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Physical
(31/ 43)
[6][_]
0,5 % de
(4)
[7][_]
10 % de
(3)
[8][_]
1,5 ml
(3)
[9][_]
de 30 mm
(3)
[10][_]
de 60 mm
(2)
[11][_]
2,5 ml
(2)
[12][_]
20 minutes
(2)
[13][_]
16,4 mm
(1)
[14][_]
2 ml
(1)
[15][_]
1,25 ml
(1)
[16][_]
de 1 mg/litre
(1)
[17][_]
3 mg/litre
(1)
[18][_]
2 mg
(1)
[19][_]
de 5 % de
(1)
[20][_]
75 %
(1)
[21][_]
90 %
(1)
[22][_]
de 90 mm
(1)
[23][_]
7 ml
(1)
[24][_]
0,25 %
(1)
[25][_]
3 ml
(1)
[26][_]
1 minute
(1)
[27][_]
5 ml
(1)
[28][_]
2 N
(1)
[29][_]
0,03 %
(1)
[30][_]
4 N
(1)
[31][_]
0,1 mg/ml
(1)
[32][_]
5 minutes
(1)
[33][_]
0,5 %
(1)
[34][_]
de 10 minutes
(1)
[35][_]
0,1 % de
(1)
[36][_]
2 % de
(1)
[37][_]
Gene Or Protein
(11/ 24)
[38][_]
Etre
(11)
[39][_]
Protamine
(3)
[40][_]
DANS
(2)
[41][_]
APTE
(1)
[42][_]
Tre
(1)
[43][_]
Est-a
(1)
[44][_]
Adap
(1)
[45][_]
Cata
(1)
[46][_]
Ral
(1)
[47][_]
Snt
(1)
[48][_]
Protein
(1)
[49][_]
Molecule
(12/ 18)
[50][_]
sulfate
(3)
[51][_]
phosphate
(3)
[52][_]
DES
(2)
[53][_]
water
(2)
[54][_]
ammonia
(1)
[55][_]
nega
(1)
[56][_]
nitrogen
(1)
[57][_]
quide
(1)
[58][_]
deta
(1)
[59][_]
lysine
(1)
[60][_]
X-100
(1)
[61][_]
minee
(1)
[62][_]
Polymer
(2/ 6)
[63][_]
Poly-D-lysine
(5)
[64][_]
Polyester
(1)
[65][_]
Generic
(1/ 2)
[66][_]
amine
(2)
[67][_]
Organism
(1/ 1)
[68][_]
virus
(1)
[69][_]
Disease
(1/ 1)
[70][_]
Polio
(1)
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Publication
_________________________________________________________________
Number FR2510604A1
Family ID 1978147
Probable Assignee Yeda Res And Dev
Publication Year 1983
Title
_________________________________________________________________
FR Title PRODUCTION D'ACTIVATEUR DE PLASMINOGENE
Abstract
_________________________________________________________________
PROCEDE DE PRODUCTION D'ACTIVEUR DE PLASMINOGENE (A.P.).
IL CONSISTE A CONDITIONNER DES CELLULES FIBROBLASTES DIPLOIDES, FIXEES
SUR DES SURFACES ENDUITES OU NON ENDUITES, PAR UN CERTAIN NOMBRE DE
PASSAGES DANS UN MILIEU DE CULTURE RENFERMANT DU SERUM, PUIS A
CULTIVER LES CELLULES AINSI CONDITIONNEES DANS UN MILIEU DE CULTURE
APTE A PRODUIRE A.P.
ON OBTIENT AINSI, A PARTIR DE CELLULES NORMALES, DE PLUS GRANDES
QUANTITES D'A.P.
Description
_________________________________________________________________
La presente invention concerne un procede de pro-
duction d'activeur de plasminogene, ci-apres designe par
a.p, ainsi que l'enzyme ainsi obtenue.
L'urokinase est une enzyme proteolytique,utilisee en medecine pour
traiter des patients souffrant de caillots sanguins Son efficacite a
ete prouvee, et son utilisation
est autorisee aussi bien aux U S A qu'en Europe et au Ja-
pon Il semble que les enzymes, designees sous les noms
d'urokinase d'une part, et d'activeur de plasminogene d'au-
tre part,soient pratiquement identiques A l'heure actuel-
le, l'urokinase est produite principalement a partir de 1 '
urine, dans laquelle elle est presente en tres petites quan-
tites, de l'ordre de 8 Unites/ml Le cout de la preparation finale est
tres eleve, et les quantites disponibles sont tres faibles En
consequence, on a cherche a produire a p. par d'autres procedes, en
quantites pouvant etre mises dans
le commerce.
*La presente invention est basee sur la constata-
tion inattendue que l'on pouvait obtenir l'enzyme a p, en
quantites industriellement interessantes, a partir de cel-
lules diploides normales Des cellules sont isolees, qui produisent a
p, et leurs lignees sont conditionnees pour produire des quantites
accrues de a p, sans recours a
des transformations au moyen de virus ou de traitements chi-
miques (inducteurs) qui sont carcinogenes ou co-carcinoge-
nes A la fin du cycle de production, les cellules sont in-
changees quant au nombre de leurs chromosomes et a leurs
caracteristiques de croissance Elles proliferent dans les
conditions normales, utilisees pour chaque lignee de cel-
lules et peuvent ainsi etre recyclees.
Le nouveau procede selon l'invention, de produc-
tion de a p, consiste a cultiver une souche de fibroblastes diploides,
fixee sur des surfaces enduites ou non enduites, pour un certain
nombre de passages dans un milieu de culture
contenant du serum, puis a cultiver les cellules ainsi con-
ditionnees, dans le milieu de culture o elles produisent
de l'a p, qui est recupere a partir de ce milieu.
On a constate que certaines lignees de cellules diploides etablies,
humaines, comme IMR-90, WI-38 ou HEL-299, acquierent l'aptitude a
produire l'a p, lorsqu' on les cultive initialement pendant une
certaine periode de l'ordre de 5 a 15 jours, sur un milieu renfermant
un
serum autre que le serum foetal de veau (FCS), de preferen-
ce du serum de cheval (HS), ou lorsqu'on les cultive sur des coupelles
prealablement enduites d'une matrice, comme
poly-D-lysine Les cellules, ainsi conditionnees, produi-
sent par la suite et excretent l'a p de maniere continue sur une
periode d'au moins 15 jours, dans un milieu exempt de serum renfermant
de l'hydrolysat de lactalbumine (LH) ou un autre milieu nutritif
convenable Apres accumulation d'a p dans le milieu, et lorsqu'une
certaine concentration
est atteinte, la production de a p diminue, et meme even-
tuellement s'arrete La valeur de cette concentration maxi-
male est de l'ordre de 1 U/ml pour de nombreuses lignees de
cellules normales; de 3 a 5 U/ml pour les cellules trans-
formees, de 30 a 50 U/ml pour les cellules de vessie de
porc et de 100 a 300 U/ml pour IMR-90 L'elimination conti-
nue de l'a p du milieu nutritif, empeche d'atteindre cet-
te concentration maximale; ainsi, les cellules produisent l'a p
pendant un laps de temps tres prolonge Avec IMR-90
le taux de production est d'environ 50 U/jour/105 cellules.
L'a p peut egalement etre absorbe a partir du milieu et ce dernier
peut etre recycle L'a p produit est analyse et on constate qu'il a un
poids moleculaire d'environ 55 KD, et qu'il a des reactions
immunologiquement croisees avec l' urokinase urinaire (UK) Il semble
donc que l'a p produit
et l'espece 54 KD d'urokinase urinaire (H-UK) soient homolo-
gues, cette derniere etant consideree comme etant l'espece
a activite therapeutique la plus forte.
IMR-90 est une lignee cellulaire similaire a WI-38, cette derniere
etant une source classique pour la
production de vaccins vivants contre la polio et la rube-
ole La culture de ces lignees cellulaires est decrite en detail dans
la litterature, et les conditions optimales sont bien connues
Conformement a l'invention, le procede
est decrit avec reference a la lignee de cellules IMR-90.
Il est bien entendu que cela n'est fait qu'a titre d'exem-
ple non limitatif, et que l'on peut utiliser, dans le meme
but, des lignees cellulaires nouvelles ou etablies, simi-
laires, ayant des caracteristiques proches.
Parmi les differents serums utilisables selon l'invention, on peut
citer ceux du porc, du cordon humain, du veau nouveau-ne, du chien, de
la chevre, de la poule etc. Une lignee preferee de cellules utilisee,
est
IMR-90, une souche de fibroblastes diploides humains, ob-
tenus par W W Nichols ( 1977) a partir de poumon d'un foetus femelle
age de 16 semaines Les cellules proviennent de ATCC (CCL 186, passage
7) Pas plus IMR-90, que WI-38 ou HEL-299 n'ont eu la reputation de
produire a p en quantite appreciable A l'origine, au cours de la
presente recherche, ces souches etaient considerees comme non
productrices On a decouvert qu'il etait possible de convertir ces
cellules
en producteurs de quantites appreciables d'a p, par cultu-
re sur un milieu renfermant du serum de cheval, suivie de
culture ulterieure sur d'autres milieux nutritifs Les cel-
lules IMR-90 provenant d'ATCC sont degelees et deposees dans un milieu
contenant 10 % de FCS, comme recommande par ATCC Apres un passage, les
cellules sont transferees dans le milieu LH, et l'on dose la teneur en
enzyme On observe
une lente formation d'a p (moins de 5 U/ml apres 4 jours).
Apres deux passages dans FCS, les cellules IMR-90 sont repiquees dans
un milieu contenant 10 % de HS (serum de cheval) Apres quatre passages
( 12 duplications estimees) dans ce milieu, les cellules sont
transferees dans LH Les resultats (figure 1) montrent que les cellules
deviennent
tres fortement productrices de l'a p L'enzyme est pro-
duite rapidement et sa concentration dans la solution-at-
teint environ 100 U/ml.
Dans la figure 1, en ordonnee,est portee l'activite de 1 ' a.p en U/ml
et, en abcisse, la duree en jours du sejour
dans le milieu LH.
Les memes cellules sont repiquees de maniere continue dans du HS et la
production de l'a p est controlee de temps
en temps Les resultats (Tableau 1) indiquent que la capa-
cite de production de l'a p demeure, jusqu'a ce que les cellules
commencent a montrer des signes de vieillissement,
c'est-a-dire une division lente et l'aplatissement".
On observe ce phenomene apres le passage 22 a 24, ce qui
est estime correspondre a 65 a 70 duplications.
Afin d'eliminer la possibilite que la production de l'a p soit le
resultat d'un cas de mutation singulier
et non reproductible, on repete l'experimentation en par-
tant de cellules congelees apres le 9 eme passage Les resul-
tats indiquent que la capacite de production de l'a p s'ex-
prime de facon reproductible.
Dans certaines conditions, les lignees ci-dessus de cellules
fibroblastes peuvent etre conditionnees pour produire de l'a p, par
culture sur certains substrats en
presence de serums On fait croitre les cellules sur diffe-
rents serums, dans des recipients pour culture qui ont ete
prealablement enduits de divers composes (voir ci-dessous), et l'on
suit l'apparition de la capacite productrice de l' a.p On constate que
la quantite d'a p dans le milieu
varie a la fois selon le serum et selon la matrice Les re-
sultats obtenus avec des recipients prealablement enduits de
poly-Dlysine (tableau IV) montrent que, sur ces matrices, des cellules
peuvent s'adapter pour produire de l'a p dans
des milieux tels que FCS (serum foetal de veau) qui autre-
ment ne menent pas a la production d'enzyme Une fois adap-
tees, ces cellules continuent a produire l'enzyme dans un milieu sans
serum, comme decrit plus haut Ces cellules
conditionnees sont utilisees dans le procede de produc-
tion. Suivant les observations decrites plus haut, la production est
caracterisee par quelques details Au cours de ces experimentations,
les cellules croissent dans un milieu contenant HS, puis sont
transferees vers un milieu contenant LH, et le taux d'a p dans le
milieu
est controle.
Les resultats, rassembles dans la figure 2, mon-
trent qu'avec les cellules provenant de passages de debut,
la concentration en enzymes dans le milieu atteint une li-
mite superieure de l'ordre de 100 U/ml Cette limite supe-
rieure augmente lorsqu'on utilise des cellules provenant de passages
ulterieurs Avec de tres vieilles cellules la
production d'enzyme ne s'arrete pas, meme quand sa concen-
tration dans le milieu atteint 300 U/ml.
Sur les figures 3 a 5, les signes suivants sont employes: O pour la
totalite du milieu remplace; A remplacement de la moitie du milieu;
* pas de remplacement du tout.
Figure 3: Les cellules IMR-90, apres le passage 15 ( 6 passages dans
HS) sont deposees (lxl O) dans des boites de Petri de 60 mm avec 2,5
ml de milieu HS 24 heures plus tard ce milieu est remplace par LH Aux
moments indiques par les fleches, la moitie ou la totalite du milieu
dans
chaque boite, est recueilli et remplace avec du LH frais.
Dans les boites temoins, 100 il de milieu sont recueillis
pour essayer a p et sont remplaces par LH frais.
Figure 4: Les cellules IMR-90, apres le passage 9 dans FCS, sont
deposees ( 5 x 10) dans un logement ( 16,4 mm) avec 2 ml d' un milieu
renfermant FCS 24 heures plus tard ce
milieu est remplace par un milieu renfermant LH, et on pour-
suit l'experience.
Figure 5: Les cellules IMR-90, apres le passage 23 ( 13 passages dans
milieu ES), sont deposees ( 2 x 10) dans les bottes de Petri de 60 mm
avec 2,5 ml de milieu renfermant HS 24 heures plus tard, ce milieu est
remplace par LH Les milieux sont changes aux moments indiques par les
fleches. Dans le groupe 1, la moitie du milieu dans chaque boite est
recueilli et remplace par du milieu LH frais Dans le groupe 2, la
totalite du milieu est recueillie 1,25 ml de LH frais est ajoute aux
cellules Le milieu recolte est traite avec de la silice (pour absorber
a p) et 1,5 ml de
ce milieu est recycle vers chaque boite du groupe 2 L'ac-
tivite de a p est determinee sur des echantillons de mi-
lieu en chaque point.
Ces resultats suggerent avec force que le taux
d'a p, observe dans le milieu, est determine par sa forma-
tion d'une part, et quelque processus "negatif" d'autre part Ce
dernier peut etre une retroaction inhibitrice sur la synthese (ou
excretion) de l'enzyme, ou la formation d'
un autre produit cellulaire qui inhibe l'enzyme ou cata-
lyse sa degenerescence Le passage repete de ces cellules, dans un
milieu contenant ES, semble amoindrir ce reglage
negatif, permettant ainsi l'accumulation de l'activite en-
zymatique decelable, superieure, dans le milieu.
Il faut remarquer qu'une activite de 100 U/ml correspond a une
concentration en enzyme de l'ordre de 1 mg/litre, de
sorte que les taux de produit dans les experimentations ci-
dessus sont compris dans l'intervalle de 1 a 3 mg/litre.
La recolte et la purification du produit s'ef-
fectuent comme suit: l'a p produit par les cellules peut etre recolte
par adsorption a partir du milieu de culture,
au moyen d'agents connus pour adsorber l'urokinase, par con-
centration au moyen de membranes, ou par combinaison de ces
procedes Deux exemples sont donnes ci-apres a titre d'il-
lustration non limitative.
1 Adsorption.
Le milieu LH contenant l'a p est traite avec de la silice finement
divisee, par addition de 1 a 2 mg de -olides par ml de solution, et on
melange pendant 1 heure es solides sont alors recuperes par
centrifugation On constate que
la partie surnageante contient moins de 5 % de l'a p ini-
tialement present, et on la reutilise comme decrit plus
loin -
L'analyse du solide revele que a p peut etre quantitative-
ment libere de la silice par traitement avec une base, en particulier
ammonia, amine organique et amines polymeres, ce qui donne une
solution de l'a p qui peut etre encore
purifiee par divers procedes utilises dans ce domaine.
2 Concentration par dialyse Le milieu LH contenant de l'a p est
transfere dans une poche a dialyse et on place a l'exterieur une
substance
absorbant l'water L'enzyme est ainsi concentree de 10 a 20-
fois, avec une recuperation totale superieure a 75 %.
On etudie l'action des modifications de milieu
sur la production d'a p de la maniere suivante.
La similitude entre les durees de production de l'a p par
IMR-90 et ceux que l'on a observes Fnterieurement avec d'au-
tres cellules, conduit a des essais sur l'action de change-
ments repetes de milieu On constate (figure 2) que, comme
dans les cas anterieurs, le retard de l'apparition de l'en-
zyme dans les cultures de IMR-90, a concentration elevee en
enzyme, est aboli dans une grande mesure par une perfusion.
Apparemment, la perfusion interfere quelque peu avec le mecanisme de
reglage de la retroaction negative dont il a
ete question plus haut.
Les resultats de la figure 3 (en ordonnee la pro-
duction totale d'enzyme exprimee en Unite et en abcisse le nombre de
jours dans le milieu LH) semblent indiquer que le changement de milieu
agit sur la vitesse d'apparition de 1 ' a p lorsqu'une quantite
appreciable d'enzyme s'accumule dans le milieu, mais n'agit pas sur la
vitesse initiale
de production d'a p Une preuve supplementaire est appor-
tee par une experimentation, au cours de laquelle des cel-
lules, ayant pousse dans FCS, sont transferees dans LH (fi-
gure 4: en ordonnee la production totale d'enzyme expri- mee en Unite,
et en abcisse le nombre de jours dans le
milieu LH) Ces cellules produisent de l'a p tres lente-
ment, de sorte que la concentration dans le milieu est
faible, et la vitesse de formation d'a p n'est pas affec-
tee par les changements de milieu.
Comme le cout du milieu est considere comme un facteur economique
important, on realise une experimentation
concue pour essayer la possibilite de recyclage de ce milieu.
Le milieu use est traite avec de la silice pour en eliminer l'a p, et
il est recycle apres dilution dans la proportion de 1/1 avec du milieu
frais On constate quele traitement par la silice elimine 90 % ou plus
de l'a p contenu dans
le milieu Les resultats (figure 5: en ordonnee la produc-
-tion totale d'enzyme et en abcisse le nombre de jours dans
le milieu LH) indiquent que le recyclage du milieu est pos-
sible La production observee d'a p est reellement plus forte avec le
milieu recycle que lors de la perfusion de
milieu frais.
Le milieu utilise pour la production de l'a p,
au cours des experimentations ci-dessus, contient de l'hydro-
lysat de lactalbumine (LH), suivant le mode operatoire gene-
ral employe dans les recherches sur a p On observe cepen-
dant, que la production de l'a p peut etre obtenue avec differentes
peptones, comme substrat pour la croissance de
micro-organismes qui sont des produits d'hydrolyse de pro-
teines d'origine animale ou vegetale Des resultats en sont donnes dans
le tableau V. Culture de cellules IMR-90 1 Mode operatoire normal Les
cellules sont cultivees de maniere habituelle sur des plaques de
Falcon en matiere plastique, de 90 mm, dans un milieu compose d'un
melange ( 1/1 en volume/volume) de DMEM et de F-12, et on y ajoute a
une concentration reelle de %, du serum foetal de veau (FCS) ou du
serum de cheval (HS), fournis par Gibco USA Chaque plaque est
ensemencee avec 5 x 105 cellules et 7 ml de milieu La confluence est
atteinte en 3 a 5 jours, a environ 8 x 106 cellules par pla-
que En vue de leur passage, les cellules sont trypsinisees
avec une solution de trypsine a 0,25 % (Biolab, Jerusalem).
On ajoute a la plaque 2 a 3 ml de solution de trypsine, et
apres 1 minute a temperature ambiante, on aspire cette so-
lution de trypsine Les cellules sont laissees recouvertes d'une fine
pellicule de liquide Apres 15 a 20 minutes, on ajoute une petite
quantite de milieu frais, que l'on melange vec les cellules et on
aspire dans une pipette a plusieurs
reprises, pour obtenir une suspension de cellules disper-
sees On ajoute alors a chaque plaque 5 ml de milieu frais, et l'on
preleve des portions pour compter les cellules et
pour les redeposer.
On a egalement cultive les cellules sur des plaques de di-
mensions differentes, ou dans d'autres recipients utilises pour les
cultures cellulaires, en utilisant le meme rapport cellules/surface
specifique que plus haut, et en suivant le
meme mode operatoire general.
2 Effets du substrat sur la fixation et la proliferation de IMR-90 On
a effectue des etudes concernant la culture de IMR-90
sur differents substrats et enduits Les cellules sont de-
posees sur differents substrats et on les laisse proliferer pendant 4
jours de facon a obtenir un effet combine sur 1 '
efficacite du depot et la proliferation.
Les resultats (Tableaux Il et III) montrent que la culture
peut etre amelioree par un revetement prealable des plaques.
Le prerevetement efficace le plus simple est constitue par de la
gelatine En outre, une couche de gelatine permet
aussi la croissance sur d'autres surfaces comme"Gelbond".
Unites L'activite de l'enzyme est exprimee en unites CTA Les essais
d'enzyme sont realises par le procede de la plaque de fibrine, graduee
avec de l'urokinase normale
provenant de NIH (USA).
Caracterisation des cellules apres utilisation pour la production d'a
p.
Des cellules IMR-90, adaptees en vue de la production d'ap.
comme decrit plus haut, sont caryotypees Un complement
normal de chromosomes ( 2 N= 46) est constate, avec une dis-
tribution des resultats experimentaux, similaire a celle de la lignee
de cellule d'origine Des cellules, utilisees pour la production d'a p
en milieu LH pendant 12 jours, sont transferees dans un milieu de
croissance contenant % de FCS, et se propagent dans les conditions
normales, decrites plus haut Ces cellules sont suivies pendant 1
mois, et on observe que, la vitesse de croissance, la den-
site cellulaire a la confluence et l'aspect morphologique
des cellules, sont identiques a ceux des IMR-90 d'origine.
La production d'a p tombe egalement au niveau de celui
des cellules normales.
On peut obtenir des resultats similaires avec
des cellules de lignees telles que WI-38, HEL-299, ou si-
milaires, et l'invention a egalement pour objet l'utilisa-
tion de ces lignees de cellules pour la production d'a p.
TABLEAU I
Production d'a p par des cellules IMR-90, qui se propagent dans un
milieu contenant du serum de cheval (HS) Exp Nombre de Taux d'a p U/ml
passages *
1 12 98
110
208
22 45 **
24 15,6
Exp Nombre de Taux d'a p U/ml passages *
2 14 160
17 43 **
24 272
Passages numerotes a partir de 8 * 0,5 x 105 cellules, seulement Les
cellules sont repiquees en continu dans du milieu HS (serum de
cheval), par le mode operatoire normal Afin de
determiner la production d'a p, elles sont deposees, a-
pres trypsinisation, dans du milieu HS, ( 2 x 105 cellules, plaque de
30 mm, 1,5 ml de milieu) et 24 heures plus tard
ce milieu est remplace par du LH (hydrolysat de lactalbu-
mine) L'activite est determinee sur une portion de ce mi-
lieu 96 heures apres le transfert sur LH Des temoins, con-
duits avec des plaques exemptes de plasminogene sont nega-
tifs. IMR-90, recues congelees apres le passage 7, snt degelees
et passees a deux reprises (passages 8 et 9) dans DMEM/FCS.
La premiere experimentation est menee avec des cellules con-
gelees apres le passage 9, et conservees dans l'nitrogen li-
quide Ces cellules sont degelees, passees a deux reprises
dans DMEM/FCS, puis passees dans DMEM/HS.
TABLEAU II
Utilisation de pellicules de GELBOND* et de revetement de GELATINE
pour cultiver IMR-90 Substrat Compte des cellules (x 10-5 Plaque non
traitee 1, 3
Plaque traitee a la ge-
latine 3,2 Gelbond 1,0 Gelbond traite a la gelatine 1,7 *Gelbond est
le nom de marque (Marine Biocaloids) de fines feuilles de polyester
Une face de la feuille est rendue hydrophile par un procede non
decrit, probablement a l'aide
d'alcali C'est cette face que l'on utilise.
Les experimentations sont realisees sur des plaques de
mm, avec au depart 1 x 105 cellules et 1,5 ml de milieu-
HS Pour les experimentations avec "Gelbond", on prepare
un rond de pellicule et on en couvre le fond de la plaque.
La gelatine est appliquee sous forme de solution aqueuse
A 0,03 %, laissee 20 minutes sur la plaque, puis cette so-
lution est enlevee par aspiration.
A 4 out de 96 heures de croissance, les cellules sont deta-
chees par trypsinisation, et comptees.
*TABLEAU III
Utilisation de divers revetements de plaques Substrat Comptes des 4
N/No cellules (x 10) Plaque non traitee 4,5 1,3 Traitee au
protaminesulfate 3,0 0,8
Traitee a la poly-D-
lysine 6,5 1,8 Matrice de cellule 7,5 2-,1
Les details experimentaux sont les memes que pour le ta-
bleau II, sauf que l'on utilise une serie differente de cellules et
que 2, 6 x 104 cellules sont deposees sur des plaques de 30 mm Ces
plaques sont traitees avec du sulfate
de protamine ou dqla poly-D-lysine ( 0,1 mg/ml).
Apres 5 minutes d'incubation, les plaques sont rincees a deux reprises
avec H 20 sterile et une fois avec du milieu
et on y depose les cellules.
La matrice de cellule est preparee par la croissance de
monocouches de cellules CCL 6 (epitheliales, intestin hu-
main) et traitement avec "Triton X-100 " A 0,5 % dans l'water.
Au bout de 10 minutes d'incubation, les plaques sont rin-
cees a deux reprises avec PBS et une fois avec du milieu.
A ce stade, les plaques sont pretes a recevoir des cellules.
TABLEAU IV
Production de a p par des cellules IMR-90 qui se ropa-
gent dans divers serums Serum Revetement de a p dans le Serum foetal
de veau (FCS) Serum de cheval (HS) i Serum de porc Il Serum de cordon
humain Il Serum de veau nouveau-ne Il Serum de chien It Serum de
chevre l Serum de poulet il Poly-D-lysine + + + + + + + + milieu en
U/ml i Les cellules IMR-90 se propagent dans un milieu renfermant
% de serum, dans des boites de Petri en matiere plasti-
que, prealablement recouvertes avec 0,1 % de poly-D-lysine.
L'activite d'a p est essayee dans le milieu.
TABLEAU V
Effet de differentes peptones sur la production d'a p. Peptone a p
dans le milieu U/ml Hydrolysat de lactalbumine 36 Hydrolysate de
caseine 72 D. M peptone Bouillon au phosphate de tryptosphosphate
Prematone K Hydrolysat de lactalbumine " de caseine D.M peptone 1 1
0,5 % de Bio-lab ISRAEL 2 % de Gibco U S A. 0,5 % de Scientific
Protein Labor Inc. TABLEAU V (suite) Peptone a p dans le milieu __
U/ml Bouillon de phosphate de tryptosphosphate 0,5 % de Difco
Prematone K 0,5 % de Humko Sheffield Chemicals. Les cellules ( 105
cellules/coupelle de 30 mm) sont deposees dans un milieu avec 10 % de
HS, et 48 heures plus tard ce
milieu est remplace par du milieu frais renfermant la pep-
tone indiquee La quantite d'a p dans le milieu est deter-
minee au bout de 24 heures.
Claims
_________________________________________________________________
Revendications
1 Procede de production d'activeur de plasminogene (a.p) par culture,
caracterise en ce qu'on cultive une souche de fibroblastes diploides,
fixes sur des surfaces
enduites ou non enduites, par un certain nombre de passa-
ges dans un milieu de culture renfermant du serum, puis cultive les
cellules ainsi conditionnees dans un milieu de culture approprie a la
production de a p, d'o l'on recueille a p. 2 Procede selon la
revendication 1, caracterise
entze que les cellules fibroblastes diploides sont des li-
gnees de cellules IMR-90, HEL-299 ou WI-38.
3 Procede selon la revendication 1 ou 2, caracterise en ce que les
cellules sont cultivees sur les surfaces
non enduites de plaques, feuilles, grains, ou autres.
4 Procede selon une des revendications 1 a 3, carac-
terise en ce que les cellules sont conditionnees par cul-
ture sur des surfaces enduites avec de la poly-D-lysine, du
protaminesulfate ou de la gelatine, ou bien sur une matrice
cellulaire, et sont ulterieurement cultivees
sur une surface enduite ou non enduite.
Procede selon une des revendications 1 a 4, carac-
terise en ce que les cellules sont conditionnees dans un
milieu contenant du serum de cheval (HS) pendant 3 a 12 -
jours, puis cultivees dans un milieu renfermant de l'hy-
drolysat de lactalbumine (LH).
6 Procede selon une des revendications 1 a 5, carac-
terise en ce que les cellules sont conditionnees pour pro-
duire de l'a p par culture dans un milieu renfermant du serum de veau
foetal (FCS), serum de porc, serum de cordon humain, serum deqveau
nouveau-ne, serum de chien, serum de
chevre, ou serum de poulet, puis sont ulterieurement culti-
vees dans un milieu renfermant un hydrolysat approprie pour
produire l'a p voulu.
7 Procede selon la revendication 6, caracterise en ce que la
production d'a p s'effectue par culture dans
un milieu renfermant une peptone choisie a partir d'hydro-
lysat de caseine, bouillon de phosphate de tryptosphosphate pep-
tone D M,Prematone-K, ou autre produit equivalent du commerce.
8 Procede selon une des revendications 1 a 6, carac-
terise en ce que l'a p produit est enleve en continu de
la culture par perfusion.
9 Procede selon une des revendications 1 a 8, carac-
terise en ce que a p est adsorbe sur de la silice, libere
par contact avec une base et purifie par des moyens clas-
siques.
Procede selon une des revendications 1 a 9, ca-
racterise en ce que le milieu est recycle apres enlevement d'a p.
11 Activeur de plasminogene obtenu par le procede se-
lon une des revendications 1 a 10.
? ?
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