.63 ь— 2.39D„e,
2) в
растворе ацетона (Wettstein, 1957): с„ ь— 0,990 С»
мг/л—21.42б
4.650
3) в
растворе спирта (Winier:mans, de MoiS, 1965) с,
13,70 [Ъ— 5.76 с,
ь — 7,60 4) в 8070 -м растворе
ацетона (Lichtemthaler et al., 1982): си
D„—281
С,
— 5,03
3.27С,
—
СБ, мг/л 229
Цель
работы.
Определить
спектрофотометрически
содержаННе хлорофилла а. хлорофилла Ь и каротиноилов в
исследуе• мом материале, Рассчитать соотношение хлорофилл
а/хлоро• филл Ь, Показать адаптацию пигментного аппарата
растений К световому режиму окружающей среды.
Реактивы и оборудование: 96Ъ•й раствор этилового спирта или 80%.Й раствор
аиетона; MgCO: •{CaCOs); кварцевый песок; фарфоровые ступки
с пестиками: скальпель; ножницы; пинцет; стеклянные палочки: коба ГянЗена со
стеклянным фрльтром № З; мерные ктхбы объемои 26 мл; мер;ый 111•лтядр
объемом 23 стеклянные воронки;
аробирки; ПИПеТ• км объемом 2 л
5 мл; фольта: Песы торсионные. спектрофотометр.
Объект исследовании: листье рдетслпй разных световых экотипов; листья
Или тоя одного и того же растения. растущие при разлом световом режиме (листья
внутри кроны. верхушке побегов и т. листья разного
Ход работы. Для решения задачи необходимо провести
экстракцию пигментов и определить на спектрофотометре их
Концентрацию, Навеску растительного материала (100—200 мг)
Размельчают ножнииамн, помещают в маленькую ступку,
добав.тяют на кончике скальпеля немного MgC03, приливают
мл ацетона и тщательно растирают. Полученную вытнЖ•
каротиноидов.
61
ку сливают ло палочке на стеклянный фильтр, вставленный а
колбу Бунзена. При помощи насоса жидкость отсасывают. После
этого в ступку приливают еще немного ацетона, растирают,
снова вливают на фильтр -и отсасывают. Эгу операцию повто. р
дют несколько раз, пока раствор, стекающий аз фильтра, не
будет абсолютно бесцветным,
Вытяжку переливают в мерную колбу, колбу Бунзена
ололаскивают несколько раз небольшими порциями ацетона н
10водят чистым апетоном объем вытяжки з мерной колбе да
метки. Работа количественная, немВя терять одной капли! Пс.ту:евпая ацетоновая вытяжка содержит сумму зеленых и желтых
пигментов.
Концентрацкю хлорофиллов а ж Ь определяют на
спектрофотометре. Для этого часть птпученного экстракта
наливают в кювету спектрофотометра. Вторую кювету,
заполнению чистым растворителем раствор ацетона), использх•ют
как контрольную. Кюветы помещают в кюветную камеру
спектрофотометра и определяют оптическую плотность D
вытяжки прп длинах волн. соответствующих максимумам
поглощения
хлорофиллов
а н в 8004-м
растворе
ацетона, 663 и
646 нм. Дм:
определений
каротиноидов
вытяжку
промеряют при
—470
ни.
Концентрацию хлорофиллов а, и каротиноидов рассчитывают по
формулам:
Где св, СЕ и Свар— концентрация хлорофиллов а, Ь н каротиноидов,
Затем вычисляют содержание пигментов А в растительном
материале, мгјг сырой массы:
А — VC,'1000P,
где С — концентраиия пигментов, мги; V — объем вытяжки, мл
(25 мл); Р — навеска растительного материала, г (0,1— 0,2 г).
Оформление работы. См. разд. 1, задача 1.
РАБОТА 2. ИССЛЕДОВАНИЕ Физичгских И химичЕСКИХ СВОПСТВ
ХЛОРОФИЛЛА
Цель работы. Исследовать ряд свойств хлорофилла.
Реакливы и оборудование: те Же, что в 1 данной задачи; бензли:
спиртовой раствор щелоче; раствор НСИ КОН: (CH3COO',Zn али
(СПзСООКСи; реггстрнруюи:ай саехтрофотометр. Объект исследования: те же.
что в ра&ле данной задачи.
опыт п Флуоресценция хлоро,гилЛА
Флуоресценция — явление свечеугип веществ при поглощении
ими света. Переход возбужденной молекулы пигмента в основное
исходное состояние сопровождается излучением
[лощенной
энергии в виде света флуоресценции. Излучаемый свет имеет
бёльшук) длину волны, чем поглощаемый. Для хлорофиллз
характерна красная
Ход работы. Получить вытяжку пигментов, как описано в работе
1 данной задачи. Вытяжку пигментов Иомегцают на черном фоле у
окна млн освещают сине-фиолетовым светом в области
коротковолнового максимума хлорофилла, Вишнево, красный цвет
вытяжки в отраженном свете свидетельствует о способности
хлорофилла
флуоресцировать,
что
Йвляется
признаком
фотохимической активности вещества.
опыт 2,
пигмЕнтов по КРАУСУ
Метод основат на различной растворимости пигментов в спирте
н бензине. Сродство пигментов к полярным (спирт, ацетон) и
неполярным (бензил) растворителям определяется степенью их
полярности. Ксантофиллы, содержащие две или более полярных
групп, хорошо растворимы в спњрге, з то время как каротин
отличается более высоким сродстзсм к бензину. Фитольный
остаток в молекуле хлорофилла представляет ее Гидрофобную
часть и обусловливает возможность взаимодействия молекулы
пигмента с бензином, Удаление фитола при омылении хлорофилла
увеличивает сродство пигмента к ло.тярным растворителям,
Ход работы. В пробирку наливают 2—3 мл спиртовой вытяжКи
пигментов, прибавляют примерно полуторный объем бен.
Зина и несколько капель воды для того. чтобы спирт не сме•
шизался с бензилом, Пробирку закрывают и несколько р аз сильно
встряхивают, а затем ставят на 2—3 мин, Происходит разделение
слоев; верхний зеленый слой (бензиновый) содерЖит оба зеленых
пигмента каротин, нижний желтый слой (спиртовой) —
ксантофиллы. Определяют спектр но глощения Ксантофилла,
Показателем чистоты отделения ксантофилла от
Зеленых пигментов является отсутствие поглощения в красной.
области сиектрз.
оПыт З. ОМЫЛЕНИЕ хлорооиллА И ОТДЕЛЕНИЕ КАРОТИНА
Ход работы. В пробирку с мл вытяжки пигментов ирмбавляют
несколько капель спиртового раствора щелочи. Наливам 1— мл
бензина и две капли дистиллированной Воды, Сильно
встряхивают, а затем дают отстояться, Нижний, Спиртовой, слой
содер жиг соль хлорофиллиновой кислоты (продукт омыления
хлорофилла) и ксантофилл, верхний, бен. ЗиновыЙ, слой—
каротин. Определяют стектр поглощения каРотина.
63
Можно произвести омыление л после разделения слоев по
Краусу, Для этого в ту же пробирку прибазлпют кусачек щелочи,
встряхивают и наблюдают перемещение хлорофилла из верхней
фазы (бензин) в нижнюю (спирт)_ Реакция хлорофилла со
щелочью идет следующим образом:
нос1: ,— СПЗОН Т С „Г;
Ф
опыт 4, полнгУIИЕ сгЕо,ритинА и ВОССТАНОВЛЕНИЕ
МЕТАЛЛООРГАНИЧЕСКОЙ СВЯЗИ
Ход работы. В пробирку наливают 2—3 мл спиртовой вытяжки
пигментов и добавляют 1—2 калли 10¶0 „го раствора НС|, При
взбалтывании вытяжка становится бурой вследствие образования
производного хлорофилла — феофнгина (в хлорофилле атом
магния заметцаегся водородом). Реакция идет по следующему
уравнению:
со сн,
coocil,
+
,МвС12
К побуревшей вытяжке прибавляют несколько кристаллов
уксуснокислого пинка или меди, осторожно нагревают на водяной
бане и наблюдают появление зеленей окраски благодари
восстановлению металлоорганическоЙ связи.
Оформление задачи. См, разд. 1, задача 1. В каждом опыте
опишите свои наблюдения п на ах основании сделайте заключеле
о физических м химических свойствах хлорофилла.
РАБОТА З_ СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
СПЕКТРАЛЬНЫХ СВОИС„ТВ ПИГМЕНТОВ В РАСТВОРЕ И
ТКАНЯХ ЛИСТЛ
Пигменты фотосинтетического аппар ата локализованы в
мембранах и образуют лигментбелковые комплексы. отвечающие
за логлпщение света и передачу его энергии а реакционные
центры. Пигмеат-белковые и пигмент.пигменткые ззаимо•
действии, тролсходягцие в мембранах, обусловливают изменение
спектральных свойств пигментпн. Это ведет к образованию набора
различных форм лигмента, обладающих одной и той же
химической структурой, ис отличающихся спектрами логлс• щенкя
(излример, хлорофилл ае,2,
и др.). Такое разнпобразие
форм мелет к увеличению спектральной области лс• глощения
фотосинтетического аппарата, т. е. более полному поглощению
света, и обеспечивает возможность эффективного направленного
Переноса энергии света наиболее длинноволновым формам
хлорофилла а реакционных центров,
Цель работы. Сравнить спектры поглощения Пигментов в
растворе и листьях высших растений.
Реактивы и оборудованае: те же,
в работе 1 данной задачи; регвст.
рируТщай спектрофотометр СФ-14 кли СФ-'8.
Объект исследования: листья растеиий разлжциых экотМПбВ; ласгьЯ
растенай
при
различной
степени
формирования
н
деградации
фот•хннтетнце
аппарата (этиолированные и зеленеющие проростки кукурузы,
асенкне пистья клена, каштана др.)
Ход работы. Работа состоит из нескольких этапов, 1.
Приготовленње ацетоновой и спиртовой вытяжки пигментов из
лисгьез, Способ приготовления вытяжки пигментоз описан в работе
1 д анной задачи. В качестве зкстрагнрующето раствора
испольвуют 8070 -й раствор ацетона м 963,6 -Й раствор этилсвсм-п
спирта_
2. Регистрация спектров поглощения на спектрофотометре.
Порядок работы ма регистрирующих спектрофотометрах описан в
Приложении 11. Спектры поглощения растворов пигмеитов и
листьев записывают на одном бланке,
Для снятия спектров поглощения вытяжки пигме.кгов их
раствор
наливают
в
кювету,
укрепляют
в
помещают в лразую часть (ло ходу луча)
кюветного отделения спектрофотометра. В контрольную кювету
наливают чистый растворитель, На барабане укрепляют бланк,
строго следя за точностью совмещения линии 400 нм на бланке м на
шкале прибора, Производят запись спектра.
Для регистр ации спектра логлошеиия живого листа его
Поме]ЦаиЈг в специальные круглые кюветы, В качестве контроля
для уравнивания мутности непрозрачного лњста используют
пергаментную или фильтровальную бумагу, Кюветы ставят в
специальные прорези кюветного отделения и записывают спектр
поглощения
Оформление работы. См. разд. 1, задача 1.
Отметьте различия в положении максимума лрглощенцн
Пигментов в ацетоне (этиловом спирте) и в живом листе,
Рассчитайте содержание пигментов лп спектрам логлощекня,
используя формулы, приведенные в работе 1 данной задачи,
РАБОТА
4_
ИССЛЕДОВАНИЕ
ПИГМЕНТНЫХ
цидног;лкТЕРИИ Л,'.'АВЛЕЛ'А VARIABILIS-
СИСТЕМ
Цель работы. Экстрагировать хлорофилл и фикобилины из
Клеток А. variabi!is. Сравнять спектры поглощения пигментов irl
vivo в клетках д, variu,5iIis в растворах.
реактивы и оборудование: см. работу 1 данной задачи; жидкий азот;
центрифуга ЦЛС•З_
Объежт исследования; культура А. variabi!is различного возраста. Ход работы.
Культуру клеток Л, variab'!is разливают в
центрифужиые пробирки, клетки осаждают центрифугирова—
кием в течение 5 мил 4000 објмнл, Осадок из одной цен.
трнфужлой пробирки суслеилируот з небольшом объеме (З— 5
мл) культуральной Жидкости и используют для смятия сле№ тра
поглощения пигментов in vivo. Оставшиеся осажденные клетки
леренсн:ят в фарфоровую ступку и используют для извлеченнн
пигментов- Для этого клетки в ступке заливают жидкнм азотом.
Затем к ним добавляют Немного кварцевого песка и СаСОз н
растирают, добавляя небольшими порциями (по 3—5 мл) раствор
ацетона.
Полученную вытяжку сливают по палочке на стеклянный
фильтр № 3, вставленный в колбу Бунзена. Внутрь колбы по—
мещают мерную пробирку. Отсасывают жидкость лрм ломощи
апетона, растирают. скова сливают на фильтр и отсасывают
жидкость, Эту операцию повторяют несколько раз, пока раствор.
стекающий с фильтра, ле будет абсолютно бесиветен.
Вытяжку из пробирки переливают в мерную колбу объемом 25
мл и доводят ацетоном объем вытяжки до метки. Ацетоновая
вытяжка содержит зеленый пигмент цнанобактерий — хлорофилл
а,
Осадок голубого цвета, оставшийся на фильт е, заливают
водой, настаивают при помешивалли стеклянно палочкой.
Водный экстракт отсасывают с Помощью гласо•
сз в пробирку, Помещенную в колбу Бунзена, Промывают осадок
несколько раз водой до полного удаления фнкобилилов (до
обесцвечивания фильтрата) и объединяют водные экстракты.
Экстракт содержит водорастворкмые пигменты цианобак— терн“
— фикоби.шны (флкоииамнн аллофлкбцнаиан)
Спектры поглотценля суслепзлИ клеток, ацетонового
экстрзктз и водного экстракт з регистрируют На с лектгофото.
метре. Порядок работы на регистрирующих спектрофотометрах
описан в Приложении 11.
Оформление результатов. Проведите расчет содержанию
пигментов по формулам, приведенным в работе данной за дачи.
РАБОТА
5,
СРАВНГНИЕ
КАЧЕСТВЕННОГО
СОСТАВА
пигмГнтовЭукхриотных и прокхриотных ФОТОТРОФОВ
Пигментный алларат фотосинтезирующих организмов может
быть качественно охарактеризован с ислользовзаием метода.
хроматографии.
Разделение смеси лягментов на отдельные комлоиенты
проводится с помошью хроматографии на различных носителях.
адсорбентах (бумага. сахароза, силикагель, силуфол и др.). Чтобы
лигментн разделились нз сорбентах, исполызуют систему
неполярных растворителей с Примесью определенного
количества лплурного растворителя. Пигменты. обладая
неоди нановой растворимостью в данном растворителе и разной
сло
к адсорбции. передвигаются по мере движения ра•
66
створителя с различной скоростью н рјслолагаются на адсор• бенте
отдельными зонами. Чем больше растворимость Ллгмелта в
растворителе и чем хуже он адсорбируется данным адсорбентом,
тем быстрее этот пигмент будет передвигаться и тем дальше от
старта будет располагаться зона этого пигмента.
Цель работы. Разделить смесь пигментов с помощью
хроматографни н проследить, какие сходства н различия имеются в
шигментном алларате у разных Групп фототрофов.
Реактивы и оборудование: раствор ацетона; 96%.П раствоз Эти. гового
спирта: петролеПны1 эфир; этиловый эф“; гексаН; &изии: MgC03 (СТО.); Na,S04
безводный; кварцевый песок; фарфоровые ступки с песта. нами; скальпель:
ножницы; паинек; палочки; колба Бунзена со стеклянниц фильтром № З: мерные
пробаркн объемом 10 мл: мерный ли нар оСъемом 25 мл; комичесхне пробирки;
центрифужпые пробирки; пипетжН объемом 2 и 5 мл; капилляры; гилуфоловые
гластИНХН; хромато, г з нческме камеры; весн торсионные; Мектрофотометг;
центрифуга
„З; жидкий азот,
Объект исслетоаание: Листья высших растенай (гороха, ПшенВИЫ и др.)
Н культура клеток цивнобактерии_
Ход работы. Работа состоит из двух этапов. 1. Получениг
вытяжки пигментов. Для :ъолучения вытяжки лигментов из
высших растений навеску лжстьев, равную 0,5 г, тщательно
растирают з сухой фарфоровой ступке с Г безводного
и
небольшим количеством СаСОз до сухого зеленого порошка.
Измельченный растительный материал переносят на стеклянный
фильтр № З м настаивают в течение 5 мин с З— 5 мл растворителя
(смесь ацетона и этилового спирта в отноЧенки З : l)_ Небольшими
порциями растворителя из растительного лтнтоцјка на фильтре
вымывают все лигменты з пробирку, вставленную в колбу
Бунзена. Для окончательной экстракиии лиг,мелТоВ порошок
промывают лорцией этилового эфира и общий объем экстракта в
пробирке доводит растворителем до мл. Экстракт содержит сумму
зеленых и желТых пигментов,
Для экстракции пигментов из цианобактерии клетки предВарительно осаждают пентрифугированнем при 4000 објмин в
Течение 5 млн. Затем их переносят в фарфоровую ступку н
несколько раз замораживают жидким азотом оттаивают. При.
готовленные Таким образом клетки тщательно растирают с 1—2 г
безводного Na:SO, и небольшим количеством СаСОз, Переносят
на стеклянный фильтр л производят экстракцию
Пигментов описанным выше способом.
2, Хроматографическое разделение пигментов. Разделение
Пигментов производят на лласгинках снлуфола размером 5Х
Х см. Эти пластинки лредиазначены для тонкослойной хр..
Матогрзфии. Они изготовлены нз злюмлнлезой фольги, нз ко.
Торую в качестве сорбента нанесен силикагель; связывающим
Веществом здесь является крахмал, Чтобы предотвратить окис.
Ление хлорофилла во время разгонки лигментов, пластинку
Предварительно обрабатывают 10—2 М раствором аскорбиновой
кислоты.
На пластињку силуфола с помощью капилляра наносят
вытяжку пигментов (0,05—0,15 мл) полосой см на расстоянии 2 см
от нижнего края пластинки. В процессе нанесения вытяжкн
пластинку подсушивают струей воздуха, После нанесенна нужного
объема зытджки ллзстилку подсушивают до полного испарении
растворителя и помещают в хроматографическуо камеру,
предварительно насыщеипу10 смесью растворителей следующего
состава: бензин, ацетон, петролейный эфир, гексан в объемном
соотношении И) : 10: 3 : 10. Вытяжку пигментов из высших
растений и диапобактерий накосят на одну
Объект исследовария: листья высших
ротищ 2 эхиаелоа, З растений (например, приутулы),
феофитин,
Ксантофиллы, 5 — хлора илл а,
6 — хлорофилл Ь,
— лютепп + зеаксантин,
РАБОТА 6, РАЗДЕЛЕНИЕ ПИГМЕНТОВ МЕТОДОМ ХРОМАТОГРАФИИ И
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
ОСНОВНЫХ кдротинОИДОВ ЗЕЛЕНОГО лис.ТА
в работе 5 данной задачи,
ставлен на рис. 11.
Рис. 10, Распределение отдельнзх зон пигментов выс-
Ход работы. Для решеиия задачи надо лолччить вытяжку пигмен-
то в, отделить каротин, лютеин и
виола ксантин, а также определить
лаксаатин, 10 — неоксантин,
концентрацию каротиноидов.
, Получение
пигментов.
инксосантофил
Методика получения вытяжки
8— антерзксантун. 9 — в
пластилку.
Разгонку проводят в сосудах с 11Лптно закрытой крышкой,
затемнен:ных черной бумагой, После того как фронт
растворителя поднимется вверх (ме доходя 2 см дг» края
пластинки), хроматограмму вынимают и высушибают под
струей воздуха. Идентифицируют пигментные зоны (риг 10)
Оформление ра боты. Полученкую хроматограмму наклейте
в тетр адь, Отметьте зоны пигментов. Опишите различия
пигментных
систем
двух
Е
сг.медованных
групп
отосантезирующих орга низмпв. подробного оформления
задачи см. разд. 1, задача 1.
ших растепий
4 — минорные
Для
Цель
работы.
Отделить
количе
каротиноиды от хлорофиллов и
ственн
определить
ого
их содержание в зеленых листьях.
опреде
Реактивы и оборудование: те же, что
ления
л, 12— старт
58
вигментов из листьев растений описана в
работе 4 данной задачи. Смесь для экстракции
пигментов содержит спирт и ацетон в
отношении 1 : З,
2.
Хроматографичсское
разёеление
пигменгоз. Разделение пигментов производят
на силуфоловых пластинках размером
1 5
гм. Пигменты наносят капилляром пп всей
ширине пластинки, отступая 2 см от лижнего
края пластинки и но 1 см от боковых краев.
Объем наносимой вытяжки: 0,5—0,8 мл.
После тщательного подсушивания пластинки
в токе возд\'ха проводят хроматографическое
разделение пигментов, Условия проведения
разгонки пигментов те же, что в работе 4
данной задачи, Порядок расположения
отдельных зон пигментов предкаротиноидов необходамо получить две-три
хроматограммы.
З,
ОпрсДеление
концентрачии
карогиноиДов. Окр аш енные зоны, соответствующие каратину и ксантофиллам
(неок
са
нтин,
виолакс
антин,
антероК
сантин,
лютеин
+зеакса
птин),
соскабл
ивают
скальпе
лем
с
2—3
хромато
грамм,
зоны
одноиме
нных
пигмент
ов
соединя
ют
и
помеща
ют
в
пробирк
и
с
притерт
ыми
пробкам
и.
Пигмен
ты
элюиру
ют
следую
щ
и
м
и
ра
ст
во
р
ит
ел
я
м
н:
ка
р
от
и
н
—
п
ет
р
о
л
и
н
е
й
н
ы
м
э
ф
и
ром,
ксантоф
илЛы — этанолом.
Эмоцию производят при встряхивании проб, затем элюат
фильтруют через бумажный фильтр з мерные пробирки с
Рис. 11. Распределение пигментов на Хроматограмме: 1 — #-каротнп,
2 — феофнтиа, З— хлорофилл а. 4 — хлорофилл Ь, 5 — лютеин -4
зеакс3НтИН, б — виолаксентин,
7 — пеоксаатии, 8 — старт
притертой пробкой, фильтр несколько раз промывают
соответствующим растворителем и объем доводят до 3 мл,
Пробы промеряют на спектрофотометре; каротин — при
452 нм, лк-ттеин — 445, виолзксантан — 442, неоксантин — при
438 нм,
Концентрацию пигментов С рассцитывают
формуле
С, а!л-Ща1,
Где D — оптическая плотность при соответствующей длине
волмы; а — удельный коэффлциент погашения, • „—1 • см— (для
Каротина — 260, лютеииа — 2,68, вколаксантииа — 225,
неоксапТипа — 227); [ — толщина слоя раствора, см.
6
9
Содержание каротиноидов на 1 г сырой массы растительного
материала А (мтјг) определяют по формуле
где С — концентрация пигментов, «л; V — объем вытяжки, мл (10
мл); К — отношение объема элюата к общему объему вытяжки,
нанесенному на хроматограммы; Р — извеска растительного
мзтеризлз, г (0,5 г).
С
функционированием
солряжежы
реакции
фотофосфорилировання и создзння мощного восстановителя. в то
время как ФСП связана с реакциями фотоокнслеиия воды.
Продукты, обр азуюшиеся при возбуждении ФСП, используются в
реакциях, сопряженных с ФС[. Взаимодействие двух фотоснстем
осуществляется через промежуточные компоненты ЭТЦ
фотосинтеза.
Оформление работы. См. разд. 1, задача 1. Данные опыта
поместите в табл. 10.
Таблниа Ш
А, мг(г
С.
ЗАДАЧА З. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Фотохимичгской АКТИВНОСТИ
хлороплАСтов
На тачальных этапах фотосинтеза энергия света используется
для переноса электронов з электрон-транспортной непи (ЭТЦ)
фотосинтеза. При этом образуются восстановленные соединения
(НАДФ.Н' и АТФ. Эти соединения являются Первымн стабильными
«консерваторами» световой энергии. В результате фотоокисления
воды выделяется молекулярный кислороД.
В настоящее время доказано, что изолированные хлоропласты
являются полноценными фотосинтетическими структурами н
способны осуществлять все этапы фотосинтеза. Световые
фотохимические реакции происходят в пигментсодержащих
мембранных структурах пластид; фиксацхя СО, и темновые
ферменгативиые реакнии протекают в основном в строме
хлоропластов, где сосредоточены и стпветствующие ферментные
системы,
Организация цепи переноса злектроиов хлоропластов (ЭТЦ
фогосинтеча), наиболее признанная в настоящее время, предст
авлеиа на рис. 12. Опа включает две последователы:о протекзющие
фотохимические реакпии, которые осушесгвляются за счет световой
энергии, поглощаемой двумя разными фотосистемами: ФС1—
длинноволновой с пигментом Пто в резкцис,нном центре и ФСП —
коротковолновой с реакщиоюным центром, включающим пигмент
[1€. Две фотосистемы осуществляют различные функции,
Рис. 12. Схема электрон-транспортной цепи фотосинтеза, — пигмент акциозного
центра ФСП; — пигмент реакционного иентрз ФСЛ; П Возбужденное состоямие
пигмента; Пх — — пластоЦП2НИН', Фд растворимый ферредоксин; Феи —
феофнтиа: фп — флавопротеан (ферредокспн-ГIАДФ-редуктаза); щит. Цит, Г —
цитохро№ы; До, — первнц
зк«еп-горы злехтроаов ФСГ FeSA, FeSB, FeSx —
связанные Железосеране белки. акиепторы элекгронов ФИ; FeSk — железосерный
белок Риске: М— система фотоокисдсапя виды: ОА, Ов — акцепторы электронов
ФСП
Плаетохннозавой кислоты; Z — донор электроназ ФСП; контурами обведены
структурно•функционзльннс комплексы ЭШ
Как видно из приведенной на
фотореакциях происходит запасание
Между
двумя
фотосистемами
ОбразовавШиеся молекулы НАДФ•Н
рис. 32 схемы, в обеих
энергии, а па “3стке цепи
—
ее
высвобождение,
гг АТФ, в которых световая
энергия Преобразована и «запасена» в виде химической энергии,
участвуот в последующих реакниях восстааозлеляя СО,
Одним
из
показателей
фотохимической
активности
хлороПластов является реакция Хилла, Ола представляет собой
комПлекс начальных стадиЙ фотосинтеза, связанных с
фотоокисле71
нием воды, в которых мобилизованные из воды при участии ФСП
электроны направляются на восстановление введенных в
реакционную смесь акцепторов электронов, фотовосстановление
акцептора сопровождается выделением кислород а :
02,
где А— акцептор электронов.
Эта реакция была открыта в 1937 г. англичанином Р. Хиллом
(R. Chill) и названа его именем. Он обнаружил, что изолировзнные
хлоропласты при освещении способны восстанавллват:, желе5о
одновременно выделяя кислород. В дальнейшем было
[Оказано, что изолированные хлоропласты могут восстанавливать
на свету не только железо, но и ряд других соединений:
окислительно•восстановительные индикатоы, бензохинон, а тажже
естественный акцептор электронов — ћАДф. Таким образом,
реакция Хилла, в которой хлоропласты производят разложение
воды и восстанавливают какойлибо окислитель, добавленный
извне, представляет собой наиболее простую моДель первичных
стаДиа фотосинтеза.
В отношении спектра действия, чувствительности к
специфическим ингибиторам и различным физическим и
химическим факторам реакция Хилла весьма сходка с процессами
фотосинтеза в целом. Поэтому ее используют в качестве
физиологиче• скоЙ характеристики состояния растений.
На изолированных хлоропластах могут быть охарактеризованн
базальный поток электронов (поток электроков без экзогенной
фосфат„акпепторпой системы, т. е. без АЛФ), сопряженнь!й лпток
электронов (поток электронов, связанный с синтезои АТФ и
индуцируемый экзогенными АДФ • Фа) и разобщенный поток
электр.онов (поток электронов в присутствии разобщителей,
например NH4Cl). Сравнение скорости реакции Хилла в этих
услпвнях может служить характеристикой работы системы
сопряжения синтеза АТФ с переносом электронов в ЭТИ
хлоропластов,
Для определения скорости реакции Хилла могут быть
использованы полярографический метод, регистрирующий
количество выделенного в реакции кнс„тпрпда, а также
спектрофотометричес,кий
метод
определения
скорости
Восстановления акцепторов электронов,
Определение фотохимической активности хлоропластов
(независимо от метода) включает следующие стадии: 1) выделение
хлоропластов, 2) проведение реакции, З) определение содержания
хлорофилла в суспензии хлоропластов, 4) расчет фотохимической
активности.
Цель задачи. Определить скорость реакции Хилла и
исследодать некоторые факторы регуляции фотохимической
активности хлоропластов,
Объект исследоваиия: проростки гороха, пшеницы, кукурузы, выращен72
ные в различных условиях водоснабжения, минерального питаиия,
освеще
растения разного возраста; семядоли тЫвы; поработанные регуляторам“
роста и развития растений.
РАБОТА ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛКТИВНОСТИ РЕАКЦИИ ХИЛЛА В
ХЛОРОПЛАСТАХ ПО скорости ВОССТАНОВЛЕНИЯ
АКЦЕПТОРА ЭЛЕКТРОНОВ
Акцептором электронов в реакции Хилла могут быть соли
трехвалентного железа, например k3Fe(CN) (нормальный
окислительно-восстаповителнный потенциал Е = 0,36 В),
окклите.льпо-восстановите.чьные индикаторы, например 2,5дихлорфенолиндофенол (Е! —0,22 В) , физиологические акцепторы
электронов — хилопы, цитохромы, НАДФ+. Место зключения
акцептора электронов в ЭТЦ завл.сит от его окислительнопос
потенциала.
Определение активности реакции Хилла хлоропластов по
скорости восстановления акцептора электронов основало а а
различии спектров поглощения окисленной и восстановленной
форм акцептора электронов. Восстановительная активность
хлоропластов оценивается спектрофотометрически по разности
оптической плот постм освещенных и темповых проб при
оттределенной длине волны. Скорость реакции может быть
измедена путем внесения в реакционную смесь фосфатакцепторипй системы (АДф) или разобщителя (NH4Cl).
Цель работы. Определить в различных условиях эксперимента
скорость потока электронов в ЭТЦ фотосалтезз по скорости
восстановления феррициаг:ида калия
Реактивы и оборудование: среда выделения (0,3 М NaCl в М фосфатном
буфере. рн 5,9”; ГЛ мм ЗО мм АЛФ РН 7,8; 2П%-й раствор трахлоруксусной
кислотн (ТХУ); 1 М СНјСООХа;
И растворы аиетана; фарфоровая ступка с пестиком; цеит•
рифужные пробирка; мерные каландры объемом 25 и 60 ул; мерязя пр(в бурка
объемам 10 Мл; коническая пробирка объемом 10 мл; пробирки, ноничеекие колбы
объемом 10—20 Мл; пипетки объемом 1, 2, 5 н 10 мл: стекляниые вороти; колба
Бунзена стеклянным фальтром Х З; тефлоНовый соуоген“ззтор; полотно:
стеклянные палочки; теилзя банка; лед; бума:нные фильтгы; центрифуга ЦЛС-З;
техишческле весы; спектрофотометр Оли Спекплј.
Объект исследоватия: листзи гороха.
Ход работы. работа состоит из нескольких этапов. 1. В5!Деленце
хлоропластов. Выделение хлоропластов производят В
0—408.ВОдной Все п оцедуры среде методом выделения
дифферегщиального хлоропластов ведут центрифугирования.на
холоде при
З мл среды выделелия и перелосят в Гомогенизатор,
гомогенизируют до получения однпродной смеси. а затем
помешают в мерный ц нлнпдр. Цептрнфужлую пробирку и
гомогенизатор ополаскивают небольшими порциями среды
выделения для полного перенесения хлоропластов в цилиндр.
Конечный объем суспензии в шилиндре— 12—15 мл.
Суспензию хлоропластов храпят на льду в темноте.
2, ПровеДение реакции Хилла в различных условиях
эксперимснта. Опыт проводят в конических колбах небольшого
объема. Ниже приведена схема опыта.
Номер колбы
а) Получение гомогенага_ Навеску листьев 2 г (предвариТельно
помещают в полиэтиленовый пакет или во влажную
Слет+АДФ
Свет+ЛДФ
Темаота+АДФ
Темнота+АДф свет —
АДФ
свет
—
темнота
—
Темнота — АДО
Возможны варианты ерелы выделения хлоропластов: 1) М NaCl 0,06 М
фосфатном буфере, Н 8,04: 2) СА М сахараза и 0,01 М NaC1 в М фосфатном
буфере, 5,9; З) М сахароза и М NaC1 в М фосфатном буфере, 8,04.
73
фильтровальную
бумагу
и
охлаждают в течение 10—15 мин в
холодильнике или в ступке ни льду) размельчают кожлидами и
затем растирают в фарфоровой стулке на льду в течение
млн с
15 мл среды выделения, (Изменение объекта иссле. дования
требует применения соответствующей среды выделекия
хлоропластов, Возможные варианты среды см, в Приложе нми к
этой задаче.)
Полученный гомогенат фильтруют через полотно в фарфо.
ровую чашку и переносят в иенгрифужпую пробирку.
б)
Палу
чение
суспензии
методом
Дифференципльного
центрифугирования,
Фильтрат
в
центрифужной лрп• бирке уравновешивают водой с другой
центрифужной пробиркой, Проводят первое пент?ифугировалне
при 800 в течение 5 мин. Осадок, содержащий обрывки тканей,
ядра, разрушенные клеточные стенки и другие фрагменты,
отбрасы• ватт. Супернатант центрифугируют 10 мин при 3000
об,умнн (второе центрифугирование). Полученный осаДок
(содержит хлоропласты) гомогенизирукуг в центрифужной
пробирке стекляннп(ћ палочкой или кисточкой с 5 мл среды
выделения с целью промывания хлоропластов. Проводят третье
центрифуги, Рона ние — 10 мин при 3000 об!мин.
Таблица
Сулернатант отбрасывают, а осадок перемешивают с
С у мм а р ны й
о б ъе м
реакц иониой
смеси
П
риме
чани
е.
Прис
утств
ие и
отсут
ствие
АДф
обоз
наче
но
а мл
соответственно знаками + и —
В каждую колбу налива от реакционную смесь. Составы
реакционной смеси приведены в табл.
С еда выдеМеНИя
2,85
0,13
0,15
1.0
0,15
Хлор опластЫ
Тем ловые варианты помещают в темноту, а световые освещают
в течение 5 мин на специальной установке (рис. 13).
После выключения света в снетовые пробы сразу же добавлят
мл тху и 2 мл С.Н3СООК'а, затем те
же реактивы приливают в темновые
варианты.
Пробн фильтруют через Двойные
бумажные фильтры. Палу ченные
фильтраты промеряют на
спектрофотометре или Спеколе при
1—420 нм (контроль— вода)
З. ОпреДеление хлорофилла д
суспензии хлоропластов. В мерную
пробирку вносят 1 мл суспензии,
мл дистиллировапиой воды
раствором ацетона доводит
объем до lD мл,
Раствор хорошо -перемешивают
н
фильтруют
в
коническую
пробирку через стеклянный фильтр ЛЬ 2 л,лн № 3. Полученный
фильтра г промеряют на спектрофотометре или рис. •13. Установка
для
опредеСпеколе
при
i=i36'2
нм
(контроль
тофосфорнлнровааия: фотосннтеллегкого
8004-й раствор
ацетона). Измерен- пэр, 2 — вращающийся диск с ную оптическую
плотность раствора кс.аПами, З — кристаллизатор С
(контроль
800/0 -Й раствор водой, 4 — штатив. 5— защитацетона).
Измеренную оптическую Нын лампа кожух накаливания для
лампы; (500 Вт)б —
плотлость раствора D,i32 используют 7 — термои€<гр для расчета
содержания хлорофилЛа в суспензии хлоропластоз. 1 мл суспензии хлоропластов
содерЖит 0,29 [_)652 мг хлорофилла (расчет коэффициента 0,29
приведел в задаче 4 данного раздела).
4, Расчет скорости реакции Хилла, Активиость переноса
электронов в УГЦ фотосинтеза выражают в мкмолях
хлорофилла
Формула для расчета активности реакции Хилла:
Оформление работы. См. разд. 1, задача 1. Полученные
зультзты в1:есите в табл. 12. Сделайте выводы о влиянии Л ф на
скорость потока электронов в ЭТЦ.
Таблиц э 12
Вагн.нт(.
рофИт•1 ч—
РАБОТА 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОТОХИМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
хлоропл№тов ПО СКОРОСТИ ВЫДЕЛЕНИЯ КИСЛОРОДА
(ПОЛЯРОГРАФИЧЕСКИМ МЕТОДОМ)
Фотоиндуцируемый перенос электронов в ЭТИ, сопряжен
выделением кислорода з ФСП (см, рис, 12), Поэтому скорость
выделения кислорода изолированными хлоропластами на све• ту в
присутствии экзогенного акцептор з электронов может бЫть
использована для характеристики фотохимической активкости
хлоропластов.
Цель работы. Определить фотохимическую активность
хлоропластов по скорости выделения кислорода в различных
условмях эксперимента.
реактивы и оборудовадие: среда выдеаеаня (0,3 М раствор NaC! в
0,06 М фосфатном буфере, ЭН 6,9); 35 мм раствар .\1gCl,; 7,5
раство
ЗО „М МФ; 7,8: 35. Ш— М раствор 35, М раствор диурона; М раствор
и растворы ацетона: фарфоровая ступка г Пестиком; центриружнме пробирки —4
шт.; мерный пилидр объемом 25 И 50 мл— 2 ШТ, ; мерная пробирка объемом 10
мл— шт; коническая пробтрка объемом 10 м: — 1 шт; пипетки объемом 1, 2, 5 я
мл; калбз Бунзена со стеклянным фильтром № З: Шпришы (Веном 1 мл— 4 шт.:
тефлоновыП гомогенлззтор; иолотНо, стеклянные палочки; темная банка; лед;
дентр“фуга тек, НИЧескИе весы; спектрофотометр; полярографическая установка с
термостатируемой ячейкой,
Объект исследовалия: листья гороха.
Ход работы. Работа состоит из нескольких этапов. 1. Выбеление
хлоропластов, Метод выделения хлоропластов описан в работе 1
данной задачи. 2. ОпреДеленце скорости зыДелекия кислороДа
хлоропластами полярографизеским методом, Теорля метода
№лпжена в разд. [V, Определение лплярографическкм методом
проводят на специальной \'становке, Блок-схема устаНовки (см. рис.
30) и порядок работы на Мей представлены в Приложении П.
Реакционную смесь готовят непосредственно в полярогра76
теской ячейке. Объем ячейки 3,5 мл. В ячейку вносят: мл (СМ)
6 (колечная концентрация в реакционной смеси
мм), мл
(конечная концентрация в реакционной смеси мм), 2,4 мл
суспензии хлоропластов. После залолпеаия ячейки плавно,
ввинчизаюгдим дзижелием опускают крышКУ, следя за тем, чтобы
лод крышкой не осталось пузырька воздуха.
Включат двњжение диаграммной ленты самолисца и В те»
нение нескольких минут (в темноте) запись исходного содержалия
кислорода в реакционной смеси, После установлевия •прямпй лини
включают свет (отметить па диаграмме мо. мент включения света)
и регистрируют изменения содержания кислорода в реакционной
смеси в течснки 2—3 мин. Запись отражает скорость базального
потока электроном з ,ЭТЦ фотосинтеза.
Для реглстрации сопряженного потока электроноз в ячейку
через отверстие в крышке шприцем вносят мл раствора АДФ
(конечная концентрация мм). На длзграмиаой ленте отмечают
момент внесения ЛДФ и лрсвп_ля-т запись в течение 2—3 мин.
Для исследования разобщенного транслпрта электроиэв в
ячейку шприцем вносят мл раствора NH,Cl (конечная
кпацег:трация М)
При изучении дейс«гвин ингибиторов в реакционную смесь
через отверстие н крышке при помощи шприца вводят
мл
диурона (конечная концентрация в реакционпсй смеси 10—3— 10—
4 М) или гидроксиламлпа (конечная концентрация М).
Все добавки делают, не выключая свет,
3. ОпреДеление хлорофилла в сцспењзиц хлороплостов.
Метод определения хлорофилла в суст:ензми хлоропластов описан
н работе 1 данной задачи.
4. расчет активности реакции Хилла. Активность переноса
электронов в ЭТЦ фотосинтеза выражают в мкмплях 02,
Хлорофилла Для расчета необходнмп предварительно прп•
вести калибровку электрода,
а) Кол ибровка электрода по кислороДу_ Цель калибровки—
определить цену деления мм (1 см) диаграммной лечты по
кислороду и выявить прямолинейную зависимость локазаний
электрода от колцентраиии кислорода в среде. Калиброику можно
проводить с использованием N32S03, либо суслеа• зин дрожжей
(биологическая калибровка по
В обоих случаях обеспечивается обеднение по кислороду
среды, находящейся в ячейке. Разинин между начальным со,
держанием 02 в среде и конечным, нулевым на диаграммной Ленте
будет соответствовать тому количесгву кислорода, котоРое
находится в среде при далных ионном составе, температуре,
давлении, Злая растворимость О! при данных условиях (по Табл.
13 находят количество кислорода, мгјл дистиллирован77
Т а б ли
13
Завигну«ть содержаний растворенного в дистиллиров•ииой Воде
КИСЛОРОД“ ( мед) ОТ температуры ПРИ
давлении
0,101 МПа и парциальном давлени О, 20,94
20
21
22
9,74
9.36 .
9.23
23
24
876
9,70
9.53
9.36
9,19
9,03
873
953
9,49
9.33
885
8,70
8,56
9,45
9.29
9.13
8,97
8.82
8,кн
950
9,42
851
ной воды), рассчитывают его количество в объеме ячейки.
Основываясь на этих данных н зная величину отрезка дна.
граммной ленты, соответствующего данному содержанию
кислорода, можно рассчитать цену деления диаграммной ленты В
икмолях
Пример расчета. При 20' С
в 1 л дистиллированной воды растворяется 9,39 мг 02 » 3,5
млх МГ О:
25
8,'62
8'59
S,54
9.39-35
—32,87 • 10—3 мг
• 10—3 мм
Таким образом. ячейке содержалось 1,027 мкмоль кислорода_
По калибровке ЗОО мм — отрезок на днаграммной ленТе от
начального до конечного (нулевого) уровня кислорода в ячейке, т.
е, ЗОО мм длаграммной ленты соответствуют 1,027 мкмоль 02.
Отсюда 1 мм диаграммной ленты соответствует
мкмоль
0) Расчет по Диаграммной записи (см. рис- 8) . 1. Из любой
точки экспериментальной линии опускают перпендикуляр а к
горизонтальной липни и измеряют его веллчину, мм, Эта величина
соответствует изменению концентрацаи 02 в ячейке за время,
соответствующее отрезку 6_ Исходя аз калибровки цены деления
диаграммной лепты в мкмолях О, (см. выше), определяют эту
величину в мкмолях 02.
2, Измеряют величину отрезка б. мм, и тсходя из скорости
движения диаграммной ленты, выражают ее в единицах вре• менв,
ч,
З. Зная количество ютслорода. выделившегося за время б.
рассчитывают количество кислорода, выделившегося за ч.
4, Пересчитывают количество кислорода, выделившегося за 1
ч, на I мг хлорофилла (учитывают количество суспензчи
хлоропластов, внесенное в ячейку, и величину рассчитанной
концентрации хлорофилла в суспензии).
Оформление работы. См. разд. 1, задача 1. Результаты за.
бишите в таблицу. Рассчитайте активность базального, сопря•
женного и разобщенного потоков электронов в хлоропласта к.
Оцените Степень воздействия АДФ, разобщите.пејб л ингибиторов
потока электронов на скорость переноса электронов в ЭТИ
фотосинтеза (за [00% принимают скорость базального потока
электронов).
замыкается, Окисленная форма пигмента восстанавлилается л при
возбуждении снова может служить источником для циклического
процесса.
Во время описанного процесса электроны движутся по
градиенту окислительно•носстановлтельного потепиаала. Этот
перемос электронов сопряжен с сантезом АТФ. Таким образом.
энер79
гия света, поглощенная
ментом реакционного
центра, фиксируется в
вале
ЛТф.
Процесс
циклического
фотофосфорзлирозания
ке
сопровождается
выделением
02
или
синтезом
восстановленных
кофакторов н может
быть
представлен
следующим образом:
ЗАДАЧА 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ циклического
Фото•оСФорилнроВАния хлороплдстов
Опыты с изолированными хлоропластами доказали, что при
фотостпезе энергия квантов света, поглощаемая хлорофиллом,
переходит в энергию химических связей молекул АТ ф. Этот
процесс назван фотосинтетическим фосфорилированием в отличие
ог
окислительного
фосфорилирозання
при
лыхани“.
Фотофосфорилированне на хлоропластах Ш пината было открыто
в 1954 г. Арноном.
Согласно
теории
электронного
погокп
Аргона
индуцируе
светом ток электронов в хлоропластах сопряжен с
опразованиеч АТф, Свободная энергия. необходимая для синтеза
АТФ, высвобождается в определенных участках ЭТИ. где
происходит перенос электрона Ло граднелту термодинамического
потенциала. Пра наличии сопрягающих механизмов эта свободная
энергия может бњгь зафиксирована в макроэргиче• схих связях
АТФ. В настоящее время известны два основных типа
фотофосфорилировання: циклическое ненаклическое.
Ци,иическое фотофосфорилированне сопряжено с инклНЧе•
ским потоком электронов, при котором удаленный из
фотовозОужденной молекулы хлорофилла электрон возвращается
к ней по замкнутой системе переносчаков кофакторэв (рис, И).
В реакциях циклического фотофосфорнлированая уааствует
только фС1. Под действием света электроны возбужденной
моЛекулы хлорофилла принимаются акцептором Ло с потенциалом
— В и груплой FeS•coeAHHeHBh (Е —
Затем электроны Переходят к железосодержащему белку
Ферредоксину, который при этом восстанавливается. а от него— к
цитохром Ь6Л-комплексу. На последнем этапе, растратив энерГаю.
полученную лрН переходе В возбужденное состояние, элек• троны
возвращаются на свои орбитали в молекулах хлорофилла а, Цикл
АД Ф + фи
ф.
Существует
несколько
путей
илклаческого
транспорта электронов,
сопряженных
с
фотосантеглческнм
фосфориллрованлем.
Они
разлачмотся 110 включению
разных
кофакторов
и
энергетической
эффективноРазличные
пути
инкллче• с косо транспорта
электронов
обеспечивают
назболее
эффек•
тинную
работу ЭТИ При нзме. нении
условий существования
растений,
Рис. 14, Схема мклического
фотофосфорнлнрованкя; Л,
В экспериментальных услониях для образования АТф
акиелтор ФСГ,
— пигмент реакционного центра
ФСП Пц — лластощип•
Фд — феррело«снн, Цит.
азолированннми хлоропластауа необходимы
как источ-
нак энергал. основные компо•
ненты фосфориллрующей сижелезосерные белки
стемы—
ЛДФ,
Mg2+
и
кофакторы, которые служат
промежуточным переносчиком электронов. К кофакторам ии•
клического фотофосфорнлированая относят ферредоксин (фл
феназинмстгасульфат (ФМС) , флаззнмононуклеотнд (Ф МН
витамины Кз.
Ь, Цит. ' — цитохромы, FcS —
Цель работы. Определить активность циклического
фотофосфорлларования в хлоропластах высших растений в
завнснмо• сти от условий выращаванля н онтогенеза растенай. В
качест— ве кофактора исполызовать ФМС.
реактивы оборудование: да выделения (0,35 М раствор NaCl в 0.05 М
грис•НС1 буфере. РН 0.6 М раствор NaCl; М раствор
MgCl,;
М раствор
1 'мм
ФМС; 0.1 М раствор АДФ,
РН 7,8;
раствор ТКУ; 1 М раствор CH,COON3; 02 М ацетатный
Су„снтгнфужныс арг,бнрки фильтром объемом пробирки: № З; мл; лабораторные
мерные коническая цилиндры пробирки; пробирка; обнвом малеинкие ксм“. 25
80
Бунзена и воронки: 30 уз; со стекляи•Мерныеколбы
объемом 25 ил: стеклянный стакан обт.гмом 50—100 мл; ступка е пестиком;
зефлоиовый гомогенизатор; пс„томно; ножницы; скальпель; бумажные фильтлед;
цептрафута ЦЛС•З; весы техническне: спект№фотометр; ФЭК. Объект
исследования: проростки гороха, пшеницы и других растений. Ход работы.
Определение фотосинтетдческого фосфорилнро• вяния растений включает четыре
этапа: выделение хлоропластон; проведение фосфорилирона мня: определение
фосфора в реакционной смеси; определение содержаная хлорофилла су-
спензни хлоропластов.
Выделение хлоропластов. Навеску листьев (4—5 г) размельчают ножницами, растирают в предварительно охлажденной
фарфоровой ступке с кратным (по массе) количеством среды
выделения. После растиранля гомогенат отжимают че• рез полотно
в фарфоровую чашку н переносят в центрифужную пробирку.
Первое центрифугирование проводят пра 1000 об/ман в те.
цение З мин. Осадок, содержащий обрывки тканей, ядра,
разрушенные клеточные стенка н т, л., отбрасывают, а надосадоч•
кую жалкость переливают в другую центрифужную пробирку. Дли
осаждения хлоропластов суспензию центрифугируют в теченле 7
млн ирл 3500 отмин. Надосадочну.о жалкость сллвают, а
полученный осадок хлоропластов суспендиру!от в тефлоновом
гомогенизаторе с 7 мл среды выделения. Полученную суспензию
хлоропластов помещают в банку со льдом, защлщенную от света
черной бумагой.
2, Проведение фотофосфорплнрованая. Для Проведеная
фотофосфорллзрования готовят реакционную среду, состав
Которой приведен в табл. Н.
Растворы для реакционной смеси, кроме АДФ и ФМС,
приГотавлнвают заранее на бидзстиллированной воде и хранят в
холодильнаке. АДФ ФМС готовят непосредственно перед опытом,
я тогда все Компоненты реакционной среды сливают Вместе.
Реакционную среду Готовят сразу на Четыре колбы (две
Олытные на свету н две контрольные в темноте для одного
Логического варианта). Каждый
реакционной
смеси берут в пятикратном объеме (табл. 14'.
В каждую колбу наливают по 2 мл реакционной смеси и Мл
суспензла хлоропластов. В контрольные колбы сразу добавляк;т 1
мл раствора ТХУ мл CH3COONa, Опытные колбы освещают
течение 5 мин (схема установки показана на Рис. 13). Следить,
чтобы температура воды в ванне не превыШала 20 Для ее
регулирования можно использовать лед.
Осле освещения з каждую колбу быстро добавляют по 1 мл Тху и
мл СНзСООХа. Содержимое
колб
фильтруют
через
бУмажные фале,тры в проблрки и в фильтрате определяют
соДержание неорганического фосфора методом Лоури.
Т а блица [4
Состав реакционной среды для циклического фотофосфорилиропания
в
Т нс.НС1 буфер, рн
45
(бидиетиллиропаниай)
Общий объем
2,0
3, Определение
фосфора в реакционной смеси
по методу Лоун. К 0,5 ул фильтрата добавляют мл
61'дистиллированной воды, Затем в пробирку прибавляют 2 мл 4
мл ацетатного буфера; мл аскорбиновой каслоты, Через [0 мин приливают мл раствора
Через мин
плотность раствора фосфорномолибделовой сини измеряют на
ФЭКе в кювете см с красным светофильтром (коптроль — вода).
Концентрацию фосфора в растворе определяют по
калиброночной
кривой.
Показателем
фосфорилиру:ощей
активности хлоропластов служит убыль неорганического фосфора
за
время
инкубации,
Фосфорллирующую
активность
изолированных хлоропластов выражают н микрпмп.аях фосфора за
I ч в расчете на мг хлорофилла,
4. ОпреДеленис хлорофилла в суспензии хлоропластов. Для
расчета фосфориллрующей актлвности хлоропластов на 1 мг
хлорофилла необходл_мо определить содержание хлорофилла в 1
мл суспензии. С этой целью к 1 мл суспензии хлоропластов
добавляют мл Н2() и 8,0 мл 10096-го раствора ацетона, Раст, вор
фильтруют через стеклянный фильтр № 2 или 3, Затем объем
фильтрата дозодят 80%-м раствором ацетона до мл н измеряют
оптическую илот“асть раствора на спектрофотометре при 1—652
нм (копт роль — 80%-й ацетон). Содержание хлорофалла в
миллиграммах н 1 мл исходной суспензии можно рассчитать,
умножая оптическую плотность DBS2 на коэффицнент К:
к—
—0,290.
345.1,а
Оформление работы. Результаты обобщите в виде таблицы (см,
табл. 15), Для подробного оформления задачи см. разд. 1, задача 1.
82
ЗАДАЧА 5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФотоиндуцируЕмых
ИЗМЕНЕНип рн В суспензии хлоропластов
ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКИМ
МЕТОДОМ
перенос электронов по ЭТЦ фотосинтеза
сопровождается формированием на мембранах тихакоидов градлен
та электрохимического потенциала понов водорода Аџн+. Этот
потенциал складывается аз разностн электрического иотенцаала н
трансмембранной разности РН (А рН):
Согласно
хемиосмотической
гипотезе
Митчела,
поддерживаемой в настоящее время многлми учеными, этот
электрохимическлЙ градиент протонов служат Движущей силой
синтеза А ТФ н хлоропластах.
Для начала синтеза ЛТФ в хлоропластах необходимо
формировапие д рН, и МГ, равного 100 мВ.
Дне составляющие — электрическая и концентрационная —
по-видимому, взаимозаменяемы при синтезе АТФ; доля каждой аз
них в процессе синтеза АТФ может быть различна.
Преобразование энергии электрохимического градиента протонов в форму макроэргических связей АТФ осуществляется
ЛТФ•сгжтетазным
комплексом
хлоропластов
связанHF,iM с мембранами талаколдов.
Полагают, что энергия Аџн. используется либо на синтез АТФ,
либо на высвобождение уже синтезированной ЛТФ нз
реакципнного центра фермента,
Т а ' лица 15,
К(«цен-
ИзмеКИНе содерКгмцен•
розьмкг,'м
л
ТВТнота
(кбатрскть)
Свет (опыт)
Формирование электрохимического потенциала Н+ на мембран
ах тилакоидов объясняется определенной оргалнзацией ЭТЦ и ее
локализацией в мембране. В состав ЭТЦ хлороплаСток входят
перелосчики электронов (интохромы, железосер11ые
63
белки, пластоцианин), а также переносчики электронов и про.
тонов (пластохиноны). Чередование этих переносчиков и их
определенная организация н мембране приводят к зозможпости
разделения заряда на мембране тилаколдом, а также к
формированию
градиента
концентрации
ионов
между
строма,тьным
и
внутритилакондным
пространствам
д
хлоропластов па свету. Собственная непроницаемость мембраны
для протонов позволяет сохранить индуцируемый на свету
электрохимический тра. диент НФ.
На рис, 15 лрелстанлена схема локализации ЭТЦ в мембране,
отмечены места, связанные с образованием Л рН. В формированни
быстрого (20 нс) электрического потенциала на мембране
основная роль принадлежит реакционным центрам н разделению в
них зарядов. Дальнейшее разделение зарядов и образование ДРН
связано с работой ЭТЦ на уровне пула пласто-
Рис. 15. Расположение электрон-транспортных камллексоа и АТФ•саптетазы в
мембране тилакоидов с указанием мест транслокации (обозначение пунктирам)
протонов: обозначения те же, что на рис. 12; CFm—CFt — АТф-синте•
иомпзеКс
хинонов, системы фотоокисления воды, восстановления НАДф+
(время прохождения этих процессов пт 300 мкс до мс)
Транслокация НФ и разделение зарядов на мембране (плюс —
на внутренней стороне мембраны, минус — на знеш• ней)
приводит к электрогенному движению других ионов (в
хлоропластах в оснонпом Mg2+ и Cl-) , направленному На
нейтрализацию электрическо:, компоценты елскгрохимпчсского
потею пиала, В стационарных
функционирования
хлоропластов МГ поддеожьвается на уровне 20 мВ, а основная
роль в синтезе АТФ, по-видимому, принадлежнт А р}1, Величина
ДРН
84
при этом должна быть не менее 2,5, поскольку расчетная велианна
Аџн+ для синтеза АТф составляет 125—200 мВ.
Исследования показали, что существует определенное
стехиометрическое соотношение между поглощением Н+,
потоком электронов и синтезом АТФ
Процесс формирования па свету электрохимического
потеппиала может быть выявлен на изолированных хлоропластах
по электрохромному сдвигу в области 315—520 нм, связанному с
изменением поглощения каротинондов при энергизации мембран
хлоропластов.
фотоиндуцируемое перемещение ГУ извне вовнутрь
тилакондов может быть г,пределено ло изменению флуоресценции
РНзависимых красителей, например 9-амииоакрндина, а также
фотоиндуцируе.мох1у кзмененлю РН в среде при освещении
хлоропластов.
В
ланкой
задаче
используется
потенциометрическнЙ метод определения фотоиндуцируемого
поглощения НФ суспензией хлоропластов.
Установлено, что кинетика и амплитуда фотоиндуцируемых
измепеинй р Н в суспепзаи хлоропластов может быть показателем
активности ряда сопряженных с потоком электронов реакдай:
образодания трансмембранного протонного градиента, синтеза
или гидролиза АТф и др. В последние годы потенциомег•
рнческий метод регистрации изменений РН в суспензии
хлоропластов был применен для определения активности
циклического
фотофосфорилиров
ания;
нециклического
фотофосфорилирования, сопряженного с восстановлением
ферридианида калия; активности ЛТФаз; скорости реакции Хилла.
Изменение РН реакционной смеси при освещении хлоро•
пластов описывается кривыми, представленными на рис. 16.
В смеси, не содержащей
АДф,
фотоиндуцируемые
изменення РН полностью
обраТимы при выключении
света (кривая 1).
Добавление АДф в
реакЦиоиную смесь приводит
к увеЛНчекию амплитуды
изменеНия рН. При
выключении света РН
раствора снижается, Не достигая, однако, исходного
уровня (кривая 2) . Это объяс•
НЯется тем, что при освещении
изолнрпванных хлоропластов
В среде, содержащей фосфат-
Рис. 16. Кинетика фотоиндуцаруг•
мога изменения РН в суспензии Хлоупластан: 1 — отсутствие АДФ,
— в присутствии ДДФ
акцепторную систему л «офакТоры
циклического
фотафосфорилированая,
происходит
изменеНЕе концентрации ионов Нт в соответствии с уравнением
АД ФЗ-+НРО42-+пН+-»
85
т, е. при фосфорилированпи АДФ число кислотных групп
уменьшается, в результате чего происходит подщелачивание
среды. Таким образом, с синтезом АТФ связано необратимое
поглощенпе протонов из среды.
Специальными
исследованиями
показано,
что
н
фосфорилирующих условиях общее изменение РН обусловлено
двумя про. цесса,мн: 1) обратимым в темноте поглощением Н+,
происходя[цим также в отсутствие фотофосфорилнрования (—
ЛДФ) связанным с образованием трансмембранного протонного
градиента, 2) необратимым поглощением Н+, сопровождающим
синтез АЩФ в присутствии фосфат•акцепторнпй системы (+АДф)
При добавлении в реакциоппую смесь разобщающих агентов
или
ингибиторов
фотофосфорилнрозания
амплитуда
фотоИндуцируемых изменений РН резко уменьшается или
исчезает полпостью, следовательно, скорость фосфорилироваш[я
можно оценивате, в суспензнп хлоропластов потенциометрически по изменевия
м рН, которые сопровождают процесс фосфорилировання АДФ.
Цель работы. Определить фотолнтуцируемые изменения РН
в суспензии хлоропластов дри различных условиях эксперимента,
Рассчитать активность циклического фотофосфорилирона• Ния
хлоропластов
н
полной
фосфорилирующей
среде
по
фотоиндуцируемым изменениям РН среды.
Реактивы н оборудование: 50 мм растнгр МЕС1:; 250 мм раствор NaC1; 50
мм кн,ро,; 25 мм раствор АДФ; 5 мм раствор ФМС: среда выделения 1 0.4 М
раствор сахарозы, 0.01 М раствар N2Cl; 0,025 М трисНС1 буфер, РН 7,8—8,0);
среда выделения 2 (0,4 М раствор сахяразы, 0,01 М раствор NaCl, „Н 7,8); 1 „ мм
НС-1; 1 мм №ОН: аиетаи; целтрнфужпие пробирки; с:удка с пестиком; цилиндры
мерные Объемам 23—50 Ма; Конические мерные пробирки объемом 10 Мл;
тефлон(ь вый гомопмизатор; пипетки объемом 1, 2, 5 и мл; Колба Бунзена со
стеклянным фильтром № З: водаструЙныЙ насос; полотно Или Капроновая
ткааь: кисточка; центрифуга ЦЛС-З; потенциаиетрическая устанома;
спект
Слекол.
Объект исследования: проростки гороха, пшеницы, кукурузы, выращеи• ные
в различных условиях водоснабжения. минерального питания, освеще— ни“;
растения разного впзрзста.
Ход работы. Выполнение задачи состоит из четырех этапов:
выделение хлоропластов; олределение фотоиндуцируемых
измепений РН н суспензии хлоропластов л;ји варьированнн
условий реакции; определение количества хлорофилла в
суспензии хлоропластов; расчет величины фотоиндуцнруемого
переноса протонов в хлоропластах.
1. Вьи)еление хлоропластов. Все процедуры выделегтя
хлоропластов проводят на холоду при 0—4 ос.
з) Получение гомогенага, Навеску листьев 2 г (предварительно охлажденных в течелне 10—15 мин в полиэтиленовом
пакете или во влажной фильтровальной бумаге в холодильнике
в ступке на льду) размельчают в фарфоровой ступке на льду в
течение 1—2 мин с 15 мл среды выделения 1. Полученнь1Й
гомогенат фильтруют через полотно в фарфоровую чашку и
переносят в центрифужную пробирку.
б)
Получение
суспензии
хлороплосгоа
мегоДом
Дифференцидльного
центрифугироаанил.
Фильтрат
в
центрифужной пробирке уравновешивают с другой центрифужной
11робпркой. Проводят первое центрифугирование при 100 в
течение 5 мин. Осадок, содержащий обрывки тканей, ядра,
разрушенные клеточные стенки и другие фрагмемы, оторасынают.
Супернагант центрифугируют 10 мин при 1000 g. ПолученныЙ
осадок (содержит хлоропласты!) гомогенизируют в центрифужной
пробирке кисточкой с 15 мл среды выделения 1 с целью
промывания хлоропл астов, Проводят центрифугирование — 10
мин при 1000 g. Супернатант отбрасывают, а осадок
перемешивают с 2—3 мл среды выделения 2 (среда не содержиг
буфера) , переносят в гомогенизатор, гомогенизируют в нем до
получения однородной смеси п затем помещают в мерный
цилиндр. Центрифужную пробирку гомогенизатор ополаскивают
небольшими порциями среды выделения 2 для полного
перенесен11Я хлоропластов в цилиндр. Конечный объем
суспензии в цилиндре 15—20 мл,
Сускензию хлоропластов держат в темноте н на льду,
2, Определение фотоиндуцируемых изменений РН в суспензаи хлоропластов, Опыт проводят на установке, описание которой
дано в Приложении (см, рис. 31). Реакционную смесь готовят
непосредственно н ячейке. Состав реакционной смеси приведен в
табл. 16, Конечный объем смеси 20 мл.
Таблица 16
Сдтав
реакционной смеси для Определения
изменений РН хлоропластами
Комечная
П ИЧс5Хс, ЯМ
О•3ъм,
— АдФ
фотоиндуцируемых
з ячейку.
АИФ
месь N2Cl
кн,Р0,
АДФ. рн
ФМс
13,4
Н,О, рн
(бидигталлчр
овзннзя) Ха
сэролластг,'
0.5
0,02
13,0
РАБОТА 1, РЕГИСТРАЦИЯ ФОТОИНДУЦИРУЕМЫХ ИЗМЕНЕНИП „Н
В ОТСУТСТВИЕ АДФ
В опыте используют среду, не содержащую фосфат•акцеп•
торной системы (—ЛДф). Измерения проводят При варьиро87
ванна РН реакциог1НоЙ среды в интервале
Изменения
РН достигают путем добавления небольших количеств (добавлять
по каплям!) 1 мм НС! али хм ,Na01-l.
После
внесения
реакционной
смеси
в
ячейку
потенциометрической установки и доведения ее до нужного
значения записывают в темноте начальный уровень РН среды, Затем
включают свет л записывают кинетику фотоиндуцируеиых
изменений РН среды. После этого выключают свет наблюдают
возврамление РН к лсходному уровню.
Поскольку хлоропласты и компоненты реакционной смеси
обладают буферной емкостью и величина ее зависит от РН среды.
для расчета истинной величины поглощения Нч- хлоропластами
на свету при всех исследуемых значениях РН пронзводят
калибровку. Для этого в реакционную смесь после проведения
каждого определения млкрд11лпе•гкой или автоматическоЙ ин
леткоЙ добавляют олрелеленное количество
мл) НС!
известной концентрапии М). Отмечают амплизуду изменений рН,
соответствующую добавленному количеству протонов, на рНметре на диаграммной ленте.
Это позволяет определять, на сколько изменяется РН среды
при добавлении известного количества протоном в реакционную
смесь (ДЮ/АрН), а также цену деленая диаграммной ленты в
единицах содержания протонов,
РАБОТА 2. РЕГИСТРАЦИЯ ФОТОИНДУЦИРУЕМЫХ ИЗМЕНЕНИИ
хлороплАстдми в условиях ЦИКЛИЧЕСКОГО
Фотосросоорилировлния
Опыт проводят на потенциометрической установке, 011исание
которой дано в Приложении П
В ячейку вносят среду, содержащую фосфат- акцепторную
систему (+АДФ). РН реакционной снеси 8,0—8,2 (для лоднеде•
ния РН используют мм растворы НС' и ХаОН, добавлять по
каплям!). Дождавшись установления стационарлого уровня ЭН [4
темноте, включают свет и записывают кинетику фотоиндупн•
руемых изменений РН среды. Затем выключают свет и наблодают
за установлением нового стационарного уровня рН.
С целью определения пены деления диаграммной ленты в
единицах изменения содержания протонов н исследуемую
реакционную смесь вносят определенное количество
мл)
1 мм раствора НС] и отмечают на диаграммной ленте амплитулу
изменений Полученные данные используют для расчета величины
фотоиндуипруемого поглощения протонов хлоропластами д
активности циклического фотофосфорллирования.
3, Определение хлорофилла в суспензии хлоропластов. В мер
чую пробирку ннпсят 1 мл суспензлл, мл дистиллированной воды
и 100 раствором ацетона доводят объем до 10 мл. Раствор хорошо
перемешивают 11 фильтруют через стек_лянный фалыгр № 2 или
№ 3. Полученный фильтрат промеряют на спектрофотометре или
Спеколе при 1=552 нм (контроль 800,6 -й раствор ацетона) .
Измеренную оптическую плотность раствора [)€52 используют
для расчета содержания хлорофилла в суспензлл хлоропластов.
мл суслензли хлоропластов содержат 0,29 1)6S2 мг хлоро
фалла. Содержание хлорофилла н дробе рано 0,29 5 мг.
4. Расчег активности реакции. Для определения величины
обратзмогп фотоиндуцированного процесса поглощения протонов
хлоропластами достаточно звать амплитуду изменений РН на
свету, цену деления диаграммной ленты в значениях содержанив
протонов п содержание хлорофзлла в опытной снеси. На
оснпванзн этих величин рассчитывают члсло микромолеј НФ
поглощенных в опыте н расчете на 1 мг хлорофилла.
Активность циклического фотофосфорилирования определяют
ио изменению РН при ослещенни суспензии изоллровапных
хлоропластов в присутствии АДФ
Для расчета ЛТФ необходимо знать цену деления
диаграммной ленты в едилидах содержания прогонов, время
установлепня ста',шонарного уровня РН на свету, величину
необратимого изменения РН (разумна между максимальной
амплитудой а обратимым изменением РА), содержание
хлорофилла в пробе н значение коэффициента ц. Коэффициент
п— стехиометрическое .отношенне числа молей поглощенных
протонов к числу молей поглощенного фосфата при
фосфорллированнн АДф н условиях данного рН:
п = НУФп.
Значения п рассчитаны теоретически и определены
экспериментально (Nishimuva et al., 1962). При РН 7,4 велачина
п— 0,89, при РН 8,0 величина Фосфорилирующую акТивность
хлоропластов выражают в микромолях Фц• мг— хлорофилла ч—
1.
Оформление работы. См, разд. К, задача В выводах отМетьте
связь фотоиндуцируемпго поглощения протонов на свету
Хлоропластам] с процессом фотофосфоридирования.
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
Гавриленко В, Ф..
М, Е, ХичДобина Л, М, Большой практи• Кум
по физиологии растений, М., 1975.
Гудвин Т.. Мерсер З. Введение в биохимию растений. М., 1986. Т. 1, 2.
Полаабй В. В. физиология растений. М,. )983. Рубин
Л, Б. Биофизика. М., 1987. Т, 1, 2.
Тзердислпв В. А., Тихонбб А, Н,. Яковенко Л, В. физические механизмн
Функционирования биологически» мсмбоаа. 1987.
Фглогинтез ! Под Ред, Говинджи, М., 1987. Т. 1, 2.
Фотосинтез и биапродуктжвносты Методы определения Под ред. А Т.
Мокроносова. А, Г Ксаалева. М., 1989.
Эдвардс Дж.. Уокер Д, Фотосинтез С:- и Сл-растений: механизмы и
реГуляцая. М., 1985.
89
(ОКИСЛИТЕЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ
В РАСТИТЕЛЬНОИ КЛЕТКЕ)
Жизнедеятельность растительных организмов связана с
вовлечением кислорода в метаболический н энергетический обмен
клеток, Центральное место среди процессов, связанных с поглпщеннем кислорода, занимает дыхание.
Дыхание— аэробное окисление органических субстратов до
диоксида углерода и воды. Субстратами окисления в клетке
являются в ословпом углеводы, однако ими могут быть также
липиды и белки. Общее уравнение дыхания при использовании в
качестве субстрата глюкозы:
кдж,'моль.
Биологическое окисление глюкозы н процессе дыхания
включает ряд стадий: гликолиз (анаэробные реакции), цикл Кребса
и стадию, связанную с работой ЭТЦ дыхания. Существуют и
другие пути окисления субстратов в растежии, например
окислигельный пентозофосфатный цикл, котором используется
однократно фосфориллронанная глюкоза, Отдельные реакции
дыхания в настоящее время хорошо изучены (см. рекомендуемую
литературу)
Окисление субстратов в процессе дыхания происходИт с
участием окислительных ферментов.
Первый этап окисления осуществляется Дегидрогеназами—
ферментами, отнимающими от субстрата водород. терминальныЙ
этап —
передающими восстановительный эквивалент
па кислород. Кроме того, в дыхании участвуют ферменты —
промежуточные Переносчики электронов в ЭТЦ митохондрий.
Дыхание занимает центральное место в энергетике
растительной клетки. В ходе дыхания происходит высвобождение
энергии органических субстратов и иглользование ее для
процессов Жизнедеятельности растений. Ббльшая часть энергии в
ходе. дыхания запасается в виде макроэргических связей ЛТФ,
однако она может быть использована организмом на стадии
образовання электрохимического градиента протонов Дџн., а
90
Раздел 'V
ДЫХАНИЕ РАСТЕНИИ
также в виде тепла (термогенез), Количество энергии,
используемое Е каждой из этих форм, определяется внешними
условия,ми и внутренними потребностями организма.
Не менее важна метаболическая роль Дыхания В ходе
окисления органических субстратов происходит перестройка уе
„родных скелетов органических веществ и образованне важных
промежуточных продуктов, которые используются для синтеза
белков, липидов, ароматических веществ и др. Через реакции
дыхания в растенди осуществляется связь различных процессов
обмела веществ. Восстановленаые в ходе дыхания коферменты—
НАДФ•Н и НАД. Н— исао,льчуются в реакциях биохимического синтеза, восстановления нитратов до аммиака,
воссгановительного амин зрования кетокислот и других
восстанови• тельных процессов.
БольшуЮ метаболическую и физиологическую нагрузку несут окислительные, реакции, связанные с так называемыми
альтернативными путями окисления органических субстратов,
Участвующие в этих процессах термимальные оксидазы
(например полифенолоксндаза, аскорбатоксидаза, пероксидаза), а
также ,окслгеназы (например, липокслгеназа) контролируют
реакции синтеза и распада ароматических веществ. фенолов,
регуляторов роста и развития растений и др. В растениях
происходит смена терминальных окислительных систем н
изменение их активности в лродессе онтогенеза, ири смене
внешних условий (температуры, концентрации кислорода), в ответ
на действие патогена,
Несмотря на то что общее уравнение дыхания обратно
уранНению фотосинтеза, по физиологическому значению эти два
процесса близки: дыхание, как и фотосинтез, снабжает клетки
энергией н важными метаболитами, Дыхание наряду с
фотосинтезом
оказывает
непосредственное
влияние
на
продуктивНость растений. Однако в отличие от фотосинтеза, где
процесс в целом напр авлеп против термодинамического
градиента за Счет логлощенной энергии света, дыхание включает
реакции, идущ;'е по термодинамическому градиенту с
высвобождением энергии. Конечной формой запасания энергии
при фотосинтезе Являются достаточно стабильные органические
соединения (угЛевады, белки, липиды); физиологический смысл
Дыхания состоит в препбрззозаннн энергии этих спедиленнй н
более доступную для растения лабильную форму макроэргические
Связи Набор промеж№точных метаболитов, синтезируемых П
процессе дыхания, значительно шире, чем набор метаболитов
фотосинтеза.
Общая интенсивность дыхательного процесса у растений
моЖет быть охарактеризована по скорости поглощения кислорода
и выделения углекислого газа, скорости расходования
органиЧесках веществ. Важными физиологическими показателями
дыХательнпго метаболизма являются также величина дыхательпого
коэффициента, соотношение различных путей окисления
оргапическнх субстратов, активность окислительных ферментов.
Активиость синтеза АТФ в митохондриях и степень сопр
ногти этого Процесса с работой ЭТИ является
характеристикой энергетической эффективности дыхания,
ЗАДАЧА 1. опргдглгние ИНТЕНСИВНОСТИ ДЫХАНИЯ РАСТЕНИЯ
Дыхание— один из важнейших биологических продессов. Он
сопровождается обменом кислорода н углекислого газа с окру.
жающей средой. Измерепие скорости и уровня газообмена дает
простой, удобный н чувствительный метод исследования этого
процесса,
Для характеристики дыхательного газообмена могут быть
использованы различные методы регисграцяи Ог и СО2•
полярографический метод с ислользованием кислородного
электрода, потенциометрический метод на основе электродов,
чувствительных к СО), и манометрический метод.
В данной задаче будут использованы полярографический и
манометрический методы для анализа дыхательного газообмена
растений.
РАБОТА 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНТЕНСИВНОСТИ ДЫХАНИЯ
И
ДЫХАТЕЛЬНОГО
КОЭФФИЦИЕНТА
МАНОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
Манометрический метод заключается в регистрации
изменений количества газа, которые происходят в результате
реакции н небольших сосудиках, соединенных с манометром.
Манометрия
как
метод
исследования
газообмена
биологическик систем отличается высокой чувствительностью и
позволяет вести исследования в строго контролируемых условиях
температуры и концентрации СО. Метод дает зозможнасть
непрерывис следить за обменом кислорода и диоксида углерода,
причем величина этого обмела не зависит от парциального
давления газа в начале эксперимента, Мегод применяют для
изучения клеточных органелл, клеточных суспензий, тканезых
срезов и гомогеиатов, семян, Однако он подходит только для тех
случаев, когда исследуют большое количество материала,
Различают три вида
Манометрия при
постоянпом объеме, манометрня при постоянном давлении,
дифференциальная манометрпя.
В данной работе используют миномегрию при постоянном
объеме. В этом слущае объем газа в сосудике н температура
поддерживаются постоянными, а изменение количества газа
определяется изменению давления. По этому принципу дейстнуег
манометр Варбурга.
92
Манометр Варбурга (рис. 17) состоит
из И „образной капиллярной трубки,
которая соединена у основаная с
резервуаром
(резиновая
труб
заполнеппым манометрической
жидкостью. Правое колено трубки
соединяется с сосудиком посредством
хорошо смазанного стеклянного шлифа,
левое (открытое) — с воздухам. и Образпая трубка имеет миллиметразую
шкалу.
По
этой
шкале
можно
регистрировать
изменение
уровня
жидКости в открытом колене манометРа.
На правом колене примерно в середине
шкалы (возле отметки 15) уст анавлнвают
контрольную точку сравнения, к которой
подводят уровень жидкости в правом
колене, перед тем как снимать показания.
Это гарантирует проведение
всех
измерений при постоянном объеме.
Манометр с хорошо притертым
со
и открытым крапом ла правом
93
Любые изменения уровне жидкости К, в левом колене
второга манометра используют для коррекции наблюдаемых
значеииЙ. Если изменяется н том же. направлении, что и h, го
11, вычитают из если изменения происходят в противоположных
направлениях, го и складывают.
Изменение уровня манометрической Жидкости связано с
количеством выделившегося или поглощенного газа Х
следующнм уравнением:
колен
е
помещают в термостатируемую водяную баню. [Ј•Образная
трубка крепится на штативе, а сосуд погружается воду. Для поддержания раз-
Манометрический метод Варбурга
нонесия между газом в растворе н
газовой фазой сосудик качают с ча-
на резервуаре с манометрической жидкостью, За гем замеряют
уровень жидкости в левом колене.
Поскольку жидкость в левом колене сообщается с воздуХам,
на величине будет сказываться изменение барометричеСкаго
давления. Кроме того, б»дгт зависеть и от незначитель[ioro
колебания температуры водяной бани.
Для устранения обоих источников ошибок применяют
термобарометр, Он представляет собой второй манометр,
полностью
Идентичный первому, за исключением того, что реакционная
Смесь в пем заменена равным объемом буфера или воды.
рас. 17, Реакционный Сбсуд с манометром К
газомет?пческому
аппарату
Варбурга (пояснение см.
стотоЙ 100—120 раз/мин, чтобы снять
в тексте)
ограничение, связанное с даффузией
аз газовой фазы в жидкую.
Сосудики термостатируют с открытым краном в течение 20
мин, затем уровень манометрической жидкости з правом коЛеле
подводят до контрольной метки и кран закрывают.
В ходе эксперимента перед каждым отсчетом показаний
уроВень Жидкости в правом колене подводят до контрольной
метки «15» (точки сравнения) с помощью регулировочного винта
где к— объем, занимаемый газом (объем сосудика плюс обк ем
капилляра от сосудика до точки сравнения), мм3; Vt—
ем
жидкости н сосудике, муз; а— растворимость таза (02 или СО2)
в жидкости, находящейся в сосудике, мФ; Т— темпера тура
водяной бани, К; Ре— стандартное давление, мм
манометрической жидкости,
Плотность манометрической жидкости доводят до 1,034
(обычно жидкость Броди), так что Po=lO ООО мм. [Ло.
скольку для каждого конкретного сосудика для каждой реакдни,
которая протекает при определенных условиях, все вели. чины,
находящиеся в скобках в уравнении, постоянны, можно
записать:
где К — постоянная сосудика.
Проведение
измерений
возможно
при
неизменной
концентрации одного из газов. Для в центральпый цилиндр
сосудикз (сосудик 1) помешают раствор КОН для поглощени
СО), выделяющегося в процессе эксперимента, В этом случае
изменение давления в манометре обусловливается количеством
поглощенного 02,
Однако с помощью манометра ВарОурга можно определить
одновремемло выделение СОЕ и поглощение Для этого берут
второй манометр с той Же реакционной смесью, что н первый,
однако не, добавляют в сосудик КОН (сосудик 2) ,
Таким образом, одновременно измеряют изменение объема
двух газов — 02 и СО:, заметно различающихся растворимостью.
Порядок расчета приведен ниже.
Сосудик ] (с КОН). Изменение объема обусловлено
поглощением 02. Если константы сосудика для 02 и СО)
обозначить Как И К'со„ то
где — изменение показаний манометра, — объем утили •
зированного кислорода.
94
Сосуди
к 2 (без ме ж ду
КОН).
Изметепие
объема
определяет
ся
соотношением
ся
Если
а
наблюдаемые
объема и
по г л щ е н о г
отношение называют Дыхательным коэффициентом (ДК).
Величина ДК может характеризовать субстрат окисления. При
окислении углеводов ДК— 1, при окислении органических
кислот 1, при окислении липидов ДК Однако это справедливо
при условии, если исключены возможность неполного
окисления субстрата и вклад окислительных процессов,
происходящих с ущастнем кислорода, но не связанных с
выделением СО?.
С помощью манометрического метода можно исследовать
также влияние ингибиторов н разобщителе!) на Интенсивность
Дыхания. В качестве ингибитора гликолиза может быть
использован NaF (0,02—0,05 М раствор в фосфатном буфере, РН
4,6); ингибитор цитохромоксидазы ЭТИ митохондрий— азид
натрия
раствор в фосфатном буфере, РН 6,5); разобщитель
— 2,4-динитрофенол
Е М раствор ДПФ в фосфатном
бу фере, РН
Цель работы. Определить интенсивность поглощения
кислоРода н ДК в зависимОсти от вида растений,
физиологического Состояния и условий выращивания растений.
Реактивы и оборудование: 2036-й раствор КОН; 0,06 М фосфатный бу. сер;
о,
Е“со,
02 и выделившего-
М
Л,
в фосфатном буфере, РН 45;
М днаи•
Тро:ренол в фосфатном буфере, РН 3,0; 3
распар сахарозы; колбы Обь.
250 и 500 мл; ва;пнки стеклянные; капроновая ткань с размером
ск
60Х90 и 120Х120 мкм; пробочные сверла; скальпель; пинцет; шприц с
ПЕННОЙ иглой;
и аналитические весы; вакуумнап смазка;
ваКУум•эксинатор; аппарат Варбурга; центрифуга ЦЛС-З.
Объекты исследования: прорастающие семена пшеницы а
подсолнечнирастения разиых видов и разиаго возраста; проростки
пшеницы, выраценные при различных условНлХ водоснабжения; суспензия
клеток моркови
95
Отсюда
Следует помнить, что суммарное изменение, объема газа
соответствующие ему показания манометра принято считать
от— рицагельнььиц, г. е. отрицательно, отрицательным может
быть и
Таким образом, по разнице показаний двух манометров
определяют количество выделившегося СО2.
Данные, полученные для двух сосудиков. используют для
расчета интенсивности поглощения 02 и ныдеиепия СО). На
основе этих данных можно рассчитать отношение СОГ к 02. Это
различного возраста и разного физиологического состояния; каллус
различного возраста; суспензия водорослей Ch!oreHa. АлаЬаепа_
Ход работы. Работа состоит из нескольких этапов. 1. Подгоговкп
расгнтельного материала. При работе с листьями рас. тений
мелкие листья можно взять целиком, из больших листьев
делают высечки сверлом диаметром 10 ми, лисугья шпенипы
нарезают из центральной части листа кусочками размером 0,5
см.
В случае анализа действия ингибиторов и разобщителеП на
интенсивность поглощения кислорода растительными тканями
производят вакуум-инфилетрацию исследуемого вещества в
ткань. Для этого навеску растилрльного материала заворачивают в
марлю, кладуг в стакан заливают исследуемым раствором. Сверху
помещают груз и накрывают стакан воронкой, Помещают стакан в
вакуум-эксикатор, хорошо притирают крышку эксикатора,
подсоединяют эксикатор к электрическому
Масляному
вакуумному насосу н откачивают воздух в течение 20—30 мин.
Когда из растительного материала перестањут вы. деляться
11узырьки воздуха, кран эксикатора закрывают н отсоединяют его
пт насоса. Затем кран медленно открывают,
этом жидкость
заходит в межклетники ткани. К№-сочки выпимают, обсушивают
бумагой и используют для Проведения опыта. ар аллельно делают
контрольные пробы, ин. фильтруя их буферным раствором без
ингибилора.
При работе с воДорослямн их суспензию центрифугируют в
предварительно взвешенных центрифужных пробирках в
течение 10 мин ири 1000 g. Надосадочиук) жидкость аккуратно
оттягивают шприцем, взвешивают пробирку с осадком и затем
добанляют к нему з раствор сахарозы из расчета мл на 250 мг. В
каждый сосудик вносят по 2 мл суспензии,
При работе с культурой клеток суспензию клеток фильтруют
через капроновую ткань с размером ячеек
мкм, при
этом фракция крулаых ассоциаций клеток остается на ткани,
Затем фильтрат вновь фильтруют через ткань с меньшим
размером ячеек мкм), на ткани при этом осаждается не,
обходимая для анализа фракция клеток. Клетки промывают ма
фильтре раствором сахарозы, затем подсушивают на фильтро•
вальной бумаге и используют для взятия навесок для акализа„
Клетки, предназначенные для газометричгского анализа,
суспензнруют в растворе сахарозы из расчета 230—300 мг; мл. В
каждый сосудик вносят Ио 2 мл суспензии.
При работе с семенами для каждого сосудика берут навесКу
г. То же делают и при работе с коллуеол_
2, Заполнение сосудикоа Варбуреа, растительный материал
вносят в основной объем сосудика,
Два сосудика Варбурга с растительным материалом исполь•
зуют для определения поглощения кислорода, В центральный
цилиндр этих сосудиков вносят 0,5 мл КОН для поглощения
выделяющегося при дыхании СО,
96
Дна сосудика с растите.льиым материалом используют для
определения суммарного газообмена. Центральный пилиндр
этих сосудиков заполняюг 0,5 мл дистиллированной воды.
Кроме сосудиков с растительным материалом готовят
термобарометры (вместо растительного материала вносят
раствор сахарозы или фосфатный буфер, в центральный сосудик
вносят мл КОН или 0,5 мл коды),
В центральные цилиндры всех сосудиков встар„ляют фитили
из фильтровалыюй бумаги, сложенные гармошкой (квадрат
примерно 2Х2 см), с тем чтобы увеличить площадь
соприкосновения газовой фазы с КОН или водой, Заполненные
сосудики закрепляют на соответствующих манометрах, следя за
тем, чтобы шлифы были хорошо притерты (до прозрачной
поверхности шлифа). Для этого шлифы манометров
предварительно смазывают специальной cMa3koit,
3, ПроаеДенне опыта, Описание прибора Варбурга и порядок
работы Аа нем представлены в Приложении 11.
Манометры (с открытыми кронами) устанавливают в
специальные, держатели прибора Варбурга и нгипочакуг
качание. Измерение газового давления начинают только через
20—30 мин. Для начала отсчета устанавливают уровень
манометрической жидкости в правом колене па деление 15 и
записывают показания с левого колена манометра, Затем
закрывают краны манометров и снова включают качание.
Через каждые 20 мин в течение ч манометры останавливаюг и
снимают показания. Для этого отключают качание; ме открывая
крана, уровень жидкост'{ в правом колене устанавливают на
метке 15 с помощью винта па резервуаре с Манометрической
Жидкостью и снимают показания с левого колена. Данные
заносяг в таблицу,
После окончания опыта открывают краны манометров.
ПосЛе этого вынимают манометры из ванны и ставят их на
спеЦлальные подставки. Снимают сосудики с манометров и
извлеКают из них растительные, пробы и жидкость. Вакуумную
смазКу снимают со шлифов манометра ватой, смоченной
толуолом. 4. Расчет интенсивности газообмена. Учитывая
исходное
(нулевое) показание манометров, определяют
величину смещеНия уровня манометрической жидкости за время опыта,
Вводят поправки на показания термобарометра: берут
арифМетическую разность между показаниями опытного
сосудика и Термобарометра.
Умножив полущенное после поправки на термобарометр
знаЧение на константу сосудика, получают количество
поглощенНого кислорода. В табл. 17 приведен пример записи
результаТов опыта,
На основании данных, полученных для двух видов сосудиКов (с КОН и без КОН), рассчитывают количества выделенно
СО2 и поглощенного О, в микролитрах ла 1 г сырой массы
За ч (способ расчета см выше), Вычисляют величину ДК,
Оформление работы. См. разд. 1, задача 1. Результаты запишите в табл.. 17.
Рассчитайте интенсивность дыхания и ДК. В выводах отметьте действие
исследуемого фактора на интенсивность поглощения кислорода и ДК.
РАБОТА 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕИ интенсивности
пророс.ТКОВ ИЛИ ОТДЕЛЕННЫХ ЛИСТЬЕВ
ДЫХАНИЯ ЦЕЛЫХ
МЕТОДОМ
Полярографичеч-•кий метод определения интенсивности дыхаНия основан
на измерегши скорости поглощения кислорода проростками с использованием
закрытого электрода Кларка. Теория метода описана в задаче 4 разд. lV,
Цель работы. Определите, интенсивность дыхания полярографическим
методом у растений разного вида и возраста, выращенных в различных
условиях.
реактивы и оборудование: полярографичеежан установка с закрЫТНМ электродом Кларка;
сушельные шкафы (105 и 80 С); аналитические весы; эксикатор; миллуметразан бумага.
Объект исследования: проростки пшеницы, гороха, кукурузы различного возраста; проростки
пшеницы. выращенные в различных условннх водоснаб-
Ход работы. Полярографическая установка для определения интенсивности
дыхания фотосинтеза целых проростков и порядок работы на ней описаны в
Приложении П.
Исследуемые растении помещают в специальные камеры, герметично
закрывают крышками, устававливают на штативе и подключают компрессор.
Включают самописец и записывают скорость њзменения концентрации
кислорода на многоканальНом самописце в течение 10—15 мин. После
регистрации интенсивности дыхания отделяют части растений, взвешивают нх
на аналитических весах в бумажных пакетиках (пакетики предварительно также
взвешены на аналитических весах). Опредеаяют сырую массу растепнй,
Пакетики с растениями помещают в сушильный шкаф при температуре 105
о
с на 15—20 мин, после чего пробы переносят в сушильный шкаф на 80 ос и
доводят до постоянной массы. Определяют сухую MaCcv растений, взвешивая
растения с паКетиком и отдельно пакетик.
Расчет интенсивности дыхания производят, как описано в Задаче 1 разд. Ш,
и выражают в микромолях 02 на 1 г сырой Массы за ! ч и микромолях 02 на г
сухой массы за ч.
Оформление работы. См. разд. 1, задача Сделайте выводн о влиянии
физиологического состояния растений на интенсквность дыхания.
ЗАДАЧА 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ НЕКОТОРЫХ
ОКИСЛИТЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ
Окислительные процессы в растительной клетке охватываЮт все известные механизмы окисления.
99
98
[ , Окисление по типу отнятия электронов (подобно реакции
2. Окисление по типу отнятия водорода (подобно реакции
З, Окисление путем присоеДинения к субстрату кислороДа
(подобно реакции
Таким образом, окисление может происходить как с участием кислорода в
реакции, так и без него.
Окислительные процессы катализируют ферменты. Все окис. лительные ферменты
принято делить в зависимости от меха. низма окисленвя на Дегидрогенозь!,
оксиДа,зы и оксигеназы. Кроме того, в митохондриях клеток содержится группа
ферментов — промежуточных переносчиков электронов ЭТЦ дыхания.
Дегидрогеназы. Ферменты этой группы окисляют субстрат путем отнятия
водорода. При широком разнообразии апоферментов, позволяющих окислять
широкий спектр субстратов, ко. ферментная часть дегидрогеназ представлена либо
пиридиновыми нуклеотидами (НАД или НАДФ), либо флавиновыми нуклеотидами
(ФМН, Ф АД). Соответственно различают пиридиневые и флавиновые
Дегидрогеназьк
Пнрндиновые дегидрогеназы являются анаэробными ферМентами, они не способны к последующей передаче
восстановительного эквивалента на кислород. Окислительно-восстановиТельный потенциал этих дегидрогеназ составляег
—0,32 В,
К НАД-зависимым дегидрогеназам относят лактатдегид оГеназу, малатдегидрогеназу, изоцитратдегидрогеназу, к
НАКфзависимым — глюкозо-б-фосфатдегидрогеназу, 6-фосфоглюкоНатдегидрогеназу,
Флавиновые дегидрогеназы могут быть и анаэробными, И аэробными. Окисление с участием флавиновь1х
дегидрогеназ аэробного тила, как правило, ведет к образованию пероксида Водорода. Этн дегидрогеназы морут быть
названы и оксидазами Из-за их взаимодействия с кислородом, Примером анаэробной флавиновой дегидрогеназы может
служить сукцинатдегидрогепаза, аэробных — оксидаза гликолевой кислоты, оксидаза 1—
завершают многие окислительные процессы. происходящие вне
аманокислог. флавановые дегидрогеназы отличаются большим
митохондрий. Вклад этих реакций в общее потребление
разнообразием окислительно.восстановительного потенциала,
кислорода в растительных организмах сравнительно невелик,
они нередко содержат металлы — медь, молибден, железо.
однако они Несут большую метаболическую нагрузку п растении.
Суб• стратами оксидаз могут служить ароматические вещества,
Оксидазы. Ферменты, осуществляющие окисление путем
феволы, аскорбиновая кислота н ДР, Они составляют так
передачи восстановительного эквивалента от субстрата либо на
назызаемую группу альтернативных оксидаз (рис. 18).
молекулярный кислород, либо на кислород пероксида водорода
или органических перекисей. ферменты группы оксидаз широко
Представлены в растительных клетках. Они участвуют в процессе
дыхания на терминальной его стадии передачи электронов на
кислород в ЭТЦ митохондрий_ Ферментами, осуществляющами
эту реакцию, являются цитохромоксидаза и альтернатив. ная
оксидаза, не чувствительная к цианидам,
Однако ббльшая часть оксидаз катализирует реакции окнс•
ления. не связанные с дыхательной цепью митохондрий. Они
р-ДФО
орто•
—
ф ла оп ро т е Н ,
Рис. 18.
НАД (ф) — НАД
Ряд оксидаз содержит Железо п виде гема (цитохромоксида•
за, пероксидаза, каталаза), другие ферменты могут содержать
медь (аскорбатоксидаза, Полифенолоксидаза) либо молибден.
Оксигеназы. ферменты, осуществляющие включение одного
(монооксигеназы) или двух (Диоксигеназы) атомов кислорода в
молекулу субстрата. Оксигеназы участвуют в метаболизме таки.\
соединений, как стерины. Чаще всего оксигеназы необходамы
для катаболизма веществ, содержащих неполярные группировки,
которые не поддаются действию других ферментов,
Диоксигеназы разрывают двойные связи ароматических соеди102
нений, расщепляют алифатические соединения. Это белки.
содержащие, лак правило, негеминовое железо. однако
существуюг
оксигеназы,
содержащие
гем
(триптофандиоксигеназа), ли60 вообще не имеющие железа
(лигоксигеназа). ряд оксидаз (полнфенолоисидаза, пероксидаза)
могут осуществлять оксигеназную функцию.
Промежуточные переносчики электронов. Эти соединения
входят в состав электрон-транспортной цели митохондрий и осу.
шествлнют перенос на кислород электронов от НАД. Н Или ФАД •
Н2. Среди них выделяют группу цитохромов (интохромн групп а,
Ь и с), содержащих геминовое железо, группу железосерных
белков. содержащих негеминовое железо, а также переносчнки
типа хлионон (убихинои).
Электрон-транспортная цепь
митохондрий растений представлена на рис. 19. Здесь же показаны
Некоторые альтернативные пути окисления органическик
субстратов, реализуемые в растительной клетке
рис. 19. Электрон-транспортная цепь митохондрия растений: ф— положенте
Мест фосфорили;юаания, ФАЛ, ФМН— флавопротенни; FeS — железосерные
(елки;
а.
Ь,
с—
шнтлхромы;
koQ
—
убихинт•;
копураия
структурно•функцнональные Комплексы
Цель задачи. Определить активность некоторых окислител+ Ных
ферментов п зависимости от условий эксперимента.
РАБОТА 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ
ДЕГИДРОГЕНАЗНОИ
Активности МЕТОДОМ ТУНБЕРГА
Дегидрогеназы, Находящиеся в клетке, осуществляют окис.
Ленке различных субстратов путем отнятия водорода н передаЧи
его на коферменты дегидрогеназ (пиридиновые ФлавиНовые).
Общая активность работы дегидрогеназ в растительных Тканях
может
быть
оценена
путем
определения
скорости
восСТановления
искусственных
редокс-агентов,
общим
свойством
103
которых является способность принимать электроны от
восстановленнЫХ коферментов дегидрогеназ. В качестве таких
агентов могут быть использованы 2,6-днхлорфенолиллофенол,
тетразолий синий. Эти системы характеризуются изменением
цвета в процессе постановления. Ввиду этого скорость
восстановЛенин красок может быть оценена н визуально, и
спектрофотометрически.
1 мл раствора. Таким образом пробу количественно переносят в
трубку. Конечный объем гомогената З мл.
В шарообразное расширение пробки трубки Тунберга Вносят
мл раствора 2,6-лихлорфенолиндофеиолята Ха, смазывают шлиф
вакуумной смазкой, вставляют н пробирку и хорошо притирают
шлифы,
вращая
пробку
с
небольшой
амплитудой.
Пришлифованные поверхности прозрачные. Совмещают отверстия
пробирки и крышки и откачивают из пробирок воздух на
вакуумном насосе в течение 2—3 мин. Затем, не отключая насоса,
поворотом пробки закрывают пробирку. Подготовленные та
образом пробирки помещают в водяную баню. После 15-минутной
инкубации переливают краску из пробки в пробирку, аккуратно
встряхивают последнюю для перемешивания реакционной смеси н
замечают время. Пробирку оставляют в термостатируемой бане и
периодически
встряхивают,
следя
за
обесцвечиванием
реакционной смеси. Отмечают время полного обесцвечивания
смеси, отражающее активность дегидрогеназ в пробе.
Расчет общей активности дегидрогеназ производят по формуле
100
Где Л — относительная активность (на г сырой массы за
время обесцвечивания, мин, Р— навеска, г.
мин);
Оформление работы. См. разд. 1, задача 1. Результаты запишите в таблицу. Отметьте разницу в активности дегидрогеНаз
зародышей И семядолей.
РАБОТА ОПРЕДЕЛЕНИЕ Активности ПЕРОКСИДАЗЫ
Цель работы. Определить дегнлрогеназную активность в
прорастающих семенах гороха по скорости восстановления
2.6дихлорфеколиидофенола.
Реактивы и оборудование: Ха; 50 мм фарфоровые раствор К,НРО.; ступка с 5,10—
пестикам: М раствортрубки
Тунберта•, пипетки объемом 2 н 5 мл; вазелин: вакуумный насос; термоста•
тируемая водяная баня на 37' С: секундомер.
Объем нсследовання; Проросшие семена гороха.
[04
Ход работы. Проросшие семена гороха (корешок не должен
быть
см) очищают от оболочки н разделяют на
семялоли и зародыши, Навески зародышей (100—200 мг) и се
мядолей (300—500 мг) отдельно растирают в ступке с мл раствора
К2НРО4. Гомогенат переносят в трубку Тунберга. а ступку
дважды ополаскивают раствором
каждый раз добавляя по
Пероксидазы (Кф .7) — ферменты, окисляющие субстрат при
помощи пероксида водорода, Общий вид реакции
Где А и АН: —окисленный и восстановленный субстраты
с.:ютветственно.
Субстратами пероксидаз служат фенолы и ароматические
соединения, органические гидроле • № Киси с небольшими
алифатическими заместителями, НАД (НАДО • Н), нафтогидрохи•
Нон, индолилуксусная кислота и др. ПероксиДазщ—
железосодержащие ферменты. простетической группой которых
Является Гем — феррипротопорфирин IX. Окисление субстратов
осущест103
вляется. по-видимому, По одноэлектронному механизму. Первой
сталией каталитического процесса является образование компдекса
между железом фермента и пероксидом водорода. Следонательно,
окисление субстрата осущеџ“гвляется пероксидом водорода,
активированным ферментом;
Е — HzOz-F АН:
Соединение 2-6
Соединение 2+АН•
— Н2О+А
Соединение — окисленная форма фермента, где Железо связано
с пероксидом и валентное состояние Fe выше Fe3+; соединение 2—
продукт воссталоаления соединения путем одноэлектронното
восстановления за счет субстрата АН,— субстрат реакции; —
снободнораднкальная форма окислен. Ного субстрата; А— продукт
полного окисления субстрата.
В растительных тканях пероксидазы широко распространевы: в
основном их находят в пероксисомах, обнаружены они также в
клеточной стенке, Известно более 20 изоформ пероксидазы с
различной каталитической активностью. Множественкость форм
фермента и каталитических функций позволяет суднгь о
значительной роли пероксидаз в биохимии и физиологии растений,
однако ло сих пор их физиологическое значение оконнательно не
выяснено,
Показано изменение
изоферментного
состава
Перокснлаз н их активности в онтогенезе растений, при
Патогенезе. в условиях стресса. ЛКгизность пероксидаз наряду с
каталазой. очевидно, препятствует Накоплению перокснда
водорода в Клетке. Используя для окисаекня пероксил водорода,
пероксидазы могут играть роль в нейтрализации лро• ЛУКОВ
вторичного обмена (фенолов), в регуляции гормонально. го статуса
растений через окисление индолилуксусной кислоты. образование
этилена из метионина, участвуют в процессах сан. теза лигнина в
клеточной стенке.
Однако одноэлектронный механизм переноса, который осу
шествляется пероксидазой при окислении субстрата, может
привести к образованию активированных форм кислорода (02 и
др.), вызывающих повреждающий эффект в клетке (см. задачу З
этого разд.). Тем не менее существует мнение, что образованные в
пероксилазных реакциях активные формы кислорода мо:ут быть
использозаны растением в защите от патогена.
Определение активности пероксиё}изем основано на образо•
вании окрашенных продуктов при окислении бензидина. гваяко•
ла, гидрохинона, катехола [1 других фенолов, Общая схема ре.
акции
Пероксидаза
фенол+ Н:О2
Хинон ф 21420
В данной работе используется наиболее чувствительный и
быстрый гваяколовыа ,uerod). При действнн пероксидаз в при-
пероксида водорода гваякол окисляется до тетрагвая.
кохинова, что приводит к разнитню красно-коричневой окраски В
реакционной среде н позволяет пронести фотометрическое
измеренне скорости ее образования,
Цель работы. Определить активность пероксидазы в различных
органах растения, изменение активности фермента с возрастом
растения.
Реактивы и оборудование: 1/15 М фосфатный буфер. ГН 6,5—6,7;
раствор Н,О,; гваякола (д, 183 г в 50 мл воды); фарфоровые ступки с
пестиками; мерные колбы объемом 50 ма; стеклянные стаканн «тб» ем0М 100 мл;
средние стеклянные воронки; пипетк“ объемом 2 З мл; 1п• томаттзескнс пипетки:
бумажные фильтры; 42); стск• лянные кю№ТН к ФЭКу толщиной 2 см.
Объект исследования: листья и корни разного аоз• рзета,
Ход работы. Навеску растительного материала (50—100 Мг
растирают в ступке с небольшим количеегном мл фосфатного
буфера. Растертую массу переносят количественно в мерную колбу
на 50 мл, доводят пробу буфером точно до метки, хорошо
перемешивают и оставляют на 10—15 мин. Затем раствор
фильтруют через двойной бумажный фильтр или центрифугируют
[О мин при 4000 об/мин. Фильтрат (или надосадочную жидкость)
используют для определения активности фермента.
Активность фермента исследуют на ФЭКе (1—440 нм). Об
активности фермента судят по временн развития окраски до
определенного значения оптической плотности (значение D
выбирают в зависимости от скорости развития окраски в преде•
лау от 0,25 до 0,4).
Для анализа каждой биологической пробы используют трл
одинаковые кюветы ФЭКа: одна— Контрольная. дне другие —
оПыгные
(две
аналитические
повторности
из
одной
биологическоЙ пробы). Во все трл кюветы вносят: 2 мл вытяжки; 2
мл буферного раствора, 2 мл гваякола.
Затем в контрольную кювету приливают 2 мл воды н
устаНавливают ее в контрольную (дальнюю) кюветную подставку
фэка. Вводят ее в световой луч.
Закрывают кюветную камеру и ручками грубой и тонкой
Наводки устанавливают нуль на шкале оптической плотности По
контрольному образцу. Затем одну из опытных кювет ставят в
держатель и вводят ее в световой луч.
Автоматической пипеткой вносят в опытную кювету 2 мл
раствора [1,0, и оДноарехенно включают секундомер, Пробу
Хорошо перемешивают стеклянной Палочкой. Затем закрывают
КЮнетную камеру н по шкале оптической плотности следят за
Развитием окраски. Замечают по секундомеру время достижения
Необходимой оптической плотности.
107
Аналогично производят измерения для второй опытной Кюветы,
Расчет активности ведут по формуле А—
где А — активность выраженная в относительных единицах на г
сырой массы за с: D — зарегистрированная в опыте оптическая
плотность; t — время, с; d— толщина слоя жидкости (толщина
кюветы), см; 5, т— факторы разведежня: с —отношенне
количества жидкости, взятой для приготовления вытяжки, х.“, к
массе навески, г: $—степень дополнительного разведения вытяжки
после центрифугирования (если это требовалось); т— сгелень
постоянного разведения вытяжки в кювете (в наших условиях
равна 4).
Оформление работы. См. разд. 1, задача 1. Результаты представьте в виде таблицы, Сделайте выводы о зависимости
активности фермента от исследуемых физиологических факторов.
РАБОТА
З.
ПОЛИФЕНОЛОкСИДА.3Ы
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
АКТИВНОСТИ
В РАСТИТЕЛЬНЫХ ТКАНЯХ (ПО БОЯРКИНУ)
ПолифенолоксиДа3а (ПФО) , известная также как
катехолоксидаза, фенолоксидаза или о-дифенол: кислород
оксидоре• дуктаза (КФ 1.10.3.I) катализирует окисление
о•дифснолов до о-дихинонов (дифенолоксндазн или Катехолазная,
активнос-ть. см. уравнение 1), а также о-гндрокснлированне
монофеколов
(монофенолгидроксилазная,
или
креолазная,
активность, см. уравнение 2).
(3
Только катехолоксилаза (ПФО) способна осуществлять огидроксилирование фенолов. Обычно в норме дифенолокеи•
дазная активность значительно превышает монофенолгидрокеи•
лазную активность этого фермента. Гидроксилирование и
окисление составляют две главные реакции в синтезе и
расщеплении фенолов растения,
Полифенолоксидаза — медьсодержащий фермент, субстратами
которого могут быть катехол. хлорогеновая,
ки„оты,
иирокатехин и другие о-дифенолы. Полагают, что ПФО
осуществляет окисление по одноэлектронному механизму. Это
сопряжено с образованием свободных радика.пон субстратов
акции, а также, возможно, с возникновением активированных
форм широких кислорода, пределах Оптимум (РН активности .
Характерной РН лежит особенностьюв довольно
фермента является нлзкое сродсгно к кислороду; поэтому для
выявления максимальной активности фермента необходима
хоШая аэрация субстратов.
Катехолоксилаза — наиболее изученная н превалирующая форма
фенолоксидазы в растениях. В клетках высших растений
ПФО локализована в основном в пластидах тех типов (в
роплаетах, лейкопластах) и находится в латентном состоянии
(протолифеаолоксидаза) Активация латентной формь ПФО
происходит три действии детергентов, жирных кислот, протеаз и
некоторых других воздействиях, Физиологическая роль ПФО
остается недостаточно ясной, Показано изменение ее активности н
онтогенезе растений (активация ПФО при старении) , при
[Овреждениях и патогенезе.
Активность ПФО может быть опреде.лена измерением
скорости окисления фенолов (в ультрафиолетовой области
спектра) или ло образованию окрашенных продуктон. Однако
механизм реакции сложен; он связан с образованием ряда
последующих полимерных продуктов, поэтому определение
активности фермента по скорости развития окраски в реакционной
смеси возможно лишь На коротком начальном эгале реакции,
Более удачным является определение активности ПФО по
развитию окраски в окислительно-восстааовительных реакциях,
сопряженных с окислением фенолов. С этой целью используют
систему пирокатехнн•р.феннлендиамии или пирокатехнн•днэ• тилр•фениленднамин.
Реакция протекает следующим образом:
[09
Цель работы. Определить активность полифенолоксидазы е
различных частях растений и изменение ее активноми с
возрастом растительных тканей.
Реактивы н оборудование: 1!15 М фосфатный буфер, РН раствор
пирокатехина (спежепри.-отовлгпяый\; растпор дниетнл•р.
в воде
фарфорппнс ступки с Пес. тиком; мерные колон объемом 25 ма; стгклнллыс
стаканы объемам 50 и 100 ел; срелнне стеклянные вороним; пипетки объемом 2
5 мл; аптоеатн. ческие пи мтхИ; бумажные фильтры; ФЭК ; стеклянные
к
фЭКу толщиной 2 гы.
Объект исследования: листья корни проростков гороха разлнчвогс
Ход работы. Навеску растительного материала (250—500 мг)
растирают в ступке с небольшим количеством (10—15 мл)
фосфатного буфера. Растертую массу переносят количественно в
мерную колбу, доводят буфером точно до метки, хорошо
перемешинают и оставляют на 10—15 чин. Затем раствор
фильтруют
через
двойной
бумажный
фильтр
Или
центрифугируют 10 мин При
Фильтрат (или
Надоеадочную жидкость) используют для определении
активности фермента.
Активность фермента исследуют фотометрически на ФЭКе
(1=590 нм). Об активности фермента судят по времени развития
окраски до определенной оптической плотности (значение
оптической плотности — О—выбирают в зависимости от скоро—
сти образования окраски в пределах от 0,025 до 0,4).
Для анализа каждой биологической пробы используют три
одинаковые кюветы „для фЭКа: одну контрольную и две опыт•
ные (две аналитические повторности из одной биологической
пробы). Во все три кюветы вносят: 2 мл вытяжки, 2 мл буферного
раствора, 2 мл диметил.р.фенилендиамина.
Затем в контрольную кювету приливают 2 мл воды, уста
навливаюг ее в контрольную (дальнюю) подставку ФЭКа и вводят
в световой луч,
Закрывают кюветную камеру и рутжами грубой н тонкой регулнровки устанавливают нуль на шкале оптической плотностн
По контрольному образцу.
Одну из опытных кювет ставят в держатель и вводят ее в
световой луч.
Автоматической пипеткой добавляют в опытную кювету 2 мл
раствора пирокатехина и оОновременно включают секундокер.
Пробу хорошо перемешивают .леклянной палочкой. Затем
закрывают кюветную камеру и следят за развитием окраскн по
шкале оптической плотностд. Замечают по секундомеру время
достижения необходимой оптической плотности. Аналогичные
изменения производят и для второй опытной Кюветы.
Расчет активности ведут по формуле
D аву
где А — активность фермента, выраженная в относительных
единицах на 1 г сырой массы за с; Д— зарегистрированная в опыте
оптическая плотность; i время, с; а — толщина слоя жидкости
(толщина кюветы), см; а, ё, Т —факторы разведения:
— отношение ксмнчесјва жидкости, взятой для приготовления
вытяжки, мл, к массе навески, г; В— степень дополнительного
разведения вытяжки после цепгрнфугнронання (если это тре•
«звалось); Т— степень постоянного разведения вытяжки в кюрете
(в наших условиях равна 4).
Оформление работы. См. разд. 1, задача 1. Результаты за. поите
в таблицу. Сделайте выводы о влиянии исследуемых факторон на
активность ПФО,
РАБОТА 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСПТ ЛИПОКСИГЕНАЗ В
РАСТИТЕЛЬНЫХ ТКАНЯХ
Липоксигеказы (линоленат: кислород оксидоредуктаза; КФ
1.13.11.12) — класс ферментов, которые катализируют
пероксиданно полиненасыщенных жирных кислот в липидах,
содержащих цасписпентадиеновые мостики, Эти ферменты
широко расиространены в природе и найдены как в высших
растениях, так и н грибах, водорослях и бактериях. Субстратами
липоксигеназ (ЛОГ) в высших растениях являются да- и
траненасыщенные жирные кислоты: линолевая н линоленовая
, наиболее широко представленные в большинстве
растательных тканей (до 80 % ацильных групп липидов мембран
хлоропластов). Продукты реакции окисления Представлены
гидроперекисями
липидов.
Окисление
сопровождается
образованием свободных радикалов.
Липоксигеназы— мономерные белки с молекулярной массой
94—97 кДа. Липоксигеназы представлены в виде ряда изоформ. В
семенах бобовых растений различают три формы, или изоэнзима:
ЛОГ 1, ЛОГ2 н ЛОГЗ. Эти формы имеют различные Оптимумы рН,
субстратную специфичность и, по-видимому, играют различную
роль в растении. Оптимум РН активности для ЛОГ 1 — 9,5, для
ЛОГ2— 6,5: для ЛОГЗ отмечен широкий инТервал ГН:
определение ее активности проводят при
ры 7,0.
Лилокснгеназа наиболее эффективна в гидропероксидацин
Свободных или полярных жирных кислот. Липоксигеназы 2 и 3
более эффективны в пероксадации нейтральных жирных кислот
или их эфиров, например этиловых эфиров жирных кислот.
ЛиПоксигеназа 3, по•видимому, наиболее активна в генерации
синГЛегного кислорода. В семенах бобовых наиболее представлена
ЛОГ3, затем $101 Л н наименее —3101-2, Однако ЛОГ2 обладаОт
наиболее высокой удельной активностью.
Субклеточная локализация липоксигеназ в различных рае.
ТИТельных тканях неодинакова. В семенах бобовых большая часть
липоксигеназ находится в цитоплазме, в листьях— в пластидах, в
корнях— в вакуолях. Возможно, что различные кзо. энзимы
липоксигеназ имеют разную локализацию в клетке.
Физиологическая
роль
липокснгеназ
исследована
недостаточно, однако имеется, по крайней мере, три области
физиологни растений, гле Выявлено участие липокснгеназ: рост и
развитне. старение, раневой эффект н устойчивость к паразитам.
Так, наибольшая активность ЛОГ наблюдается в растущих
тканях с высокой метаболической активностью (в апекс. в
молодых быстрорастущих листьях). Отмечается Изменение
активкости ЛОГ при анфференпировке тканей. Гиббсрслловая
кислота (ГАЗ), снимая ингибирующее действие света на рост
гипокотиля у капусты, стимулирует липоксигеназную тк.
т•ивность.
Происходит также изменение изоэнзимного состава и актив.
Ности ЛОГ во время созревания семян. Возможно, при созре
ванин семян ЛОГ способствует деградации клеточных мембран н
увеличению транспорта запасных продуктов к развивающеМуся
зародышу.
Роль ЛОГ в старении связывают с вовлечением фермента в
синтез
жасминовой
кислоты
через
образование
13•гилропироксиллиноленовой кислоты. которая может быть
промотором старения растительных клеток. Считают, что
жасминовая кислота обладает свойствами ретардањта. как и
абсцизовая кислота. Липоксигеназа может быть вовлечена в
альтернативный синтез абсцизовой кислоты из каротиноида
виолаксантина. Липоксигеназа и гидроперекисные продукты ее
действия способны прямо уаствовать в старении. Гидроперекиси
жирных кислот могут вызывать старение различными путями.
включая
инактивадию
синтеза
белков,
ингибирование
фотохимической
активности
хлоропластов,
нарушение
цитоплазматических мембран. приводящее к увеличению их
пронипаемости для ионов. Последнее ведет к изменению Ионного
баланса клетки, нарушению ее метаболических реакций.
Раневой эффект и защиту растений от заражения микробами
считают главной функщией ЛОГ. Липоксигеназа участвует в
синтезе травматина при повреждении. Гидроперекиси жирных
кислот. продуцируемые ЛОГ, могу: служить (хнозоЙ При
образевании токсинов для микроорганизмовЛипоксигсказа играет важную роль в прямой и откредован• ной
формах устойчивости растений к паразитам. При пораже• ини
увеличиваются количество ЛОГ и ее активность. радикалы
гидроперекиси липидов. образующиеся при действии ЛОГ,
токсичны для паразитов. Уста новлено, что ЛОГ играет важную
роль в реакции сверхчувствительности при патогенезе растениЙ.
Определение активнтти липоксигеназ может быть произведено
либо спектрофотометрически
нм) с помощью
регистрации образования при гидропероксидацин нена112
селенных жирных кислот конъюгированных диенов, либо
подярографически путем регистрации линолеатзанисимого
поглощення кислорода,
Цель
работы.
Определить
активность
липоксигеказ
полярографическим методом в тканях растений различного возраста.
6.5; 1
Реактивы и оборудование: среда вндглгння (1/13 М фосфатный буфер.
раствор альбумина; 0.35 М раствор старозы;
раствор
Ха): лрелзрат лнналеаовпй (линолепай) Кислоты (1.3 мм
.0О2Њ•й раствор азида натр“) ; (ЛВЩ: жидазот; фарфоровая ступка е пестиком;
прпбирки объемом 5 мл; ПНПг:жи мимом 1.2 и 5 мл: шприц с л.лилпой иглой;
центрифуга: полярографнче. пая стаиавка с закрытым электродом Кларка.
асследоаанн“: листья н корни гороха разного возраста,
Ход работы. работа состоит из Нескольких этапов. 1.
Приготовленце препарата липоксигеназы.
Навеску растительного материала (2 г) охлаждают в ступке на
льду, затем замораживают жидким азотом и растирают с 130 мг
пвп.
После оттаивания рам•ительного материала в ступку
добаванют 5 мл среды выделения, вновь хорошо растирают смесь
Н настањваОт на льду 15—20 мин, Затем гомогенат переносят в
пробирку и шентрифугируют 10 мин при 4000 об/мин,
Полученный сулернатанг аккуратно оттягивают шприцем,
переносят в чистую пробирку и используют для определения
лкпоксигеназной активности,
2. Определение активности липоксигеназ. Определение
активностн ЛОГ проводят на лолярографической установке,
Описание установки и порядок работы на ней приведены в
Приложени П.
В полярографическую ячейку Помещают 2,5 мл препарата
линоленовой (линоленой) кислоты и 1 мл свежеприготовленноГо
препарата фермента. Аккуратно, ввинчивающим движением,
закрывают ячейку крышкой так, чтобы не было пузырька воздуха,
и регистрируют скорость поглощения кислорода препаратом.
3. Расчет активности фермента. расчет проводят согласно
описанию, приледенному в задаче 3 разд. Активность ферМента
выражают в микромолях кислорода на 1 г сырой массы за ч.
Оформление работы. См. разд. 1, задача 1.
ЗАДАЧА з. ХАРАКТЕРИСТИКА АКТИВНОСТИ процессов перекисного
окисления липидов по ОБРАЗОВАНИЮ МАЛОНОВОГО ДИАЛЬДЕГИДА В
РАСТИТЕЛЬНЫХ ТКАНЯХ
Окислительные процессы в живых организмах в ряде слуЧаев происходят при участии свободных радикалов. Индуцирование
этих процессов часто обусловлено кислородными радикалама:
супероксидным анион-радикалом 02, гидроперекисным радикалом
НОГ, гидроксильным радикалом ОН. стабильным продуктом
восстановления кислорода — пероксидом водорода Н2О2, а также
синглетаым кислородом. Возникновение этих актинных форм
кислорода связано как с пропессами, происходя
в клетке в
норме (например, в световых реакциях при фотосинтезе), так и в
отпет на стрессовые воздействия (вод. ныЙ дефицит, загрязнение
среды, низкие температуры, действие герблдидоп и т. Изменение
активности процессов генерацин активных форм кислорода
наблюдается и в онтогенезе растений_
Важное место средн систем, генерирующих активные формы
кислорода, залимаюг окислительные ферменты клетки. Пока. зано
образование этих форм кислорода н ходе реакдгЙ окислечия,
катализируемых
лероксндазой,
ксантиноксидазой,
липою
сигемазой н др.
Отмечена возможность образования активных форм кислорода
в результате работы электрон-транспортной испи фотосинтеза
дыхания.
Особая
роль,
ло-вилнмо.му,
принадлежит
цианид„устойчивому пути переноса электронов в ЭТЦ
митохондрий,
Генерация активированных форм кислорода может вызывать
повреждения в клетке, и н первую очередь повреждение
мембранных структур. Причиной этих повреждений являются
свободнораднкальные процессы, приводящие к перекисному
окислению ненасыщенных жирных кислот липидов мембран.
При действии кислородных радикалов происходит отрыв атома
водорода от молекулы ненасыщенной жирной Кислоты с
образованием свободного радикала и далее гидроперпксидг этой
кислоты. В результате окисления моноеновых жирных кислот
(олеиновой) образуется четыре изомерных гидроперс,ксида, В
случае полиеновых жирных кислот, как следствие делокали•
задии неспарелпой вглептности, связь мигрирует с образованием
конъюгированного диенового хромофора, поглощающего в
ультрафиолетовой области (максимум — около 232 нм)
Процессы Перекисного окисления липидов е участием форм
активированного кислорода приводят к разрушению полинена•
сыщенных жирных кислот а обеднению клетки содержащими их
полярными и
жирны,мл кислотами, появлению
гидролероксидных группировок в составе гидрофобной зоны
мембран.
Это изменяет физико-химические свойства мембран: теку
честь, способность к латеральной диффузии, что приводит к
отклонепию
в
футкциозироьании
мембранно-связанных
ферменТов, увеличивает лропидаемпсть мембран для многих
веществ и ионов, Кроме того, липидные пероксиды вызывают
разрущеНия многих физиологически важных соединений, таких,
ках сульфгидрильные соединения, гормоны, стероиды и Др,
Продук игрекисного окисления липидпп способны ингибировать
репликацио ДНК и белковый синтез. Возможно появление внутри
межмолекулярных ошибок н результате свободнорадикальной
полимеризации и поликонденсации с некоторыми продуктами
перекисного окисления липидов, например с малпновым диаль•
дегидом.
Малоновый ДиальДеги&) (ЛЯДА) — продукт перекисного
окислен“я липидов, Этот бифункпаона,льный альдегид способен
образовывагь шиффсјвы основания с аминогруппами белка,
выступая в качестве сшивающего агента, В результате
образу
нерастворимые
белок-лилидные
Комплексы,
называемые пигментами изнашивания или лиаофусцинами:
нс —снг — сн
о
о
Малоновый диальдегид
В ответ на различные стрессовые воздействия п тканях
растення происходит увеличение содержания МДА, что связано с
активацией в этих условиях свободнорадикальных реакций в
клетках, Таким образом, содержание МДА может служить
показат•слсм
активности
окислительных
процессов,
обусловленных кислородными радикалами,
Определение содержания МДА в растительных тканяХ
оснонано на его реакции е 2•тиобарбитуровоЙ кислотой (ТЕК), в
результате чего образуется окрашенный продукт с максимумом
поглощения Яри 532 нм.
Цель работы. Исследовать влия ние условий выращивания
растений на содержание МДЛ в растительных тканях. Определить
изменение содержания МДА в зависимости от возраста растений.
Реактивы и оборудование: 2006-й раствор ТХу; раствор ТНК в растворе
ТКУ; фарфоровые с:упкн с пестиком; мерные пробирки объемом З мл с
прн•гериыми арабками; лабораторные пробирки; лялегки объе2 н 5 мл; шприц с длинной иглой; водяная баня; весы аналитические; центрифуга;
спектрофотометр.
Объекты исследования: листья Прорасткаа пшенит1ы, выращенных пра
Различных условиях водогна&жения; листья горпхз различного возраста.
Ход работы. Навеску исследуемого материала (0,5 г)
изМельчают ножнипами и растирают в фарфоровой ступке с З мл
Дистиллированной воды. Затем к гомогенату добавляют З мл Туку
О и повторно гомогенизируют. Из полученного гомогената
Тбирак»т в мерные пробирки с притертыми пробками две пробы
Ло 2 мл. К одной из проб добавляют равный объем (2 мл) ТХУ;
Г
дальнейшем эту пробу челользуют в качестве контроля при
Пектрофотомстрии. К другой лробе приливают 2 мл раствора
ТЕК. Пробы инкубируют 30 мин на кипящей водяной бане, заТем
охлаждают и центрифугируют мин при 3000 об/мин.
Супернатант аккуратно отбирают шприцем в пробирки и про.
меряют на спектрофотометре или Слеколе (1—532 нм). Колг
чество МДА (А) в растительной ткани выражают в нано,молях
МДА 11а I г сухой массн и рассчитывают по формуле
где — значение оптической плотиости при 523 нм; у— объем
реакционной смеси (4 мл); а —отношение общего объеме вытяжки
к объему пробы, взятой для определения МДА; — молярный '
коэффициент эксгинкпии, 155 000 л
Х моль— : • р —
навеска растительного материала, г. Оформление работы. См.
разд. 1, задача 1.
ЗАДАЧА 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕПЕНИ сопряженности
ПОГЛОЩЕНИЯ КИСЛОРОДА С СИНТЕЗОМ АТФ ПО РЕАКЦИИ нА
динИТРOФЕнол
В процессе дыхания происходит сопряженньпј с окислительновосстановительными реакпиями синтез АГФ. На первых двух
стадиях дыханжя—в гликолизе и Дикле Кребса — синтез АТС
прочно связан с окислением субстрата И протекает по механнзму
субстратного фосфорилирования. Однако эти две стадиу
малоэффективны в отношении образования АТФ (4 моля АТф на 1
моль глюкозы). Наиболее «энергодающей» стадией дыха Ния
является работа ЭТЦ митохондрий и сопряженный е
синтез
АТФ. Синтез АТ Ф, сопряженный с работой ЭТИ, назы вают
окислительным фосфорилироаанисм в Дыхательной цепи
Организация ЭТЦ мигохолдриЈ растений локализация мест
синтеза АТФ представлены на риг, 19,
Механизм сиктеза АТ ф, сопр нженного с окислительновосстановителнными реакциями в ЭТЦ, подобен механизму синте
за АТФ п хлоропластах, В обоих случаях идет преобразовапкс
энергии, высвобождающейся при окислительно-восстановител,
пых реакциях, в энергию макроэргических связей ЛТф чере
промежуточную стадию образования электрохимического гра
диента протонов.
Такая опосредованная связь синтеза АТФ с окислительно
восстановительными реакнкя:ли в ЭТЦ приводит к возможное
разобщения переноса электронов от восстановителей (НАД • 1 и
ФАД• Н2) на кислород от процессов синте2а АТФ_ При эго лоток
электронов в ЭТЦ и поглощепие кислорода растенияп1!1 не
свя,заиы с си"тезом АТК). Такой поток электронов называю
разобщенным в противоположность потоку электронов,
связавпому с ст:тезом А Тф и нарываемому сопряженным.
Разобщенный поток электроион можно наблюдать in vivo
растениях на определенных этапах онтогенеза, при изменени условий
выращивания растений И др. При этом происходи актав,тция потока
коферментов, электроноз что в ЭТЦ, в определеппых ускоряется
окисление условиях спо-восстановлеиных
собстнует необходимых усиленной для работе метаболических иккла
Кребса реакций. и синтезу Часть интермеди-или вся
энергия, высвобождающаяся при работе ЭТЦ в условиях разобщения, разобщение выделяется потока н виде электроков теплоты
(явление и синтеза термогенеза).АТф может быть достигнуто
также искусственно, при использовапии специфических веществ
— разобщителей. Природа этих вещеугв может быть различна, но
все опи разрушают градиент протонов и тем самым нарушают
синтез АТФ в митохондриях, Одпи,м из разобщителеЙ,
эффективно влияющих на систему сопряжения митохоадрий,
является 2,4-динитрофенол (ДНО).
Под
влиянием разобщителей происходит активация
погло
кислорода
в
ЭТЦ
дыхания,
поскольку
снимается
конгтохондрий роль патока — Аэлектронов ТФ „синтетазногп со
стороны комплекса сопрягающей митохондрий, системы ми-Полому степень сгимулядии поглощегжя кислорода митохондриями
при добавлении разобщителей может служить показателем
сопряженности потока электронов в ЭТЦ с синте
АТФ.
ДНФ примеляют и на целых тканях. При этом стимуляция
поглощения кислорода тканями может сл№'жить косвенным
локазатслем
сопряженности
поглощения
кислорода
и
фосфорилированля.
Несмотря
на
некоторые
сложности
интерпретации ре зульгатпв, этот показатель может быть
использован для характеристики работы системы сопряжения
митохондрий.
Удобным методом исследования ЭТЦ и сопрягающей системы
митохондрий
является
полярографический
метод
с
использованнем закрытого электрода Кларка. Этот Метол
позволяет проИЗзодить довольно быстрые измерения ашивности
работы ЭТИ, по скорости поглощения кислорода, а также
исследовать дейстЕИе различных веществ (субстратв окисления,
АДФ, разобщителей и ингибиторов дыхания) на активность этого
процесса с целью определения механизмов регуляции работы
ЭТЦ митохондрий.
Теория полярографического метода
Полярография
представляет
собой
чрсзнычгйно
чувствительзый метод, позволяющий работать с очень
разбавленными растНорами и небольшими объемами, С сго
помощью можно выя вить наличие того или иного вещества в
препарате, определить его концентрацию, С 11пмошью
полярографии изучают как быСтрые, так и медленные реакции, Ее
широко использхл-от мри Работе с ферментами (например, с
каталазой и пероксидазой) , с Изолированными органоидами
клеток, с тканями и органами,
Основпой недостаток полярографии — побочные эффекты,
коТорыс не всегда легко устранимы.
Полярографический анализ веществ заключается в гроведе„
ниа электролиза исследуемого раствора в электрохимической
ячейке и интерпретации зависимости между силой тока,
характеризующей скорость электрохимического процесса, н
потенциалом электрода или приложсгним напряжением. При этом
ско. рость электрохимического процесса зависит от потенциала
элск. трола.
Метод применим для анализа веществ, способных
электрохимически восстанавливаться или окисляться на
поверхности электрода,
В основе полярографического анализа лежат закономерности
диффузной кинетики,
кинетика электрохимической
реакции на рабочем электроде определяется наиболее Мед.
ленными ее стадиями, имеющими диффузный характер:
подводом реагирующих частиц из объема раствора к
поверхности электрода н удалением продуктов реакции в объем
раствора.
Если в растворе содержится некоторое вещество Л. способное
восстанавливаться на электроде в вещество В, а скорость этого
превращения зависит от скорости диффузии моле. Кул А к
электроду, то зависимость тока от потенциала будет иметь вид
кризоЙ, называемой полярографической волной
(рис. 20). При начальных значениях величина потенциала
электрода (участок а) еще не достаточна для осуществления
электрохимической реакции и сила тока равна пулю, При этом
концентрация вещества А у поверхности электрода CAS не
отличается от таковой в глубине раствора Сдо,
При смещении потенииала в
сторону
отрицательных
значений
начинается
электролиз,
скорость
которого растет быстрее, чем скорость
смещеНия потенциала (участок б),
Начилается превращение А в В и
поверхностная
концентрация
становитсЯ меньше объемной, В
результате возникает диффузиоииый л
родесс,
направлелмый
на
выравнивание концен• трации А и
обеспечивающий тодачу А
к электроду.
Скорость диффузионного процеСРис, 20. Полярографическая
волна (объяснение см, в тексте)
са выражается первым законоМ
фика:
се—са,
i=nFDA
где i — скорость процесса, выраженная величиной плотности
тока; П— число электронов, участвующих в процессе; Р — число
Фарадея; Г), — коэффициент диффузии вещества А; 61—
толщина диффузного слоя,
По мере смещения потенциала Сла падает, i — возрастает. наконец,
скорость процесса при поверхностной становится концентрации
максимальной САЗ, и перестает равной нулю,зави-
С
еребряного анода, погруженных в один и тот же раствор кон-
„гб, от потенциала электрода (участок 8). Величина id, назыБаемая
плотностью предельного тока диффузии, прямо пропор„нинальаа
коэффициенту диффузии и обратно пропорциовалька величине
диффузного слоя ДА:
Пропорциональная зависимость между величиной предельного
тока диффузии и концентрацией вещества в объеме раствора и
является основой количественного полярографического анализа.
Величина [.)А постоянна для данных частиц в расчворе и
обычно имеет порядок
Величина зависит от
коэффицнента диффузии, кинематлческой вязкости раствора и ско•
роста движения жидкости. Для снижения величины раствор
перемешивают, что резко уменьшает толщину диффузного слоя и
увеличивает предельный ток диффузии. При этом важен строго
определенный режим перемешивания растворов, для поддержания
которого используют
мешалки и
вращающиеся электроды. Скорость диффузионного Процесса не
зависит от природы электрода или состояния его поверхкости,
Потенциал полуволны
является величиной, характерной для
данного соединения, и может быть использован для Идентнфикации
посаледнего.
На основе полярографии (вольтаметрии) возможно измерение
содержания кислорода с помощью ртутного и платинового
электродов, При электролитическом восстановлении кислорода
образуется полярографическая волна, По которой и определяют его
содержание. Наиболее часто для анализа концентрации Кислорода
применяют платиновый закрытый электрод Кларка, Обычно
приложенное напряжение поддерживают постоянным (потенциал
полуволны и измеряют силу тока, которая за, висит от
концентрации кислорода. Когда платиновый электрод Используют
в сочетании с хлорсеребряным а подом, электродная реакция идет
следующим образом:
Анод 4Ag+4ClКатол
4Н+ +4Ag+4Cl—+O,
4AgC1 +2Н2О
Если напряжение на электродах составляет
В, то
Сила тока, возникающего при этом, прямо пропорциональна
Концентрации кислорода в растворе,
Электрод Кларка (рис. 21) состокт из платинового катода н
рис. 21, Электрод Кларка: 1 — платина (катод), 2 — сплав платины с медью, З—
место прикрепления алели, 4— чехол для прижима пл.лугронтдаемой пленки, 5 —
серебро (анод), б — кожух с раствором НС1 в Ь-лрзтном буфере, 7— пробка с
запрессованными дыјадами от Платины серебра, 8 — резнно. вый уплотпи«э.щ 9
— прижимное кольцо
центрированного КС] и отделенных от исследуемого раствора
мембраной.
Этот
электрод
применяют
для
изучения
биохимических реакций наиболее широко, поскольку мембрана
(которуло обычно изготавливают из политетрафторэтилена,
например тефлона) защищает электроды от загрязнения
химическими ре. агентами, содержащимися в исследуемом
растворе, и, таким образом, устраняет один из недостатков,
свойственных откри• тому электроду. Однако наличие мембраны
увеличивает гостоянную времени прибора,
В течение опыта концентрация О: в растворе постоянно ме
ияется за счет поглощения его органоидами При этом прибор
регистрирует изменение
тока диффузии, что дает
представление о динамике окислительных процессов в препарате.
Цель задачи. Опрслелить полярографическим методом степень
сопряженности синтеза АТФ с окислительно-восстанови•
те.льными реакциями ЭТЦ по степени стимуляции поглощения
кислорода растительными тканями в присутствии ДНФ
Реактивы и оборудование: 1/15 М фосфатный буфер, РН 3%-11 раствор
сахарозы; 10—9 М раствор 2,4-динитрофеппда (способ приготовленин см,
Приложенаи 1); колбы объемом 250—500 мл; стеклянные воронкн; бюксы,
доведенные до постоянной массы; чашки Петри: капроновая ткань с размером
ячеЯки 60Х90 мкм;
установка с закрытым электродом Кларка;
ааалитические весы: торсионные весы,
Объект Кеследонання: )часъкл корней гороха газличного возраста; культура
клеток моркови различного возраста и разного $изпалот:щеского сх}• стояния:
каллус моркови, выращенный в разных условиях и различного 303раста-
Ход работы. Работа состоит из нескольких этапов, 1. подгоговка
растительного материала, При работе с кормя.чи гороха отрезают
участки корня определенной длины, соответствующие различному
возрасту тканејЈ, и мелко нарезают,
При работе с суспензионной культурой клеток суспензию
фильтруют через капроновую тка нь. Клетки, осажденные на
фильтре, промывают раствором сахарозы (250—500 мл), под[20
ошивают на фильтровальной бумаге н используют для взятия
навесок.
Для определения массы клеток помещают навеску в бокс и
выдерживают пробу в сушильном шкафу при [10 О ОС в течение
10—15 мин, а затем в сушильном шкафу при ВО С доводят до
постоянной массы. Остальную массу клеток исполЫу• ют для
анализа дыхательной активности клеток.
При работе с каллусом материал не требует предваритель ной
подготовки,
2, ОпреДеленне скоростн поглощения кислорода. Исследовакия
проводят полярографическим методом на установке с какрытым
электродом Кларка. Описание установка и порядок работы на ней
приведены в Приложении Н.
Навеску растительного материала (0,25—0,5 г) помещают в
полярографическую ячейку, предварительно заполненную 3,5 мл
соответствующего раствопа: при работе с корнями гороха ис•
пользуют фосфатный буфер 1/15 М, РН 5,9—6,2; при работе с
„суспензией клеток и каллусом— раствор сахарозы. Ячейку
закрывают крышкой и производя г запись поглощения кислорода
на самописце.
Затем, не открывая ячейки, через отверстие в крышке шприцем
вносят 0,' мл раствора ДИФ (конечная концентрация 5, 10-6—5,
[0—4 М). Производят запись поглощения кислорода в условиях
разобщения.
З, Расчет активности сопряженного и разобщенного потока
электронов, Расчет активносги поглощения кислорода проводят
аналогично расчету, описанному з задаче 3 разд. Ш,
Активность дыхания зыражают в микромолях кислорода на 1 г
сырой массы за 1 ч микромолях кислорода на г сухой массы за 1 ч.
Оформление работы. См, разд. 1, задача 1. Результаты запи•
Тите в таблицу. Определите степень стимуляции поглощения
кислорода тканью в присутствии ДНФ. Сделайте выводы об
Изменении стегени сопряженности потока электронов в ЭТЦ с
синтезом АТФ у исследуемых физиологически вариантов.
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
Гудзин Т.. Мерсер Э, Введение в биохимию растений. М., 1986, Т. 1, 2.
ЛенинДжер А, Основы биохимии. М., 1985.
Мерзлят М, Н, Активированный кимород И окислительные процессы
стнтельной клетки У! Итоги науки и техники. Сер. Физиол. Раст. М., 1389.
Методы изуч•еиня мембран расчительпых клеток Под ред. В, В. ПоЛевого. Г, Б. Максимова, П. Ф. Синютмпой. Л., 1985,
Методы практической биохимии Под ред. Б. Уильямс, К. М. Уилсон.
м.. 1975.
Мезлер Д, Биохимия. М., 1980, Т. 2.
В, д Физиолагня
М., 1289.
Семихатова О, Л. Методы оценки энергетической эффектизности дыхаНМ;
растепай. Л., 1967,
дыхания Семихатова и фотосинтеза О. А. Чулановсргпя растений, М.—Л-, М. В.
1966.Манометрические методы изучения
compou“ds lipoxygenases: Виа Hi!debrand И “ Апп_ S осслгепсе, П. 0xygenation
Ргос. Р., Hami!ton-kernp phytoclleru. properties ard oxidatian Sac. Г. Rwssible
Еморе_ „ in Legg Ше functior-,s. 1985, С, metabolisrTt S„ Doo№fans 23- Cvrrents Р.
349—363О. aramaticTopit3P1ar-,i
in Р'зг* [3iochernistry znd Physiolagy, 1988. V. 7.
Higher Cell Respirati0U Ed. Ну Л. ОоИсе, Д Л. дау. Sprirger— 1985,
1979, Мауер V. 18. А. 2. М„ р. Нам: 193—215хЕ, P01ipheLIQl oxidases
Phytochem
istry.
oxidase
high*
Раздел V
МИНЕРАЛЬНОЕ питАНИЕ
Неорганические питательные вещества, необходимые для
нормального развития растений, подразделяют на макро- и
ликрозлементы в зависимости от количественной потребности в
них. К первым принадлежат С, О, Н, К, р, К, Са, Mg, иногда Na, Si,
СЛ. Содержание их в растении довольно велико —от «0,1 до
нескольких процентов от сухой массы растений. При концентрации
до 200—300 мг{.л в наружном растворе они те оказывают вредного
действия на растение. Микроэлеме1ггы — это В, Мп, Си, Zn, Мо,
Со, и др. Их содержание в растении со, ставляет сотые, тысячные и
десятитысячные доли процеита от сухой массы растения.
Большинство элементов этой группы При концентрации выше мг(л
угнетают рост растения, Железо занимает промежуточное место
между микро- и макроэлементами. Его оптимальная для растения
концентрация в наружном растворе 5—l0 мг{л.
Поглощение перечисленных элементов, за исключением С, Н и
О), у высших наземных растений происходит ' через корни из
почвы или питательного раствора, Водные, а также низшие
растения поглощают питательные вещества из окружающей среды
всей своей поверхность:о. В Почвенном растворе ионы „либо
находятся в свободном состоянии, либо связаны с Почвенными
коллоидами. Поглощаются элементы минерального питаНия чаще
всего в ионной форме.
В соответствии с современными представлениями процесс
тоглощения ионов растением можно разделить на два этапа:
Проникновение ионов в свободное пространство корня н
передвижение их в протопласты клеток тканей корня. СвобоДное
пространство включает клеточные стенки и межклеточное
проСтранство эпидермиса и паренхимы коры корня, Оно
локализовано вне протопластов клеток и составляет объема Корня,
Ионы могут поступать в свободное пространство и выдеЛяться
обратно путем свободной диффузии и ионного обмена. Свободное
пространство представляет собой систему капа—Лов и пор, стенки
которых имеют отрицательный заряд (наприМер, за счет карбоксильных групп пектиновых веществ) и могут
Адсорбционно связывать катионы. Поэтому концентрация ка-
рис. 22, фрагиепт поперечПого среза корня (По А. Кларксону, 1978): 1 —
ружнм# раствор, 2— цитоплазма, З— вакуоль, 4 — поясок Каспари: заштги.
хозана область симпласка, не заштрихована — апопласта', стрелками указаны
путн перемещедия
тионов и анионов в центре каналов и около их стенок различн В
лентральной части пор концентрация катионов и апнонс близка к
их концентрации в наружном растворе. Отсюда ион могут
выделяться в воду путем диффузии. Около стенок пс
коппеитраиия катионов увеличиваечся, а анионов— уменьшаеся, и
ионы могут выделяться только в солевой раствор путе обмена.
Свободное пространство корня, т. е. взаимосвязаны: система всех
клеточных стенок и межклетников, форм ируе транспортную
систему — апопласг, где передвижение ломов жет происходить
пассивно (рис. 22). Такое передвижение во: можно только до
эндодермы корня, так как субериновые участ ки клеток этой ткани
(пояска Каспари) плотно соприкасаются с цитоплазматической
мембраной и создают преграду апоплас1, ному транспорту.
Поступление ионов в свободное пространствз считают первым,
подготовительным этапом поглощения,
Следующий этап гог•лпщеаия — проникновение ионов в
цигоплазму клеток корневых тканей. Теперь ионы должны пройти
через полупроницаемые мембраны, и прежде всего плазмалемму,
Транспорт ионов может происходить в соответствии с
электрохимическим
этого иона. Это пассивный
транспорт— без затраты дополнительной чнергин. При движе•
нил иона против градиента электрохимического потенциала
осуществляется активный транспорт, потребляющий энергию И,
следовательно, зависящий от фотосинтеза и дыхания. По современиым представлениям он осуществляется через участки
переносз. Их специфичностью в отпошении ионов объясняют
бирательмую способность растепий поглощать питательные
элементы из среды.
Корень— орган не только поглощения ионов, но и их
ассими.ляции, в нем происходит синтез органических соедииеииЙ,
ряд элементов, в первую очередь Х, Р и S, попадая в ткани корня,
претерперает сложный цикл метаболических превращечий,
Позтому поглощение ионов из среды зависит и от процессов,
определяющих проникновение их через мембранные структуры
клетки, и от общего метаболизма в корке и растении в делом,
Отсюда поглощение во многом зависит от условий вырощнваыия
растений — освещения, температуры, РН питатель“ ного раствора,
снабжения корневой системы кислородом, колимоства и
соптноШсИия ионов в
растворе.
Зависимость скорости поглощения от света. Свет влияет на
поглощение косвснлым путем. Образовавшиеся на свету в
прошессе фотосинтеза углеводы являются субстратом дыхания.
Дыхание — очень важный процесс для поглощения и как источник
энергии, и как поставщик пластических веществ, необходимых для
ассимиляции неорганических веществ (например, Н). Кроме того, в
процессе фотосинтеза образуются сильные восстановитии, которые
могут участвовать з восстановлении ионов NOs— и S042— На
свету активи?уется транспирационный ток в
сосудах ксилемы, что также сказывается на тшглощении
минеральных элементов,
Зависимость скорости поглощения от температуры. Характер
зависимости поглощения от температуры при о с, в интервале от 5
до 400 и после 400 имеет существенные различия, С повышением
температуры от 5 до 40 скорость поглощения увеличивается до
максимальной, Дальигйшее повышение темпе. ратуры приводит
поглощения солей. Это связано, повидимому, с
инактивацней ферментных систем, принимающих ущастие в
поглощении и ассимиляцлл нонов, Кроме того, гри высоких
температурах (суперппгимальных) обнаруживается поаы• шенная
проникаемость мембран, что способствует усилению пассивной
утечки солей. В интервале температур от 5 до
температу ный коэффициент для поглощения ряда ионов (К, Са,
Nh,+ и ДР) близок двум, Это свидетельствует об определяющеЙ
роли метаболических реакпий в развитии скорости процесса
поглощения в данных температурных условиях.
При температурах, близких к ос. поглощение солей
кается
как за счет замедления биохимических реакций, так и за счет
повышения вязкости, а следовательно, сопротивления клеточных
мембран. поглощения ионов здесь обычно меньШе двух. В этих
условиях определяющими скорость поглощения оказываются
физические процессы (диффузия, массовый ток, адсорбция),
Зависимость
скорости
поглощения
от
концентрации
водородНык ионов. Кислотность среды оказывает влияние на ряд
процессов, опредејяющих величину поглощения того ила иного
Иона. От нее зависит степень растворимости ряда солей а пояВе и,
следовательно, доступность их для растения. В почвенном
растворе, в питательной смеси РН может обусловливать степень
диссоциации многоосновных солей, Так, подщелачивание среды
125
от 5,5—6,0 и выше приводил к видоизменению преобладающей
рмы фосфатов от одновалентной
к двухвалентной
НР 042—) и трехвалентной (РОД. В значительном количестве
Поглощаются только одновалентные ионы.
Увеличение концедтрации Водородных ионов (снижение (эн)
приводит обычно к ослаблению поглощения катионов, в том числе
NH4+, вероятно, вследствие конкуренции между одинаково
заряженными ионами за Возможность вступать в реакцию с
переносчиками, В зависимости от РН среды могут меняться к
поглощающие свойства самого растения. Например, высокая
кислотность • среды увеличивает проницаемость мембранных
структур клеток,
Зависимость скорости поглощения ионов от их концентрации в
среде. Скорость поглощения растением ионов из раствора за. висит
от Концентрации даш:ого иона гак же, как и скорость
ферментативной реакции— от концентрации субстрата;
зависимость подчиняеп-•я уравнению Михаэлнса—Ментон и
может быть представлена следующим образом:
vz.,c
где с— скорость поглощения иона пра определенной его
концентрации (С); V — максимально возможная скорость по
Глощения при концентрации иона, стремящейся к бесконечности;
— константа скорости процесса. Графическое выражение этой
зависимости является гиперболой (рис. 23, А).
Рис. 23. Соотношение между впешг:еП концентрацией растворенного веществз П
скоростью его аоглощепия для случая актинпого Переноса (абознзчений см, в
тексте)
Если по осям отложить величины, обратные ” и С, кривая
принимает линейную форму (рис. 23, Ь). Пра этом прямая лиНия имеет наклон, авный и отсекает от оси ординат отрезок,
равный Такая зависимость скорости поглоще• Ния от
концентрации иона в растворе подтверждает возможносгь
поглощения при участии переносчика,
В присутствии другого иона с зарядом того же знака
происходит снижение скорости поглощения данного иона, подоб126
ное снижению скорости ферментативной реакции, которое
наблюдается, когда в среде находится ингибитор. Так же, как в
случае ферментативиой рёакцил, подавление поглощения иона при
добавлении других ионоз может носить конкурентный,
неконкурентный и смешанный характер.
з
З —
25
м о л ь ; л •,
лит я—
концентрация
26
м стл Ы л
На рис, 24, А представлен вариант конкурентного
ингибированну поглощеаия ионов рубидия калием. Характерным
является неизменное значение 1 Д. Па рис, 24, Б проиллюстрирован
случай неконкурентного подавления поглощения рубидия ионами
лития. В разных диапазонах концентраций соли зависимость
скорости поглощения иона от наличия других ионов имеет
некоторые принципиальные отличия. При низких концентрациях
Иона (до 5. 10—4 М соли) поглощение мало зависит от наличия в
растворе другого нона. Когда концентрация иона выше (60лее 10—
2 М голи), при поглощении проявляется большее сродство с
другими
ионами,
На
этом
основании
предпплага10т
функцианирование двух механизмов поглощения (1 и Н),
соответстВу:ощих разным переносчикам и локализованных в
плазмалемМе
и в тонолласте
Взаимодействие между нонами. Ионное окружение сущестВенно вл на поглощение конкретного иона В моносолевом растворе
катион будет поглощаться быстрее а присутствии летКо
поглощаемого аниона, На скорость Лог.лощения иона влияет
Величина гидратной оболочки. Поэтому одновалентные ионы
Поглощаются быстрее, чем двух- или трехвалентные. Но, кроме
Этого, важную роль играют специфические особенности,
свойстВенные самой поглощающей системе. Так, среди щелочных
ка127
тионов калий поглощается лучше всего, хотя диаметр
гидратнровзнных ионоз рубидия и цезия меньше. Если в средс
присутствуют два или больше ионов, то между ними могут
наОлю. даться отношения либо антагонизма, либо синергизма.
Часто химически близкие ионы мешают друг другу при
поглощении, различные же ионы не конкурируют между собой.
Такие анионы, как нитраты, сульфаты, фосфаты, оказывают
стимулирую. щег действие на поглощение других ионов, повидимому, вслед. ствие активации процессов обмена.
Щелочные катионн при поглощении растением в большей или
меньшей степени конкурируют друг с другом, увеличени. ем
концентрации одного уменьшается поглощение другого катиона.
Взаимоотношения ионов при поглощенйи (конкурентные и
неконкурентные) могут быть определены по анализу зависимости
скпроста поглощения от концентрации иона в среде, Для этого
определяют зависимость скорости поглощения иона от его
концентрации в присутствии какого-то другого иона и без него.
Строят графики зависимости обратных величин скорости
поглощемя (ось ординат) и концентрации (ось абсцисс) разных
условиях, При колкургнтпом поглощении прямые. [Тересекутся в
одной точке на осп ординат. При неконкурентном поглотснил
прямые будут почти параллельны, На рис. 24, А, Ь
проиллюстрированы конкурентные отношения калия и рубидия и
неконкурентные — рубидия и лития.
ЗАДАЧА 1. ПОГЛОЩЕНИЕ АММОНИЯ РАСТЕНИЯМИ В РАЗНЫХ
условиях кислотности среды
Поглощение растением аммония можно проследил, по
изменению концентрации аммошийного азота в литательном
растворе после экспозиции в нем растений. Для этого готовят
питатем,ную смесь определенного состава и помещают туда на
определенное время растения. Определяют концентрацию
аммониЙного азота до и после экспозиции. Рассчитывают
изменение концентрации за ч на 1 г скрой массы корней.
Цель работы. Изучить влияние концентрации водородных
ионов на поглощение иона аммония,
Реактивы и оборудование: растворы солей для Питательна? смеси (см. Ход
работы); фосфатная буферная смесь, РН 12; фенолят натрия; раствор
Нитрогруссида натрия; гипохлорит натрия см, Приложенле 1); цнлиндр объемом
500 мл; пипетки лбъемом 1 мл; кол объемом З л; стаканы объемом 25 и 102 ил;
рН•метр; весы технические; магнитная мет:алК3;
Объект исследования: для работи используют растения кукурузы 20•дяевнаго
возраста, выращенные На видоизмененной смеси Кнопа, разбањденной в 10 раз, и
выдержанные в течение сут до опыта на водопроВодной воде. Во время
выращивания поддерживал астимальный для данНсго растения РН среды.
Питательна; г месь дл; выращивания астея¶й име•
ст следующий состав, г,'л: Са
КН'РО.— 0,04: MgS04 0,012; —0,010;
кс: —0,017,
Ход работы. Для изучения поглощения NH4+ готовят
128
тельную смесь того же состава, что и для выращивания растениЙ,
но концентрацию увеличивают вдвое. Для приготовления этой
питательной смеси используют готовые исходные растворы
нужных солей в более высокой конгкентрации:
Исходные «л
C9(N0,),
25,0
Meso,
12,5
10,0
17,0
В цилиндр наливают 200—300 мл водопроводной воды,
прибавля:от туда по каждо(ю исходного раствора соли, Объем
раствора доводят ладой до 500 мл, переливают в колбу и
перемешивают•. Готовую питательную смесь разлинаог поровну в
два стакана, Измеряют смеси и доводят его в одном стакане до 7,0,
а в другом — до 5,0. Для этого помещают стаканн на Магнитную
мешалку, опускают н раствор электроды рН•метра, включают
прибор и, добавляя в стакан по каплям кислоту Или щелочь,
доводят РН до нужного значения.
В четыре стакана объемом 100 мл наливают по 50 мл
приготовлемпой питательной смеси: в два из них раствор с РН 5,0,
в два других—с он 70, Растения сое.'јяняют в пучка ло З— 7 шт.,
промывают 2—3 раза в дистиллированной ноле и удаляют остатки
воды фильтровальной бумагой. Кирни опускают в приготоплелные
растворы так, чтобы семена не попадали в раст• вор. Стаканы
растениями взвешивают, затем ставят на свет и подсоединяют к
системе продувания раствора воздухом. Эк. сппзиция длится 30
или 50 мим. За это время растения могут поглощать и испарять
воду, Объем питательного раствора Меняегся. По окончании
экспозиции стаканы с растениями взнешивают вновь. массу
доводят ло первоначальной, добавляя в питательный раствор по
каплям воду. Растения вынимают из раствора, корни отрезают,
сушат фильтровальной бумагой и
взвешивают.
В растворах, на которых проводилась экспозиция растений, и в
исходном питетел,ном растворе определяют концентрацию
аммонийного азота методом Любошинского и Зальта.
Определение аммония методом Любошинского и Зальта
При взаимопейс•твии аммония, фенола и гипохлорита
р ия
натобразуются
производные индофенола. окрашенные в синий
ц вет.
Добавление
н качестзе катализатора нитропруссида нагрив
обеспечивает быстрое протекание реакции при комнатной
Температуре, Идтен снвностт, синего окрашинаиля пропорциона
льна количеству аммонийного азота н пределах 0,02— 0,4 мкг/мл,
Построение калибровочной кривой (8—10 точек). В мерные
Колбы объемом 25 мл приливают такое количество испытуемого
129
раствора. чтобы примерная Концентрация азота в нем состав. ляла
0,02—0,4 мкг{мл, В каждую колбу прибавляют в указан, ной
последовательности следующие растворы: фенолят натрия — 2,5
мл; фосфатную буферную смесь —2,5 мл;
раствор
нитропруссила натрия — мл (готовят непосредственно перед
употреблением из 1 4-го раствора); гипохлорит натрия — мл (см.
Приложение 1)
Колбы взбалтывают, голивают водой до метки н ставят в
темноту на 30 мил, За это время интенсивность окраски достигаег
максимума и гохэ¶няется в течение нескольких часов_ Через 30
мин измер'АОт оптическую плотность растворов на ф,ЭКе с
красным светофильтром. Строят график зависимости оптическоЙ
плотности от концентрации стандартных растворов,
Определение аммония в питательной среде. Исходя из того что
кониентрация N[L.Y03 в литатсльной смеси составляет 20 мг,/л,
рассчитывают концептпадию азота в аммонийной фор. ме и
равбазленис, котптэое наип сделать для работы в лаеделах
калибровочной кривой Х, Соответствующий расчетам объем
литатель110}ј смеси из опытных стаканов переносят в мерные кол.
бы объемом 25 мл, добавляют ружте реактивы в строго опре.
деленной лоследонателнност« (см. метод), объем раствора доводят
дистиллиэованной
водой
до
метки
и
проводят
колориМг:трирование, По калибг,овочиоП кризоЙ находят
концентрацию аммонийного азота в мерной колбе, Учитывая
разведение, рас. считывают колцемтрац:по его в питательной
смеси и содержание в 50 мл смеси. По разности меж ту исходным
и конечным содержанием аммонийного азота в 50 мл питательной
смеси находят величину поглощения его растением, Рассчитывают
голошение на г сырој массы корней за Л ч. Сравнивают
поглощение аммония глри РН и РН 7,0_ Объясняют причину
различиЙ в поглощении аммония в разных условиях кислотности
среды.
Оформление работы. Результаты работы запишите в виде
таблицы (табл. 18)
18
от активной концентрации иона в среде и выражается уравненкем
Нернста:
2.3RT
Е—Ео+
lga,
Удс Е — ЭДС элемента; Ео — стандартное значение ЭДС
элеМента (Е— Ео при а— ! ) ; R — молярная газовая
постоянная; — температура, К; — постоянная Фарадея,
ЗАДАЧА 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Интенсивность поглощения ионов растительными организмами
или суспензий растительных клеток можно оценить по нз130
мененшо ик концентрации в питательном растворе. Наиболее
удобным и перспективным методом является регистрация ионного
состава раствора с помощью ианселектнвных электродов (ИСЗ). Вопервых, ИС,Э рсгнсгрирует не общую концентрацию данного иона,
а только активную, т, е. «доступную» для растепия. Во-вторых,
измерения Протекают очень бистро (1 —2 мин), не. требуя
специального отбора проб: электроды могут быть опу[цены
непосредственно в сосуд, в стакан с растениями или даже н
суспензионную культуру водорослей Наконец, воЗможна
непрерывная регистрация конного состава питательного раствора.
Принцип метода заключается в измеренаи электродвижушей
силы (ЭДС) гальванического элемента, состоящего из двух
электродов: вспомогательного (электрода сравнения) с постоямным
потенциалом и индикаторного (ионсе.чекгивного), по, тенциал
которого зависит пт активности иона в растворе. ЭДС
гальванического элемента определяют ло разности потенциалов
обоих электродов,
В качестве электрода сравнения используют хлорсеребряныЙ
электрод. Он состоит из стеклянного корпуса с впаянной
асбестовой нитью, соединенной чсрсз раствор AgCl с серебряной
нитью, Корпус электрола капо.“ лен насыщенным раствором kCl.
Потенциал вспомогательного электрода известен, его считают
неизменным при изменении состава изучаемого раствора,
Ионселективные электроды бывают разными. Широко известны
стеклянные рН• и Уа•ИСЭ. В последнее время на основе
п.№астафицирпванного дибутилфта.патом поливинилхлорида с
добавлением ионселективного вещества равработан новый класс
мембранных ИСЭ_
Ионселективный и вспомогательный электроды составляют
гальванический
Разность потенциалов, которая возникает
на границе фаз между мембраной ИСЭ и средой, зависит
Из уравнения следует, что при изменении активной
конЦенграаии одновалентного иона в 10 раз ЭДС элемента должНа
меняться на 59,14 мВ. Реальная же зеличила этого изменеНия для
каждого электрода отличается от теоретическои. ПоЭтому все
электроды калибруют, т. е. измеряют ЭДС в серии Стандартных
растворов с извесгнол активностью, строят график Зависимости
ЭДС от —iga и рассчитывают угловой коэффициант (S)
калибровочной кривой Ло формуле S lg а.
Зная S
электрода, можно, измерив ЭЛС исследуеМого
раствора, определить активность иона з данном растворе,
Использование для калибровки электродов растворов, по со.
ставу н ионной силе близких к исследуемому, дает возможность
рассчитать концентрапию иона. Значение ЭДС в исследуемом и
стандартном растворах можно записать следующим обрам)м:
Разность Потенциалов между исследуемым стандартным
то гд а
растворами ДЕ составляет
где
коэффициент активности иона.
Полагая, что ?„сел
И потенциируя уравнение, По,
лу. им
Сиеел Сетавд
Для регистрации ЭДС с точностью до 1 мВ можно исполь
зовать иифровой лабораторный ионометр И, 120М или обычный
рН.метр, подключенный к потенциометру КСП-4
РАБОТА 1. ПОГЛОЩЕНИЕ ИОНОВ КАЛИЯ культуроп АА'АВАЕУА
VARIABILIS
Интенсивность поглощения калия водорослями характеризу,
ют по изменению колпентраинН иона п наружном растворе за
определенный промежуток времени. Для этого определяют
конпентраито данного иола в исходном питательном растворе и
после экспозиции в Кем водорослей в течение заданно:о вреМен Н.
Цель работы. Изучить динамику поглощения калия водоро•
слями.
Реактивы оборудование: О.[Ю8 М фосфатный буфер (0,2 М
+0,2 М КОН), РН 7,0; колба объемом 200 мл; центрифуга; ФЭК; установка для
потеюшометрлческого
алреде.ления
поное
(рис,
25),
включающая
термостатнровзниую камеру для водоутслей с магнжтной мешалкой мостат U-I
с электродаин вспомогательным ЭВЛ-' н измернтельннм рН•Метг включен в
работу в режиме чувстви• тельности из 1 ещ Для регистрации тзиереяня РК
служит электронный самопишуиџтй потенциометр КСП“ (ткала 10 мВ).
По:енцноуетр под• кгючс•• к рН•метру через компенсирующее устройство
Компенсирующее устройсп•о служит для того, чтобы перо самолнсца могло
быть установлено
любой начально“ точке его (икали (ыезавнсамо от
рН•метга). В качестве источника света И(ТOЛЫую: утопраектор
Объект исследования; культура водорослей АпаЬаеаа varia№s. выращенная
на Иииеральиой среде.
рис. 25. Установка для определеная поглощения калия водорослями (обозна• чеиие
си. в тексте)
Ход работы. Работа состоит из нескольких этапов. Изучение
лог.лощения калия культурой водорослей проводят на фосфат• ной
буферной смеси
КОП). Для ее п игогонлеаия в колбу
объемом 200 мл наливают 5 мл М и 3 мл 0,2 М КОН. раствор
доводят дистилли ованноЙ водой до метки, Концентрация калия
здесь состааляет • мол,'л.
1, Калибровка электроДа. Для калибровки электрода
регистрируют показания потенциометра. отмечая уровень заласи
на ленте самописца при трех значениях концентрации калия в
буфер мом растворе, используемом для поглощения иона, В
термостатируемую камеру приливают 8 мл буферного раствора и
помещают з раствор электроды так, чтобы они не касались стенок
камеры, а шарик измерительного электрода был полностью
Полужен в раствор. Включают рН-метр и самописец.
ыбираот наиболее удобный режим работы самописца,
пользуя ком пенснрующее устройство. В зависимости от
показания рН•метра переключателем устанавлизают перо
самописца в начале шкалы. Если необходимо. Используют
плавную комПенсаци'0. После того как устанавливается
постоянный уровень запаси на ленте самописца, добавляют к
буферному раствору 1 мл дистиллированной воды, Регистрируют
вновь установившееся показание потенциометра. Еще раз
добавляют ! мл НЮ и снова регистрируют показание самописца.
Рассчитывают коалентрацию калия при первом (8 мл бук
ферногтэ раствора и мл ГЕО) и втором (8 мл буферного раствора и
2 Мл ГЕО) разбавлениях. Находят РК для этих концен• граций.
Определяют. какому изменению РК соответствует мм шкалы
самописца,
2, регистрация поглощения калия водорослями. Определяют
оптическую плотность культуры на фЭКе с зеленым
светофильтром в кюветах шириной см. Используя калибровочную
кривую для данных водорослей, рассчитывают Концентрацию
кле133
ток з культуре. используемой для задачи, и количество клеток в
100 мл этой культуры.
100 мл суспензии водорослей центрифугируют в течение 5
мни при 2000 об/мин. Осадок зодороелей ресусиелдируют в
дистиллированной воде, сливают в один центрифужный стакан и
центрифугируют еще раз з том же режиме. К осадку водорослей
приливают 3 мл дистиллированной воды. Рассчитывают
концентрацию клеток в этой суспензии,
В камеру налила:от 8 мл буферного раствора, на дно ее ила.
дут магнитик и включают магнитную мешалку, В буферный
раствор опускают электроды, включают освещение и самописец.
После того как устанавливается постоянный уровень запи в
камеру приливают мл суспензии водорослей. Регистрируют
изменение кониентрации калия в среде з течение 20—30 мин.
Зная, какой величине РК соответствует 1 см шкалы самописка
(данные калибровки), рассчитывают изменения РК (А РК) за
каждую минуту после пр 16:зв.чения водорослей и РК в каждый
данный момент. По зе.лнчнпе РК находят концентрацию калия.
Поглощение калия культурой водорослей характеризуют по
уменьшению кониентрации иона з растворе в единицу времени на
млрд клеток.
Оформление работы. Постройте график зависимости погло•
щения от времени. Подробнее см. разд. задача
Варианты опытов. Поглощение калия культурой водорослей
Поглощение калия культурами разного возраста. Для
выполненая этой задача берут 4—5-дневную и 20—25- дневную
Культуры. Измеряют оптическую плотность. более Густую сусп
пензию водорослей разбалляют так, чтобы культуры разного
Возраста имели одинаковую оптическую ллогность, Для работы
Используют по 100 мл каждой культуры, Далее проводят опыт
так, как описано выше, последовательно, т- е, сначала для од, ной
культуры, затем для другой.
Влияние освещения на поглощение калия водорослями.
Проводят работу в соответствии с описанием в двух вариантах: в
темноте и при освещении,
Поглощение калия в зависимости от концентрации иона в
среде. Для данной задачи используют молодую 4—7-дневную
культуру Апаћаепа uariabilis. Разную концентрацию калия
создают соответствующим разбавлением буферной смеси.
РАБОТА 2. ВИДО13АЯ
ПОГЛОЩЕНИЯ
НИТРАТА ВЫСШИМИ РАСТЕНИЯМИ
Нитраты—
основная
доступная
растениям
форма
минерального азота среды_ Давно известно. что использование
растениями ХОЗ— среды зависит ог вила: так, Chenopodiurn,
рапс, тыква, гречиха сильнее «любят» нитраты по сравнению с
соей, рисом, просом или льном. Пол генетическим контролем
находятся ра3•
134
ные этапы нитратного обмела растений, Активность нитратре•
дуктазы значительно различается л зависимости от вида. органа,
периода развития растения. Печально знаменитыми стали в
последнее время некоторые овощные культуры нитратомако•
кители: белокочанная капуста, огурец, тыква, морковь, картофель
и многие другие. Установлены различия по кинетическим
параметрам
и поглощения Нитрата между аилами н
даже между сортами, Интегральным результатом этих различий
на молекулярно.биохлмическом уровне, определяемом Ге• номом.
Является разная способность видов использовать
среды.
Измеояя
концентраиии нитрата в растворе за
заданный промежуток заемснн, можно рассчитать нетто-погло•
наение ХОз-, которое увляется результатом двух одновременно
идущих процессов: потока аниона из среды л корень (inf1ux) н его
выхода из корня в омывающий раствор (efflux), у здоровых
растекий нормального соленого статуса регуляция поступления
иона Осуществляется через систему вход!ныход на уровне целого
растения, Изменяться может как величина входа, так и величина
выхода. Полученные посзеднее время экспериментальные данные
показывают, кинетические характеристики по. глощения ЧОЗотносятся непосрелственмо к системе пола, Ме.
ханизм работы системы выхола пока остается неясным: з коли.
чественном выражении он достигает половины от величины
тока
внутрь.
Регистрируя нетто-логлощение уОз— у растений разного вида.
но одного возраста, Помешенных одинаковые условия, можно
составить представление об их способности потреблять
окисленный азот среды, Следует помнить, что измерение
Изменения нетто-лотока в ответ на меняющиеся условия среды
(освешенность, температура. сопутствующие ионы) выявляет
интегральный ответ со стороны петого растения, расшифровка
коТорого требует постановки специальных экспериментов,
Цель работы. Определить с помощью ХОз•ИСЭ нетто•погло•
щение нитрата кукурузой. тыквой. полсолнечником; сравнить
поглощение подсолнечником На слегу н в темноте.
реактивы и оборуто•ани: растворы ввей питательной смеси (см. ЗЭдзч• 1
данного п23дглз): калибровочные гзЛ3орЫ ККО> в уонагнтрацнях 10-1. 10-1. 1
10—• М; раствор H:SO,: н, раствор КОН; ион(в Метр И -12031: ХО,-ИСЭ:
стаканы объемом мл; весы влектрнческуе влк•тзоог.м,
Объект нсследоазння:
растения кукурузы. тнквы, лод•
Солнечник.“ 0,'IHOro
условляк темпгрз•
Туры и В. смеси Киг•лз (см. ЗалаЧУ Присутствие ионов нитрита в феде
выращивании •вляетгя обя• Зательным для аилукинм систем ю отлощения ХО,
Ход работы. Готовят З л свежего раствора Кнопа, используя
Исходные растворы солеЙ, входящих в состав смеси, В мерную
Колбу объемом 3 л наливают 2 л зололрог;одной волы, добав•
ляют по З мл са кн,ро,. ,MgS04,
kCl и доводят до метки.
Раствор аэрируют воздухом в течение 5—10 мин и проверяют рН.
который должен быть в пределах 6—7. При необходимости для
доведения РН используют растворы [12SO, и кон.
Для каждого вида растений берут по З стакана. В них нали.
ваот 110 50 питательного раствора и помещают по Ра. стенай,
Корин предварите.чьно промывают в свежем питатель. ном
растворе. Стаканы с растениями взвешивают и оставляют па свету
в течение 2—3 ч,
Порядок работы с ИСЗ И цифровым ионометром И-120М
Подготовка электродов к работе. Залить внутренние растворы:
для ХОз.ИСЭ—ОЛ М КХОЗ*0.01 М ка; для К-ИСЭ—
М kCl;
для
М X114Cl_ Ввинтить вспомогательный
электрод,
2. Поместить электроды н? 24 ч в те же растворы, что залиты
внутрь (их жс используют ДЛЕ хранения электродов) ,
Калибровка електродов. Подсоединить ИСЗ и электрод
сравнения к нонометру_ Включить прибор и прогреть его в
течение 5 мин, Промыть электроды дистиллированной водой,
просушить фильтровальной бумагой н начать измерения от мены
ших концентраций к большим, снимая показалия прибора в
милливольтах, Между этими измерениями электроды не
промыват. а только просушивают фильтровальной бумагой.
Если электродная фупкцня S находится в пределах от 47 до 62
мВ и в интервале намеояеме;х козлентраиий наблюдается
линейная зависимость ЭДС от логарифма концентрации, то
электрод пригоден к работе
При работе с растворами сложного иоаного состава
калибровку желательно проводить на фоне исследуемого
раствора,
В конце экспозиции стаканы с растениями опять взвешивают.
Разница по сравнению с предыдущии взвешиванием отражает
интенсивность транспирации. Растения вынимают, корна
обсушивают фильтровальной бумагой, Определяют сырую массу
разных органов: корней, листьев, стеблей, Результаты записывают
в виде произвольной таблицы.
С помощью ИСЭ определяют активность ХО:— в растворах до
и после экспозиину_ По формуле рассчитывают концентрапии
М)з— и вводят поправку на уменьшение объема за счет
транспирации. Зная и конечную концентрации N(h—, вычисляют
скорость нетто-поглощения иона в микромолях ХОЗ— 1 г
сырой массн корней за ч и микромолях ХОЗ— на одно растение за
1 ч,
ЗАДАЧА з. ИЗЛЕНИЕ СИНТЕТИЧЕСКОЯ Функиии корнгп НА
ПРИМЕРЕ усвоения ОКИСЛГННОГО АЗОТА СРЕДЫ
Азот — один из четырех элементов органогенов. Расчеты
показывают, что за год растения земного шара выносят кз появы
1010 т азота (для сравнения: в результате азотфиксации они
получают 17,5, 107 т). Основными доступными растению
формами азота почвы являются и NH,+, Почвенные нитраты
находятся в водной фазе, а ионы аммония адсорбируются на
отрицательно заряженных сючвеммых частицах. Поэтому
поглогцепие NH4+ осуществляется корнями по мере роста и
проникновеаия в новые слои ночвы, а ионы КОЗ— движутся к
корневой поверхности с водным током. Соотношение окисленной
и восстановленной форм азота н варьирует. Однако часто, в силу
высокой активности почвенных нигрификаторов, особенно на
хорошо аэрируемых не очень кислых почвах, основной досгупноЙ
растениям формой акота являются нитраты.
Поступав в растение, нитраты либо восстанавливаются и
включаются
в
состав
органических соединений,
либо
накапливаются н тканях и служат запасной формой азота.
Ассимилягорное восстановление N03— включает в себя два этапа:
двухэлектронное восстановление нитрата в нитрит, катализируемое
нитрагреДукгазоЙ (НР) , и шестиэлектронпос восстановление
нитрита до аммония, катализируемое нитрнтредухта.зой (Нир),
Скорость второй реакции в 5—20 раз выше, поэтому лри
благогцжятных условиях нитриты практически не накапливаются в
тканях. Аммоний токсичен, 30 он также Не накапливается, а
быстро зключается в первичные реакции амидирования и
аминирования, Реакция, катализируемая НР, самая медленная в
стела превращений атома азота от окииенного состояния до
положения в составе органических соединений, и, следовательИо,
именно этот этап лимитирует скорость процесса в целом. В
растительных тканях нет альтернативных путей восстановлений до
Поэтому по активности НР можно судить об интенсивности
усвоения нитратного азота.
Ассимиляция нитрата у высших растений идет как в надземных
органах, так и в корнях, Создание учения о биосинтетической
функции корней наряду с поглощением воды и минеральных
элементов — заслуга выдающегося ученого Д, А. Сабинина (1949).
Согласно современным лредсгазлениям, рслукция нитрата —
наиболее важная восстановительных реакций, Протекающих в
корнях, В зеленых тканях 2 электрона поступают от окислеаия
углеводов и электронов —из ЭТЦ фотосинтеза через ферредоксин.
В корнях все 8 электронов образуются за счет окисления углеводов
предположительно в пентозофосфатном дыхательном цикле.
Распределение нагрузки между корнями и листьями по усвоению
нитрата во многом определяется видом растения,
Цель задачи. Сравпить потенциальные возможности корней и
листьев разных видов растелий ассимилировать N03—.
Реактивы и оборудование: раствор уксусной кислоты 1,04); стандартные
растворы перекрасталлизованн(јге-, NaN02 с содержанием азо• Та в л раствора от
0,02 до г для калибровочной кривой; М фос137
буфер (РН 72);
М яблочная кис*ота•,
М раствор
Нигрит.чьТ реактив Грасса: а-нафтилами:' н сульфаниловая кислот„ а
соотношении Компоненты реактина н готовят следутаим образом
г знафтиламиаа растворяют 20 мл воды при нагревании, затем рати вор фильтруют
через стеклянный филе,тр № [ в колбу, содержащую lRO 324-го раствора
уксусной кислоты; сульфаниловой кислоты раств,ј. ряют в мл 32 % -го раствора
уксусной кислит“.
Объект исследозаная: растения кукурузы, тыквы, горо_ одногб возраста.
выращенные не растаоре н, питательной смеси Кио. ПЗ (см, задачу М
Присутствие асноз нитрата А питательнач растворе при выращивании является
обязательным, так как НР — индулируемы,•, субс:ратом фермент.
Ход работы. Активность НР in vivo (на кусочках тканей)
определяют по количеству эндогенно образовавшегося нитрита,
который накапливается в тканях в темноте, в анаэробных
условия„х. Последние необходимы для предотвращения
конкуренцин с кислородом за энлогсипо образующийся
лирилиннуклеотид. Растения достают из раствора, корни
отрезают, просушивают фильтровальной бумагой и взвешивают,
Определяют также сырую массу листьев,
Навески листьев (0,2 г) л корней (0,3 г) разрезают на кусочки
размером около 5 мм: , заворачивают н марлю и завязываюг, затем
помещают в трубки Тунберга, в которые предварительно налито 9 мл
инкубационной смеси; 5 мл фосфатного бу
Фера (0,6 М, РН 7,2),
! мл М яблочной кислоты, 1 мл М kNOs и 2 мл дистиллированной воды.
Целесообразно проводить определения в корнях и листьях
одного вида параллельно, Навески для каждого органа делают в
трех повторносгях„ Трубку закрывают пробкой, смазанной
вакуумной смазкой, совмещая отверстия в трубке и пробке, С
помощью вакуумного насоса откачивают возлух н течение 3 мин,
При этом наблюдают эффект «закипания» среды с содержимым,
трубка охлаждается. Если мешочек с навеской выброшен
эдакуируемым воздухом н верхнюю часть трубки, его надо
стряхнуть вниз, Затем при работающем насосе поворачивают
пробку, закрыв отверстие в трубке, через которое откачивается
воздух, и только лотом выключают насос и отсоединяют шланг.
Далее, совмещая поворотом пробки отверстия в трубке и пробке,
впускают воздух во внутреннее пространство трубки, благодаря
чему раствор входит в срезы тканей, Хорошо видно, как после
инфильтрации ткань темнеет и опускается на дно, Таким
способом увеличивают проницаемость ткалей для среды
инкубации: экзогенно добавленные малаг и нитрат создают в
клетках
оптимальные условия для работы НР.
Для создания анаэробных условий воздух из трубок вновь
эвакуируют в течение б мин, а затем помещают их в термостат
При 37 С на 30 мин. По истечении этого времени трубку слегка
встряхивают для перемешивания раствора, ОбразовавшийсЯ
нитрит из инфильтрированной ткани свободно попадает в омы-
правило, такой способ используют при большом числе
аовторлостей,
С реактивом Грисса окраска развивается практически сразу.
Интенсивность окрашивания определяют на ФЭКе при 540 нм. По
калибровке находят концентрацию н растворе.
Оформление работы. Рассчлтайте активНОсть НР в микро,
молях ХОЗ— на 1 г сырой массы растительной ткани за ч и
потенциальную возможность корней и листьев восстанавливать
нитрат (микромоли на орган одного растения за Ч).
Основные правила оформления см. разд. 1, задача
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
Баславския С, С. Трубецкова О. М Практикум по фнзнологни растени2.
Вахмистров Д. Б,. Мазедь Ю. Я. Поглощение и передвижењие соле\ в Клетках
науки и техники. Сер, Физиол Раст. М., 1973. Т.
с. 164—212,
Кларксон Д, Транспорт конон н структуре растительной Клетки. М. 1978.
Лютгае Уз Хыеинбогал Н. Передвижение вещес:н в растеннн, М.. 1984. Г. Б,
Мелпды Максимова. Лохиуического Л. 1978. С. анализа 140—46,растений $ Под
ред. В, В. Полеваго,
Нобель П. физнолагнн растительной клетки. М., 1973. С.
Полевой В. В, физиалогнн растений, М,
С 215—27'.
М„ Сабинин 1971 Д, Л. Избранные труды ло минеральному Пнтаник;» растений.
А Т. фомосннјез н
биопродуктианоеть: 1989. С.
274—285. методы определения ! ПСА ред.
138
Ёјющић раствор й становится доступным для кёличествейиы*
определений.
Концентрацию N02— определяют с помощью реактива Г рисга,
который готовят непосредственно перед определением, смешивая
нафтиламин н сульфаниловую кислоту. Вместе с нитритом они
образуют азосоединение, окрашеннос м розовый цвет. реакция идет
две стадии; сначала сульфаниловая кислота, „заимодейстнуя с
НМ)г, дает диазосоедиаение, которое затем в реакции с анафтиламином превращается в конечный продукт.
Из грубок Тунберга отбирают в трех аналитических повтор,
постях по 1 мл инкубационной среды н добавляют по 1 мл реактива
Грисса, Одновременно ставят контроль на реактивы; к 2 Мл
неиспользованной среды приливают 2 мл реактива Грисса. Отбор
проб и реакцию определения следует проводить быстро, не
мешкая, чтобы избежать потерь нитрита, Альтернатинным
способом может быть остановка реакции уксусной кислотоЙ,
которую добан.ляюг в конце экспозиции в среду инкубацил, Как
Раздел Vl
ВОДНЫЙ РЕЖИМ РАСТЕНИИ
Вода составляет большую часть массы живых организмов: н
среднем от 70 до Биополимеры, в том числе белка, мо. гут
нормально фупкпипнлронать лишь н водной среде, Поэтому
некоторые исс.педонателл считают, что многие физиологические
явления обусловлены особенностями не только растворенных
веществ, но в равной мере и растворителя — воГ)ы_
Свойства
воды
определяются
ее
высокой
структурированкостью. Молекулы воды, представляющие собой
диполл, соединяюгся водородными связями, образуя ажурную
квазикрКгаллическую структуру с тетраэдрлчсско:"' координацией
соседних молекул. Это отличает воду от других жадностей, Не все
мо, леку.лы воды входят в состав кристаллической структуры. Суп
ществуют и более подвижные молекулы, не имеющие Н-снязеЙ
или имеющие малое кол (Шество Сложная структура воды
обусловливает
ее
взаимодействие с
электролитами
и
неэлектроантами (н том числе и биополимерами), способе—гнуег
переносу протонов и электронов, Таким образом, во многом
влияет на ход физиолого-биохнмичсских процессов в растепли,
роль воды н жизни растений проявляется во всех аспектах их
жизнедеятельности, Вода является и средой, и непосредст• венным
участником большинства биохимических реакций. Вода служит
компонентом структуры протоплазмы.
Нормальная обеспеченность клеток водой необходима для
поддержания их оболочек н упругом состоянии, н состоянии
тургора. (Туреорны,и давлением называог Мдростатическое
давление содержимого клетка на оболочку.) Благодаря тургорному
состоянию поддерживается форма органов растений со слабо
развитой механической тканью и осуществляется их рас“
положение в пространстве, С изменениями тургорного давления
снизаны некоторые движения частей растений.
Теплоемкость, теплопроводность, теплота плавления и испз•
рения воды, наиболее высокие для жидкостей (кроме Х НЗ),
уменьшают пределы температурных колебаний, способствуют
сохранению постоянства тем лературы организма, дают
термостатический эффект в точке замерзания, Испарение водо
(транспирация) служит основным средством терморегуляции у
растений,
показывает эффективную (реальную) концентрацию вещссгна, в
частности воды, в сисце_ме, За меру активности воды принимают
относительное давление водяного пара, с которым система в
данных условиях находится в равновесии:
где а— активность, р— давление пара над системой. Ра— давление
насыщенного пара над частой водой при тех же условиях.
Активность чистой воды В живой клетке подвижность воды
снижена
вследствие
межмолекулярных
взаимодействий,
гидратации, иммобилизации воды в микрокапи.ллярах между
макромолекулами и внутри инк, а также осмотического давлени.
Поэтому затруднено перемещение •молекул, замерзание л
Испарение, связанная зола менее интенсивно участвует в хлми•
ческах реакциях, т, е. облаласг меньшей активностью.
Положительно влияет на активность повышение температуры и
давле лия.
Важным термодинамическим показателем состояния воды в
системе является аоДный потенциал Ч;, Водиый потепциал
отраЖает способность воды в системе совершать работу по
сравне НИю с той, которую произвела бы при прочих условиях
чистая вода с актавностью, равной единице. Иначе его можно
опредеЛить как работу, необходимую для того, чтобы поднять
потенИнал связанной воды до потенциала чистой, т. е, свободной,
воды.
Термин «водный потенциал» не вполне точен. Правильнее, Но
менее употребителен термин «разность потенциалов воды»,
Поскольку он определяется разностью между химическими
лоТенщиалами воды системе и чистой воды:
140
Высокое
поверхностнос
натяжение
обусловливает
переђвиженле воды по капиллярам, Это свойство наряду со
способ„остью растворять многие минеральные н органические
вещества определяет участие воды в почвенном питании растений
и передвижении веществ По растению. Немалую роль для дыхапня
и фотосинтеза играет растворимость в воде газов, н первую очередь
02 и
Вышесказанное свидетельствует о значении воды для
жизнедеятельности организма в делом и каждой индивидуальной
клетки, Однако для биохимической активности протоплазмы важно
не просто количество воды, а ее термодинамическое состояние.
Достаточно хорошо характеризует состояние воды н, растении
активносгэ ьоды. Под атланостг,ю понимают способность вещества
участвовать в химических реакциях, фазовых переходах.
механических перемещениях и т. п. Следовательно, активномь
Дж/мз,
где џ.—џ.— разность химических потенциалов системы и чистой
воды. — парциальный мольный объем воды.
Таким образом, размерность водного потенциала эквивалент.
на размерности давления (Н!м2), поэтому его также выражат в
паскалях (Па) или других единицах давления (1 ату— 101,325
кПа). Химический потенциал воды связан с актин. ностью:
а. Активность воды в растворе всегда меньше единицы,
поэтому 171 а Следовательно. потенциал вол в растении. почве и
атмосфере меньше нуля. Потенциал чистой воды или системы.
находящейся в равновесии с чистой водой. равен нуль,
Положителен потенциа.' волы. подвергнутой дейст-
Вию давления. по сравнению с Потенциалом воды при стандарт.
них условиях. Поэтому водный потенииал может быть положи.
телен при гуттации. или плаче растений (см. ниже)
Различие значений водного потенциала в разных точках и
означает. что между этими точками вола не находится н
состоянии равновесия и будет стремиться в точку с более ню.
ким значением t_
Чем ниже водный потенциал системы, тем с большей силой
она поглощает воду. Поэтому водный потенциал, взятый с ог
рицательннм знаком, обозначают термином сосущая сила (5)
Различие сосущей силы в двух точках системы также указнва• ет
на возможность передвижения водн между ними; в этом слу чае
вола стремится в точку с большим значением сосущей
силы,
ВоДообмен растений складывается из неразрывно связанных
Процессов: 1) поглощения волы, 2) ее перелвкження. распреде•
ленив. 3) транспирации, Эти процессы находятся между собой в
подвижном равновесии. Они обеспечивают постоянное пере
движение воды в системе
обуслоз•
ленное выравниванием активности воды и водного потенциала в
этой системе.
Надземная часть растения находится обычно в воздушной
среде (за исключением водных растений). В воздухе существу ет
дефицит упругости водяного пара. поэтому его водный
потенциал низок, т. е. высока сосущая сила. Перепад сосч;шеЙ
силы ведет к постоянной отдаче воды растением в воздух в виде
водяного пара. Из-за частичной потери воды поверхностными
клетками растення ее активность снижается и возрастает сосу
щая скла этих клеток. За счет этого они могут отнимать воду у
более глубоко лежащих клеток, те у следующих н т. д.
Предполагают, что вода в мезофилле листа передвигается
главным образом по капиллярам клеточных стенок. т. е. спо•
собом наименьшего сопротивления. Передвижение волы идет
осмотическим путем вследствие уменьшения набухания коллоЛ•
дов и повышения осмотического давления.
Присасывающее ( повышающее осущу•ю силу) действие
транспирации вызывает разрежение в сосудах, вследствие чего
от корней к листьям по сосудам поступает вода. Но арнсасЫ•
142
зающеЙ силн транспирации недостаточно, чтобы поднять воду на
всю длину капаллярного столба в сосудистой системе,
достигающей у деревьев десятков метров. Считают. что в
поддержании транспирашюнного тока важно у'астие силы
сцепления молекул воды между собой— когезии, действующей в
отсутст ние пузырьков газа. Большое значение имеет и сила
сцепления воды со стенками сосудов— адгезия. Действие этих сил
пркво•
к тому, что вода в просветах сосудов движется непрерыв•
ннм Потоком со скоростью от м/ч у ряда травянистых ра• стенал до
у лиан.
Наряду е присасывающим действием транспирации, именуемкм
верхних концевым Двигателем водного тока. в поглощении н
передвижении воды в растении участвует также нижний концевой
Двигатель. или корневое Давление. В отличне от «лассиа• кого»
поглоШеЊия мзды, вызванного ее потерей в Ходе транспи• рации,
корневое давление обусловлено «активным. поглощением,
связанным с затратой энергии. Если При интенсивной
транспирации вода расходуется быстрее, чем поглощается. это
уси.ти• нает натяжение водных нитей з сосудах и приводит к
созданию в них отрицательного гидростатического дав.лення, При
ослаб, лении или отсутствии транспирации давление в сосудах
станозлгся избыточным. Это обусловлено существованием
корневого давления. действие которого в этих условиях
проявляется наглядно_ Так, при насыщении атмосферы водяннмн
парамн наблюдается гуттация— выделение капельно-жидкой воды
через гида годн (водные железы).
Преллолагают, что г:ослощОНИО воды корнем н ее передаи•
жение по клеткам коры до центрального инлинлра осушестзля•
ется, как и передвижение золы н мезофилле листа. осмотиче• ским
Путем по градиенту водного потенциала. , Нерешенным остается
вопрос о том, какие именно процессы создают грали• енг сосущей
силы, обусловливающей односторонний ток воды, Существует
гипотеза о полярности клеток коровой паренхимы. т. е. о локальных
различиях проницаемости и метаболических процессов в
противоположных участках цитоплазмы этих кле
В коровой паренхиме вода движется главным образом по
Капиллярам клеточных сгенок_ В центральный цилиндр она
Проходит через цитоплазму пропускных клеток эндодермы, так Как
опробковевшне стенки клеток с поясками Каспари препят• сгзуют
апопластному току, В сосуды ксилемы вода поступает Вследствие
высокой сосущей силы их содержимого ОсмотическнЙ потенциал
н. следовательно, сосущая сила сока ксилемы создаются за счет
активного транспорта ионов живыми клеткаИи паренхимы в
сосуды. Активный транспорт требует затрат Метаболической
энергии. лоэтому корневое давление зависит от Интенсивности
дыхания, При интенсивной транспиращии, как уже указывалось,
высокая сосущая сила в сткулах поддержиВается за счет
присасывающего действия транспирации. Доля
из
«активного» поглощения в общем поглощении воды различна у
разных растений и варьирует в зависимости от времени года н
условий произрастания.
Корень растения извлекает воду [13 почвы до тех лор. пока
существует градиент активности воды между корнем и почвой, т.
е. пока сосущая сила клеток эпидермиса, контактирующих с
почвенными частицами, хотя бы незначительно превышает со,
сущую силу почвы Для этого клетки корней развивают сосу. Шую
силу до 6000 кПа,
Сложность л.звлеченив волы из почвы заключается в том, что
корням. необходимо преодолеть сопротивление сил, которые
связывают почвенную влагу, удерживаемую поцвс;мымл часта.
цами. Уже при
снижения содержания воды лочве
ее сосущая сала резко возрастает, все меньше отличаясь от
сосущей силы корней, что снижает интенсивность постулле. ная
волн растение, Способность растения поглощать воду зависит не
только от свойств почвы, ее влагопроводности, ЕО и от
соотношения неличин водного потелииала в почве н растении,
температуры почвы и особенностей самой корневой си, стемн,
ВоДныЙ баланс, специфичный для разных видов растений,
определяется разностью поступления и расходования воды. В
случае согласования поглощения, передвижения и потери воды
водный баланс будет уравновешенным, Как правл.ло, водныЙ
баланс постоянно колеблется, Поддержание баланса меж, ду
поступлением и расходованием воды на определенном уровне
достигается путем регулирования как поглощения ее, так н
испарения. Водный баланс — один из сущхтьенных факторов,
определяющих выживаемость и продуктивиостА растений.
ЗАДАЧА 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИНАМИКИ поглощения
ВОДЫ ТАЛЛОМОМ ЛИШАЙНИКА
Приспособления растений „к недостатку воды весьма
разнообразны. В частности, чрезвычайно высокую устойчивость к
условиям дефицита влаги проявляют лишайники. Именно
способность лишайников адаптироваться к неблагоприятным
условиям, н том числе к засухе, определила их широкос географи•
ческое распространение. Эта эволюционно выработанная
адалтация носит комплексный характер. При неблагоприятных
условиях все Процессы замедляются, становятся латентными, в то
время как при благоприятных — быстро восстанавлива• юлтя.
Один из путей физиологической адаптации лишайников к
ксеротическим условиям — быстрая Потеря воды и отсутствие
специальных приспособлений для предохранении от испарения.
Способность быстро высыхать позволяет лишайникам без
повреждений переносить нагревание солнечными лучами, что
было бы опасна для влажного таллома, В засушливый период
144
некоторые виды лишаЙников содержат лишь воды, Лишайзнки
способны жить без воды более года При увлажнении
филологические функции лишайников быстро восстанавлива,отся,
прежде всего дыхание, Фолослнтез начинается со слабой
интенсивностя и гостспемпо нарастает до нормы. Механизмы,
обеспечивающие быстрое поглощение воды сухими лишайниками, н настоящге зре_мя не выиснеиы.
Цель работы. Определить динамику поглощения воды
воздушно•сухики талломами лишайнџкон при удлажнелпп.
Объекты истледазанпя: талломы листизатых лашзйникпв (например, peitigera.
,трј, хранившиеся а лабораторных услсвиях з возмушлгЈ-сухдМ слабом исвеклениа,
Реантнвы и оборудование: чашка Пари с влажным пегжом; песочные «асы на З
Н МИН ИЛИ часы с секундомером: тсрсианНЫе весы со 11_Ж3лбй до г.
Ход работы. Три таллома лишайника азаеснть на торсионпых
весах и поместить во влажную камеру, В качестве камеры можно
использовать чашку Петри (на ее дно насылают лесок с влажностью
приблизительно 200,6), в которой установился определенный режим
влажности, Последующие взвешивания лролзнодят с интервалами
1, З, 5, 10, 30 мин и I ч. Короткие временные интервалы удобнее
отмечать по песочным часам.
Количество волы, поглощенной
за определенныЙ
интервал времени, определяют вычитанием исходно“ (сухоЙ)
массы таллома из очередного результата взвешивании,
показывающего массу увлажненного таллома, Производят расчет
поглощения воды на г сухого таллома,
Оформление работы. Оформите задачу (10 образцу. См, сноску в
разд, 1, задача Резх'льтаты занесите в таблицу (табл. В
окончательном ваде результаты предстаньте н форме графика, гле
по горизонтали отложено время, а по вертикала— масса
поглощенной воды на г сухого таллома (каждая точка представляет
собой среднюю величину для трех определений).
Таблица i9
м
Время.
ме
воды,
галлом“.
Среди дт•
зо
60
145
ЗАДАЧА 2. ИЗУЧЕНИЕ ЭКССУДАЦИИ Корнея
Еми срезать надземную часть р астения, на срезе пенька
начинает выделяться жидкость, Это явление называют плачем
растений, или экссуГ)ацией. а вытекающую из сосудов жидкость
(водный раствор ряда органических и неоргапичсгких не. ществ) —
пасокой, пли экссуОатом. Величлна корневого давлс. ная, скорость
плача и состан пасоки варьируют ь зазисимостл от вида растения,
его возраста, времени года л времени суток, Экссудация, как и
гуттация, н зблюдается лишь пра условли нормальной. работы
корневой системы; оба процесса тормозятся в отсутствие 02 кли
„при воздействии на корень инглбллорпн дыхания, разобщителей
дыхааля л окислительного фосфорилировании. Это показывает, что
корневое давление, являющееся причиной плача и гуттап;ш,
обусловлено именно «активным» поглощением воды. Последнее
связано с метаболическими процессами клетках кормя, идущими за
счет высвобождения эпер. гии при аэробном дыхании, Агенты,
изменяющие проницаемость мембран, влияют (1 на эти процессы,
что подтнсрждаст У'астае мембран 8 создании корневого давления,
в особенностл при прохождении воды через клетка эндодермы. В то
же время зависимость величины корневого давления от
температуры свидетельстнует об участии в его создании и
физических факторов, Таким образом, корневое давление имеет
сложную природу,
Цель работы. Изушть влияние температуры л агентов, мн,
гибнрующих или стимулирующих метаболизм, на интенсивность
экссудации корней.
Объекты исследования: проростков кукурузы, тыкнк или подсол, нечника.
выращенных з Кюветах на влажной фильтровальной бумаге при ксмнатной
температуре.
Реактпвы и оборудование: М раство;з 2.4-линлтрофгнола (ДНФ}; 5' М расТНог
абсцизовой кислоты (ДбК\; ультрагермосжат; кристаллизатор пластмассовой
крышкой с отверстиями, иааилляр[,' с делениями: замазка; водяная баня;
безопасная бритва; часовые стекла.
Ход работы. Выбирают прямые корни проростков длиной 8—10
ем. В капле воды на стекле разрезают корень поперек,
приблизительно на дне равные части. Для опыта берут нижнюю
половину, обладающую наибольшей поглотительной способ
ностьо, Эту половину вставляют в капилляр длиной см таким
образом, чтобы дерхняя часть входила н просвет примерно на 2 мм,
В качестве капилляра удобно использовать отрезки микропипеток с
ценой ,чслення 0,001 мл, Место соединения кормя с приемником
заклеиват смесью канифоли с парафином ' 1). Эту замазку но
время работы держат на водяной бане для сохранения в жидком
виде (температура плавления С).
Отрсзкл пипеток с корнями факспру:ог пра помощи резиновых
колен в крышке кристаллизатора н в течение 20 мин выдержинают
корни во влажной камере для снятия раневого эффекта и усиления
экссудации, Затем крышку с корнями пере146
носят на кристаллизатор с водой или испытуемым раствором,
находящимся в ультратермостате. Между концом капилляра и
водой должеп быть слой воздуха около 5 мм,
Схема установки приведена на рис, 26. Максимальная
интенсиниость экссудации происходит при 25—30' С, лоэгпму
опыты „рекомендуется пронодите, при этих температурах.
Сравнение скоростн экссула• ини при температурах с антер• валом
100 С позволяет вычлс• лить температурный коэффиШент
экссудации. Скорость экссудации определяют по передвижению
мениска пасоки в капилляре и рассчитывают в миллилитрах в час,
Наблю
26. Схема опыта деинс производят
20—30 мнн_ В каждом вариан-
пей: — ультратермостат, 2 — корень,
тс берут 10 корней,
З — угоне нь пасоки, 4 — каплллр,р
На основании ср авиения
дл н сбора пасоки, 5 — рези лозое
для фиксирочания
капиллира,
б— замазка, 7— вода или раствор
скорости экссудации корпя на
испытуемого
вещества. 8
воде и исследуемых растворах
лазах»р
делают вывод о действии на этот
пронесс метаболического
в течение штекс“вногти зхссудзцин кир•
ингиблтора
ДНФ
или
мембранотрппного фитогормона
ЛБК,
Оформление работы. См.
разд. 1, задача
ЗАДАЧА З. ТРАНСПИРАЦИЯ
РАСТЕНИЯ
определе•
Транспирация, или испарение воды в атмосферу надземными
органами растений, может быть кутикулурной
с ку
типизированной поверхности эпидермиса), периДермальной
(испарение с опробковевшнх Поверхностей); но наибольшая часть
испаряемой воды приходится на усгаичну,ю транспирацию, т, е.
испарение через устьица, Основным транспнрирующнм органом
растения, на котором сосредоточены устьица, является лист
Типичный устьичнђ{й аппарат— щель. окаймленная двуМя
видоизмененными эпидермальннми клетками бобовидной формы с
неравномерно утолщенными оболочками , —замыкающкмл
клетками. У разных видов растений устьица различаются по форме,
строению, количеству и величине, что определяет Максимальную
транспирационную способность растения, У больШинстна растений они располагаются на нижней стороне листа,
Вода из сосудов жилок ласта попадает в клетки мезофилла Листа,
испаряется С их поверхности в межклетники, диффунди• РУет в
Подустьичную воздушную полость, а оттуда через Усть, Ичную
щель в атмосферу.
Транспирация (как и испарение) — диффузионный процесс,
она определяется градиентом водного потенциала н системе
поя
Поэтому все факторы, влияющие на этот
градиент, воздействуют на общую (устьичт,'го и кутикулярную)
транспираиию в той же мсрс, что и на испарение долы,
Транспирация как физический процесс зависит от дефицита
насыщения
воздуха
водяными
ларами,
температуры,
освещенности, движеиня воздуха, а также ст не.пичины формы
испаряющей поверхности, определяемой особенностями строения
растений,
Строгая зависимость транспирации от этих фактором
сохраняется ллшь• при условии постоянства площади устьичных
отверетий, так как благодаря специфике строения замыкающих
клеток шири!на устьичной щели может изменяться от макса.
мальной до полного закрывания, Таким образом, растение
способко регулировать отдачу воды.
Открывапие а закрывание устьиц основано на изменен ин
гургорного давления в замыкающих клетках, связанном с
изменемнем осмотлчсского давления з этих клетках. При
повышении тургорнпгп давления устьица открываются.
Закрывание устьиц происходит, когда расход волы превышает ее
поступление через корна и тургор замыка.ощл,х клеток падает до
определенного критического уров1“.5Г Механизм движения
устьиц, т, е. создания определенных величин тургорного и
осмоти=зеского давления в них, окончательно не выяснен,
Известно, что немаловажную роль играет содержание СО,
замыкающих клетках, определяемое преимущественно ходом
фотосинтеза н них. Показано значение ионов К+, [1+ и С!(прежде
всесо К+) в создании тургора в замыкающих клетках, Это связано с
деятельностью [1+-помпы плазмалеммы этих клеток, Измснемис в
их вакуолях концентрации ионов или других осмотически
активных веществ (органических кислог и др.) приводит к
соответстнудошему изменению поступления воды в вакуоли и
увеличению или сокращению размеров клеток, Их кривизны н,
следовательно, ширины устьичной щели.
В последние годы большую роль в механизме движения устьиц
отводят фитогормону абсцлзоной кислоте (АВК), называемоЙ
иногда гормоном стресса, так как она наствует в приспособленля
растения к неблагоприятным условиям. Так, при водном дефиците
АБК быстро накапливается в тканях листьев, в частности, в
замыкающих клетках устьиц, подавляет (3 них функционирование
НФ, помпы плазмалеммы, усиливая выход КА- из клеток, их
тургор смижается, и устьица закрывајотся„ Это может происходить
еще до наступления заметного увядаНия растения.
РАБОТА 1, ИЗУЧЕНИЕ устьичнот•о АППАРАТА РАСТЕНИИ
опыт движання Устьиц
Цель работы. Проследить за дважениями устьиц при воздейСТВий
на них осмотически активного вещества (глицерина) п вещества,
влияющего на свойства мембран (АБК)
Объект исследования: листья трахесканции. згбрины. сеткреазиу, герани и
других застеннй.
реактивы и оборудование: 20%-Й растворн глицерина; М раствор АВК;
предметныг и докрозныг стекла; безопасная бригза', микроскоп.
Ход работы. Вариант 1. С нижней стороны листа снимают
кусочки эпидермиса, надрезая его бритвой, и помещают их в 54-й
раствор глицерина на ч. Глицер11н, проникая а вакуол11
замыкающих клеток устьиц, повышает их осмотическое давление и
соответственно способность насасывать воду. Затем срезы
эпидермиса в этом же растворе просматривают под микроскопом,
отмечают состояние устьиц и зарисовынаюг их,
Заменяют глицерин на дистиллированную воду: одной стоРоны
покровлого стекла наносят каплю воды, с другой
дают
глицерин фильтровальной бумагой, Наблюдают раскрывание
устьиц. После этого таким же способом заменяют воду 2006-м
раствором глицерина и наблюдают закрыманис устьиц.
Зарисоьызаюг устьица 30 всех наблюдаемых состояниях и делают
вывод о причинах движений устьиц.
Вариант 2. С листа растения, предварительно обильно полиТого
и хорошо освещенного, снимают кусочки эпидермиса, как описало
выше, и капле воды просматривают их тод микроскопом„ Для
опыта берут эпидермис с достаточно широко открытыми устьицами, Отобранные кусочки эпидермиса помещают в 10—
М раствор АБК. Черев 30—40 мин рассматривают срезы и
отмечают изменение состояния устьиц, Исходное 11 конечное
состояния устьиц зарисовывают и объяснюот_
опыт 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ
ПОВЕРХНОСТИ ЛИСТА
У растений с очень тонкой кутикулой на долю кутикулярной
транспирации может приходиться до 504 всей испаряемой ноды,
Однако в большинстве случаев сущестнегтчо преобладает
устьичная транспирация, и трансплрирующей поверхностью
практически является поверхность устьичны.\ щелей. Хотя устьИца
даже в полностью открытом виде редко занимают площадь более 2
% листовой поверхности, скорость испарения воды из них
составляет не менее Аспа рения с водной поверхности равной всей
площади листа, Эго объясняется эффектом малых отверстий.
Цель работы. Определить количество устьиц и суммарную
Поверхность устьичных щелей на единицу площади листа у
растений различных экологических групп ила при разном
водоснабжении,
При расчете площадн устьичнпй щели произведение длины и
ширины умножают на коэффициент 0,7, так как форма щели близка
к ромбической.
При помощи объективного микрометра измер яют в
миллиметрах диаметр поля зрения при большом увеличении и
рассчитывают его площадь, Используя среднюю площадь
устьачной щели и среднее число устьиц в [иоле зрения, вычис.ляют
общую испаряющую поверхность всех устьиц в поле зрения.
Используя полуошые латные, определяют количество устьиц на
единицу площади листа и относительную площадь усть• ичных
щелей в процентах.
Оформление работы. Результаты представьте в виде таблицы
(табл. 20). Подробнее см. разд. 1, задача 1,
Объект исследования: листья традесканции, зебрины, герани, каллы,
Толстянка. очитка и других растений, реактивы и оборудование: предметные И
покрозмые стекла; безопасная Пришва; коллодий; микроскоп; объективный и
окулирнпй мтрометры.
Таблица 20
Ход работы. Выбирают объекты для сравнения. Ими могут
быть, например, растения с ксероморфными признаками и мезо.
фиты, а также разновозрастные листья одного растения, Можно
исследовать верхнюю и
стороны одного листа, Же.
лательно взять не менее двух объектов,
С поверхности листа снимают эпидермис, надрезая его брит.
мой, помещают в каг„лю воды рассматривают под микроскопом
при увеличении объектива С листьев растений, у которых
эпидермис снимается плохо, можно сделать отпечатки методом
Полачча, Для этого на поверхность листа лаппсяг палочкой топкий
мазок коллодия, Быстро застывая, коллодий образует пленку, на
которой отпечатывается поверхность эгидермлеа с устьлцами_
Кусочек пленки рассматривают под микроскопом л капле воды.
Подсчитывают количество устьиц в пяти полях зрения при
унг,лнчепаи объектива Х 40 и вычисляют среднее. Измеряют
окулярным микрометром длину и Ширину устьичной щели для
пяти устьиц, ныбнраг наиболее раскрытые.
Целу де.лсн•ля окуляр микрометра определяют следуо• щи,м
образом, Совмещают окулярную шкалу со шкалой объекгнвного
микрометра, Находят какой-либо интервал, на котором совпадают
риска шкал. Подсчитывают, сколько делений окулярноЙ шкалы и
сколько делений объективного микрометра укладывается на этом
отрезке. Учитывая, что цепа деления объективного микрометра
составляет 0,0! мм, рассчитывают цену деления окулярного
микрометра, Получив эту величину, опреде.ляют длииу а ширину
устьичной щели в миллиметрах.
РАБОТА
2,
опргдг-лгниЕ
ИНТЕНСИВНОСТИ
психромнтричрским МЕТОДОМ
ТРАНСПИРАЦИИ
Интенсивностью транспирации называют количество воды,
испарившейся с единицы поверхности листа за единицу времеаи, В
эколого-физио.логическлх исследованиях большое внима• ние
уделяют изменениям интенсивности транспирации в зав леимости
от внешних услонлй, «Амплитуду» транспирации в ответ на
внешнее воздействие рассматрнвао:• как признак, характеризу:ощий
подвижность или устойчивость водного режима растеная, т. е.
способность растения адаптироваться к измеленн• ям условий
среды. Между экологическиыи группами растений не всегда
выявляются четкие различия Ло интенсивности транспнрации,
скорее можно судить о
гигрофилов к меньшей
интенсивлосги транспирации по срањнению с мезофитами,
учттыная при этом условия среды.
Установка для определения ггнтемсшзности транспираг:аи
растения или его листа работает на принципе измерения разности
между влажностью воздуха, поступающего в герметическую камеру
с растением или его органом, л воздуха, выходящего из камеры.
Воздух прокачивается через камеру микрокомпрессо• ром.
Влажность воздуха определяется датчиком. Принцип дейстния
этого датчика ословал ла измерении разности температур сухого и
Термопары соединены последовательно одноименными поувлажненного термометров (принцип действия психро• метра
Лярностями (встречно). При этом между сдободными концами Тс№мопар
Августа — охлаждение поверхности земедстнле испарения влаги)
возникает разностная ЭДС (Еизх), величина которой Пропорциональна
разности температур сухой и влажной термо-
Схема гическое
устройство
датчика представлено на рис. 27,
Двухкамерная ячейка 1 разделена
на водяную 8 и воздушМую 3
камеры. В стенке ячейки
проделано заправочное отвер•
стис 7, через которое в водяную
камеру шприцем подают воду.
Воздушная камера имеет
отнерстие, через которое в
водяную камеру проходитфитильная трубка 2 для
увлажнения одной Из термопар и
штуцера входа воздуха 4 и выхода
камере Рис. 27, Датчик для огределезяь
Помещаются термопары 6, котовлажности воздуха (обозначения
см, в тексте)
рые в данном случае используют
вместо термометров.
4'. Ячейка закрывается герметической Крышкой 5. В воздушной
Пар (ic й Разность температур, в свою очередь, Находите, в
обратной зависимости от ф— относительной влажности возду ха,
проходящего через датчик.
Таким образом, при
температуры термопар
П
актически одинаковы. Тогда разность между ЭДС сухой, (Ёс) л
ЭДС влажной (Ев) термопар — Е.— О. При
температуры
термопар различаются: tc>tB, и Етм=-—
Величину Е„зм измеряют с гомощью многопредельного
малливольтмнкроамперметра Ф = 1 16 или аналогичного прибора.
Выходной „сигнал через усилитель (ЛПУ-О1 или другой)
регистрируют самописцем.
Калибровку установки производят следующим образом. Оп.
ределяюг показания приборов при пропускании воздуха известной
относительной влажности через датчик, Для этого шланг,
подающий воздух, присоединяют к камере или сосуду достаточно
большого размера, чтобы поместить туда психрометр.
Повышенную влажность в камере создат увлажненной бумагой.
Регистрируют
одновременно
показания
приборов
и
психромет Кроме того, в течение нескольких дней определяют
влажность атмосферного воздуха (она значительно варьирует).
Имея ряд данных, составляют калибровочную кривую, на
которую наносят по горизонтали относительную влажность, по
вертикали— показания измеряющего Ею, прибора
Использованле самописца позволяет наблюдать динамику
изменений влажности п проверять стабильность результатов.
Величину
отклоненлй
пера
самописца
также
можно
прокалибровать по показаниям измеряющего прибора л
психрометра.
Цель работы. Сравнить интенсивность транспирации
растеНАЙ разных экологических групп, разновозрастных листьев
одного растения, а также одного н того же растения ила его
оргама при различных внешних возлеиствиях.
Объект исследован“: различные растения в почвенной, песчаной
водной
культуре.
реактивы и оОрудоваНве: глицерин или вакуумная смазка; осветительная
лампа; торсионные весы; установка для определемик транспирации.
Ход работы. В прозрачную герметическую камеру установки
помещают лист растения или всю его надземнытю часть,
Смазывают резиновую прокладку камерн вакуумной смазкой или
глицерином, закрывают стеклянной крышкой л завинчивают
прижимы, Включают воздушный компрессор и приборы. После
того как показания приборов стабилизируются, регистрируют их.
Затем извлекают лист из камеры, продувают датчик атмосферным
воздухом н регистрируют показания для него. Можно начать
определение с атмосферно:ю воздуха. Таким же образом проводят
определение с новым объектом.
Высокая чувствительность н малая инерционность прибора
позволяют также производить сравнение интенсивности
транспирации одного объекта при различных воздействиях.
Таковымн могут быть изменение освещения, полив
предварительно подсушенного растения, изменение температуры
питательного раствора, помещение корневой системы или стебля
срезанного побега в раствор гербицида али другого биологически
активного вещества и т, д,
Интенсивность трањспирацин рассчитывают по следующей
формуле:
RT,s
где [—интенсивность транспирации, г зоды/см2• мин; —
относительная влажность атмосферного воздуха, % ; относительная
влажность воздуха, прошедшего через камеру с объектом, % ; р—
упругость насыщенного водяного пара при данной температуре, Па;
у — пропускная способность компрессора, мумин; М— молярная
масса воды (18 1¶мпль); К— универсальная газовая постоянная
(8,31 Дж; (моль. К) ] ; Т— температура, К; S— площадь листа (или
листьев), см2.
Площадь листа определяют весовым методом, Для этого лист
кладут на бумагу (лучше всего кальку, имеющую наиболее ровную
толщину и соответственно равномерную массу) н обводят его по
контуру, Можно наложить кальку на лист или использовать малик с
подсветкой. Изображение листа вырезают з взвешивают на
торсионных весах, Затем взвешивают фи. гуру с известной
площадью (например, квадрат 10 см2), составляют пропорцию и
находят площадь джута.
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
Аксенов С И. Вода н ее роль в регуляции биологических процессов. М., 1990,
Борисова Т. А., Лазарева Н. П., Жалкевац В. Н. Влияние химических агентов
на эндодермальный скачок водного потеииигла и экссудацию корней Zea
тиу;њџдокл. АН СССР, 1982. Т. 267, № З, С 756—7€8,
Водный обмен растений / Под ред. И. Х Тарчевского, В. Н, Жолкевнча. м- 1989.
Гусев Н. А, Состояние воды в растении. М., 1974, С. 3—10.
Гэлббн А„ Девцс П„ Сэтгер Р, Жизнь зеленого растения. М.. 1983. с 107—110.
169—204. 325—327, 413—416.
Лархер В. экология растений, М, 1977. С. 209—26 219—227, 229—24'.
Либберт Э. Физиология растений, М. 1976. С, 271—280, 285—292, 534— 537.
Падевой В. В. физиология растений. М „ 1989. С. 177—215, 405—108, 419—424.
Раздел Vll
ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНОСТЬ ОТВЕТНЫХ
РЕАКЦИИ РАСТИТЕЛЬНОГО ОРГАНИЗМА
Объект исследования: проростки двух соэтов яровой пшекацы. разли•
язюцикся по згеуоустойчпзост•з (например. Саратовская 52 н Альбидум 43).
выращенные при парькроаании усјкмнй
ЗАДАЧА 1, влияниг ВОДНОГО ДЕФИЦИТА НА взАимодгяствие нгкоторых
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ
Функция
у
сортов
ПШЕНИЦЫ РАЗНЫХ
устоячивостњ К ЗАСУХЕ
ментбелковнх комплексов, ингибирование фотохимической
актнВностн н фотофосфориллрозания хлоропластов. изменена?
активности ключевого фермента фотосинтеза — рнбу лозобнс•
фосфаткарбоксилазы, При водном дефиците нарушается дыхаине
и его энергетическая эффективность, наблюдается изменс• ние
активности ряда окислительных ферментов, замедляются
ростовые процессы, меняется гормональный статус растений.
значительно увеличивается содержание абсщизолой кислоты.
Одной из первых реакций растения на стрессовые воздействия, в
том Числе и на водный дефицит. является увеличение проничаеЦОСТИ мембран.
Изучение ф «зиолого-биохимических основ формирования
устойчивости растений — одна из важнейших задач физиологии
растений, н одним из подходов к ее решению являются
сравнительные исследозалня генотипов растений, различающихся
по реакции на экстремальные воздействия.
Цель задачи. Исследовать комплекс физиологических н
биоХимическнх реакций и их взаимодействий на проростках
пшеннцы различных по засухоустойчивости сортов в условиях
варьированая водоснабжения.
по
устойчивость растений к экстремальным воздействиям (засуха,
высокие н низкие температуры, засоленность др.) основана на
изменении
биохимических
гг
физиологических
про
растениям а да ПТиропаться к
неблагоприятным
воздействиям
окружающей
среды,
Адаптационная способность организмов неодинакова и зависит, с
одной егоРоны, от их генеглческнх особенностей. стадии
развития. физлологического состояния, а с другой — от условий
выращивания растений, длительности н характера действия
стрессового фактора.
Одним из неблагоприятных факторов, влияющих на
продуктивносгь растений, является засуха. Показано, что дефицит
воды приводит к изменению физиолого•биохимических реакций В
растении: скорости н награвленностн азотного обмена, синтеза
белков и липидов. состава н свойств мембран, интенсив• мости
фотосинтеза и дыхания, энергетики этих процессов и др.
Так, у неустойчивых растений при обезвоживании отмечают
нарушения в фотосинтетическом аппарате: повреждение ПнГ•
Подготовка растительного материала
Семена пшеницы после замачивания проращивают в кювеТе с
влажной фильтровальной бумагой. а затем высаживают в землю.
Растения в течение 4 сут выращивают при нормальных
условиях полива (60% от полной влагоемкости почвы). Затем
опытные растения прекращают поливать (содержание воды в почве
поддерживают около 400/0 от полной влагоемкпстн), а
контрольные растения оставляют при прежних условиях Полн. на.
Спустя З сут растения используют для исследования.
РАБОТА ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВОДНОГО ДЕФИЦИТА В ЛИСТЬЯХ рдстннип
Цель работы. Исследовать влияние засухи на содержание воды
в листьях пшеницы двух сортов. различающихся по
засухоустойчнностн. Определить влияние почвенной засухи на
биопродуктивность различающихся по засухоустойчивости сортов
Пшеницы,
Реактивы Н оборудование: эмалированные кюветы; бумажные пакети•
весы
аналитические; сушильные шкафы На 85 и С.
Объект Плелования: листья ароростхон ишеиицщ '.зличающнхси по
засухоустойчивости сортов, выращенных в различных условиях полива.
Ход работы. Для определения водного дефицита берут 10
растен“ из каждого варианта, отделяют листья п взвешивают их в
бумажных
пакетиках
(массу
пакетика
определяют
предвариТельно) на аналитических Весах. Определяют сырую
массу листьев
Затем листья погружают в воду не менее чем на 12 ч, после
Чего их тщательно обсушивают фильтровальной бумагой и вновь
взвешивают в пакетиках. Определяют lV'
Листья в пакетиках помешают в сушильный шкаф с темпе.
ратуроЙ 10.53 С на 15—20 мин, а затем в сушильный шкаф с
Температурой 85' С 71 ловодяг до постоянной массы, Затеи
Листья вместе с пакетиком н отдельно лакетнкн вновь взвеши• Ваюг
и определяют сухую массу листьев W,.
Расчет водного дефицита (Р) в листьях производят по
следующей формуле:
100%.
На основании полученных данных делают вывод об изменении
содержания волы в листьях исследуемых растений.
Сравнение сухой массы листьев исследуемых растений
позволяет судить о влияннн засухи на биопродуктивность
различающнхся по засухоустойчивости сортов пшеницы.
Оформление работы. См. разд. 1, задача 1. Статистическую
обработку данных проведите с использованием ЭВМ (см.
Приложение П).
РАБОТА 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕЯ интенсивности
ФОТОСИНТГ3А И
Щ;ЛЫХ ПРОРОСТКАХ
ПШЕНИЦЫ полярогр№гичгским методом
Цель работы. Исследовать влияние почвенной засухи на общую
интенсивность фотосинтеза и дыхания проростков пшени• цы
различающихся По засухоустойчивости сортов,
Реактивы. оборудование в ход работы см. в разд. Ш, задача 1.
Оформление работы. См. •разд. задача 1, Статистическую
обработку данных проведите с использованием ЭВМ (см,
Приложение П).
РАБОТА з. ХАРАКТЕРИСТИКА пигмГнтного АППАРАТА ЛИСТЬЕВ
ПШгНИЦЫ
Цель работы. Определить содержание хлорофиллов а н Ь и их
соотношение в листьях пшеницы, выращенной в различных
условиях водоснабжения.
Реактивы. оборудованяе н ход работн см. в разд. Ш, задача 2,
Оформление работы. См. разд. 1, задача 1. Расчет Всех
показателей произведите на 1 г сухой Массы листьев.
Статистическую обработку данных проведите с Использованием
ЭВМ (см. Приложение 11).
РАБОТА 4. ОПРЕЛЕЛЕНИЕ ФОТОХИМИЧЕСКОП АКТИВНОСТИ
хлороплж:тов ПШЕНИЦЫ
Цель работы. Исследовать влияние водного дефицита на
фоТохнмическую
активность
хлоропластов
пшеницы
различающн*• ся По засухоустойчивости сортов.
реактивы, офрудованяе и ход работы см. разд. Ш, задача З.
Оформление работы. См. разд. 1, задача 1 . Статистическую
обработку данных проведите с использованием ЭВМ (см.
Приложение П).
РАБОТА 5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОСФОРИ.лирующЕй АКТИВНОСТИ
ХЛОРОПЛАСТОВ ПШЕНИЦЫ
Цель
работы.
Исследовать
активность
циклического
фотофосфорилировання хлоропластов пшеницы различающихся по
засухоустойчивости сортов в зависимости от водного дефицита в
раСтенин.
Реактивы, оборудование и ход работы см, в разд. Ш, задача 4.
Оформление работы. См. разд. Г, задача Статистическую
обработку данных проведите с использованием ЭВМ (см.
Приложенне П).
РАБОТА В. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Активности по.ЛИФГНОЛОксиДА3Ы в
листьях гингницы
Цель работы. Определить влияние водного дефипита на
акТИВность
полифенолокеидазы
в
листьях
пшеницы
различающихся по засухоустойчивости сортов.
реактивы. оборудование И ход работы ем. в разд. lV. задача 2.
Оформление работы. См. разд. 1, задача . Расчет активности
фермента произведите на г сухой массы листьев. Статистическую
обработку данных проведите с использованием ЭВМ (см.
Приложение И).
РАБОТА 7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Активности пкроксиддзы В ЛИСТЬЯХ
ПШЕНИЦЫ
Цель работы. Исследовать влияние почвенной засухи на
акТнвность пероксндазы в листьях пшеницы сортов, различающихсв
по засухоустойчивости.
Реактивы. оборудование н ход работы см. в разд. 1V. задача 2.
Оформление работы. См. разд, Т, задача 1. Расчет активности
фермента ПроаздедИте на 1 г сухой массы листьев. Стати.
стическую обработку Данных проведите с Использованием ЭВМ
(см. Приложение П).
РАБОТА ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ МАЛОНОВОГО
ЛИА.ЛЬДЕГИДА В ЛИСТЬЯХ пшг;ницы
Цель работы. Определить влияние водного дефицита на
перекисное окисление липидов Ло содержанию малонового
диальдегила в листьях ллленицЫ сортов, различных ло
засухоустойчивости.
оборудование н ход работы см, в разд. Щ задача З.
Оформление работы. См. разд. [, задача 1. Расчет произведите
на I г сухой массы листьев, Статистическую обработку данных
проведите с использованием ЭВМ (см. Приложение 11)
РАБОТА 9,
СОДЕРЖАНИЯ САХАРОВ
В ЛИСТЬЯХ ПШЕПИЦЫ
Цель работы. Определить содержание сахаров в листьях
пшеницы сортов, разных по засухоустойчивости н зависимости от
водного дефицита.
Реактивы, оборудование и ход работы см. в разд. V11, задача 2.
Оформление работы. См. разд. 1, задача 1. Pac['VI• всех
показателей произведите на 1 г сухой массы листьев.
Статистическую обработку данных прозелите с использованием
ЭВМ (см. Приложение 11),
РАБОТА
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
АКТИВНОСТИ
нитРАТРЕДУКТАзы В ЛИСТЬЯХ ПШГНИИЫ
Цель работы. Исследовать влияние водного дефицита на
актизносгь нитрзтредуктазы в листьях пшеницы сортов,
различающихся по засухоустойчизости.
Реактивы, оборудование и ход работы см. в разд. V, задача З,
Оформление работы. См. разд. 1, задача Расчет активности
фермента произведите на г сухой массы листьев, Статистаческую
обработку данных проведите с использованием ЭВМ (см.
Приложение П),
РАБОТА ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЫХОД ЭЛЕКТРОЛИТОВ ИЗ
ЛИСТЬЕВ ПШЕНИЦЫ
Цель работы. Определить влияние почвенной засухи на
проницаемость мембран листьев лшеницы двух сортов,
различающихся по засухоустойчивости.
Реактивы, оборудование и ход работы см. в разд. 1, задача 1,
опыт 1. Оформление работы. См. разд. 1, задача Статистическую
обработку данных проведите с использованием ЭВМ (см.
Приложение 11).
ЗАДАЧА 2. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ МЕТАБОЛИЗМА
ЭМБРИОГЕнных И НЕЭМБРИ0гЕННЫХ клеточных культур
моркови
Клеточная культура моркови — объект многочислектых
исследований, касающихся регуляции соматического эмбриогенеза,
Это связано с тем, что клетки моркови хорошо растут пря
контролируемых условиях и достаточно легко образуют больтое
количество эмбриоилоа. Среди факторов, контролирующих
соматический эмбриогенез моркови, важнейшая роль принадлежат
гормонам, На фракции одиночных клеток четко показа по (А. Кота
пйпе, et 31., 1986) наличие в развитии змбрло• иде-.в двух стадий,
различающихся ло чувствительности к ауксину. Вначале для
индукции клеточного деления необхолнмо присутствие 2, 4дихлорфсноксиуксусиой кислоты (2, ЛД) в среде, затем дальнейшее
разлитие эмбриолдов требовало удаление ауксина из среды. В
культуре клеток моркови 2, •1Д инициировал развитие
лрозмбриогенных клеточных масс л даже глобулярную стадию
эмбриоида, но дальнейшее развитие он ингибировал.
Известно, что под влиянием ауксина в клетках растений
происходят
биохимические,
биофизические
структурные
изМенения. Ауксины действуют на лроцессы гракскрнлции,
транс.ляции, влияют на физиологические функции клеточной
чембрат. Однако механизм ингибирующего действии ауксина на
образование эмбрипилол окончательно не установлен,
Действие цитокинина на соматический эмбриогенез еще менее
лзулено. Некоторые цлтоклнлне-. (бензиладенин, кинетин)
эмбриогенез, зеатин стимулирует его з узкой области
концентраций,
Изучение метаболических процессов, сопровождающих ранние
стадии змбркосенеза моркови, показало, что при индукции
эмбриогенеза увеличиваются скоростн синтеза ДНК, РНК и белков,
В течение перехода от преглобулярной к глобулярной стадии
изблюдтот изменение в составе негистонопых белков. Особый
интерес представляют биохимические маркеры эмбриогенсза у
моркови, К маркерным свойствам птносиг синтез двух
полипептидов (Е 1 и а также инактивацто циклогексимида и ааманитина, наблюдаемую только при развитии змбрноидов,
Растительные клетки, способные образовывать органы или
целые эмбриоды, при продолжительном культивировании обычло
теряют эго свойство, Уменьшение эмбриогеппого лотенинала
может быть вызвано н мутациями, Штаммы культур клеток,
Которые потеряли эмбрлогенныи потенциал, исследуют в срав•
нении с эмбриогепными штаммами, Таким образом выявляют
особенности метнболазмн последних и анализируют биохимиЧеские процессы, тесно связанные с ранним развитием эмбриоидов.
После индукции соматического эмбриогенеза в клетках
эмбраогенного штамма моркови наблюдают изменение активностл
ряда фермен10в н количества некоторых метаболитов (1. Carlherg,
1987). Так, активность лерокслдазы значительно возрастает и
появляются новые изоформы, активность, протеаз уменьшается по
сравнению с но,мбрлогеиаым штаммом. С эмбрногенным
потенциалом коррелирует также фенолоксидазная
активность.
При образовании эмбриондов моркови увеличивается уро.
полил мн нов и активируется аргининдс•кзрбоксплаза. В
неэмброгенной культуре. растущей На среде без ауксн[юв,
метаболизм полиаминов не изменяется. Углеводный метабо. Лизу
в клетках, индуцированных к эмбриогенезу, мало изучен.
Известно, что органогенез в каллусной ткани ряда растений
сопровождается накоплением крахмала на ранних этапах
дифФеренцирозки. В эмбриогенных клетках моркови также содерЖится большее количество крахмала, чем в неэмбрногенаых.
Изучение 'метаболизма клеток на ранних этапах эмбриогенеза
важно для понимания механизмов, контролирующих этот процесс.
РАБОТА ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОНИЦАЕМОСТИ
КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК МОРКОВИ
Цель работы. Определить проницаемость мембран ло выходу
электролитов из клеток суспензионной культуры моркови при
индукции соматического эмбриогенеза.
Объект исследования: эмбриогенная неэмбриогемная сус*изи• анной
культуры клеток морковн Раиси-; carota сорт Нантская. выращемиоП на средах
МС, содегжашнх и не содержащих гормонов.
реактивы и оборудование:
раствор сахарозы; с;жда МС, содержаШая
мг!л 2, АД и
мги кннетина; среда МС, не содержащая гормоны;
оборудование То Же, что в работе 1 (разд. 1, задача
Ход работы. 14.суточную суспењзпонную культуру клеток
моркови фильтруют в стерильных условиях Через сито с диа•
метром пор 120 мкм. Фильтрат оставляют на 30 Мин для осаж•
ДенЛЯ клеток, затем удаляют надосадочную жидкость с по•
Мощью стерильной пипетки н шприца. В оставшемся осадке с
небольшим количеством среды определяют Число клеток а Мелких
агрегатов в мл.
Для определения плотностн культура должна состоять из
одиночных клеток или маленьких групп клеток. Чтобы раздс• лить
клеточные агрегаты, суспензию обрабатывают различныМи
•м:јцерирующнми веществами. Например. суспензию клеток
смешивают с раствором Н2Сг,О, в отношении 1 : 1. Смесь
ломещают в термостат при 60' С на ч.
Мацерацию можно также проводшть с помощью смеси
ферментов: раствор целлюлазы, Онозука R 10. % -й раствор
мацерознма R 10. раствор дризелазЫ в 0,7 М манните, содержащем
раствор CiC12. Перед подсчетом кле• ток суспензию энер:мчно
встряхивают.
Клетки подсчитывают в гемошпометре с сеткоП Фукс—
РоЗенталя. Подсчет ведуг н четырех больших квадратах ло дна160
гонали счетной камеры. Проводят подсчет в 3—4 пробах. Число
клеток (А) в 1 мл суспензии определяют по формуле
где п — число клеток в 4 больших квадратах, объем камеры (З, 2
мм!).
После определения плотности культуры суспензию рассевают
на две среды (содержащую 2, АД гл кинетин Не содержащую
гормоны) из расчета
клеток на 1 мл среды. Суспензию
клеток помещают на качалку (120 кз ча
при температуре 260 С,
освещенности 700 лк. Через 4 дня суспензионную культуру клеток
каждого варианта филь. трут через капрон с диаметром отверстий
30 мкм, осадок 3 раза промывают раствором сахарозы, обсушивают
фильтровальной бумагой.
Взвешивают на торсионных весах б навесок по 30 мг массы
клеток каждого варианта, помещают навески в бюксы, приливают
по 10 мл раствора сахарозы. З бюкса ставят в термостат при 25' С на
1 ч, З бюкса— в кипящую водяную бано на 15 мин. После
инкубацњи жидкость из бюксов сразу фильтруют через капрон
(поры— 30 мкм) в чистые бюксы, осту. жива.от их до комнатной
температуры
и
определяют
электропроводность
кондуктометрическим методом,
Оформление работы. Рассчлтаће количество электролятов,
Вышедших из клеток каждого варианта, в процентах от полного Их
выхода (при кипячении). Сравните полученные данные. Сделайте
выводЫ.
РАБОТА 2. опредглг.ниг Активности
АМИЛАЗ в культург: клгток
моркови
Цель
работы.
Определить
влияние
состава
среды
культивирования (с гормонами и без них) на активность амилаз в
клетКах эмбриогенной и неэмбрлогенной линий моркови.
Объект исследовании: см. работу
Реактивы и оборудование: 0,005 М фосфатный буфер, РН 7.4;
свежеПриготовленный 1 раствор крахмали R 0,005 М фосфатноу бђфере; 3,5дыни
трос.ллщилонля Ю•слота (лрнтотонленне СУ. в Приложении ступки с Пестиками;
центрифркные пробирка; стеклянные пробирки; мерные пробирки объемом 10 мл;
цилиндры объемом 50 мл: пипетки; термостат с темПсратурой 37' С; водяная баня
с температурой С; технические
центрифуп; центрлфужные весы; фЭК,
Ход работы. См. опыт 5 (разд. П, задача 1, работа 1).
Оформление работы. Рассчитайте активность амилаз в
милЛиграммах мальтозы на 1 г сырой массы клеток за мин.
СравНите активность в различных вариантах. Сделайте выводы.
РАБОТА З. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ
ПОЛИФгнолоксид.А3Ы в клллусг. и сус№нзионноп
КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК моркови
ПолифенолоксиДаза (ПФО) — фермент, осуществляющий
окисление о.дифено.лов и о•гидрокснлирование монофењо,тоз (см,
задачу 2, разд. lV, работа З). Соединения фенольной при.
роды широко представлены в растительных тканях. Это иростые
фенолы
(например,
гидрохинон),
фенольные
кислоты
(пирокатеховзя кислота, р.гидроксибензойная кислота. галловая
кислота ее полимеризованная форма — таннлн и др.),
гадроксикоричные кислоты (р-хумаровая, кофейная кислоты и др.),
флавоноиды (антоцианы, флавоны, флзвонолы), лигнины и дрЬиохимичесхая и физиологическая роль фенолов в настоящее
время окончательно пе выяснена. Фенолы иногда рассмат. ринзют
как регуляторы роста и развития растений. ln vitro показано их
действие из гормоны и их синтез, in vivo возможно участис
фенолов в образовании этилена из метионина (эфир— р•кумаровой
кислоты — необходимый кофактор для этого
цесса). Выявлено
изменение в фенольном обмене в онтогенезе растений, при
повреждениях. На культуре клеток отмечены корреляции между
синтезом алтоиианов и эмбриогенностью культуры клепд
изменение состояния и активности ПФО в связи с
эмбриогенностью клеток. активаиии ПФО При образова ини
корней. Появление активности полафенолокслдазы может быть
индуцировано цАМФ.
Цель работы. Определить активность ПФО в культуре клеток и
тканей, выраденных в различных условиях.
реактивы и оборудование: см. разд. плача 2, работа З. Кроме того,
необходимы 1:15 М фосфатный буфер. РН 70; 0.04%-й раствор
диметилфФенилепдгаыина в ваде (свежеприготовленный): 120 мм рас7ЕOГ
СаС[и;
раствор с;харааы; колбы объемом 25 250—00 мл— „2 шт.; Ь-мыпие
стеклянные воронкл— 2 шт.; капроновая ткань с йчећами 60Х90 мкм.
Объекты исс.ледования: каллусы морК09Н, выращеные в различных
условнях; суспенмя клеток могковм. выращемная на культуральных средах
различного труональаого состава; различные ло змбриогенности лима сус•
пензноннс)й культури клеток моркови.
Ход работы. Работа состоит из двух этапов. 1. Подготовка
растительноео латериала (см. задачу 2, работу 1 данного раздела).
2. Определение активности ПФО. Навеску растительного
материала (250—500 мг) растирают в ступке с небольшим
количеством (10—15 мл) фосфатного буфера_ Растертую массу
переносят количественно в мерную колбу на 25 мл, доводят пробу
буфером точно до метки, хорошо перемешивают и оставляют на 10— 15 мин.
Затем раствор фильтруют через двойной бумажный фильтр или
центрифугируют 10 мин при 4000 об!мил. Фильтрат (ила
надосадочную жидкость) используют для определения активногти
фермента,
Активность фермента исследуют на ФЭКе нм), Об активности
фермента судят Ло времени развития окраски до определенной
оптической (значение оптической ллп•гмости— D выбирают в
зависимости от скорости образования окраски в пределах от
Для анализа каждой биологической пробы используют три
одинаковые кюветы для ФЭКа: одну — контрольную две опытные
(две аналитические повторности из одной биологическоЙ пробы). Во
все три кюветы вносят: 4 мл вытяжки, I мл СаС1:, [
мл
Затем в контрольную кюзету лрилизают 2 мл воды и
устанавллвзют ее з контрольную (дальнюю) кюветную подставку
ФЭКа. Вводит ее в световой луч. ФЭКе устанавливают необходимую
длину залпы, Закрывают кюветную камеру н ручками грубой тонкой
регулировки устанавливают нуль на шкале оптической плотности ло
контрольному образцу,
Одну из опытных кювет ставят в держатель вводят ее в световой
луч. Автоматической пипеткой вносят в опытную кюветч: 2 мл
раствора лирокатемп:а и одновременно включают секундомер.
Пробу хорошо перемешивают стеклянной палочкой. Затем
закрываог кюветную камеру л следяг за развитием окраски ло шкале
оптической плотносгл, Замечают по секундомеру время достижения
необходимой оптической плотностя. Аналогичные измерения
производят н для второй опытной кюветы. Расчет активности ведут
по формуле, приведенной ранее (см, разд. lV, задача 2, работа 3;
7=2).
Оформление работы. См. разд. 1, задача Результаты запишите в
виде таблицы, Сделайте выводы об активности полифенолоксидазы
у исследуемых культур клеток моркови.
РАБОТА 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Активности ПЕРОКСИДАЗЫ
В КАЛЛУСЕ И
культУРЕ К.ЛЕТ(Ж МОРКОВИ
Пероксис)азь! — ферменты, окисляющие субстрат при помощи
перокснда
водорода,
играют,
по.
видимому,
важную
физиологическую роль н растениях (см. разд. [V, задача 2). Па
культуре клеток и тканей локазано изменение изоферментного
состава активности пероксидазы н птвег на изменение
гормонального состава среде выращивания. Полагают, что
пероксидаза, окисляя индолилуксусную кислоту ЩУК оксидаза),
играет важлую рол, в регуляции гормонального статуса клеток и
влияет на рост и раззнтие клеток н тканей,
Цель работы. Определить активность пероксидазы в культу.
ре клеток моркови в зазнслмостн от их физиологического состояния.
163
Реактмвы и оборудование: см. разд. задача 2, *-т-а 2 Кроме то. го,
необходимы: З%.й раствор сахарозы; 0.2 М Кб в М Зиетатиом буфере, РН 4,3;
рзст•зр НО: расттр гваяхоаа: 83 мм раствор СЕСЛ мерные колбы объемом 25 ма —
2 т.; колб“ обимом — 250—500 мл — 2 шт.; воронки —2 шт.; капроновая Ткань г
ячейками мкм,
Объект исследования: клети каллуса МОКом л•явй:
ки каллуса,
выращенного в р•злтных услов•х; •мбрвогеннзя в веэмбрио• Генная культурн каток
моркови.
Ход работы. Работа состоит из двух этапов. 1. ТЮгоговка
растительного материала.
Культуру клеток моркови готовят к опыту. как описано ранее
(см. разд. 1V. зад.тчу 2, работу 2). Каллус используют для анализа
без предварительной особой подготовки.
2. ПровеПение опыта. Навеску растительного материала
100—200 мг) растирают в ступке с небольшим количеством 10—15
мл) раствора КС! в ацетатном буфере. Растертую массу переносят
количественно в мерную колбу объемом 25 мл. доводят пробу
буфером точно до метки, хорошо перемешивают оставляют на 10—
15 мин. Затем раствор фильтруот через двойной бумажный фильтр
или центрифугируют 10 мин при 1000 g. Фильтрат (или
надосадочную жидкхгь) используют для определения активности
фермента.
Активность фермента исследуют на ТЭКе (1—440 нм). Об
активности фермента судят по времени развития окраски до
определенной оптической плотности (значение оттачЕкой плотностп
— D выбирают в зависимости от скорсти образования окраски в
пределах от 0,025 до 0,4),
Для анализа каждой биологической пробы используют три
одпнаковые кюветы для ФЭКа: одну— контрольную, две— опытные
(две аналитические повторности из одной биологическоЙ пробы).
Во все три кюветы вносят: 4 Мл вытяжки, 1 мл СаС1„ 2 мл
гваякола.
Затем в контрольную кювету приливают 2 мл воды н
устанавлнвают ее в контрольную (дальнюю) кюветную подставку
ФЭКа. Вводит ее в световой луч.
Закрывают кюветную камеру и ручками груЬй и тонкой
регулировкк устанавливают нуль на шкале оптической плотности по
контрольному образцу.
Одну из опытных кювет ставят в держатель и вводят ее в
световой луч. Автоматической пипеткой вносят в опытную
вел 2
мл 11202 н 0(Јчовременно включают секун№мер.
•пробу хорошо перемешивают стеклянной палочкой. Затем
закрывают кюветную камеру и следят за развитием окраски по
шкале оптической плотности. Замечают до секундомеру времн
достижения необходимой оптической плотности. Аналогично
производят измерения для второй опытной кюветы.
Расчет активности ведут по формуле, приведенной ранее (см.
разд. у, задачу 2. работу 2; 7=2).
Оформление работы. См. разд. 1, задача 1.
РАБОТА 5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАСТВОРИмых САПРов и
КРАХММА В КУЛЬТУРЕ клеток моркови днтроновым
МЕТОДОМ
Метаболизм углевоДов составляет одну Из важнейших сторон в
жизнедеятельности клетки. углеводы являются основным субстратом
дыхания растительных клеток и служат поэтому важнейшим
фактором регуляции метаболических и энергети• ческах процессов,
сопряженных с дыханием. Изменение относи. Тельно;О содержания
растворимых сахаров в тканях исполозую: в качестве показателя
метаболической активности ткачи. Значение сахаров ле
исчерпывается только участием их в энерГетических процессах
клетки, Возможно, они выполняют Также важную роль з регуляции
роста и развития растений. По. казано, что соотношение
растворимых (сахара) и нерастворимых (крахмал) форм углеводов
изменяется в связи с ростом. развитием и дифференцировкой клеток.
Отмечается связь Между содержанием сахаров и репродуктивным
морфогенезом в растениях.
Для определения растворимых сахаров и крахмала в
растительных тканях используют ангронов','й метоД,
Ангроновый реактив образует синевато-зеленое окрашивание со
всеми растворимыми углеводами, которые в одинаковой
концентрации дают окрашенные растворы практически одной и той
же оптической плотности, Это позволяет при определении
различных углеводов использовать калибровочную кривую,
составленную по глюкозе.
Метод дает
определять крахмал и сахара в
небольших концентрациях (до 0,2 мг в пробе) п пригоден для
анализа вегетативных органов.
Цель работы. Изумить углеводный баланс в клетках каллус. ной
ткани моркови л суспензионной культуры в связи с диффе
рениирозкой, соматическим эмбриогенезом, органогенезом.
Реактивы и оборудование: саежелритотовлгнннй антроновкй реактив (см.
Приложение 1); раствор H'SO„ (2,8 мл серной кислоты— дель• ядтность 84 —
растворяют п Л дистиллированной поды):
желтой кровяной
—
25 мл— 2 шт.: колбы объемом
ул— 2 шт.: плетки объемом
2. 5. мл: стекленные воронки—4 шт.; бюксы, доведенные до постоянной капроновая
ткань с ячейкой 60Х90 мкм; водяная бзия на 100 0 сушильные шкафы на и 80' С; фЭК,
Объект исследоаааия; каллус Моркови; суспензионная культура клеток
уоркоа“_ В используют культуры, выращенные при разлечных ус. осы!щеная.
питания, снабженан фитогоомонами н др.
Ход работы. Работа состоит из Нескольклх этапов. Подготонка
растительного материала к опыту. При работе с суспензионной
культурой предварит ельно производят фильтрацию
клеток через капроновую ткань, а затем промывают осадою на
фильтре трл раза (250—500 мл) дисл иллиропанной водой. После
полного удаления водн капроновый фильтр вместе с клетками
помешают на влажную фильтровальную оумагу.
Из подготовленного для анализа растл гелг,ИОГО материала
берут три навески: одну для определения сухой массы н две — ло
200—500 мг для антронового анализа,
При работе с каллусной тканью материал непосредственно
используют дла определения сахаров сухой массы.
Навеску, взятую для определения сухой массы. ломещаюг п
бюксе в сушильный шкаф при температуре 110“ С на 15— 20 мин, з
затем в сушильный шкаф на 80' С доводят до лостоянкой массы,
2. ОпреОеление сахаров а растительных тканях. Дае навес. кн
(по 200—500 мг) помещают в две мерные колбы емкостью 25 мл.
В одну колбу для суммарного опреОеления сахаров и крахмалов
добавляют 12,5 мл НАС). гидролизу:от на кипящей водяной бане в
течение 15 мин (при 'гом происходит гидро крахмала), Затем
добавляют по 0,5 мл сернокислого Инн. ка и желтой кровяной соли
для осветления раствора, доводят объем дистилл ировзнноП водой
до метки и фильтруют через бумажный фильтр.
В другой колбе с навеской, предназначенной для определе—
ная растворимых сахаров, проводят извлечение сахаров в течение ч
с 20 мл воды при периодическом взбалтывании. После этого
экстракт осветляют, прибавляя по 0,25 мл растворов сернокнслого
иинка и желтой кровяной соли. Объем доводят до метки и
фильтруют.
Берут по две пробирки для каждого экстракта н одну дм
контроля. Наливают ло З мл антронового реактива н по 1 м.т
Соответствующей вытяжки.
Контролем служат пробирки г З мл антронового реактива, в
которые прибавляют по 1 мл воды. Все пробирки быстро
взбалтывают п помещают в кипящую водяную баню на 7 мин.
После кипячения пробирки с растворами охлаждают до 200 С и
затем определяют плотность синевато-зеленой окраски на ФЭКе,
применяя красный светофильтр нм) претит контрольной пробы. По
калибровочной кривой рассчитывают содержание сахаров.
З. Построение Калибровочной кривой. Дли построения
калибровочной кривой готовят исходный раствор глюкозы — 20 мг
на 100 мл воды. Варьируя объем исходного раствора. вносимый в
пробу, строят калибровочную кривую п интервале концентрапнй от
О до мг в пробе, Конечный объем пробы поводят до 1 мл
дистилллрованно'! водой. К пробам добавляют по З мл антронового
реактива. взбалтывают помещают про. бы в кипящую баню на 7
мин.
После охлаждения проб до
С определяют плотность окраски на
фЭКе, применяя красный светофильтр (—610 нм) против пробы, не
содержащей глюкозы. На осноззннн полу ценных данных строят
калибровочную кривую на миллиметровой бумаге.
4. Расчет содержания растворимых сахаров и крахмала.
Вычисления производят по формуле
—100%,
Где а— количество сахаров, найденное ло калибровочной криВой,
мг{м.л;
объем экстракта, мл; Р— навеска,
По результатам измерения экстракта а первой колбе уз. мают
суммарное содержанке сахаров крахмала, а по результатам
измерений экстракта из второй колбы определяют содержание
свободных сахаров. Дли вычисления количества крахмала разность
между суммарным содержанием сахаров после гидролиза до
гидролиза умножают из 0,9.
Оформление работы. См. разд. 1. задача 1. Результаты
поместате в таблицу, Сделайте выводы об изменениях содержания
свободных сахаров и крахмала у исследуемых вариантов кулю
туры клеток моркови.
приложенИЕ 1, приготовление РЕАКтивов
Антроао•ы• реактив
200 мг антрона растворяют ы 100 мл концентрированной серной кислоты
(удмьвгя плотность 1,84).
Гваякол (0,4 (КЛ распор)
Если гваякол находится в твердом Ваде. его предварительно расплавЛают нг
теплоп бане, После охлаждения набирают нсполыпвать затомат«чесжую липетку
али стеклянную пипетку
грушей! и по каплям вмогп его в стакан. на
мзды. весах. РзетворВзя• тую навеску (0,4 г» волбу расторяют объемом в 50 100
мл чл. дистиллированной ополаскивают стакан несколько перемонт газ золой г
для мерную кгкличегтвенного переноса реактива в мерную колбу. Реактив хранят
в темной склянке.
2,4-дикитро-фенол (10—1 М раствор)
«молекулярная
масса
184,12'
в
количестве 18,4 мг раствориют в 20 мл дистиллироазнло• щелочь воды, Затем
добавляя раствор для осторожно доводят годо каплям концентрированную
РН 7В концентрированно) НС!
Пероксид водорода
раствор)
3016-го раствора пероксида водорода разбавляют истяллнроввнрой
водой до 130 мд. Для проверки в растворе содержалия НО, пробы этого раствора
титруют 0,05 а_ раствором до появления устойчивой розово“ окрасхи (на 5 мл
раствора Н,О, должно расходоваться б
КМ“О.-, титрование лговплят в прусутстни” 5 мл 4 раствора H,SOO.
культатов тигронания К приготовленному раствору НО
лобав.тяот воду, либо перокснд водорода. доводя его до нуж• ной
Концентрашиа„ Приготовленный раствор хранят в темной склянке не более 2—3
сут.
3,5-дтмтросадициловая кислота ( 1
ложенный воронку Бохнера, а злтем через стеклянный фильтр № З. По. лр•аот
прозрачный зеленоваты“ раствор силох.•юрата натрия. Определяют путем
титгпванин его тиосульфатом натрия. Раствор не долЖен содержать кальция, что
провернется реакцией с щавелевокислым
мом «ем,
раствор)
кислоты раствориют в ел дистиллированной
воды, затем приливают 20 чл 2 н, раствора N20H н доводят обым
днсмлдированной водой до 50 Мл, Через 12 ” к раствг,ру трабавляют 30 г
сегнетовой соля (КХаС.Н.О.Х1Н,О'. Объем аоаодт водой до мл;
держимое
фальтруют через стекляннагй фильтр. Данный раствор тоглтца— ег СОТ,
Поэтому его хранят в закрытой темной склянке,
Гипохлорит кальция
100 г хлорной извести ртетеоряют п 170 мл воды арн сальном
перемещипании в те•кние мам (тр•• лом часть вещества остается нерастворен.
ной). Приливают раствор (70 в 170 мл аодыј и тщательно перемешавают_
Сначала смесь застывает. потом превращается в
Жидкость Ее фильтруют арн отсасывании Через двойной слой појютня, по168
раствор)
5 Г хлорной извести растворяют в 80—90 мг дистсллнропянной водн из
Мешалке в течение За мин. затем раствор фњ.льтрун»: через складчатый фильтр,
доводят объем до 100 мл водой, приливают 5 капель Твина-8П и размешивают до
полного растворения. распор гипохлорита Кальиия готоонт в использования.
(смачии.ющий мот) добавляют для То. чтобы облешть доступ стерилизующего
раствора в сухие полости НМ щели, поскольку многяе семена И Имеют неровную
поверхность И могул задерживать микроорганизмы.
Раствор РК]
2.5 1, растворяют 50 мл [3,0. затем к этому раствору добавляют 5 г R
тщательно перемеш№вают. Для опыта вспользуют раствор сливая 1 мл исходного
раствора и 9 мд НЮ.
Порядок приготовлении культур•дьных сред
Приготовить хранящиеся растворы макроэлементов, микроэлементов,
витаминов и регуляторов роста растений (гм, ниже Среда МС).
2. Пимесгить литровый сосуд на магнитную мешалку, налить в него окто 700
ил дистиллированной воды, добавить определенный объем каждого хранятегося
раствора при п•хтоянном перемешивании.
З. Доб•влть мионнознт а сахарозу, рястаорить их полностью. добавять еще
воды, если необходимо.
4, Довести объем до 950 мл дистиллированной водой.
5. Довести РН
с помощью 05 М раствора МОН.
В. Довести
до л, перемешать жидкость
Среда Мурасиге и Скуга — МС (Т. Murashig4 Е Skoog)
Глат-•ые неорганические
па Тате .иные вещества
NH,NO, поз
Mgso..7H,o
КН,РО,
Раствор ацетокармина
9 мл ледяной укусной кислоты. 11 мл дистиллированной воды. ОД
•иетокармана на волной бане С обратным Хоаодильникои в те— Ченае З ч.
После охлаждения фильтруют.
38
33
3.00.
1.50,
1,25• 10—3
Микроэл еЯентх
фенолят натрия С. Н, О К а
5 г Перегнанного фенола и
г МОН растворяют в '(Ю мл воды.
0,05— нитропруссид натрия —
1720
5
•2НгО
Сначала приготовляют раствор, его хранят а холодильное. ио не &ЈЛее двух
Неделк Из 1 раствора непосредственно перед употреблением приготовляют он
быстро разлагается. особенно на прямом свету.
Гипохлорит натрия NaOO (4
znS04.7 ню
1,00,
FeSO..7H20 эдтл.2Н,о
7 460
—20
по хлору)
5
Мноинозят
1000
Накотановая
Кислот.
Пиридоксин •НС[
тиамин.нсј Г
ЛИЦИН
Ми он нозит
кислота
Дрожжевой Истр акт
Сахароза
20
30
30
20000
Источник углероаа Сахароза
30 г,'л
5,9
3.5
Сложные добавки (кокосовое молоко. регуляторы
роста) приведены.
170
7. Перенести ПО 75—100 мл среды в чистые конические колбы
Октавы широко используемых культуралы•ых сред
142
кко, хахо,
NH,XOJ
250 мл; .акрнть .твойанм слоем фольги, пелло¶Пн0М. кт[см ) . В процессе
укрепил, ПТОК№ВИРО.резинкой И 15 МИН ваиия РН сред мажет слегка
снижаться.
250
Приготовление комбинированной ( двухслойной)
культивировааия пыльников табака
среды для
В работе используется двухслойная среда: нижний слой — агарнзотн• ная
среда, а которую до(гвает актванвованаыг• уголь, верхний слой — жидкая среда.
Состав гребн мги
65
12
150
223
а 8.3
10
0. 7 5
нзво, zas0..7H,0
c,so,
С е рн а
Г: у тзмлн
025
0,25
0,025
0,025
0.25
0,023
AtCl,
МСЛ.ВН,О
наздтА
коо
5000
„н 5.6—5.8
а,03
FeCi,.6H20
FeSO .7H,o
Мтоинозит
27.86
3 7 ,2 6
1,
мл среды Ни“, коииентрироваяной вдвое:
необходимые для мл среды. развести в 100 мл (аднстнллнроааииой во дн_ Довести
до величины 5.5—58
2. Приготовить 75 Мл 1.45 •го раствора агара
билиетидлнроваиной
З. Соединить 75 Мл расплааленного с 75 мл концентрированной среды.
Добавить активированный уголь в виде лудГН до конечной конхе трааин 0.5%,
Разлить в пенициллиновые флаконы то 2,5 УХ Автоклаву.-
4, Оставшиеся 25 мл кониентрпроаанндй среды р•збзвнть бидистмллн•
рованаой водой вдвое, Стерилизовать автоклавн ованяем или фильтрацией Через
мембранные фйльтры «Миллипор• 0,22 мху
5. Перед началом добавить во флаконы е застывшей агаризо• ванной средой по
05 мл жидкой среды,
Такого количества среды хватает на 65 флаконов.
ПРИЛОЖЕНИЕ 11. порядок РАБОТЫ нА ПРИБОРАХ И
УСТАНОВКАХ
Фотоэлектроколориметр ФЭК-5В-М
Проверить з•земленпе. включить прибор а сеты
2, Включить трПлег
пвогреть прибор В течение 15 мин,
З. Установить необходимый свелофильтр_
4, Установить нуль нз 0507х барабанах прибора,
5. При закрытой шторке установить стрелку гальванометра «О» ручкой
«нуль»,
6. Поместить в левую кассету кювету с растворителем,
в правую (ДАОй• — две кюветы: з лете гнездо кювету с
раствором, в пра• с г астворнтелем.
7. Установить правой кассете рабочий ;ыствор по коду луча. открыть
Шторку и левым барабаном поставить стрелку гальванометра Иа уравняв
образом растворитель — Конјголь рабочий раствор— опыт.
8, Установить в правой кассете по ходу растворитель, используя ручку над
правым барабаном (положение «растаорихель — растворитель»). И правим
барабаном тос:авить стрелку гальванометра на
9. Считать величину оптической плотности раствора по красноа 1ТТКа.*
правого барабана,
10, Выключить тучбдер прибора, ОтКЛЮЧКТЬ прибор от сети.
влвнмузз до упора. для длины полны 620—850 НМ— выдвинута до упора!. 4, В
устройство для сиены кювет поместить эталонную («контрольную») пробу справа,
а «опытную.— слева.
З. Настроить Темновой Нуль, Для этого при закрытом Клапане светового
затвора (рутка светового затвора слева в лоложеию• переклкннТЬ усиление (ручка
Справа' п лоложстме цифровую Кнопку снизу
повернуть полностью вправо и цифровой Кнопкой наверху спра-
Колориметр фотоэтктрический концентрационный
Прове»игь Заземденне, включить прибор а сеть,
2. Включить прибор (тумблер установлен на затне• панели).
З. установить необходимый светофильтр путем переключения рукоятки Слева
в положение нужной длины волны.
4, В соответствии с выбранным светофильтром рукояткой справа ус“. довить
днапазон чувствительности в красной Или черной области (величину
чувствительности ппдбираюг при установке нуля по контрольной про&'_ 5,
Установить в кюветодержатель кювету с растворите№м («контроль» кювету с
исследуемым образцом «опыт.).
6. Ввести «КПНТгстЬ• а зод луза. закрыть крышку кюветной Камеры и
рукоятками «Грубо. «Тонко» установить по соответстаутцеП шкале аля
регистрации пропускания— шкала тля регистрации оптической азот. мости —
шкала О), при необходимости Изменить чувствительность а пределах
соответствующего диапазона чувствительности.
7. Рычагом перемещения кюветояержателя ввести и ход луща «опыт», свять
показания по соответствующей шкале.
После окончачня работы ПЫКдЮчВть прибор и откатить от сети.
Спеко»
1. Включить прибор в сеть, вКлТиТь тумблер прибора.
2. Устзнопнтъ на барабане нужную .тлнту• волны.
З. Установить соответствующий фотоэлемент при ПомошИ ручки.
расположенной За кюветной Камерой длины ПО.'ЈНН 340—63) Нм ручкя
устано•ить «(Ь По нижней шкале.
б. Ввести в камеру
«контрольную» кю*ту.
172
7.
Переключить
В, Цифровую кнопку
усиление
повернуть полностью
9, Открыть клапан светового затвора (положение
ровой кнопкой
и нижвеА циф-
установить стрелку индикатора на «О» по верх-
шкале.
10. Закрыть клапан светового затвора в вести «опытную» «юиту в
кюветную Камеру.
1 . Открыть клапан светового затвора (положеине и считать велиЧИНУ
оптической плотности образца по верхней шкале
12. Пост окончания работы выключить прибор и отключйть его от
сети.
Спектрофотометр СФ-45
1.
2.
Проверить заземление и Включить прибор в сеть.
Закрыть фотоэлемент (рукоятка Шторки слрава В ПОЛОЖИВВ
З. Установить рукояткой внизу щель им.
4.
5.
6.
Нажать кнопку «Сет».
Нажать кнопку «Пуск» на клавиатуре МПС
Установить рычаг лампы положенне «Н» (лампа накаливания для работы
в окласТИ 340—1 Т нм) или в положение (дейтериевав лампа
для работы в области
нм
7. Прогреть прибор в течение О мин,
8. Установить барабаиом требуемую длину волны (вращать в сторону
увеличения ддИН волн),
9. Установйть рукояткой тереключенни фотоэмиентов (сверху) Зото-» —
элемент, используемой зри работе нм; ск»; длине — при волны работе в обпри
работе в области спектра
лести спектра
10. Установить п кюветодержатель кю•еты с контрольными а опытными
обратами.
Установить кюветодержатедь в кюветную камеру,
Открывап крышку кюветноа камеры только при закрытом фотоэлементе!
12, Нажать клавишу «Ш нз МПС. Пра лом на фотометрическом Обло
значение синала п вольтах. пропорциональное Значению Ге унопого тока
фотоэлемента.
13. Установить рукояткой «О» (справа' на фотометрическом табло числовэе значение н от 0,05 Дб 0,1. Нажимать кнопку «Ш несколько раз до
поя•дення Показн•ия. отличаютего•ся от предыдущего НеКоиуктометр (рис. 23)
установить
Пути потока О.лучения контрольный образец. пере.
Мещзя каретку ружочткой, связанно“ е кюветной камерой, 1. Включить кондукто1.5, Установить рукоятку
переключения шторки в толоженне «Откр метр в сеть за 20 мин до 16. Нажать клавншу «К Слева высвептгя
индекс «Ь. Показа. измерения.
«вя слезует талло увеличить должнн ширину быть (пеан, преде•зх пря показании Пгн бодыпе Показаннн
внсвегиазеТСЯменыле 0.5
тередией 2. Нажать панели кнопку н опредена
лить
чувств
пельиость прииндекс . При этом с.еду•ет у (цель , На Кдз вишу (ора. ста ари Все одной Измерении а той прове-же
чуастаительности. Если ее
«К несколько раз. пока не появится показание, отличаюшееея от пре- требуется ИзуеНщть, нажать лНлущего не
(имее чем на ОГО! „
кнплку на передней
Пра
оптнчесжой плотности нажать клавишу «1)
и повернуть рукоятжу на
фотометрическом т л(мп должно появиться
(оптм. задней лгибора,
плотность
кожтвольного образца), а слева— андекс
З, Налить в ячейку ди18, Нажать кдавпшу «[КТ». утаи высвечивается
индекс «Ц» (инк— стиллировзнную воду, опуп дмческий режим снятия локаззния через каждые 5 с). Нажать
клз;ншу• стать крышку с злехтродз•
Так. бобы под
ней не 19. Вводить Поочередно н поток «здуЧенИЯ кзчеряемыг образин. ИсБыло пузырей воздуха. н
пользуя рукоятку. сяяз,'аную с кюветной камерой. в снимать показания записать показания прибо•
фотоие:рнческого табло.
рЛ.
Затем
НЗЧСРИГЬ
проводность
опытных
раст•
воров,
Перед
каждым определением ячейку
н электро•
Захена образцов в кюветной Камере производится только при мкрытом
ды ополаскивать дистиллифотоэммент е!
рои анной водой и слегка Обсушивать
фильтровальной бумагой.
20. Выключить спектрофотометр зажатием кнопки «От».
Спектрофотометр СФ- 18 рас. 28. Елок „схема кондуктометра: 1 — Источник сетевого питания
м•ат.
2. Установить
литор чувстнате-•шноетн напряжения. 5 —
на переключателе программ необходимый режим работы
и чувстви те льность_
3_ С ломощью рукоятки «Запись» установить на спетЧмКе длин волн
Отсчт 400 НМ.
преобразователь постоянного тока 9 В в
переменный 16 В (8—10 кГц), б— кнопка
включения “ читирутието сопротивления.
7— лм'гтирующее сопротивление. 8 — двух9
1. Подключить прибор К сети. вкзюч\гть тумблер «Сеть», прогреть ПРИВер в течение 5
Питания. 4 — ретупереключатель
4. Укрепить (Пик для спектра Плаке. Вращая яалик, установить поиулерпощ•нй выпрямителЫ — н лдпкз• перо самолиеца в положение нм а валик. тор (микроампермегг).
— мектроды,
Установить переключателем сбоку необходимый режим работы.
П — ячейка с испытуемым раствором
б. Включить тумблер «Ламп3'.
7. Установить исследуемый образец кюветную камеру («опыт» — спра-
«контроль'
В Включить тумблер «Отработках
9. Усталоанть «О. прибора по лале D,. Винт регулировки нуля
прибора, под кнопкођ переключателе программ О,
актся слева,
т. см.
10. Выбрать необходимую скортть развертки спектра и включить тумбЛер
развертки спектра.
Полярографическая установка для
ннтежввн*ти фотосинтеза и
дыхания целых проростков и отдедьных листьев
(рис. 29)
176
тои, вызнанные увеличением Концентрации кислорода в резу»тате фото•анте.зз
растеиаА ( 10—15 мин).
13.
калибровку измерительной сясгемы. предварительно сняв
камеры с растениями н переклн:внв тумблер нз панели регулировки в положеиИе
«Имат1цня•. При калибровке отметить на диаграммной ленте начальиое
положение пера н соответствующее ему
тока. регжстрнруе• ное ил Зисм
рукояткой панели регулировки изменить веЛНЧиву подаваемого напряжения (н
тем самым ветчину проходящего тока) н от. метить новое положенне Лера ва
диаграмме а соответствующее сиу зиаче•
•кие тока.
14. Выключить тумблер «Батарея» На панели регулировки, выключнть
тумблеры ня приборах. Отключить приборы от сети.
Рие
кислородт
регулятор
В
поляризационного
В клю ч а т е ль
лороцным
фильтр,
9—
тз—Проаерка),
ИНО Ме Тр
стен
—
регистратсо
ИЯМ
КСП-4,
Н
—
камера
КИ С-
п е.
Попрогрзфнческая установка с термостатируемой ячейкой дая
регистрации изменения содержания кислорода в жидкой смеси
(рис. 30)
(Рабо-
потев-
с ра •
1, Проверить заземление,
2, Включнтъ таборы в сеты
З. Включить усилитель ЛПУ-О,' микровольтнаноауперметр Ф •136. са•
моли сет.
4. Подключить электрод Кларка к соответствующим клеммам установки и
включать батарею,
5. С помощью рукоятки регулировки напряжения подать на электрод
напряжение €50 мВ (контролировать по шкале ЛПУ•О]}. При уток Тумблер на
ЛПУ•П' н тумблеры на паиелн регулировка установлены в положение «Проверка»
и
б. Переключить тумблер н. лПУ•01 в положение «Работа». а тумб» ры напели
регулировки— в положение «работа» н «Электроде. устано• Ить необходимое
усиление,
7. Прогреть установку в течмае 30—40 мкн, Убедиться в стабилизации ТОКА
электрода.
8, Установить растеиин в камеры так, чтобы в Камере оказались лишь Лмстья
проростжот Смазать резиновые аронладхн вазелиновым маслом н мкрьгть камеры
крышками. следи за тем, чтобы ванты плотно прижимали
крышку и обеспечивали герметичность камеры. установить камеры на шт.9. Подключить камеры нижним шлангом к микрокомпрессору, верхнам— К
ячейке с электродом. Вюючнть компрессор.
10, Отметить микровольтнаноампгрметре Ф•'Зб величину начального Тока.
Проходящего через электрох
1. Включить протяжку днатраммной на многоканальном са• мописще.
Заласть Кинетику измененан величины тока. Которое соответству ет изменению
Коиие¶трацни кислорода канале, аызываемому темновыч лы• ханаеЧ (10—15
мкн».
12, Включнть осветитель И записАть на самописце изменения велНЧИНН
Тис. 30. блок,ехема полпротрафической установки с термостатируеной
фотоячейкой: — батарея 2 — регулятор поляризационного напряжения. З—
имитирующий •лектрод•резистор, 4 — переключатель (Электрод—Имита• мя», 5
— электрод Кларка, Ь— •чеЙка Термостатируемая. 7— магнитная мешика, 8 —
тепловой водяной фильтр, 9 — осветитель, 10— мяк овольтнано• амперметр, —
регулятор чувствительности установки : lO. — переклюЧаге.Ть (Работа—
Проаерка). раторный .лпу•01ђ 13 — лир Термостат, — тотснцноиетр
15 — регистратор КСП•4
Выполнить операции. укванные в п_ 1—7 предыдушего описания,
2. Заполнить ячейку реакционной смесью а закоыть ее крышкой. СдеДЕТЬ За
Тем, чтобы в ячейке не осталось пузырька воздуча,
З, Подключить к ячейке ультрагермостаз (поток воды, ОХЛАЖ• дающей
ячейку. иалоавлеН снизу вверх).
4.
Включить мешалку,
5.
Включить самописец и произвести необходнмые записи (при
регнст• ретин фотосннтетического выделе нав кислорода вначале дождаться
уста
в темноте стационарного тока, а затеч включить осветитель).
Произвести калибровку электрода дрожжами али добавлением
6.
Осьших количеств Na„S03 в ячейку, заполненную соответствующим (Уфе7.
Выключить тумблеры. Отключить приО“Ы от сети.
Потенциометрвч«кав установка дли регжграцнн фотоиндуцируемых
изменений РН в суспензии хлоропластов
(рис. 31)
б. Полгогоцлешиые дл. работы манометры с (гТНрЫТЫМн нравами уста.
овить в держите“ аппарата а включать качание.
7. После 23—30 мин термастзтнровзния сосудиков Варбурга подвести
уровень Жидкости в правом кплеНе до отметки «15» и закрыть Вран (при
зизлизс
зктнвностн включить свет),
8, Приступить к снятию аокз:паий. Показ:ния снимают При закрыто• кране
Манометра каждые 20 мин в течение 1 ч, Во время снятия показани*,
! 78
-манометр отключают от общего качания, подводит уровень Жидкостн в праВом
Кохне да выбраниого «нулевога» уровня. используя зажим на резиноПом
резернуаГе с ЖмЯКOСТЬК3 Броди, записывают показания по левому
Лену
9. После окончания отита отключить качание, открыта
ров и
извлечь нанометры из иапны.
lO_ Выключить термостат н отключить аппарат от сети.
работа ламинар&ксе
Протереть поверхность стога и стен раствором спирта, помес• тить в
необходимые стсрнльиыс Инструменты, посуду и сп• суд с 7036-м
раствором спирта, в котором находятся аннщеТ в другие ин. струменты,
необходимые во время работы.
2. Включил последовательно: — сеть. 2— систему, Пропускаю:иую
воздух через фильтры, З— лампу. После включения лампы а коь•наге должно
быть шоДеЙ:• Через 20—30 мин ультргфиалетовую лампу выключи:ы
3_ Поверхнхть сосудов с растительным материалом и руки Тщательно
протергть раствором старта, Спсуды поставить в ламннзр-бокс„ Вклюгорелку,
При работе со Посудой и м.ттсризлоц необходимо
1.
Рн с .
фот индуцируемых
изменений
2—
(диапроектор).
С т е к. ли н п ы м
шзлка
ме-
делать
выходного
компенсатор
б ат р ея
со
9—
1_ Проверить заземление
2, Вклинить приборы в сеть.
З. Включить тумблеры ил приборах (ЛПУ•О1. гН•цетр, КСП“).
4.
З•палшть ячейку реакшионной сиесьп.
5.
Полключить ячейку к ультратермостату. включить магнитную
ме
у
б. • Включить самописец в темноте дождаться стационарного уровня
7, Включить свет записать фотоиндуцвруемые изменения ГН,
8, После окончания опыта хороло промыть элекхроды вал“, ВЫКд.• чип,
приоры,
Аппарат Варбурга
Аппарат Варбургз представляет собой ванну большой емкости, а котсн
руло погружаются манометры на стелнлльнцч креплению. ультратермостат с
контактным Термометром, Поддержавающий температуру в ванне
+0,02' с
Проверить заземление прибора.
2, Залить воду в кристаллизатор,
З. установить необходимую температуру контактном термометре термостам:
включить систему нагрева н перемешивания воды.
4, Вклинить туматеры. лгавгрить исправность механизма качания, 5.
Включить тумблеры.
работу осветительныу ламп.
помни'ы что
4. Колбы другие сосуды, закрытые крышками НЗ фольги и открывать
следующим образом: целлофан снять до внесения колбы а ла,
фольгу
обжвь. пронеся горла сосуда над горслкоВ, затем осто• рожно разиернуть кран
фольги снять ее. Закончив раоп:у (например. пе ресгв клеток). закрыть сосуд:
плыть пинцет из сосуда со сгиртам, обжечь ега в пламени горелки, обжечь гарло
сосуда. взять пинцетом крышку из фольги. обжечь ее с двух сторон и закрыть
горлп сосуда. Когда фольга зс• тынет. прижать ее плотно к горлу сосуда. После
этого сосуд можно вымес• Ти ламинар-бокса. Фале,гу целлофаном. сосуд
подписать, При
использовании стерильных инструментов и пипеток разворачивать их с того
конца. за который держат при работе,
5, Выключать лам инар-бокс Последова;сльно: — горелку. 2— вент•ля•
ЦИПННу» систему. — посуду и инструменты. Поверхность стол протереть
раствором стиртл.
Обработка экспер•МсйТаЛЬНЫх ДАННЫХ на ЭВМ
Полущенные результате экспериментов данные статистическ обрабоТать на
ЭВМ (1В,М РС». Фармат ввода данных и порядок работы с про“ граммами
определяют анстгукпив к этим программам. Полугеннне данные И результаты
сытнстнчес*ой обработки
внести о отчет. Про
подученных
данных.
РАЗДЕЛ Ш. ФОТОСИНТЕЗ (В. Ф. Гавриленко, Т. В.
51
Задача 1. Определение интенсивности фотосинтеза растений
52 Работа
Определение интенсивности фотосинтеза дыхания р ясменнП полнрографнческим
ме:олом 53 Задача 2. Изучение пигментного аппарата фотосинтезирующих орга-
55
Оглавление визиовРабота 1, Опредежите содержании основных пигментов фотосинтет ячесного аппарата листьях высших рзпгннп
Работа 2. Исследование физических и химических свойств хлорофи
62
Предисловие
з
Опыт 1. Флуоресценщия хлорофилла
63
Опыт 2. Разделеаие пигментов по Краусу
63
Опыт 3_ Омыление хлорофилла и отделение каротин; 63 РАЗДЕЛ
Физиология РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ Щ, Т Ер. Опыт 4. Получение ничегкой сиязнфеофитина восстановление металлоорга• лалов, М. И. Тукеева)
спектральных
свойств пигРабота З. Сравнательное исследование
Задача
Выход
64
бран. Проницаемость
нз клетка как отрзженме свойств ее уем.
ментов в растворе пигментных И тканях систем листа пианоб'ктгрян Ала-
мембран
6
Работа 1. Влияние р33ЛЧННХ факторов На выход электролитов
нз клеток
7
Опыт 1. Влияннс бяотических (фитол.тогены) н абиотических
факторов на выход
65
качественного состава пнгМсн1ОВ эукариотРабота 5. Сраикеняс
вы! н Прокариот ныя фототрофовметодом хроматографии н коя(темпе;мтурннй. водный Стресс)
Работа 6. раздетнис чествеННое определение пигментов основных каротиноидов
злея:голтов из клеток
Опыт 2. Делствис
Работа 4. Исследование наела
7
шока нз
клеток
9
носо листа
Задач: З. Опослс.*нне фотохимической активности хлоропластов
70
Работа 2. Влипне температуры проницаемость клеточных иен. работа 1. Оирсдсленис активности реакции акцептора Хилла в электроновУ тролластах 73 боги для по
скорости восстановления
Работа З. Определение выхода веществ нз пыльцы при ее про. работа 2. Охредетние по скоростн выделения фотохимической кислорода активности
(пол•рографнчегхимхлоропластов растанни
75
Задача 2. Движение литоплазиы 12 методом) хлороЗадача З. Выдехвце протопластов и опредехиие мх жизнеспособ Задача 4. Определение циклического
фотофпсфорилнровгния 78
18 пластов рекомендуема“ литература 21
Задача 5. Определение
фотоиндуцируемых методомизмененай РН в суспензии хлоропластов потенциометрическим
Работа Регистратин фотоиндуцируемых изменений РН хм»опластами в
отсутствие ,АЩФ
87
РАЗДЕЛ П. рост И РАЗВИТИЕ РАСТЕНИИ (И, П. Ермаков. Работа 2. Регистрашия фотоиндуциругмых изменений РН хмуроМ. И, Тукегт-( Н. П. Матеева) 22 пластам“ в
условиях циклического фотофосфорнлнрс— 88 ванн я
Задача фитогормоны
23
лттерпура
Работа 1. Влжянне фитогормонов на метаболизм изолированных семядстей тыквы 25РАСТЕНИИ (ОКИСЛИТЕЛЬНЫЕ проОпыт, 1. Опрсдс-тняе роста семядолей
РАЗДЕЛ ДЫХАНИЕ
Ол1.“Г 2. Определение количества хлорофилла в семндсмнх
27
ЦЕссы В рдстиТЕ.льнои КЛЕТКЕ) (Т. в. Жигалова)
Опыт З. Опреде.т•иие пронишземостн клеточных мембран
28
Опыт 4, Опредслснне зкТ7“НосТм
28
Задача Опреде*ние интенснвн(юти лыхзнии растений
Опщг 5. Опргдслснис зкти•носТН амилаз
29
Работа Определение интенсивности дыхгння н дыхатетного
92
Работа 2. Втянис ауксинов рост отрезков колеоптилей з.ЛПКов
Работа З. Влияние гиб&ре.тлнна ня активность гидролитичсежня
ферментов в зерновках злаков
Задача 2. Метод культуры
тканей пыс(пнх растений
зо
коэффищнснтз манометрическим метолом
Работа 2. Определинс общей интенсивности дыхгния Ие.ТА* про.
32
р«ткоа или отделенных Л1стьев полярографическии
окнепттгльных фермен•
35
Работа 1. Стери.т•зация семин выращивание стерильныз раете•
92
2. Определение активности некоторых
99
99
Рота 2, Полу•чеине каллусов Моркови шх культивирование 39 Работа Определенне общей дегидрогеназной активности мето• 103 Работа З. Глубинно. культавирозанне
клеток растений (суспензи• дое 105 культура) 41 Рота 2, Определенне активности пероксидззы
Работа 4. Соматический эмбриогенез
44
рота З. Опредемние апииности полифенодоксн№зы В растн• 108 работа 5. Андаоггнез в культуре пыльников и
получение
тельных Тканях (по Бояркину)
НдНЫХ растениП табака в условиях
Р екомецдуемая литература
vitr0
46
50
Работа 4. Определение активности липоксигеизз в растительных
Работа 10. Определение активности витргтредуктазы в листьях
Задача З, Характеристика активности процессов пгрекисмЈга окисления
158 пшеаииЫ
Работа 1 1, Определение выхода электролитов из лм:тьеи пшеницы лапидав по образованию
Малопового даальдегада в растительанх тка- Задача 2, Сравнитсгьнсје изреиие меха болизма эмбриогениых И не•мбриогеиных кгсточаых культур моркови
Задача 4. Определение степсин сопряженности поглощения кислорода
на динитрофгнол туре клеток моркови
Рекомендуемая литература
Работа 1. Опрелелеаие проницаемости клеточных мембран в куте с смнтсзом АТФ По реакции
работа 2. Олрепгление активности амилаз в культуре клеток мар•
козн
Работа З, Опредејение активности полифекплоксидазы в каллусе РАЗДЕЛ V.
МИНЕРАЛЬНОЕ ПИТАнИЕ (Е. Н. маркировщ Е. В. ха. и суспензионной культуре клеток
моркови 162 ритонашацли)123 Работа 4. Опр-гдеиснис $ктианасти пероксндазы в каллусе
сус— лензнонной культуре клеток моркови
Задача 1. Поглощение аммонля растениями н разных услонлнх рабата 5. Олредс„тснис растворимых сахароз н крахм;ля в Кут„ лат ности среды 128 туре клеток моркпзн
антроиовым Методам
Задача 2, Определение поглощенн ионов потенциометричесхам мето• до МЛриложение Т. Приготовление реактивов
Рзботз 1, Поглощеите ионов калин калия культура; Култу ой
132
Приложен“ П. Парндпк работы на приборах И установках
Варианты опытов. Паглп(цение
водоросле#
Работа 2, Вялован слецифика поглощеннн нитрата высшими растениими
Задача З. Изучение синтетической функции корней на примере усвое•
Ния акасленно(ът азота среды
Рекомендуемая литература
РАЗДЕЛ ял. вОднЫИ РЕЖИМ РАСТЕНИЙ (Г. д. Власова)
Задача 1. Определение динамики поглощения воды талломом лишайника
Залеча 2. Изучение экссудащиа корней
Задача З. Транспирация растений работа 1. Изучение
устьичного аппарата растений
Опыт 1, Движения устьиц
Опыт 2 Олрелглепие трапспирарующсй поверхности ласта
Рабата 2. Определение интенсивности транспирашин психромегрнчесжам методом
Рекомендуо•тя гитерахура
149
РАЗДЕЛ ул. политгункционАльноСТЬ ОТВЕТНЫХ РЕАКЦИП
РАСТИТЕЛЬНОГО ОРГАНИЗМА (Т. В. жигалозп, И. коз, М. И.
работа 1, Определение водного дефиците в листьях растений
Р
Зедачз 1, Влиннде водногп дефицита на взаимодействие некоторых
физиологических функций у сортов пшеницы, разных По устойчивости
л заспе
154
Работа З, Характеристика пигментного аппарата листьсН пшеницы
Рзботз 4. Опреде.зение фотохимической активности хлорапагстов
отз 2, Определение оПлсей интенсивности фогогиитеза дыханин
целых проростках пшеницы полярографическим методам 156
лилии ци
Работа 5_ Опредмсиие фосфорилнрующей активности хлараплас•
тов пшеницы
Работа б. Определение активности полифенолоксидззы в листьях
Пшеница
Рабатз 7, Определение активности Пероксндазы в листьях пшеннаы 157 Работа
8, Определение содержания малонавого диальдегндз в листьях пшеницы рабата
9, Определение содержания сахаров листьях пшеницы
183
156
а
б
Автор
ДонАгрА-З
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
4
Размер файла
3 636 Кб
Теги
практикум, мокроносова, растения, физиология, 1994
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа