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[5][_]
Physical
(127/ 236)
[6][_]
2mM
(21)
[7][_]
20 l
(15)
[8][_]
0,01 M
(11)
[9][_]
0,85 percent de
(8)
[10][_]
pH 7,4
(8)
[11][_]
15 percent de
(8)
[12][_]
0,1 M
(6)
[13][_]
5 ml
(5)
[14][_]
1 h
(5)
[15][_]
50 ng/ml
(5)
[16][_]
100 l
(3)
[17][_]
30 minutes
(3)
[18][_]
0,85 percent
(3)
[19][_]
50 ml
(3)
[20][_]
10 percent de
(3)
[21][_]
10-2 mm
(3)
[22][_]
2 ml
(2)
[23][_]
pH = 7,2
(2)
[24][_]
pH 7,2
(2)
[25][_]
pH = 8,5
(2)
[26][_]
30 ml
(2)
[27][_]
15 minutes
(2)
[28][_]
0,5 cm
(2)
[29][_]
100 ml
(2)
[30][_]
pH 7,6
(2)
[31][_]
0,15M
(2)
[32][_]
1 percent de
(2)
[33][_]
0,2 percent de
(2)
[34][_]
106 ml
(2)
[35][_]
20 percent
(2)
[36][_]
5 minutes
(2)
[37][_]
12 minutes
(1)
[38][_]
0,1 mol/l
(1)
[39][_]
0,5 mol/l
(1)
[40][_]
pH: 8,4
(1)
[41][_]
1000 ng/ml
(1)
[42][_]
500 ng/ml
(1)
[43][_]
500 mg/kg
(1)
[44][_]
10 mg
(1)
[45][_]
0,5 M
(1)
[46][_]
pH 9,0
(1)
[47][_]
2 mg
(1)
[48][_]
0,5 ml
(1)
[49][_]
10 mm
(1)
[50][_]
300 mm
(1)
[51][_]
0,05 M
(1)
[52][_]
104 mm
(1)
[53][_]
200 g/ml
(1)
[54][_]
20 min.
(1)
[55][_]
200 ml
(1)
[56][_]
20 mg
(1)
[57][_]
28 ml
(1)
[58][_]
14 ml
(1)
[59][_]
1 cm
(1)
[60][_]
17 ml
(1)
[61][_]
de 644 pg
(1)
[62][_]
de 120 ug
(1)
[63][_]
3 ml
(1)
[64][_]
de 1 ml
(1)
[65][_]
2 cm
(1)
[66][_]
pH = 7,4
(1)
[67][_]
2 mN
(1)
[68][_]
0,005 percent de
(1)
[69][_]
de 94 g
(1)
[70][_]
120 g
(1)
[71][_]
2 percent
(1)
[72][_]
15 cm
(1)
[73][_]
0,015 percent
(1)
[74][_]
de 2,0 mg
(1)
[75][_]
greater than 8 mg
(1)
[76][_]
29 g
(1)
[77][_]
de 0,03 mg
(1)
[78][_]
de 0,01 mg
(1)
[79][_]
0,015 percent de
(1)
[80][_]
de 4 ml
(1)
[81][_]
200 K
(1)
[82][_]
116 K
(1)
[83][_]
92,5 K
(1)
[84][_]
66,2 K
(1)
[85][_]
45 K
(1)
[86][_]
21,5 K
(1)
[87][_]
4 kg
(1)
[88][_]
0,106 mm
(1)
[89][_]
1 h.
(1)
[90][_]
1 l/ml
(1)
[91][_]
10 min
(1)
[92][_]
0,2 m
(1)
[93][_]
2 litres
(1)
[94][_]
0,2 percent
(1)
[95][_]
1 g/ml
(1)
[96][_]
48 h
(1)
[97][_]
0,150 mm
(1)
[98][_]
10 minutes
(1)
[99][_]
7,5 pg/ml
(1)
[100][_]
20 ml
(1)
[101][_]
1,5 pg/ml
(1)
[102][_]
0,9 pg/ml
(1)
[103][_]
60 mm
(1)
[104][_]
15 mm
(1)
[105][_]
40 ng/ml
(1)
[106][_]
100 ng/ml
(1)
[107][_]
20 percent de
(1)
[108][_]
10 ml
(1)
[109][_]
de 5 mm
(1)
[110][_]
22,3 mm
(1)
[111][_]
162,7 mm
(1)
[112][_]
de 83,3 percent de
(1)
[113][_]
5 l
(1)
[114][_]
0,3 ml
(1)
[115][_]
50 Ci
(1)
[116][_]
4 h
(1)
[117][_]
de 53 percent
(1)
[118][_]
de 25,5 percent
(1)
[119][_]
60 min
(1)
[120][_]
2 h
(1)
[121][_]
95 percent
(1)
[122][_]
2Kb
(1)
[123][_]
1 ng
(1)
[124][_]
500 mg
(1)
[125][_]
100 mg
(1)
[126][_]
18 h
(1)
[127][_]
24 h
(1)
[128][_]
1.106 l
(1)
[129][_]
0,8 g
(1)
[130][_]
0,4 g
(1)
[131][_]
4ug
(1)
[132][_]
3,8 g
(1)
[133][_]
Molecule
(51/ 209)
[134][_]
galactose
(26)
[135][_]
N-acetylgalactosamine
(24)
[136][_]
FITC
(18)
[137][_]
sodium chloride
(14)
[138][_]
Tris
(11)
[139][_]
51Cr
(11)
[140][_]
calcium chloride
(9)
[141][_]
magnesium chloride
(9)
[142][_]
cyanogen bromide
(8)
[143][_]
X-100
(7)
[144][_]
sodium dodecylsulfonate
(6)
[145][_]
phosphate
(5)
[146][_]
HCl
(5)
[147][_]
NaCl
(5)
[148][_]
I-K
(4)
[149][_]
DES
(3)
[150][_]
sodium hydrogencarbonate
(3)
[151][_]
lactose
(3)
[152][_]
mitomycin C
(3)
[153][_]
C.B.B.
(2)
[154][_]
carbon dioxide
(2)
[155][_]
indomethacin
(2)
[156][_]
Br
(1)
[157][_]
Glycin
(1)
[158][_]
NP-40
(1)
[159][_]
digitonine
(1)
[160][_]
urea
(1)
[161][_]
acetone
(1)
[162][_]
sodium hydroxide
(1)
[163][_]
water
(1)
[164][_]
acetonitrile
(1)
[165][_]
sodium
(1)
[166][_]
potassium
(1)
[167][_]
nitrate
(1)
[168][_]
nitrogen
(1)
[169][_]
methyl p-hydroxybenzoate
(1)
[170][_]
squalene
(1)
[171][_]
propyleneglycol
(1)
[172][_]
aluminium hydroxide
(1)
[173][_]
isothiocyanate
(1)
[174][_]
hydrogencarbonate
(1)
[175][_]
PC-13
(1)
[176][_]
phenol
(1)
[177][_]
MgCl2
(1)
[178][_]
CaCl2
(1)
[179][_]
Conray
(1)
[180][_]
CH3
(1)
[181][_]
trypan
(1)
[182][_]
3H-thymidine
(1)
[183][_]
acetylgalactosamine
(1)
[184][_]
N-galactosamine
(1)
[185][_]
Gene Or Protein
(24/ 87)
[186][_]
Proteins
(32)
[187][_]
Etre
(19)
[188][_]
TCGF
(11)
[189][_]
H-2k
(3)
[190][_]
CES
(2)
[191][_]
Glycoproteins
(2)
[192][_]
IL-2
(1)
[193][_]
IgD
(1)
[194][_]
PC-1
(1)
[195][_]
PC-3
(1)
[196][_]
MK-2
(1)
[197][_]
NBT
(1)
[198][_]
GCH
(1)
[199][_]
HC1
(1)
[200][_]
Les Protein
(1)
[201][_]
Galactosidase
(1)
[202][_]
Phosphorylase
(1)
[203][_]
Ovalbumin
(1)
[204][_]
Neuraminidase
(1)
[205][_]
CRA
(1)
[206][_]
Flg
(1)
[207][_]
FPR
(1)
[208][_]
Trai
(1)
[209][_]
Est A
(1)
[210][_]
Disease
(6/ 63)
[211][_]
Cancer
(57)
[212][_]
Calcification
(2)
[213][_]
Agent N
(1)
[214][_]
Plasmacytome
(1)
[215][_]
Necrose
(1)
[216][_]
Rupture
(1)
[217][_]
Polymer
(9/ 24)
[218][_]
Sepharose
(12)
[219][_]
Sephadex
(4)
[220][_]
Polysaccharide
(2)
[221][_]
Polyethyleneglycol
(1)
[222][_]
Cellulose
(1)
[223][_]
Dextran
(1)
[224][_]
Agarose
(1)
[225][_]
Methylcellulose
(1)
[226][_]
Heparin
(1)
[227][_]
Organism
(12/ 23)
[228][_]
soja
(7)
[229][_]
Dolichos
(4)
[230][_]
Dolichos biflorus
(2)
[231][_]
Helix pomatia
(2)
[232][_]
virus
(1)
[233][_]
Phaseolus limensis
(1)
[234][_]
Bauhinia purpurea
(1)
[235][_]
laver
(1)
[236][_]
canine
(1)
[237][_]
animal
(1)
[238][_]
Ricinus communis
(1)
[239][_]
Bauhinia
(1)
[240][_]
Generic
(7/ 21)
[241][_]
sugar
(14)
[242][_]
oligosaccharides
(2)
[243][_]
Carbohydrate
(1)
[244][_]
esters
(1)
[245][_]
salt
(1)
[246][_]
saccharide
(1)
[247][_]
lecithin
(1)
[248][_]
Chemical Role
(2/ 5)
[249][_]
adjuvants
(3)
[250][_]
anti-cancer
(2)
[251][_]
Substituent
(1/ 1)
[252][_]
Cresyl
(1)
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Publication
_________________________________________________________________
Number FR2513882A1
Family ID 42996991
Probable Assignee Otsuka Pharma Co Ltd
Publication Year 1983
Title
_________________________________________________________________
EN Title Lymphocytes which combat cancer cells, process for the
preparation thereof, and anti-cancer compositions containing the......
FR Title LYMPHOCYTES LUTTANT CONTRE LES CELLULES CANCEREUSES, PROCEDE
POUR LEUR PRODUCTION ET AGENTS ANTICANCEREUX CONTENANT CES LYMPHOCYTES
OU UN ANTIGENE GLYCO-APPARENTE
Abstract
_________________________________________________________________
Lymphocytes which combat cancer cells, process for the preparation
thereof, and anti-cancer compositions containing the lymphocytes as
active ingredient are described. The lymphocytes which combat cancer
cells act specifically on cancer cells which contain a glyco-related
antigen derived from cancer cells, and destroy the latter.
L'INVENTION CONCERNE DES LYMPHOCYTES LUTTANT CONTRE LES CELLULES
CANCEREUSES, UN PROCEDE POUR LEUR PRODUCTION ET DES AGENTS
ANTICANCEREUX CONTENANT CES LYMPHOCYTES OU UN ANTIGENE
GLYCO-APPARENTE; LES LYMPHOCYTES LUTTANT CONTRE LES CELLULES
CANCEREUSES AGISSENT SPECIFIQUEMENT SUR LES CELLULES CANCEREUSES
CONTENANT UN ANTIGENE GLYCO-APPARENTE DERIVANT DES CELLULES
CANCEREUSES ET LES DETRUISENT.
Description
_________________________________________________________________
La presente invention concerne des lymphocytes luttant contre les
cellules cancereuses, un procede pour leur production et des agents
anticancereux contenant ces lymphocytes ou un antigene glycoapparente.
De facon generale, l'invention concerne des lymphocytes luttant contre
les cellules cancereuses (que l'on appelle ci-apres "cellules
tueuses") et un procede pour leur production. Plus particulierement
elle concerne des cellules tueuses qui agissent de facon specifique
sur les cellules cancereuses ayant un antigene glyco-apparente
derivant des cellules cancereuses (cet antigene est designe ci-apres
par l'abreviation "GRA") et detruisent les cellules cancereuses ainsi
qu'un procede pour produire ces cellules tueuses. De plus, l'inven-
tion concerne un nouvel agent anticancereux contenant les cellules
tueuses ou un GRA comme ingredient actif.
Les cellules provoquant la reponse immunitaire, en particulier les
lymphocytes T qui jouent un role primordial dans la reponse
immunitaire a mediation cellulaire, provoquent le rejet des greffons
du aux antigenes des cellules etrangeres mais n'ont pas d'effet
inhibiteur appreciable vis- -vis des cellules cancereuses ou n'ont
qu'un effet inhibiteur tres limite. Donc, les cellules cancereuses ne
sont pas detruites et se multiplient in vivo pour finalement conduire
a la mort l'hotte atteint d'un cancer.
Cependant, le mecanisme responsable de la reconnaissance des elements
"self" et "not-self" n'est pas totalement elucide et diverses
recherches ont ete effectuees pour apporter des connaissances quant a
la nature de la matiere de base entrant en jeu dans ce systeme. Par
exemple, des marqueurs de surface des cellules sur les cellules de
leucemie de la souris ou des cellules de carcinome embryonnaire
utilisant des lectines, telles que l'agglutinine de
Dolichos biflorus (DBA) et l'agglutinine d'arachide (PNA), comme
decrit dans Biochem. Biophys. Res. Comm. 89 (2), pages 448-455 (1979),
Ibid. 96 (4) pages 1547-1553 (1980), J. Biochem. 89 pages 473-481
(1981) et Cell 18 pages 183-191, septembre 1979.
Cependant, pour autant qu'on le sache actuellement, on n'a pas tente
d'obtenir de nouveaux lymphocytes qui puissent combattre
specifiquement les cellules cancereuses et egalement des agents
anticancereux utilisant la reponse immunitaire des lymphocytes.
A la suite de recherches poussees concernant la reponse immunitaire de
l'este aux cellules cancereuses et son application au traitement du
cancer, la demanderesse a decouvert qu'un antigene specifique des
cellules cancereuses qui n'est pas present dans les cellules normales
differenciees, qui est le GRA,agit comme un immunogene pour l'hote et
a une tres forte immunogenicite qui provoque une reponse immunitaire
specifique des cellules cancereuses.De plus, la demanderesse a
decouvert que,lorsqu'on utilise le GRA pour sensibiliser des
lymphocytes, on peut obtenir des cellules tueuses qui agissent de
facon specifique sur les cellules cancereuses contenant du GRA et que
greater than Si l'on administre les cellules tueuses a l'hte, elles
reconnaissent le GRA et agissent sur les cellules cancereuses
contenant du GRA pour les detruire et presentent donc un excellent
effet dans le traitement et la prevention du cancer.
Selon ses divers modes de realisation, l'invention concerne
- des cellules tueuses;
- un procede pour produire des cellules tueuses; et
- un agent anticancereux contenant des cellules tueuses ou du
GRA comne ingredient actif.
D'autres caracteristiques et avantages de l'invention seront mieux
compris a la lecture de la description qui va suivre et en se referant
aux dessins annexes sur lesquels
- la figure I est une microphotographie de cellules cancereuses
Daudi;
- la figure 2 est une microphotographie illustrant la formation de
plaques de lyse des cellules cancereuses de la figure 1 par le GRA-;
- la figure 3 est une microphotographie de cellules cancereuses
KATO-III;.
- la figure 4 est une microphotographie illustrant la formation de
plaques de lyse des cellules cancereuses de la figure 3 par le
GRA-1-K-T
- la figure 5 est une microphotographie de cellules cancereuses de
BT-i;
- la figure 6 est une microphotographie montrant la formation de
plaques de lyse des cellules cancereuses de la figure 5 par le
GRA-I-K-T;
- la figure 7 est une microphotographie de cellules cancereases
MKN-45;
- la figure 8 est une microphotographie montrant la formation de
plaques de lyse des cellules cancereuses de la figure 7 par le
GRA-1-K-T;
- la figure 9 est une microphotographie de cellules cancereuses MOLT;
- la figure 10 est une microphotographie montrant la formation de
plaques de lyse des cellules cancereuses de la figure 9 par le
GRA-1-K-T;;
- la figure 11 est une microphotographie de BT-1 traite par un melange
de lymphocytes de sang peripherique humain non sensibilises;
- les figures 12 et 13 sont des microphotographies d'un tissu
cancereux de souris cancereuse a laquelle on a administre du
GRA-M-1-K;
--la figure 14 est une microphotographie montrant l'etat du cancer
d'une souris cancereuse d'un groupe auquel on a administre du GRA-H-l;
- la figure 15 est une microphotographie montrant l'etat du cancer
d'une souris cancereuse d'un groupe auquel on n'a pas administre du
GRA-M-1;
- la figure 16 est une microphotographie montrant le tissu cancereux
d'une souris cancereuse d'un groupe auquel on n'a pas administre le
GRA-M-1;
- la figure 17 est une microphotographie du tissu cancereux du groupe
auquel on a administre le GRA-M-1;;
- la figure 18 represente un diagramme d'electrophorese du GRA sur gel
de sodium dodecylsulfonate utilisant la methode CBB de coloration des
proteins;
- les figures 19 a 21 representent les diagrammes d'electrophorese du
GRA sur gel de sodium dodecylsulfonate utilisant la methode PAS de
coloration du sugar;
- la figure 22 illustre schematiquement les resultats du diagramme
d'electrophorase du oeA sur gel de sodium dodecylsulfonate utilisant
la methode GB de coloration des proteins. et
- la figure 23 represente un graphique montrant le taux de croissance
de la tumeur chez des souris C3H/HE sur lesquelles on a transplante
des cellules de rate de souris immune X 5563 et des cellules X 5563.
L'invention va maintenant etre decrite de facon detaillee.
On peut preparer les cellules tueuses de l'invention par exemple selon
un procede dans lequel on utilise du oeA pour sensibiliser des
lymphocytes.
Le GRA que l'on utilise dans le procede ci-dessus peut etre obtenu a
partir de cellules cancereuses contenant du GRA d'hommes ou d'animaux,
par exemple des cellules cancereuses cultivees, des cellules
cancereuses transplantees, des cellules cancereuses spontanees, des
cellules cancereuses induites par des substances chimiques ou des
virus ou des cellules cancereuses derivant de tissus operes, selon le
mode operatoire suivant.
On separe les composants. de la membrane-cellulaire des cellules
cancereuses indiquees ci-dessus et on les traite avec une lectine qui
se combine de facon specifique avec une terminaison galactose ou une
terminaison N-acetylgalactosamine terminale, le GRA se combinant avec
la lectine et pouvant etre facilement separe.
Des exemples appropries de la lectine fixant le galactose comprennent
la lectine d'arachide, la lectine de Ricins communis. et la lectine de
soja (voir J.B.C., 250 8518-8523 (1975); Biochem.
Biophys. Res. Comm., 62, 144 (1975); Z Immunitaetsforch, 138, 423-433
(1969); Br J. Exp. Pathol, 27, 228-236 (1946); Proc.
Nath. Acad. Sci. USA, 75, n 5 2215-2219 (1978); Biochemistry, 13
196-204 (1974); et Carbohydrate Research, 51, 107-118 (1976)).
Des exemples appropries de lectines fixant la N-acdtylgalac- tosamine
comprennent l'agglutinine de Dolichos biflorus, la lectine de "braid
orange", la lectine de Helix pomatia, la lectine de Phaseolus
limensis, la lectine de Bauhinia purpurea et la lectine de soja
(Glycin max).
On peut effectuer la separation des composants des membranes des
cellules cancereuses selon des techniques connues telles qu'une
methode d'homogeneisation et une methode de solubilisation utilisant
un agent dissolvant. Il est plus avantageux d'utiliser une methode
dans laquelle les cellules cancereuses sont homogeneisees dans du
solute sale physiologique ou dans un tampon approprie, une portion
precipitee est recueillie selon une technique telle que la separation
centrifuge e s t dissoute dans du solute sale physiologique ou dans un
tampon par emploi d'un agent dissolvant et la portion surnageante est
separee selon une technique telle que la separation centrifuge.Les
agents dissolvants que l'on peut utiliser comprennent les agents
tensioactifs que l'on sait generalement capables de dissoudre les
membranes cellulaires tels que les agents tensioactifs non ioniques,
par exemple le TRITON X-100 (produit par Wako Pure Chemical
Industries Ltd.), le NP-40 (produit par Schell Co., Ltd), la
digitonine, et l'urea, et les agents tensio-actifs anioniques, par
exemple le sodium dodecylsulfonate (sodium dodecylsulfonate).
A partir des composants de la membrane cellulaire ainsi obtenue, on
peut separer du GRA capable de se combiner avec une lectine selon des
techniques physico-chimiques ou biochimiques habituelles utilisant les
proprietes des lectines. Des exemples de telles techniques comprennent
la chromatographie d'affinite utilisant une colonne de support
contenant une lectine, une methode d' immunoprecipitation utilisant un
anticorps anti-GRA ou similaires, une methode de dialyse, une methode
de filtration sur gel, une methode d'electrophorese, une methode de
precipitation physique utilisant un agent de precipitation des
glycoproteins, par exemple le polyethyleneglycol et I'acetone, et une
de leurs combinaisons.On prefere tout particulierement la
chromatographie d'affinite utilisant une colonne de support contenant
une lectine et la colonne de support peut etre facilement preparee par
immobilisation d'une lectine sur un support insoluble. Cette
immobilisation d'une lectine sur un support insoluble peut etre
effectuee selon des techniques connues classiquement utilisees dans
l'immobilisation des substances biologiques. Parmi ces techniques on
prefere utiliser une methode d'activation d'un polysaccharide par le
cyanogen bromide et une methode d'immobilisation utilisant des esters
N-hydroxysuccimidiques.La methode d'activation d'un polysaccharide par
le cyanogen bromide est une methode dans laquelle on traite un support
insoluble par le cyanogen bromide et on soumet le produit active ainsi
obtenu a une reaction de couplage avec une lectine dans des conditions
moderees pour immobiliser la lectine.Dans le traitement du support
insoluble avec le cyanogen bromide par exemple, on utilise des
composes basiques tels que l'sodium hydroxide et l'sodium
hydrogencarbonate pour ajuster le pH entre 7,5 et 12 et on traite le
support dans un solvant tel que l'water, l'acetonitrile ou un tampon
maintenu a un pH de 7,5 a 12, par exemple un tampon sodium
hydrogencarbonate 0,1 M (pH environ 8,7) et un tampon phosphate 0,01 M
(pH environ 7,7), a la temperature ordinaire pendant environ 1 a 12
minutes. Generalement on prefere que la cyanogen bromide utilisee soit
egale a celle du support insoluble.
On peut utiliser dans l'invention un support insoluble connu
quelconque qui a une faible adsorption non specifique pour toutes les
substances biologiques, a une porosite elevee, contient un groupe
fonctionnel capable d'immobiliser les substances biologiques dans des
conditions moderees et est chimiquement et physiquement suffisamment
stable. Les supports insolubles que l'on. peut utiliser comprennent un
support fait de cellulose, par exemple d'aminoethylcellulose, de
carboxysfethylcellulose, de bromoacetylcellulose, et de
p-anilinocellulose, un support de dextran reticule, par exemple de
Sephadex et de CM-Sephadex (produits de Farmacia Corp.), et un support
d'agarose par exemple le Sepharose 2B, le Sepharose 4B, et le
Sepharose 6B (produits par Farmacia Corp.).
Dans la reaction de couplage du support active par le cyanogen bromide
obtenu ci-dessus avec une lectine, on utilise le support active par le
cyanogen bromide a raison de 30 a 80 fois la quantite de lectine et on
les fait reagir dans un solvant approprie tel qu'une solution aqueuse
a 0,1 mol/l d'sodium (contenant 0,5 mol/l de chlorure de sodium
chloride; pH: 8,4) a une temperature de O a 400C et de preference de 2
a 80C pendant une periode d'environ 10 a 20 heures. On peut ainsi
preparer un support contenant une lectine pour la chromatographie
d'affinite.
Par chromatographie avec le support contenant une lectine preparee
ci-dessus, le GRA desire se combine avec la lectine contenue dans le
support et est retenu dans la colonne. Ensuite on fait passer a
travers la colonne greater than pour effectuer une reaction d'echange,
des substances capables de se combiner avec la lectine ou, sinon, on
fait passer a travers la colonne un separateur d'adsorption (eluant),
par exemple un salt tres concentre, une solution aqueuse de potassium
ou un tampon nitrate pour provoquer une dissociation et obtenir le GRA
desire.
Dans la reaction d'echange des exemples des substances capables de se
combiner avec la lectine lorsque l'on uti-lise un support pour la
chromatographie d'affinite contenant une lectine fixant -le galactose
comprennent celles qui se combinent avec une lectine se combinant avec
une terminaison galactose, par exemple galactose, dissacharides
contenant une terminaison galactose et oligosaccharides contenant une
terminaison galactose, et des exemples des substances capables de se
combiner avec la lectine lorsque l'on utilise pour la chromatographie
d'affinite un support contenant une lectine fixant la
N-acetylgalactosamine comprennent celles qui peuvent se combiner avec
une lectine se combinant avec une termLnaison N-acetylgalactosamine,
par exemple N-acetylgalactosamine, dissacharides contenant une
terminaison N-acetylgalactosamine et oligosaccharides contenant une
terminaison N-acetylgalactosamine.
Le GRA ainsi obtenu contient une glycoprotein contenant une
terminaison galactose et/ou N-acetylgalactosamine, un glycolipide
et/ou un saccharide.
Le GRA ainsi prepare peut etre lyophilise si on le desire et purifie
encore en utilisant des techniques de separation ordinaires.
Par exemple, les preparations de GRA isolees avec une lectine fixant
le galactose peuvent etre soumises 8 une methode de separation
utilisant une lectine se combinant avec la N-acetylgalactosamine et
celles isolees avec une lectine se combinant avec la
N-acetylgalactosamine peuvent etre traitees par une methode de
separation utilisant une lectine fixant le galactose.
Les lymphocytes que l'on utilise ici n'ont pas de limitations
particulieres et on peut utiliser tout lymphocyte de sujets humains ou
d'animaux normaux ou cancereux. Des exemples en comprennent les
lymphocytes provenant du sang peripherique, de la moelle osseuse, des
ganglions lymphatiques, de la rate, des amygdales et du thymus.
On isole ces lymphocytes selon des techniques physiques ou chimiques,
une methode utilisant une membrane superficielle, ou similaires.
On effectue la sensibilisation des lymphocytes avec le GRA par culture
des lymphocytes dans un milieu de culture contenant du GRA pendant une
periode de 1 a 10 jours, de preference de 2 a 7 jours.
Comme milieux de culture utiles pour la sensibilisation des
lymphocytes, on peut utiliser divers milieux nutritifs courants
classiquement utilises pour de telles cultures cellulaires. Des
exemples preferes comprennent le milieu RPMI 1640, le milieu MEM de
Eagle etc., avec addition de serum humain, de serum foetal de veau
(SFV), de serum de veau, de serum de cheval ou similaires. La quantite
de GRA ajoutee au milieu de culture est generalement de I a 1000 ng/ml
et de preference de 1 a 500 ng/ml calcules en sugars par 1 x 106
lymphocytes/ml.
On effectue la culture selon une methode courante par exemple a un pH
d'environ 7,2 et a une temperature d'environ 370C.
Les cellules tueuses de ltinvention telles quelles preparees ci-dessus
sont des lymphocytes essentiellement normaux et ont une activite de
lutte contre les cellules, specifique du GRA. Par exemple le GRA-1-KT,
qui est une des cellules tueuses de l'invention, a des proprietes
communes aux cellules T du sang peripherique humain et presente une
activite de lutte contre les cellules, qui est specifique des cellules
cancereuses contenant du GRA, comme le montre l'exemple decrit
ci-apres.
Des exemples typiques des nouvelles cellules tueuses de l'invention
sont les cellules GRA-1-KT et GRA-M-1 qui sont preparees dans les
exemples decrits ci-apres. Toutes les cellules tueuses selon
l'invention sont disponibles aupres de la Societe demanderesse et leur
depat a 1'ATCC a ete demande.
On peut multiplier a l'infini les cellules tueuses de l'invention dans
les milieux de culture precedemment decrits contenant un facteur de
croissance des cellules T (TCGF, IL-2). Dans ce cas, la culture
selective d'un clone des cellules tueuses peut etre effectuee selon la
methode classique d'ultra-dilution. Ces cellules tueuses peuvent etre
conservees de facon stable pendant des durees prolongees, par exemple
dans l'nitrogen liquide.
Le GRA peut etre utilise isolement comme ingredient actif et de plus
on peut l'utiliser en combinaison avec d'autres agents anti bacteriens
et agents inhibiteurs du cancer. Les agents inhibiteurs du cancer
contenant le GRA de l'invention comme ingredient actif peuvent etre
sous une forme quelconque tant que le GRA est contenu en quantite
fficace. Generalement, on administre l'agent par voie
intraveineuse,sous- cutanee,intradermique ou intramusculaire sous
forme d'une solution, d'une sus pension ou d'une emulsion. De plus, il
peut etre presente sous forme d'un produit sec que l'on peut
transformer en un liquide par addition d'un vehicule approprie avant
l'emploi.Ces agents liquides peuvent contenir un agent de mise en
suspension, par exemple la methylcellulose, un agent emulsifiant, par
exemple la lecithin, des conserva teurs par exemple le methyl
p-hydroxybenzoate, un stabilisant qui n'a pas d'effet indesirable sur
la fonction d'immunisation de l'homme ou des animaux, un tampon et
similaires.
Les vehicules aqueux que l'on peut utiliser comprennent le solu te
sale physiologique, et les vehicules non aqueux que l'on peut employer
comprennent une huile vegetale, par exemple l'huile de sesame, une
huile minerale, par exemple l'huile de paraffine, une huile ani male,
par exemple le squalene, et le propyleneglycol. De plus, pour
ameliorer l'effet immunologique, on peut incorporer des adjuvants
appropries. Les adjuvants que l'on peut utiliser comprennent l'adju-
vant complet de Freund, la saponine pour les animaux et l'aluminium
hydroxide pour l'homme.
L'agent anticancereux de l'invention peut etre administre une seule
fois ou de facon repetee pendant une periode de temps prolongee a un
patient cancereux pour le traitement du cancer ou peut etre admi
nistre a titre preventif a un sujet susceptible d'etre atteint d'un
cancer.
Comme la DL50 (souris, voie intraperitoneale) du GRA est-d'au moins
500 mg/kg, calcule en sugar, l'agent anticancereux de l'invention a
une faible toxicite et peut donc etre administre dans une gamme
posologique etendue. Bien que la concentration du GRA dans l'agent
anticancereux de l'invention n'ait pas de limitations particulieres,
on prefere generalement quelle soit comprise entre 0,001 et 100 pglml
calculee en sugar. En ce qui concerne la posologie de l'agent
anticancereux on prefere generalement administrer l'agent a raison de
O, 001 A 1 000 pg/kg par jour en une seule prise ou en plusieurs
portions, bien que la posologie varie selon l'importance de la maladie
ainsi que l'age et le sexe du patient.
L'agent anticancereux ainsi prepare contenant les cellules tuesses
comme ingredient actif est de preference utilise comme solutions
injectables en combinaison avec des vehicules utilises pour la
preparation de tels medicaments injectes dans le sang. Les vehicules
que l'on utilise ici n'ont pas de limitations particulieres mais on
prefere les vehicules dont la tonicite est egale a celle du sang. En
particulier, on prefere le solute sale physiologique. Pour preparer
l'agent on prefere laver suffisamment les cellules tueuses avec du
solute sale physiologique ou similaires pour eliminer le milieu de
culture precite puis les faire flotter dans un vehicule.
La concentration des cellules tueuses dans l'agent n'a pas de
limitations particulieres, mais elle est de preference de 105 a 109
/ml. Lorsqu'on administre les cellules tueuses par voie intraperi- 8
toneale a la dose de 10 par souris, on n'observe pas de toxicite.
Bien que la posologie de l'agent anticancereux de l'invention varie
selon le degre de la maladie, ainsi que l'age et le sexe du patient,
on prefere generalement administrer l'agent a raison de 105 a 1012
cellules/kg par jour en une seule portion ou en prises divisees.
L'exemple, les exemples de reference, les exemples experimentaux et
les exemples comparatifs ci-apres illustrent l'invention de facon plus
detaillees sans la limiter.
EXEMPLE DE REFERENCE I
Localisation du GRA (1) - A. Preparation de lectine marquee a
l'isothiocyanate de fluisothiocyanate resceine (FITC) (PNA-FITC).
On dissout 10 mg de lectine d'arachide (PNA, produit par Ey Co.) dans
2 ml de tampon phosphate 0,01 M contenant 0,85 percent de sodium
chloride (pH = 7,2). Dans I ml de tampon hydrogencarbonate 0,5 M (pH
9,0) on dissout 2 mg de FITC (produit par Sigma Laboratories Inc.) et
on ajoute 0,5 ml de la solution obtenue au tampon contenant la PNA
preparee ci-dessus. On agite ensuite le melange a la temperature
ordinaire pendant deux heures puis on separe sur Sephadex G25 (10 mm x
300 mm, produit par Farmacia Corp.). On recueille le pic initial.
Rapport FITC/PNA = 1,0.
(1) - B.Preparation de lectine marquee par le FITC (DBA-FITC).
De la meme maniere qu'en (1)-A ci-dessus, on obtient le DBA-FITC en
utilisant le DBA fabrique par la Societe EY Co., rapport
FITC/DBA = 0,9.
(1) - C.Agglutinine de soja-FITC (FITC-SBA). Fabriquee par la Societe
EV Co. rapport FITC/SBA = 1,4.
(2) Localisation du GRA dans diverses cellules cancereuses.
(a) On lave trois fois les cellules cancereuses humaines cultivees (1
x 106) avec du tampon Tris-acide chlorhydrique 0,05 M contenant 0,85
percent de sodium chloride (pH 7,2), par centrifugation, puis on
ajoute 100 l de PNA-FITC, de DBA-FITC ou de SBA-FITC (200Zg/ml)
prepare en (1). On laisse le melange obtenu reposer a la temperature
ordinaire pendant 30 minutes pour provoquer la reaction. Apres
achevement de la reaction, on lave trois fois le melange reactionnel
avec du tampon phosphate 0,01 M contenant 0,85 percent de sodium
chloride (pH = 7,2), puis on place les cellules sur une lame de verre
et on les examine au microscope a fluorescence.
Les resultats figurent dans le tableau 1. Les cellules cancereuses
utilisees sont connues et ont ete fournies par First Pathology
Laboratories, Medical Department of Niigata University.
TABLEAU 1
Taux de positivite du GRA (percent)
Cellules cancereuses A DBA SBA
Raji (Lymphome de Burkitt) 98,3 1,4
Dauji (Lymphome de Burkitt) 93,1 5,2
BT-I (Lymphome de Burkitt) 50,1 0
P-12 (Lymphome a cellules T) 44,3 6,7
MOLT (Leucemie a cellules T) 0,6 4,8
Fujimaki (Lymphome a cellules B) 19,1 5,3
Oda (Myelome a IgD) 0,6 10,0
QG-56 (Cancer du poumon squameux) 70,4 2,0
PC-1 (Cancer du poumon, squameux) 78,4 0,4
PC-3 (Cancer du poumon, adenocarcinome) 77,1 1 0 0
QG-90 (Cancer du poumon, a petites cellules) 68,0 0
PC-13 (Cancer du poumon, a grandes cellules) 17,0 O MK-2 (Cancer de
l'estomac, mauvaise differenciation) 63,7 0 greater than 1
KATO-III (Cancer de l'estomac, en chevaliere) 57,3 0
MKN-45 (Cancer de l'estomac, mauvaise differentiation) 1,0 40,3
MKN-1 (Cancer de l'estomac, adenocarcinome squamaux) 4,6 0,4
MKN-28 (Cancer de l'estomac) 0,4 0,1
MKN-74 (Cancer de l'estomac) 0,5 0 MGH-U1 (Cancer de la vessie) 37,4 O
KU-2 (Cancer de la vessie) 4,5 21,4
T-24 (Cancer de la vessie) 14,6 0
NBT-2 (Cancer de la vessie) 13,1 1,0
NRC-12 (Cancer du rein) 23,9 0
KU-1 (Cancer du Rein) 3,3 0,6
Kuramochi (Cancer de l'ovaire) 80,0 O
NB-I (neuroblastome) 50,9 1,7
YT-nu (neurobalstome) 3,6 0,5
TGW-nu-l (neuroblastome) 4,1 0
TGW-nu-11 (neuroblastome) 2,0 1,0
GOTO (neuroblastome) 0,5 0
ITO (nephroblastome) 96,9 12,3
NEC-8 (nephroblastome) 44,6 0
SCH (choriocarcinome, estomac) 14,6 3,1
GCH (choriocarcinome, uterus) 5,4 0
YN-1 (rhabdomyosarcome) 5,7 1,7
Souris X5563 (plasmacytome) 92,0 0 90,6
Souris @@134 (hepatome) 18,6 0 6,4 (b) On fait passer des tissus
malins de patients cancereux a travers un tamis en acier inoxydable (Q
104 mm) pour obtenir une suspension de cellules simples. Apres lavage
deux fois avec le tampon tris, HCl 0,01H (pH 7,4) contenant CaC12 2mM,
MgC12 2mM et Nage 2 0,85 percent, on remet en suspension 5.105
cellules dans 100 l du tampon.
On ajoute a la suspension de cellules 100 l de FITC-PNA ou de
FITC-DBA (200 g/ml) et on fait incuber le melange a la temperature
ambiante pendant 20 min. Apres lavage trois fois par le BPS froid, on
observe les cellules au microscope a fluorescence.
Les resultats obtenus sont indiques dans le tableau 2 ci-apres.
Les tissus malins de patients cancereux ont ete obtenus a la Kansai
Medical University.
TABLEAU 2 n0 Tissu de patient cancereux GRA
PNA DBA 1 cancer de l'estomac + + 2 cancer de l'estomac + + 3 cancer
de l'estomac 4 cancer de l'estomac + 5 cancer de l'estomac + + 6
cancer de l'estomac + 7 cancer du sein + 8 cancer du sein + 9 cancer
du sein + - + 10 cancer du sein + + 11 cancer du colon + + 12 cancer
du colon - + 13 cancer de l'oesophage + 14 hepatome - +
Remarques: le symbole "+" signifie que le GRA est exprime sur la sur
face de la cellule, le symbole "-" indique que le GRA n'est pas
exprime sur la surface de la cellule.
EXEMPLE DE REFERENCE 2
Preparation de GRA (I)-A. Preparation de lectine immobilisee
(PNA-Sepharose)
On lave fond 3g de Sepharose 4B (produit par Farmacia Corp.) active
par le cyanogen bromide avec de l'hydrochloric acid lmM et on les met
en suspension dans 200 ml d'sodium hydrogencarbonate 0,1 M (pH = 8,5).
On ajoute ensuite 5 ml de tampon phosphate 0,01 M (pH = 8,5) contenant
20 mg de PNA et on fait reagir a 250C pendant deux heures en agitant
de temps en temps pour preparer du PNA-Sepharose.
(1)-B On obtient le DBA-Sepharose de la meme maniere qu'en (1)-A
ci-dessus greater than sauf qu'on utilise le DBA ou lieu du PNA.
(2) Preparation de GRA
(a) On lave trois fois avec du solute sale physiologique des cellules
(1,3 x 108) BT-I (lymphome de Burkitt) et on ajoute 30 ml de tampon
Tris-acide chlorhydrique 0,01 M (pH 7,4) contenant 2X de
TRITON X-lOO (produit par Wako Pure Chemical Industries Ltd), 0,85
percent de sodium chloride 2 mM en calcium chloride et 2 mM en
magnesium chloride. On agite le melange a 40C pendant 15 minutes puis
on le soumet a une separation par ultra-centrifugation a 100 000 x g.
Sur les 28 ml de liquide surnageant ainsi obtenus, on en fait passer
14 ml a travers une colonne (diametre 0,5 cm, longueur 1 cm) pour
chromatographie d'affinite, garnie de perles de PNAagarose (produit
par Maruzen Co.Ltd) que l'on a equilibree avec du tampon Tris-acide
chlorhydrique (pH 7,4) contenant 0,1X de TRITON X100, 0,85 percent de
sodium chloride, 2 mM en calcium chloride et 2 mM en magnesium
chloride. Apres lavage avec le meme tampon que ci-dessus, on elue avec
du tampon Tris-acide chlorhydrique 0,01 M (pH 7,4), 0,1 M en lactose,
a 0,85 Z en sodium chloride, 2 mM en calcium chloride, 2 mM en
magnesium chloride et a 0,1 Z de TRITON X-100.
On dialyse la portion ainsi eluee avec du tampon Tris-acide
chlorhydrique 0,01 M contenant 0,85X de sodium chloride, 2 mM en
magnesium chloride et 2 mM en calcium chloride pendant 48 heures pour
obtenir 17 ml de solution de GRA. On soumet cette solution de GRA a
une determination de la proteins et de la sugars respectivement selon
la methode de Folin-Lowry et la methode au phenol-acide sulfurique
pour obtenir respectivement les valeurs de 644 pg et de 120 ug. On
appelle ci-apres ce produit "GRA-1".
(b) On lave trois fois avec du solute sale physiologique des cellules
de tumeur mammaire de la souris C3H/He(MXT, 1.1010) et on ajoute 30 ml
de tampon Tris-acide chlorhydrique 0,01 M (pH 7,4) contenant 2 Z de
TRITON X-100, 0,85X de sodium chloride, 2 mM en calcium chloride et 2
mM en magnesium chloride. On agite le melange a 4 C pendant 30
minutes. Ensuite on soumet le melange a une separation par
ultra--centrifugation a 100 000 x g pendant 2 heures et on dialyse le
liquide surnageant pendant une nuit avec du tampon Tris HC1 0,1 M (pH
7,4) contenant 0,85 percent de sodium chloride, 2 mM en calcium
chloride et 2 mM en magnesium chloride.On concentre le liquide ainsi
dialyse a 3 ml et on en fait passer une portion de 1 ml a travers une
colonne (diametre 0,5 cm, longueur 2 cm) de chromatographie d'affinite
garnie du meme PNA-Sepharose que celui utilise ci-dessus que l'on a
equilibre avec du tampon Tris-acide chlorhydrique (pH = 7,4) contenant
0,005 Z de TRITON X-lOO, 0,85 percent de sodium chloride, 2 mM en
calcium chloride et 2 mN en magnesium chloride.
Apres apres avoir lave a fond avec le meme tampon que celui utilise
cidessus, on elue avec du tampon Tris-acide chlorhydrique 0,01 M (pH
7,4), 0,1 M en lactose, a 0,85 X de sodium chloride, 2 mM en calcium
chloride, 2 mM en magnesium chloride et a 0,005 percent de
TRITON X-100 et on dialyse la portion ainsi eluee pendant 48 heures
avec du tampon Tris-acide chlorhydrique 0,01 M (pH 7,4) contenant 0,85
Z de sodium chloride, 2 mM en calcium chloride et 2 mM en magnesium
chloride pour obtenir 2 ml d'une solution de GRA. On determine la
proteins et la sugar contenues dans cette solution de GRA et on
obtient respectivement les valeurs de 156 Ug et de 94 g. On appelle
ci-apres ce compose "GRA-M-I".
(c) On homogeneise environ 120 g (poids humide) de KATO-III dans 100
ml de PBS au moyen d'un melangeur Waring. Apres centrifugation a 100
000 g pendant 1 h, on dissout la pastille dans 100 ml de
Triton X-100 9 2 percent dans le tampon Tris,HCl O,OlM (pH 7,6)
contenant
NaCl 0,15M. On recueille le liquide surnageant par centrifugation a
100 000 g pendant 1 h et on l'applique sur une colonne de
PNA-Sepharose 4B (0,8 x 15 cm) equilibree avec le Triton X-100 A 0,015
percent dans le tampon tris,HCl 0,OlM (pH 7,6) contenant NaCl 0,15 M.
Apres lavage avec 50 ml du tampon, on elue le GRA avec le tampon
contenant du lactose O,lM. Le GRA elue est dialyse contre NaCl a 0,85
percent, concentre par Sephadex de la Societe Pharmacia Co. et
conserve a -200C avant l'emploi.
On trouve que les protein et de sugars determinees de la meme maniere
qu'en (a) ci-dessus sont de 2,0 mg et 0 greater than 8 mg
respectivement. Ce produit est denomme ci-apres"GRA-2".
(d) On obtient les echantillons de GRA suivants de la meme maniere
qu'en (c) ci-dessus.
TABLEAU 3
Echantillon Matiere GRA de GRA Source Quantite (g) Teneur en Teneur en
proteins ~~~~~~ ~~~~~~~~~~~ proteins (mg) sugars(mg)
GRA-3 BT-1 33 0,5 0,09
GRA-4 Tumeur 5 0,24 0, 5 mammaire
(excisee)
GRA-5 QG-56 24 0,6 0,38
GRA-6 QG-90 26 1,0 0,54
GRA-7 Raji 29 0,78 0,45
GRA-M-2 MMT 200 11,3 28,4
GRA-M-3 LLC 14,4 0,06 0,07
GRA-M-4 MH-134 85 0,65 0,35
GRA-M-5 X-5563 25 0,56 0,23 (e) En operant de la meme maniere que dans
(c) ci-dessus, sauf que l'on utilise du MKN-45 (environ 29 g) au lieu
de Kato-III et du DBA-Sepharose obtenu en (1)-B ci-dessus au lieu de
PNA-Sepharose 4B et qu'on effectue l'elution avec la
N-acetylgalactosamine, on obtient une preparation de GRA ayant une
teneur en proteins de 0,03 mg et une teneur en sugars de 0,01 mg.
Cette preparation est appelee ci-apres "GRA-8".
(f) On charge le GRA-3 prepare en (d) ci-dessus (5 ml) dans une
colonne de DBA-Sepharose et on elue par le tampon tris-HCl (a 0,015
percent de Triton X-100, 2 mM en MgCl2 et CaCl2, a 0,85 percent de
NaCl) pour obtenir des fractions n 1 a 15 de 4 ml. Les fractions n 1 a
3 sont denommees "GRA-3-A" et les fractions n 4 a 12 "GRA-3-B". On
elue ensuite la colonne avec le meme tampon,mais contenant de la
N-acetylgalactosamine 0,1M pour obtenir des fractions denommees
"GRA-3-C".
(g) Electrophorese sur gel de sodium dodecylsulfonate
On soumet chacune des preparations de GRA obtenues par les modes
operatoires ci-dessus a ltelectrophorese, selon la methode decrite par
Fairbanks et coll dans Biochemistry, volume 10, page 2606, 1971.
Les resultats obtenus sont indiques dans les figures 18 a 22.
Dans les figures 18 et 19, les chiffres 1 a 5 ont les significations
suivantes
1--- etalon; 2--- GRA-M-3; 3--- GRA-7; 4--- GRA-1; et
5 --- GRA-2.
Dans la figure 20, les chiffres 1 a 4 ont les significations suivantes
1 --- etalon; 2 --- GRA-M-2; 3 --- GRA-6; 4 --- GRA-5.
Dans la figure 21, les chiffres 1 a 3 ont les significations suivantes
1 --- GRA-M-4; 2 --- GRA-M-5; 3 --- etalon.
Dans la figure 22, les chiffres 1 a 4 ont les significations
suivantes:
1 --- GRA-3; 2 --- GRA-3-A; 3 --- GRA-3-B; 4 --- GRA-3-C.
La figure 18 represente l'etat du GRA soumis a a reaction de
coloration des proteins, selon la methode C.B.B. (Fairbanks et coll.:
Biochemistry, volume 10, page 2606, 1971).
Les figures 19 a 21 representent l'etat du GRA soumis a la reaction de
coloration des sugars, selon la methode PAS (R.M. Zacharius et col.
Anal. 13iochem. volume 30, page 148 (1962)).
La figure 22 represente schematiquement les resultats de coloration
selon la methode C.B.B. decrite ci-dessus.
On utilise comme etalons les substances enumerees ci-dessous fournies
par la Societe Biorad Lab., Califormie, Etats-Unis d'Amdrique.
200 K dalton; myosine 116 K dalton; ss-galactosidase
92,5 K dalton; phosphorylase
66,2 K dalton; BSA
45 K dalton; ovalbumin
21,5 K dalton; inhibiteur de trypsine du soja.
EXEMPLE DE REFERENCE 3
Preparation du facteur de croissance des cellules T (TCGF) (a) On
excise la rate (4 kg) d'un singe japonais (fourni par Japan
Plymates Co. Ltd) et on la lave deux fois avec du milieu de culture
RPMI-1640 (produit par Flow Laboratory Co. Ltd). On filtre les
cellules avec du Mesch (produit par Millipoee Inc. 0,106 mm) et on
soumet a une methode de centrifugation par densite (densite: 1,076)
pour obtenir deux litres d'un produit a 2 x 109 lymphocytes/ml. On
lave trois fois les lymphocytes ainsi obtenus avec un milieu de
culture RPMI-1640 et on ajuste le nombre des lymphocytes a 5 x 107/ml
avec le meme milieu que celui utilise ci-dessus contenant 10 percent
de SVF.
On laisse reposer dans un appareil de fermentation a atmosphere de
carbon dioxide a 37 C pendant 1 h. On recueille les lymphocytes
surnageants et on ajuste le nombre de lymphocytes a 1 x 106/ml en
utilisant le meme milieu de culture que ci-dessus contenant 1 percent
de SVF. Ensuite, on ajoute 1 l/ml d'indomethacin (produit de
Sigma Laboratories Inc.) et 0,2 percent de PHA-P (produit de Difco
Co.) et on cultive dans un appareil de fermentation a atmosphere de
carbon dioxide a 370C pendant 48 heures. On effectue une separation
centrifuge (3 000 tr/min) pendant 10 min et on recueille le liquide
surnageant puis on le sterilise par filtration avec un filtre
Millipore (produit par Millipore Inc. 0,2 m) pour obtenir 2 litres de
TCGF.
(b) La source de TCGF est le liquide surnageant de lymphocytes mixtes
de sang peripherique de 10 donneurs en bonne sante. On met en suspens
ion dans un milieu RPMI 1640 contenant 1 percent de FCS des
lymphocytes (1,5.106 cellules/ml) n'adherant pas prepares a partir de
Lymphocytes C.F. (Conray. Ficol, Societe Japan Immunoresearch Co.)
separes par adsorption sur une surface de matiere plastique a 370C
pendant 1 h, et on fait incuber avec du PHA-P A 0,2 percent, de
l'indomethacin (1 g/ml) et une ligne de cellules B 5 humaines (BT-1)
(1,5.10 cellules/ml) pretraitees par la mitomycin C (50)1g/mi). Apres
48 h, on recolte le liquide surnageant de la culture et on l'utilise
comme source de TCGF. less than H. Inoue et col.,
Scand. J. Immunol. 12, pages 149-154 (1980)).
EXEMPLE DE REFERENCE 4
Preparation de lymphocytes (1) Lymphocytes du sang peripherique
humain.
On soumet a une separation centrifuge avec du Ficol-Pack (produit par
Farmacia Japan Co Ltd.) 50 ml de sang heparin provenant d'un adulte
sain ou de divers patients cancereux, pour obtenir
5.107 lymphocytes de sang peripherique.
(2) Lymphocytes de rate de souris
On excise la rate d'une souris C3H/He (male 6 semaines) et on la lave
deux fois avec du milieu de culture RPMI-1640. On fragmente la rate
avec une aiguille a injection et on la fait passer a travers un tamis
d'acier inxoydable (0,150 mm d'ouverture de maille) pour eliminer les
gros morceaux. On lave deux fois les cellules ainsi filtrees avec le
meme milieu de culture que celui utilise ci-dessus et on effectue une
separation centrifuge a 1200 tr/min pendant 10 minutes pour obtenir 4
x 107 lymphocytes de rate.
EXEMPLE 1
On dilue a 1 000 fois le volume d'origine du GRA-1 (proteins: 40Pg/ml;
sugars: 7,5 pg/ml) obtenu dans l'exemple de reference 2 ((2)(a)) avec
du milieu de culture RPMI-1640 contenant 15 percent de SFV pour
preparer un milieu de culture de sensibilisation.
On ajoute des lymphocytes de sang peripherique humain (5 x 106 ml/5
ml) obtenus dans l'exemple de reference 4 (1) a 5 ml du milieu de
culture de sensibilisation prepare ci-dessus, on place dans une bote
de laboratoire et on cultive a 370C pendant deux jours. On cultive de
plus avec du milieu de culture RPMI-1640 contenant 20 Z de TCGF et 15
percent de SFV, comme obtenu dans l'exemple de reference 3, pendant
encore 5 jours pour obtenir 20 ml d'une solution de cellules tueuses
contenant 1 x 106 cellules tueuses/ml. On appelle ces cellules
"GRA-1-K-T".
EXEMPLE 2
On ajuste a la concentration de 5 x 106/ml avec du milieu de culture
RPMI-1640 contenant 15 percent de SFV, les lymphocytes de rate de
souris obtenus dans l'exemple de reference 4(2). On ajoute ensuite du
GRA-M-1 obtenu dans l'exemple de reference 2 ((2)(b)) pour que les
teneurs finales de proteins et de sugars soient respectivement de
1,5 pg/ml et 0,9 pg/ml. On cultive une portion de S ml du melange
obtenu dans une boite de laboratoire (60 mm x 15 mm, produite par
Falcon Co.) a 370C pendant deux jours. On observe la formation de
clones. On cultive encore cette portion avec du milieu de culture
RPMI-1640 contenant 15 Z de SFV et 20 percent en volume de TCGF
(produit par Japan Immuno Research Laboratories Co.Ltd) pendant encore
4 jours pour obtenir 50 ml d'une solution de cellules tueuses
contenant 1 x 106 cellules tueuses/ml. On appelle ci-apres ces
cellules "GRA-M-1-K-T".
EXEMPLE 3
On fait incuber des lymphocytes (5.106) de sang peripherique d'un
donneur sain dans le milieu RPMI-1640 contenant 50 ng/ml (teneur en
protein) de GRA-2 et 15 percent de FCS a 37 C. Au deuxieme jour, on
ajoute le TCGF humain decrit ci-dessus au milieu jusqu'a ce que la
concentration atteigne 20 percent et on continue l'incubation pendant
encore 3 jours pour obtenir des cellules tueuses. On appelle ci-apres
ces cellules "GRA-2-K-T".
EXEMPLE 4
On prepare des preparation de cellules tueuses GRA-8-K-T,
GRA-3-A-K-T et GRA-3-C-K-T de la meme maniere qu'a exemple 1 en
utilisant du GRA-8, du GRA-3-A et du GRA-3-C, respectivement (teneur
en protein: 50 ng/ml) et le TCGF obtenu a l'exemple de reference
3-(b).
EXEMPLE 5
On implante des cellules X5563 (106) de la meme souche sur des souris
C3H/HE (femelle de 8 semaines) par voie intradermique et, apres 7
jours, on excise la tumeur par voie chirurgicale. Apres encore 7
jours, on inocule des cellules X5563 (105) de la meme souche et on
appelle souris immunes les souris resistantes a l'inoculation.
On prepare, selon la methode courante, les cellules de rate des souris
immunes et de souris C3H/He normales.
On sensibilise chaque lot de cellules de rate (5.10 6/godet) avec 40
ng/ml (teneur en proteins) de GRA-M-5 dans le milieu RP!D:-l640
contenant 15 percent de FCS pendant 5 jours pour obtenir des cellules
tueuses.
La preparation de cellules tueuses obtenues a partir de cellules
normales de rate est denommee ci-apres"GRA-M-5-K-T-1" et celle obtenue
a partir de cellules immunes de rate est denommee ci-apres
"GRA-M-5-K-T-2".
EXEMPLE 6
On fait incuber pendant 2 jours a 370C des lymphocytes de sang
peripherique humain (5.106) dans 5 ml de milieu RPMI-1640 contenant 50
ng/ml (teneur en protein) de GRA-1. Au troisieme jour, on tranfere les
lymphocytes sur du milieu RPMI-1640 contenant 10 percent de serum du
donneur des lymphocytes et O a 100 ng/ml (teneur en protein) de GRA-1
et on continue l'incubation pendant encore 5 jouispour obtenir des
preparations de cellules tueuses representees dans le tableau 4
ci-apres.
TABLEAU 4
Concentration en GRA (ng/ml) ler jour 3 e jour Cellules tueuses
50 0 GRA-1-K-T-1
50 1,6 GRA-1-K-T-2
50 3,2 GRA-1-K-T-3
50 6 GRA-1-K-T-4
50 12,5 GRA-1-K-T-5
50 25 GRA-1-K-T-6
50 50 GRA-1-K-T-7
50 100 GRA-1-X-T-8
EXEMPLE 7 (a) On sensibilise des lymphocytes de sang peripherique
(PBL) de divers patients cancereux apres operation avec du GRA-3, pour
obtenir ces preparations de cellules tueuses. On fait incuber les
PBL (5.106) des patients dans le milieu RPMI-1640 contenant 50 ng/ml
(teneur en protein) de GRA-3 pendant 2 jours- et ensuite dans le
milieu RPMI-1640 contenant 20 percent de TCGF et 15 percent de FCS
pendant encore 5 jours pour obtenir les cellules tueuses indiquees
dans le tableau 5 ci-apres.
TABLEAU 5
Lymphocytes de sang peripherique.
Cancer P-GRA D-GRA Jours Cellules tueuses apres ltope- ration
Cancer de l'estomac + + 14 GRA-3-K-T-1
XI + + 35 GRA-3-K-T-2
Cancer du sein + - 21 GRA-3-K-T-3
+ + - 7 GRA-3-K-T-4
+ - 35 GRA-3-K-T-5
Cancer de l'estomac + - 21 GRA-3-K-T-6
Dans le tableau 5, P-GRA et D-GRA indiquent la localisation du
GRA exprimee sur le tissu malin (excise apres l'operation) des
patients cancereux dont on a recueilli les PBL greater than determine
de La meme maniere que dans l'exemple de reference 1, 2-(b). P-GRA et
D-GRA sont les resultats obtenus en utilisant du FITC-PNA et du
FITC-DBA respectivement. Les jours apres l'operation indiquent le
temps apres l'ope- ration au bout duquel on recteille les PBL.
(b) On fait incuber des PBL (5.106) recueillis sur des patientes
atteintes de cancer du sein apres 21 jours a partir de l'operation sur
du milieu RPMI-1640 contenant 50 ng/ml (teneur -en protein) de
GRA-3 et 10 percent de serum du patient pendant 7 jour pour
sensibiliser les
PBL et obtenir une preparation de cellules tueuses. On appelle ciapres
ces cellules "GRA-3-K-T-7".
EXEMPLE 8
On dissout du GRA-1-K-T (108) obtenu dans exemple 1 dans 10 ml de
solute sale physiologique pour preparer une solution injectable.
EXEMPLE 9 (1) On dilue le GRA-M-1 obtenu dans l'exemple de reference
2((2-)(b)) avec du solute sale physiologique pour que les teneurs en
sugars et en proteins soient respectivement de 1,0 Xuglml et 1,6
lug/ml pour preparer un agent anticancereux numero 1. (2) On preleve
sterilement des cubes de 5 mm d'un bloc tumoral de cancer spontane de
la mamelle de souris C3H/He et on les transplante chacun dans la peau
du dos de 10 souris C3H/He de la meme souche (7 semaines, malles).
Sept jours apres la transplantation, on confirme la fixation et la
multiplication de la tumeur.A cinq des souris on administre par voie
sous-cutanee l'agent anticancereux numero 1 prepare en (L) ci-dessus a
raison de 300 tu 1 par jour a des intervalles de deux jours. On
utilise les cinq souris restantes comme temoins non traite.
Dix jours apres la premiere administration, on excise la tumeur par
operation et on mesure le poids moyen. On effectue en meme temps un
examen histopathologique.
Volume des tumeurs:
Groupe administre 22,3 mm (figure 14)
Temoins 162,7 mm (figure 15)
Ceci indique une reduction de 83,3 percent de la tumeur.
Examen histopathologique
Dans le groupe temoin (figure 16) des corps cancereux en nid d'oiseaux
se sont formes, la nature du tissu est semblable a celle du cancer
medullaire-canaliculaire et la multiplication des cellules tumorales
est observee dans tout le tissu. D'autre part, dans le groupe ayant
recu l'agent anticancereux (figure 17), les cellules cancereuses ont
provoque une necrose avec liquefaction au niveau des sites de
formation des cellules cancereuses et il s'est produit une
calcification et une fibrose ne laissant qu'une quantite tres limitee
de cellules cancereuses. On a donc observe les proprietes
antitumorales de l'agent anticancereux de l'invention.
EXEMPLE D'ESSAI 1
On a place sur une microbolte (produite par Falcon Corp) Ijilde
GRA-I-K-T obtenu dans l'exemple I et on a laisse reposer a la
temperature du laboratoire pendant 15 minutes. Ensuite on a ajoute 4
p1 de SFV (produit par Falcon Corp.) et on a laisse le melange reposer
a la temperature du laboratoire pendant 30 minutes. On a ajoute des
globules rouges de mouton traites par la Neuraminidase (GRMN) ajustes
a 1 x 109/ml et 5 l de tampon phosphate 0,01 M (pH 7,2) A 0,85 Z de
sodium chloride et on a soumis la boite a une separation par
centrifugation a la vitesse de 600 tr/min pendant 5 minutes. La boite
a ete ensuite retournee et on a elimine les GRM n'ayant pas reagi.On a
ajoute une solution colorante (Brillant Cresyl
Blue, produit par Merck et Co.) pour colorer les lymphocytes et on a
examine le pourcentage de lymphocytes formant des rosettes. On a
constate qu'au moins 98 Z des lymphocytes formaient des rosettes
(cellules T).
EXEMPLE D'ESSAI 2
Activite specifique des cellules tueuses de cellules cancereuses (a)
Parmi les cellules indiquees dans le tableau 1 on a utilise les cinq
souches cellulaires suivantes ayant des taux differents de posivite du
GRA comme cellules cancereuses humaines cibles.
Cellules cancereuses cibles:
NO 1 BT-I Lymphome de Burkitt
NO 2 Daudi Lymphome de Burkitt
N 3 KATO-III Cancer de l'estomac
N 4 MKN-45 Cancer de l'estomac
N 5 MOLT Leucemie a cellules T
Sur une microplaque (produite par Falcon Corp.) on a applique 5 x 104
cellules cancereuses cibles par godet par centrifugation a la vitesse
de 800 tr/min pendant 5 minutes. On a ensuite ajoute avec precaution 4
x 103 cellules GRA-I-K-T obtenues dans l'exemple I par godet et on a
incube pendant une heure.
L'activite des cellules tueuses a ete determinee selon le degre de
formation des plaques et notee comme suit
++ activite importante
+ activite t legere activite
- pas d'activite
Dans un groupe temoin on a utilise des lymphocytes de sang
peripherique humain non sensibilises que llon a prepares comme indique
dans exemple 1 si ce n'est que lton n'a pas employe de GRA. Les
resultats figurent dans le tableau 6.
I1 ressort de l'examen du tableau 6 que les cellules T tueuses
produites selon le procede de l'invention ont une forte activite
cytotoxique specifique du GRA.
TABLEAU 6
Cellules Taux de posi- Determination de la cancereuses tivite du GRA
formatio de plaques cibles (percent)
Groupe
GRA-1-K-T Daudi (Fig. 1) 93,1 ++ (Fig.2)
KATO-III (Fig.3) 57,3 + (Fig.4)
BT-I (Fig.5) 50,1 ++ (Fig.6)
MKN-45 (Fig.7) l,O + (Fig.8)
MOLT (Fig.9) 0,6 - (Fig.10)
Groupe BT-I 50,1 - (Fig temoin (b) On melange les memes cellules
cancereuses cibles qu'utilisees en (a) ci-dessus (3,2 x 106) avec 8 x
105 cellules GRA-1-K-T (rapport des cellules 5/1) et on cultive le
melange cellulaire obtenu (nombre total des cellules; 4 x 106) avec du
milieu RPMI-1640 contenant 15 percent de SFV.Apres une heure, on
compte le nombre des cellules restantes et on calcule la cytotoxicite
a partir de l'equation suivante
Nombre des cellules Cytotoxicite (percent) = (1 - (#################)
x 100) avant culture (4 x 10)
Les resultats figurent dans le tableau 7.
TABLEAU 7
Nombre de cellules
Cellules Avant culture Apres-culture Cytotoxicite cibles (percent)
6 6
Daudi 4 x 10 2,9 x 10 28
KATO-III 4 x 106 3,7 x 106 7,5
BT-1 4 x 106 3,2 x 106 20
MKN-45 4 x 106 3,9 x 106. 2,5
MOLT 4 x 10 4,2 x 106 - 5 (c) On repete le mode operatoire de (b)
ci-dessus si ce n1 est que le rapport de melange des cellules
GRA-I-K-T aux cellules cancereuses cibles est de 5/3. Les resultats
figurent dans le tableau 8.
TABLEAU 8
Nombre de cellules
Cellules Cytotoxicite cibles Avant culture Apres culture (percent)
Daudi 4 x 106 3,6 x 105 91
KATO-III 4 x 10 3,6 x 106 24
BT-I 4 x 10 1,4 x 10 65
MKN-45 4 x 106 3,7 x 106 7,2
MOLT 4 x 106 4,1 x 106 -3
Dans l'essai ci-dessus, on observe que le GRA-l-K-T presente une forte
activite de fixation sur les cellules cibles Deudi, KATO-III et BT-1,
mais une faible activite de fixation seulement sur les cellules cibles
MKN-45 et MOLT.
EXEMPLE D'ESSAI 3
A des souris CH3/He atteintes de cancer mammaire spontane, on
administre par voie sous-cutanee les cellules GRA-M-1-K-T obtenues dam
l'exemple 2 a la dose de 3 x 106 ml/0,3 ml par souris trois fois par
semaine, tous les deux jours. Apres dix jours, on preleve le foyer et
on l'examine.
Comme le montre la figure 12, il est produit une infiltration de
lymphocytes dans les cellules cancereuses et on observe une rupture de
la zone tumorale. Egalement comme le montre la figure 13 on observe
une calcification de la zone tumorale ce qui montre que les cellules
tueuses de l'invention ont une activite antitumorale.
EXEMPLE COMPARATIF I
Dans cet exemple on utilise des cellules cancereuses elles-memes comme
antigene specifique au lieu de GRA dans le procede de llinven- tion.
On obtient des lymphocytes sensibilises par des cellules cancereuses
comme dans l'exemple 1 si ce n'est qu'au lieu de GRA on utilise des
cellules de BT-I, de Daudi, de KATO-III ou de MKN-45 a raison de 1 x
105 par boite de laboratoire.
Avec ces lymphocytes, on determine l'activite cytotoxique conne dans
l'exemple d'essai 2 (a). Les resultats figurent dans le tableau 9.
Comme le montre le tableau 9 les lymphocytes prepares ci-dessus n'ont
aucune activite cytotoxique.
TABLEAU g
Cellules Cellules utilisees pour la sensibilisation des cibles
lymphocytes
BT-1 Daudi KATO-III MKN-45 BT-I - - -
Daudi - -
KATO-III - -
MKN-45 - - -
EXEMPLE D'ESSAI 4
De la meme maniere qut l'exemple d'essai 2-(b), on determine
l'activite de cellules tueuses du GRA-8-K-T, du GRA-3-A-K-T et du
GRA-3-C-K-T obtenues a l'exemple 4. Les resultats obtenus sont
indiques dans le tableau 10 ci-apres.
TABLEAU 10
Cellules Cytotoxicite percent cibles GRA-8-K-T GRA-3-A-K-T GRA-3
-C-K-T
KATO-III 8,0 5,0 5,0
BT-1 4,3 5,0 4,0 MKN-45 20 5,0 20
MOLT O O O
EXEMPLE D'ESSAI 5 (a) On determine la cytotoxicite de chacune des
preparations de cellules tueuses obtenues a l'exemple 6 par l'essal de
liberation de Cr (J, Immunol. 122, pages 2527-2533 (1979). On ajoute
50 Ci de 51Cr radioactif (Japan Isotope Association) a des cellules
KATO-III (2.107) et on fait incuber les cellules a 37 C pendant 1 h
dans le milieu RPMI-1640 et on lave suffisamment par centrifu 51
gation pour obtenir des cellules cibles marquees par Cr.On ajoute des
cellules tueuses (cellules effecteurs) (2.106) aux cellules cibles
(1.105) (rapport E/T = 20/1) et on fait incuber le melange a 37 C
pendant 4 h dans le milieu RPMI-1640. On recueille le liquide
surnageant par centrifugation et on determine sa radioactivite au
moyen d'un compteur a scintillation a liquide.
Le taux de liberation specifique de 51Cr (percent) qui correspond a
l'activite cytolytique des cellules effecteurs est calcule selon
l'equation suivante.
Taux de liberation specifique de 51Cr (percent) = (liberation dans
l'essai) - (liberation spontanee) (La liberation maximale indique la
radioactivite determinee lorsque toutes les cellules sont lysees).
Les resultats obtenus sont indiques dans le tableau 11 ci-apres.
TABLEAU 11
Cellules tueuses Liberation speci figue figue de 51Cr (percent)
GRA-l-K-T-l 13
GRA-1-K-T-2 25
GRA-1-K-T-3 22
GRA-1-K-T-4 20
GRA-1-K-T-5 22
GRA-1-K-T-6 25
GRA-1-K-T-7 27
GRA-1-K-T-8 32
On peut voir, d'apres les resultats indiques dans le tableau 11
ci-dessus greater than que le TCGF et le FCS ntont pas de- relation
avec l'induc- des cellules tueuses.
(b) On determine la cytotoxicite du GRA-2-K-T obtenu a l'exemple 3 par
l'essai de liberation de 51Cr, de la meme maniere qu'en (a) cidessus.
On obsarve une liberation specifique de 51Cr de 53 percent sur les
cellules KATO-III marquees par Cr comme cellules cibles (E/T = 20/1).
EXEMPLE D'ESSAI 6 (a) En utilisant des cellules KATO-III (E/T = 20/1)
comme cellules cibles, on determine la cytotoxicite des cellules
tueuses obtenues a l'exemple 7-(a) de la meme maniere que dans
l'exemple d'essai 2-(b).
Les resultats obtenus sont indiques dans le tableau 12 ci-dessous.
TABLEAU 12
Cellules tueuses Cytotoxicite, percent
GRA-3 -K-T-l 38,0
GRA-3-K-T-2 18,2
GRA-3-K-T-3 20,9
GRA-3-K-T-4 23,2
GRA-3-K-T-5 24,5
GRA-3-K-T-6 20,2 (b) On determine la cytotoxicite du GRA-3-K-T-7
obtenu a l'exemple 7-(b) en utilisant des cellules KATO-III marquees
par 51Cr (E/T = 20/1), comme cellules cibles, de la meme maniere qu'a
l'exemple d'essai 5. On trouve une liberation specifique de 51Cr des
cellules tueuses de 25,5 percent.
EXEMPLE D'ESSAI 7
On determine la cytotoxicite des cellules tueuses obtenues a l'exemple
5 par l'essai de liberation de 51Cr, de la meme maniere qu'a l'exemple
d'essai 5. Les cellules cibles utilisees sont des cellules X5563
marquees par 51Cr. On utilise comme temoins des lymphocytes obtenus de
la meme maniere qu'a l'exemple 5, sauf que la sensibilisation des
cellules de rate est effectuee avec 1.105 cellules X5563 traitees par
la mitomycin C par godet (5.106 cellules X5563 par ml traitees par
50Zg/ml de mitomycin C pendant 60 min) au lieu de GRA-M-5.
Les resultats obtenus sont indiques dans le tableau XIII cidessous.
TABLEAU 13
Liberation specifique de 51Cr (x)
Rapport E/T
Cellules tueuses 40:1 20:1 10:1
GRA-M-5-K-T-1 12,7 6,3 5,7
GRA-M-5 -K-T-2 18,4 20,6 13,7
Temoin 0,0 0,0 0,0
EXEMPLE D'ESSAI 8 (essai H-2)
On dilue en serie du GRA-M-1, du GRA-M-3 et du GRA-M-4 obtenus dans
l'exemple de reference 2 ci-dessus par le PBS (NaCl a 0,85 percent)
pour preparer des echantillons.
On melange du serum anti-H-2 fabrique par le National Institute of
Genetic Research du Japon et li echantillon ci-dessus et on fait
incuber a 4 C pendant 2 h et on ajoute une cellule cible correspondant
au serum anti-H-2 utilise. On utilise canine cellules cibles des
cellules de rate ou des cellules de ganglion lymphatique obtenues a
partir de souris B10 (H-2b) et B10.BR (H-2k) par une technique
classique. Apres lavage des cellules par le PBS, on ajoute du
complement (lapin) aux cellules et on fait incuber les cellules a 370C
pendant 1 h et on colore par le PBS a 0,2 percent de Bleu trypan (Bleu
Direct 14 du Color Index) pour determiner la cytotoxicite en
percent.On utilise le serum anti-H-2 a une dilution maximale pour
qu'il presente une toxicite d'au moins 95 percent en lu absence de
GRA.
On determine l'effet bloquant par le GRA pour les systemes indiques
dans le tableau 14 ci-dessous.
TABLEAU 14
GRA Serum anti-H-2, concentration Cellules cibles
GRA-M-1 D-23 (anti-H-2Kk), X80 Cellules de rate ou D-32 (anti-H-2Dk),
X300 B10BR (H-2k)
GRA-M-3 D-33 (anti-H-2Kb), X600 Cellules de rate ou D-2 (anti-H-2Db),
X80 B10 (H-2b)
GRA-M-4 D-23, X80 Cellules de gan ou D-32, X300 glion lymphatique
B10.BR (h-2k)
Les resultats obtenus sont indiques dans le tableau 15 ciapres.
TABLEAU 15
Cytocoxicite, percent
Serum Dilution de l'echantillon
GRA anti-H-2 X2 X4 X8 X16 X32 X64 X128 X256 X512 0 * I- - 13 14 12 13
14 13 14 13 14 13
D-23. 97 99 96 97 97 96 97 96 96 14
D-32 - 95 95 95 95 94 95 95 96 95 13 II - - 19 15 14 12 15 12 11 12 13
14
D-33 - 98 98 99 99 98 99 99 99 99 15
D-2 - 95 96 95 95 97 95 97 95 95 17
III D-23 100 100 100 100 - - - - - 100 10
D-32 99 99 99 99 - - - -. 99 10
Remarques: GRA I: GRA-M-1
CRA II: GRA-M-3
GRA III: GRA-M-4
* indique la cytotoxicite lorsqu'on utilise le complement seul.
On peut voir, d'apres les resultats du tableau 15 ci-dessus que le
GRA-M-11 le-GRA-M-3 et le GRA-M-4 n'ont pas de H-2.
EXEMPLE D'ESSAI 9
On transplante par voie sous-cutanee, sur des souris C57BL/6, des LLC
(2.106) de la meme souche et, apres 6 jours, on administre par voie
sous-cutanee 1 ng (protein) de GRA-M-3 obtenu a l'exemple de reference
2-(d). On repete ensuite l'administration pendant 4 jours une fois par
jour a la meme dose. Le lendemain de la derniere administration, on
excise et on pese les cellules tumorales.
On utilise comme temoin des animaux auxquels on a administre du serum
physiologique. Chaque groupe d'essai comprend 5 animaux.
On trouve que le poids moyen de la tumeur dans le groupe temoin est
d'environ 500 mg. Dans le groupe auquel on a administre le
GRA-M-31 trois animaux presentent la disparition de la tumeur et deux
ont un poids moyen de tumeur d'environ 100 mg.
EXEMPLE D'ESSAI 10
On immunise par voie sous-cutanee des souris C57BL/6 avec 1 Flg
(protein) de GRA-M-3 obtenu a l'exemple de reference 2-(d), une fois
par jour pendant 3 jours et, au 5e jour, on recueille des cellules de
rate chez les animaux pour obtenir les cellules effecteurs. On prepare
comme cellules cible un melange de cellules effecteurs et de carcinome
pulmonaire de Lewis (LLC) dans un rapport
E/T = 50:1 et on transplante une portion de ces cellules (1.105) sur
des souris de la meme souche et on effectue l'essai de Winn (J.
Immunol. 86. pages 228-239 (1961).
Les resultats obtenus sont indiques dans le tableau 16 cidessous.
TABLEAU 16
Cellules Taux de croissance de la tumeur (percent) Mortalite
effecteurs 15 jours 17 jours 18 jours 19 jours 20 jours a 20 jours/
groupe
A 5 greater than 7 5,5 5,7 3,1 1,4 0/10
B 21,4 39,5 37,1 55,4 76,8 4/10
C 39,3 65,1 61,7 98,1 96,4 4j10
Remarques: Le groupe A represente les cellules de rate de souris
immunes GRA-M-3.
Le groupe B represente'les cellules de rate de souris normales.
Le groupe C represente les cellules- de rate de souris
10 jours apres la transplantation de LLC (1.106).
Le taux de croissance de la tumeur est calcule d'apres l'equation
suivante TA T:
Taux de croissance de la tumeur (percent) = # T # x 100
N dans laquelle T represente l'epaisseur du coussinet de la patte du
cote ou la tumeur a ete transplantee et TN l'epaisseur du coussinet de
la patte normale.
EXEMPLE D'ESSAI 11
On immunise des souris C3H/He avec 4,5Zg (protein) de GRA-M-4 obtenu a
l'exemple de reference 2 (d) et 0X1 ml d'adjuvant complet de Freund
dans la region sacrococcygienne. Apres deux semaines on recueille des
cellules de ganglions lymphatiques par une methode classique et on les
utilise comme cellules repondeurs pour determiner la reponse de
proliferation par le GRA-M-4.
A cet effet, on fait incuber les cellules repondeurs (4.105) dans le
milieu RPMI-1640 contenant 15 percent de FCS en presence de
GRA-M-4, pendant 5 jours. Pendant les dernieres 18 h de la periode
d'incubation, on ajoute au milieu lZCi de 3H-thymidine (3H-TdR) et on
compte son incorporation dans les cellules.
Les resultats obtenus sont indiques dans le tableau 17 cidessous.
TABLEAU 17
Concentration Incorporation de 3H-TdR *
GRA-M-4 (ng/ml) (coups'min, moyenne +) I.S,
Temoin 0 5 302 + 1 761
0,5 7 903 + 1 290 1,5
1 10 076 + 936 1,9
Experience 5 10 686 + 429 2,0
20 10 615 + 1 270 2,0
40 8 565 + 1 419 1,6 t Indice de stimulation exprime par le rapport
experience/temoin.
EXEMPLE D'ESSAI 12
On determine par la reaction du coussinet de la patte (FPR) la reponse
d'hypersensibilite de type retardee (DTH) d'une souris normale C3H/He,
d'unesouris immune X5563 et d'une souris immune
MH134 obtenues de la meme maniere qu'a l'exemple 5 et d'une souris
immune GRA-M-4 et d'une souris immune GRA-M-5 obtenues de la meme
maniere qu'a l'exemple d'essai 11. On essaye des cellules tumorales
traitees par le GRA ou le MMC sur la peau du coussinet de la patte de
derriere de 11 animal et on determine le gonflement du coussinet 24 h
apres l'inoculation. Le degre de reponse DTH est calcule par
soustraction du gonflement avant l'essai du gonflement apres l'essai
(10 2 mm).
Les resultats obtenus sont indiques dans les tableaux 18 a 22
ci-dessous.
TABLEAU 18
Essai Augmentacion moyenne du coussinet (10-2 mm)
Souris normale Souris immune MH134
1 2,8 13,6
2 12,4 32,0
3 3,6 3,6
4 3,2 22,0
5 6,8 27,6
Remarques: Groupe 1; cellules de rate normale syngenetique
1.106 l/20 l de milieu (solution de Hanks)
Groupe 2; cellules MH134 1.106/20)51 de milieu
Groupe 3; 20 l de milieu
Groupe 4; GRA-M-4, 0,8 g (protein)/20 l de milieu)
Groupe 5; GRA-M-4, 0,4 g (protein)/20 l de milieu)
TABLEAU 19
Essai Augmentation moyenne du coussiner (10-2 mm)
Souris Souris normale Souris immune X5563 Souris immune MH134
1 5,4 4,3 1,1
2 0,9 - 24,3
3 2,0 16,9
Remarques: Groupe 1; 20 l de milieu (solution de Hanks)
Groupe 2; 4Zg de GRA-M-4 (protein)/20 l de milieu
Groupe 3; 4 f de GRA-M-5 (protein)/20 l de milieu.
TABLEAU 20
Essai Augmentation moyenne du coussinet (10-2 mm)
Souris normale Souris immune GRA-M-4
1 1,7 -0,3
2 5,1 24,6
Remarques: Groupe 1; 20 l de milieu (solution Hanks)
Groupe 2; 4Zg de GRA-M-4 (protein)/20 l de milieu.
TABLEAU 21
Essai Augmentation moyenne du coussinet (10-2) mm)
Souris Souris normale Souris immune GRA-M-4
1 -1,8 0,6
2 6,3 20,0
3 6,8 6,3
Remarques: Groupe 1; 20 l de milieu (solution de Hanks)
Groupe 2; 4Zg de GRA-M-4 (protein)/20 l de milieu
Groupe 3; 4ug (protein)/20 l de milieu de la fraction qui passe a
travers la colonne de PNA au moment de GRA-M-4 (ci-apres "C.P.")
TABLEAU 22
Essai Augmentation moyenne du coussinet (10 -t)
Souris normale Souris immune GRA-M-4
1 2,4 -1,0
2 2,6 17,7
3 2,4 1,8
4 5,5 18,9
Remarques:Groupe 1; 20 l de milieu (solution de Hanks)
Groupe 2; 3,8g de GRA-M-4 (protein)/20 l de milieu
Groupe 3; 3,8Zg (protein)/20 l milieu de "C.P." ci dessus
Groupe 4; 3,8Zg(protein) de GRA-M-4 et 3,8 g
(protein)/20u1 de milieu de "C.P."
ESSAI DE REFERENCE
On obtient une souris immune X5563 de la meme maniere qu'a l'exemple
5. On utilise des cellules de rate de cette souris immune comme
cellules effecteurs et on transplante simultanement les cellules
effecteur (107) et les cellules cibles (X5563, 105) sur des souris de
la meme souche. On effectue l'essai de Winn de la meme maniere qu'a
l'exemple d'essai 10.
Les resultats obtenus sont indiques dans la figure 23 ci-apres, dans
laquelle les abscisses indiquent le temps en jours, et les ordonnees
la dimension moyenne de la tumeur (cm2) + ecart-type () et les
differents signes ont la signification suivante
Groupe dans lequel on n'ajoute pas de cellules effecteurs.
Groupe dans lequel on ajoute les cellules effecteurs non traitees.
Groupe dans lequel on ajoute les cellules effecteurs traitees avec le
complement de lapin.
Groupe dans lequel on ajoute les cellules effecteurs traitees avec
l'anti-Thy 1 (Societe New England Nuclear Co., E.U.A.), et le
complement de lapin.
Groupe dans lequel on ajoute les cellules effecteurs traitees avec
l'anti-Lyt 1 (Societe New England Nuclear Co., E.U.A.), et le
complement de lapin.
Groupe dans lequel on ajoute les cellules effecteurs trai tees par
l'anti-Lyt 2 (Societe New England Nuclear Co.,
E.U.A.) et le complement de lapin.
On peut voir, d'apres les resultats indiques dans la figure 23 que les
cellules T du type Lyt-l jouent un role important dans le mecanisme
d'effecteurs in vivo dans l'immunite tumorale.
En outre, on sait que la reponse de DTH est a mediation par les
cellules T de type Lyt-l (J. Exp. Med. 143, pages 1534-1539 (1976)).
Bien entendu, diverses modifications peuvent etre apportees par
l'homme de l'art aux dispositifs ou procedes qui viennent d'etre
decrits uniquement a titre d'exemples non limitatifs sans sortir du
cadre de l'invention.
Claims
_________________________________________________________________
REVENDICATIONS
1. Lymphocytes, cytotoxiques vis- -vis des cellules cancer reuses,
specifiques d'un antigene glyco-apparente derivant de cellules
cancereuses, caracterises en ce qu'on les prepare par sensibilisation
des lymphocytes avec un antigene glyco-apparente derive de cellules
cancereuses.
2. Lymphocytes selon la revendication 1, caracterises en ce que
l'antigene glyco-apparente est un composant de membrane de cellules
cancereuses qui se combine avec une lectine se combinant de maniere
specifique avec un groupe terminal galactose ou N-acetylgalactosamine.
3. Lymphocytes selon la revendication 2, caracterises en ce que
l'antigene glyco-apparente est un composant de membrane de cellules
cancereuses qui se combine avec une lectine se combinant
specifiquement avec un groupe terminal galactose.
4. Lymphocytes selon la revendication 2, caracterises en ce que
l'antigene glyco-apparente est un composant de membrane de cellules
cancereuses qui se combine avec une lectine se combinant de maniere
specifique avec un groupe terminal N-acetylgalactosamine.
5. Procede pour la production de lymphocytes cytotoxiques vis-a-vis
des cellules cancereuses,caracterise en ce qu'il consiste a
sensibiliser des lymphocytes avec un antigene glyco-apparente derive
de cellules cancereuses.
6. Procede selon la revendication 5, caracterise en ce que l'antigene
glyco-apparente est un compoeantdemembrane de cellules cancereuses qui
se combine avec une lectine se combinant specifiquement avec un groupe
terminal galactose ou N-acetylgalactosamine.
7. Procede selon la revendication 5, caracterise en ce que l'antigene
glyco-apparente est un composant de membrane de cellules cancereuses
qui se combine avec une lectine se combinant specifique- ment avec un
groupe terminal galactose.
8. Procede selon la revendication 5, caracterise en ce que l'antigene
glyco-apparente est un composant de membrane de cellules cancereuses
qui se combine avec une lectine se combinant specifique- ment avec un
groupe terminal N-acetylgalactosamine.
9. Nouveaux medicaments utiles notamment comme agents anticancereux,
caracterises en ce qu'ils contiennent comme produit actif des
lymphocytes, cytotoxiques vis-a-vis des cellules cancereuses,
specifiques d'un antigene glyco-apparente derivant de cellules
cancereuses.
10. Medicaments selon la revendication 9, caracterises en ce que les
lymphocytes cytotoxiques vis-a-vis des cellules cancereuses sont
prepares par sensibilisation des lymphocytes avec un antigene
glyco-apparente derivant de cellules cancereuses.
11. Medicaments selon la revendication 9 ou 10, caracterises en ce que
l'antigene glyco-apparente est un composant de membrane de cellules
cancereuses qui se combine avec une lectine se combinant
specifiquement avec un groupe terminal galactose ou
N-acetylgalactosamine.
12. Medicaments selon la revendication 11, caracterises en ce que
antigene glyco-apparente est un composant de membrane de cellules
cancereuses qui se combine avec une lectine se combinant
specifiquement avec un groupe terminal galactose.
13. Medicaments selon la revendication 11, caracterises en ce que
l'antigene glyco-apparente est un composant de membrane de cellules
cancereuses qui se combine avec une lectine se combinant
specifiquement avec un groupe terminal N-acetylgalactosamine.
14. Medicaments anticancereux, caracterises en ce qu'ils contiennent
comme produit actif un antigene glyco-apparente derivant de cellules
cancereuses
15. Medicaments selon la revendication 14, caracterises en ce que
l'antigene glyco-apparente est un composant de membrane de cellules
cancereuses qui se combine avec une lectine se combinant
specifiquement avec un groupe terminal galactose ou
N-acetylgalactosamine.
16. Medicaments selon la revendication 15, caracterises en ce que
l'antigene glyco-apparente est un composant de membrane de cellules
cancereuses qui se combine avec une lectine se combinant
specifiquement avec nn groupe terminal galactose.
17. Medicaments selon la revendication 15, caracterises en ce que
l'antigene glyco-apparente est un composant de membrane de cellules
cancereuses qui se combine avec une lectine se combinant
specifiquement avec un groupe terminal N-acetylgalactosamine.
18. Nouvel antigene glyco-apparente, caracterise en ce qu'on l'isole
d'un composant de membrane de cellules cancereuses humaines et en ce
qu'ilpeut se combiner avec une lectine qui peut se combiner avec un
groupe terminal galactose ou N-acetylgalactosamine.
19. Antigene glyco-apparente selon la revendication 18, caracterise en
ce qu'il est prepare par isolement d'un antigene glyco-apparente d'un
composant de membrane de cellules cancereuses humaines avec une
lectine qui peut se combiner specifiquement avec un groupe terminal
galactose ou N-acetylgalactosamine.
20. Antigene glyco-apparente selon la revendication 19, caracterise en
ce que la lectine est du type qui se combine specifiquement avec un
groupe terminal galactose.
21. Antigene glyco-apparente selon la revendication 20, caracterise en
ce que la lectine est la lectine d'arachide, la lectine de Ricinus
communis ou la lectine de soja.
22. Antigene glyco-apparente selon la revendication 21, caracterise en
ce que la lectine est la lectine d'arachide.
23. Antigene glyco-apparente selon la revendication 19, caracterise en
ce que la lectine est du type qui se combine specifiquement avec un
groupe terminal N-acetylgalactosamine.
24. Antigene glyco-apparente selon la revendication 23, caracterise en
ce que la lectine est choisie parmi l'agglutinine de Dolichos, la
lectine de "braid orange", la lectine de Helix pomatia, la lectine de
haricot de Lima, la lectine de soja et la lectine de Bauhinia.
25. Antigene glyco-apparente selon la revendication 24, caracterise en
ce que la lectine est l'agglutinine de Dolichos.
26. Antigene glyco-apparente,caracterise en ce qu'on le prepare en
isolant un antigene glyco-apparente dgun composant de membrane de
cellules cancereuses humaines d'abord avec unepremiere lectine qui se
combine specifiquement avec un groupe terminal galactose et ensuite
avec une seconde lectine qui se combine specifiquement avec un groupe
terminal N-acetylgalactosamine.
27. Antigene glyco-apparente selon la revendication 26, caracterise en
ce que la premiere lectine est la lectine d'arachide et la seconde
lectine est ltagglutinine Dolichos.
28. Procede pour la preparation d'un antigene glyco-apparente greater
than caracterise en ce qu'on isole un antigene glyco-apparente qui
peut se combiner avec une lectine se combinant specifiquement avec un
groupe terminal galactose ou un acetylgalactosamine.
29. Procede selon la revendication 28, caracterise en ce que l'on
isole un antigene glyco-apparente d'un composant de membrane de
cellules cancereuses humaines avec une lectine qui se combine
specifiquement avec un grbupe terminal galactose ou
N-acetylgalactosanine.
30. Procede selon la revendication 29, caracterise en ce que la
lectine est du type qui se combine specifiquement avec un groupe
terminal galactose.
31. Procede selon la revendication 29, caracterise en ce que la
lectine est du type qui se combine specifiquement avec un groupe
terminal N-galactosamine.
32. Procede pour la preparation d'un antigene glyco-apparente,
caracterise en ce qu'on isole un antigene glyco-apparente d'un
composant de membrane de cellules cancereuses humaines d'abord par une
premiere lectine qui se combine specifiquement avec un groupe terminal
galactose et ensuite avec une seconde lectine qui se combine
specifiquement avec un groupe terminal N-acetylgalactosamine.
33. Procede selon la revendication 32, caracterise en ce que la
premiere lectine est le lectine de soja et la seconde lectine est
l'agglutinine de Dolichos.
34. Medicaments selon l'une quelconque des revendications 9 a 11,
caracterises en ce qu'ils sont conditionns a des concentrations de 105
a 10 lymphocytes par ml.
35. Medicaments selon l'une quelconque des revendications 14 a 17,
caracterises en ce qu'ils sont conditionnes a la concentration de
0,001 A 100 / g de produit actif (en sugars)/ml.
? ?
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