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Molecule
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water
(36)
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glutaraldehyde
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benzoquinone
(3)
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acrylamide
(3)
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phosphate
(3)
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DES
(2)
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ammonium sulfate
(1)
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lysine
(1)
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glycine
(1)
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PO4
(1)
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azide
(1)
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sodium
(1)
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ascorbic acid
(1)
[19][_]
copper sulfate
(1)
[20][_]
S4C
(1)
[21][_]
Organism
(7/ 50)
[22][_]
viruses
(16)
[23][_]
Escherichia coli
(14)
[24][_]
Vibrio cholerae
(8)
[25][_]
Salmonella
(5)
[26][_]
Salmonella typhimurium
(5)
[27][_]
bacteria
(1)
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Poliovirus
(1)
[29][_]
Physical
(19/ 27)
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1 ml
(4)
[31][_]
0,1 M
(2)
[32][_]
pH 7,4
(2)
[33][_]
280 nm
(2)
[34][_]
100 ml
(2)
[35][_]
9 ml
(2)
[36][_]
200 ml
(1)
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3 percent
(1)
[38][_]
4 percent
(1)
[39][_]
5 percent de
(1)
[40][_]
de 5 mg/ml
(1)
[41][_]
pH 2,8
(1)
[42][_]
0,2 M
(1)
[43][_]
0,02 percent
(1)
[44][_]
3 cm
(1)
[45][_]
500 ml
(1)
[46][_]
pH 7,2
(1)
[47][_]
de 100 ml
(1)
[48][_]
pH 2,2
(1)
[49][_]
Disease
(2/ 11)
[50][_]
Poliomyelitis
(10)
[51][_]
Cholera
(1)
[52][_]
Polymer
(2/ 10)
[53][_]
AGAROSE
(6)
[54][_]
POLYACRYLAMIDE
(4)
[55][_]
Gene Or Protein
(4/ 9)
[56][_]
Etre
(4)
[57][_]
DANS
(2)
[58][_]
HC1
(2)
[59][_]
Est-a
(1)
[60][_]
Chemical Role
(1/ 1)
[61][_]
Coupling agents
(1)
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Images Mosaic View
Publication
_________________________________________________________________
Number FR2514367A1
Family ID 8026977
Probable Assignee Pasteur Inst
Publication Year 1983
Title
_________________________________________________________________
FR Title PROCEDE POUR LA DETECTION DE GERMES PATHOGENES DANS DES
FLUIDES PAR FILTRATION SUR DES IMMUNOADSORBANTS, ET APPLICATION A LA
DETERMINATION DE LA POTABILITE D'UNE waterDETECTION OF PATHOGENIC
GERMS IN DRINKING WATER, URINE ETC. - USES SPECIFIC IMMUNO-ADSORBENTS
E.G. POLYACRYLAMIDE-AGAROSE COUPLED WITH SPECIFIC ANTIBODIES
Abstract
_________________________________________________________________
L'INVENTION CONCERNE UN PROCEDE POUR LA DETECTION DE GERMES PATHOGENES
DANS LES FLUIDES.
CE PROCEDE CONSISTE:
-A FILTRER LE FLUIDE A ANALYSER SUR UN IMMUNOADSORBANT SPECIFIQUE DU
GERME RECHERCHE;
-A CARACTERISER LES GERMES RETENUS SUR L'IMMUNOADSORBANT.
APPLICATION: DETERMINATION DE LA water.
Process for the detection of pathogenic germs in fluids comprises (a)
filtering the fluid to be analysed through an immunoadsorbant specific
to the germ to be detected and (b) characterising the germs retained
by the immunoadsorbant. The immunoadsorbant is an insoluble support to
which are fixed antibodies specific to the germ to be detected e.g. a
polyacrylamide agarose gel to which the antibodies are fixed by
chemical coupling. Coupling agents include glutaraldehyde,
benzoquinone and similar coupling agnets. The adsorbed germs are
characterised by classical means e.g. dilution of the gel in a
selected liquid medium, cultivation on gelose and biochemical or
serological characteristaion of the germ (agglutination). Detection of
pathogenic germs in water and biological liquids, such as urine. Germs
include bacteria, such as vibro cholerae, Escherichia coli and
Salmonella, and viruses, such as poliomyelitis virus and
encephalo-myocarditro virus. The process is suitable for determining
the drinkability of water.
Description
_________________________________________________________________
La presente invention concerne un procede pour la detection de germes
pathogenes dans des fluides par filtration sur des immunoadsorbants.
Elle concerne plus particulierement la recherche de bacteries et de
particules virales dans l'water, notamment en vue d'en determiner la
potabilite.
La potabilite bacteriologique d'une water est fonction de la presence
ou non de certains germes d'origine fecale. Pour l'organisation
Mondiale de la Sante, une water est consideree comme non dangereuse
pour la sante Si elle ne contient pas de germes d'origine fecale. Il
est bien evident qu'une water sera d'autant moins dangereuse qu'elle
ne contient pas de veritables germes pathogenes.
Jusqu'a present, pour declarer une water potable, le bacteriologiste
ne recherche pas les germes pathogenes, mais met en evidence les
germes de contamination fecale.
Selon la technique utilisee, il recherche les germes soit dans 1 ml,
technique par dilution, soit dans 200 ml ou plus, par filtration sur
membrane.
La chance de rencontrer des germes pathogenes dans 1 ml est quasiment
nulle. Elle augmente avec la quantite de liquide, mais est limitee par
le fait que de nombreux autres germes seront presents sur la membrane,
ne permettant plus un isolement des germes pathogenes ou des germes de
contamination fecale. A titre de references bibliographiques dans ce
domaine on peut citer:
Pratique du Laboratoire, Masson et Cie, 399-422.
Report of the European Regional Study Group on the developpment of
international Standard of drinking water quality and approved methods
for the examina tion of water OMS Geneve, 1956.
On a maintenant mis au point une technique simple permettant de
rechercher directement, dans les fluides, par exemple les liquides
biologiques, les principaux germes responsables de maladies d'origine
fecale, tels que notamment Salmonella, Escherichia coli K 88 et E.
Coli K 99 enteropathogenes, Vibrio cholerae biotype el Tor, serotype
Ogawa, souche Mz et germes similaires.
Le procede de detection de germes pathogenes dans les fluides, selon
l'invention, consiste:
1) a filtrer le fluide a analyser sur un immunoadsorbant specifique du
germe recherche;
2) a caracteriser les germes retenus sur 1'immunoadsorbant.
Dans la presente description, on designe par "fluide" tout fluide
susceptible de contenir des germes pathogenes, tel que par exemple
l'water ou les liquides biologiques provenant d'etres vivants, par
exemple l'urine.
La premiere etape dru procede de l'invention consiste en une
filtration, sur un immunoadsorbant, du fluide a analyser.
L'immunoadsorbant mis en oeuvre doit etre specifique du germe
recherche.
L'immunoadsorbant mis en oeuvre selon l'invention est un support
insoluble susceptible de constituer un element de filtration pour un
fluide et sur lequel sont fixes, par liaison chimique, des anticorps
specifiques du germe pathogene dont on souhaite determiner la presence
dans un fluide.
Le procede selon l'invention convient pour la detection de tout germe
pathogene qui secrete des facteurs d'attachement specifique de groupes
antigeniques, lesquels provoquent, par immunisation d'un animai, tel
que le lapin par exemple, des anticorps specifiques.
Le support de l'immunoadsorbant est en general un polymere insoluble,
le plus souvent sous la forme d'un gel. A titre d'exemple de tels
polymeres on citera les polymeres d'acrylamide, d'agarose,
d'acrylamide-agarose
Le polymere connu sous a denomination commerciale ULTROCEL
ACA 34 (Industrie Biologique Francaise), qui est un gel de
polyacrylamide-agarose, est particulierement approprie aux fins de
l'invention. I1 s'agit d'un gel dont les caracteristiques sont les
suivantes:
3 percent acrylamide, 4 percent agarose et 60 a 140 vm de diametre de
particule.
Le support insoluble couple avec des anticorps specifiques du germe
recherche constitue l'immunoadsorbant mis en oeuvre selon l'invention.
Le couplage des anticorps specifiques sur le support soluble est
effectue selon des techniques classiques de couplage, mettant en
oeuvre des agents de couplage connus, tels que le glutaraldehyde, la
benzoquinone et autres agents similaires. Pour plus de detail sur les
techniques de couplage pour la realisation d'immunoadsorbants on
pourra se referer a l'article ci-apres: polyacrylamide beads for the
preparation of effective immunoadsorbants - J. Immun. Meth., 1971, 11,
29-33.
On indiquera ci-apres le procede de couplage au glutaraldehyde. Ce
procede consiste a activer le support insoluble avec le glutaraldehyde
et a mettre ensuite en contact le gel ainsi active avec une solution
des anticorps specifiques a fixer.
Les anticorps specifiques utilises pour la fabrication des
immunoadsorbants mis en oeuvre dans le procede de l'invention sont
obtenus par immunisation d'animaux, par exemple de lapin, avec un
germe pathogene ou une fraction de celui-ci. L'isolement de
l'anticorps specifique a partir du serum ainsi obtenu se fait par des
methodes classiques bien connues de l'homme de l'art.
Apres filtration du fluide a tester sur l'immunoadsorbant contenant
l'anticorps specifique du germe recherche, on procede a la
caracterisation, ce qui constitue la seconde etape du procede de
l'invention, des facteurs antigeniques retenus par 1'immunoadsorbant,
lesquels sont specifiques du germe recherche. Cette caracterisation
est effectuee par des moyens classiques, par exemple, par dilution du
gel et, en milieu liquide selectif, culture sur gelose,
caracterisation biochimique et serologique du germe (agglutination).
Le procede convient en particulier pour la mise en evidence dans
l'water de bacteries, telles qu'Escherichia coli pathogene, Salmonella
et Vibrio Cholerae, et de parti cules virales, par exemple celles du
virus de la poliomye lite ou du virus de l1encephalo-myocardite. I1
permet donc de determiner aisement la potabilite d'une water.
On peut egalement determiner, grace au procede de l'inventionr d'une
facon tres rapide, si un sujet vivant est porteur de germes pathogenes
en filtrant un liquide biologique de celui-ci sur un immunoadsorbant
specifique du germe susceptible d'etre present chez ce sujet.
Le procede de l'invention presente les avanta ges ci-apres par rapport
aux techniques classiques: il permet une recherche directe selective
du germe enterique pathogene et non plus des germes temoins de
decontamination fecale.
L'invention va etre maintenant decrite par les exemples non limitatifs
ci-apres.
EXEMPLE 1
Analyse d'eauxcontaminees par des germes de
Vibrio Cholerae,Salmonella et Escherichia coli
Les experiences ci-apres ont ete realisees avec des water contaminees
artificiellement par des germes pathogenes ou avec des water brutes.
Les souches bacteriennes utilisees pour la contamination artificielle
de l'water et l'obtention des immunoadsorbants sont indiquees
ci-apres:
A. Souches bacteriennes
Les souches utilisees provenaient de la collection de 1'Unite du
Cholera / Institut pasteur, Paris. 7
Elles etaient toutes fraichement isolees du sang du coeur de souris,
apres injection intraperitoneale de la souche virulente. L'isolement
et le repiquage pour chacun des germes ont ete effectues sur gelose
ordinaire, a l'etuve a 370C pendant 12 heures.
Les souches ci-apres ont ete utilisees:
Vibrio cholerae el tor souches Marquez Ogawa
Vibrio cholerae el tor souches 9292 Inaba
Salmonella typhimurium souche C5
Escherichia coli K88 Oudjine
Escherichia coli K99 V5.
B. Preparation des anticorps specifiques pour la fabrica de 1
'immunoadsorbant
Les anticorps ont ete obtenus a partir de serums de lapins immunises
avec l'une des souches ci-dessus. a. le serum anti-vibrio cholerae a
ete obtenu par immunisation de lapin avec la fraction Ch 1+2 (...
provenant de la souche Marquez el tor Ogawa. L'anti-serum obtenu avait
un pouvoir vibriocide de 1/40180 et agglutinant de 1/5120. En
diffusion en gelose, il n'apparaissait qu'une bande de precipite
antigene-anticorps, les ultra-sonats complets de toutes les souches de
V. cholerique agglutinables par le serum polyvalent anticholerique el
tor ou classique.
L'antiserum n'agglutinait pas les vibrions Nag et halophiles. b. les
antiserums anti-Salmonella typhimurium
C5, anti-Escherichia coli K88 et K99 ont ete obtenus en injectant au
lapin les fractions Tm 1+2 Ec 1+2 K88 Ec 1+2
K99. La specificite de ces antiserums a ete testee par agglutination
immunofluorescence et diffusion en gelose.
C. Preparation des immunoadsorbants
Les anticorps ont ete isoles des serums par precipitation au ammonium
sulfate (408). Les anticorps ont ete ensuite couples a des gels de
polyacrylamideagarose ACA 34 actives au glutaraldehyde. La methode de
couplage etait la suivante: "1' Ultrogel ACA 34" (Industrie
Biologique Francaise) a ete lave avec de l'water distillee par
decantations successives, jusqu'a ce que le surnageant soit
completement clair. Le gel a ete ensuite incube une nuit dans un
tampon phosphate 0,1 M pH 7,4 contenant 5 percent de glutaraldefiyde
(Merck, Darmstadt, RFA), puis lave avec de l'water distillee par
decantation ou centrifugations successives jusqu'a ce qu'une odeur de
glutaraldehyde soit decelable et que la densite optique a 280 nm du
surnageant soit 0.Le gel active a ete mis en contact avec une solution
de 5 mg/ml d'anticorps dans du PBS (1 volume de gel pour 1 volume de
la solution d'anticorps) et laisse sous agitation rotative pendant une
nuit a temperature du laboratoire. Le lendemain, le gel a ete lave a
40C par centrifugations successives dans du PBS jusqu'a ce que la
densite optique a 280 nm soit 0. I1 a ensuite ete remis en suspension
(volume a volume) dans une solution de lysine 0,1 M pH 7,4 et laisse
sous agitation rotative pendant 24 heures a temperature du laboratoire
ou 24 heures a 40C.
Apres lavage dans du tampon phosphate (PBS), le gel a ete traite avec
un tampon HC1 - glycine pH 2,8, pendant 15 mn a 40C, puis neutralise
avec une solution de K2M PO4 0,2 M et a nouveau lave. A ce stade,
l'immunoadsorbant a pu etre conserve dans du PBS contenant 0,02
percent d'azide de sodium.
Les differents immunoadsorbants ont ete introduits dans des colonnes
en plastique de 0,8 x 3 cm. Ces colonnes ont ete, avant l'experience,
sterilisees en passant sur les colonnes de l'water physiologique
contenant des radicaux libres (melange acide ascorbic acid-copper
sulfate).
D. Analyse et resultats
Les experiences ont ete realisees en filtrant sur ces colonnes 500 ml
d'water contaminees, soit des water brutes de l'Oise, soit de l'water
physiologique (tamponee a pH 7,2 par un tampon phosphate),
artificiellement contaminee par les memes germes. La vitesse de
filtration etait d'environ 100 ml/heure. Apres filtration, les
colonnes ont ete lavees par passage de 100 ml d'water physiologique.
Dans une premiere serie d'experiences, on a filtre des water "non
contaminees" par environ 103V. cholerae, Salmonella typhimurium, E.
coli K 88 ou E. coli K99, respectivement sur colonne Ch 1+2 (gels
couples aux anticorps anti-Ch 1+2), colonne Tm 1+2, colonne Ec 1+2 K88
et colonne Ec 1+2 K99. Dans une deuxieme serie d'experiences, on a
filtre sur chaque colonne de l'water contenant un melange des 4 germes
(103 environ de chaque germe).
Les germes. cholerae retenus sur les colonnes ont ete caracterises en
diluant 1 ml de gel dans 9 ml d'water peptonee hypersalee. Apres
agitation soigneuse au Vortex, ce melange a ete dilue en serie et
chaque dilution etalee sur botes de Petri. Pour caracteriser les
germes S. typhimurium, E. coli K88 et K99, 1 ml de gel a ete dilue
dans 9 ml d'water physiologique tamponnee, agite soigneusement au
Vortex et dilue en serie comme precedemment, avant etalement sur la
gelose. Les resultats sont resumes dans le tableau I ci-apres. Les
differents germes n'ont ete retenus que sur leur propre gel. L'analyse
quantitative a ete difficile, compte tenu de la grande vitesse de
division-des germes. Neanmoins, l'analyse et la caracterisation des
germes contenus dans l'water apres filtration sur les colonnes a
montre que la plupart des 103 germes etaient retenus et retrouves
apres passage sur leur propre gel, c'est-a-dire le gel specifique
dudit germe.
TABLEAU I
Germes retrouves Colonnes
Ch 1+2 Tm 1+2 Eu 1+2 Ec 1+2
V. cholerae +
S. typhimurium - + i -
E. coli K88 - + *
E. coli K99 ~ ~ ~ +
EXEMPLE 2
Analyse d'water contaminees par des particules virales du virus de la
poliomyelite (type II) et du virus de l'encephalomyocardite (EMC)
Cet exemple montre que le procede de l'invention est applicable aux
particules virales.
A. Preparation des immunoadsorbants
On a opere sensiblement selon le mode operatoire defini a l'exemple 1
en utilisant des anticorps anti-Polio II isoles d'un lapin
hyperimmunise avec le virus Polio II.
L'immunisation des lapins a ete realisee par injections intraveineuse
et intraperitoneale qui permettent d'obtenir un taux eleve
d'anticorps.
Le titre de l'antiserum en sero-neutralisation etait de 1/12 800
contre 103 DL 50 de virus. On a ainsi obtenu un immunoadsorbant
anti-Polio II.
De meme on a prepare un immunoadsorbant anti-S4C en utilisant
sensiblement le meme mode operatoire que cidessus et des anticorps
anti-EMC isoles d'une ascite de souris immunisee contre le virus EMC
par injection intraperitoneale chez la souris.
Le titre de l'ascite etait de 1/25 600 contre 103 DL 50 de virus.
B. Analyse
De 20 a 100 ml d'water physiologique contenant des particules virales
ont ete filtres sur les colonnes d'immunoadsorbants anti-Polio II et
anti-EMC.
La specificite des colonnes a ete testee en passant sur les colonnes
anti-Polio II de l'water contenant un melange Polio I et Polio II et
sur les colonnes anti-EMC un melange EMC et Poxvirus.
Comme les virus Polio II et EMC resistent bien a une exposition courte
a pH acides, la recuperation des particules virales accrochees sur les
colonnes a ete realisee par elution avec un tampon HC1 pH 2,2.
Les resultats sont resumes dans le tableau II. TABLEAU II
Poliovirus II $Poliovirus I
Colonnes Virus Titre percent Titre percent
Anti- ajoute 5,9.10+6 100 5,5.106 100
Polio II Apres filtration 103 less than 1 5,4.106 # 100
Elution de la 5,5.106 92 less than 10 less than 10 colonne
EMC Pox virus nombre de particules virales percent nombre de
particules virales percent
Ajoute 1,2.106 100 106 100
Anti- Apres filtration less than 10 # 0 $1,11.106 # 100
EMC Elution de la 1,11.106 93 0 0 colonne
Claims
_________________________________________________________________
REVENDICATIONS
1. Procede pour la detection de germes pathogenes dans les fluides1
caracterise en ce qu'il consiste:1) a filtrer le fluide a analyser sur
un immunoadsorbant specifique du germe recherche;2) a caracteriser les
germes retenus sur 1'immunoadsorbant.
2. Procede selon la revendication 1, caracterise en ce que ledit
fluide est un liquide biologique ou de l'water.
3. Procede selon l'une des revendications 1 ou 2, caracterise en ce
que l'immunoadsorbant est constitue d'un support soluble sur lequel
sont fixes des anticorps specifiques du germe recherche.
4. Procede selon la revendication 3, caracterise en ce que le support
insoluble est un gel de polyacrylamideagarose.
5. Procede selon la revendication 3, caracterise en ce que les
anticorps specifiques du germe recherche sont fixes sur le support
insoluble par couplage chimique.
6. Procede selon la revendication 5, caracterise en ce que le couplage
est realise a l'aide de glutaraldehyde, de benzoquinone, ou autre
agent de couplage similaire.
7. Procede pour determiner la potabilite d'une water, caracterise en
ce qu'il consiste:1) a filtrer l'water a analyser sur un
immunoadsorbant specigique du germe recherche;2) a caracteriser les
germes retenus sur l'immunoadsorbant.
8. Procede selon la revendication 7, caracterise en ce que les germes
pathogenes sont des bacteries ou des particules virales.
9. Procede selon la revendication 8, caracterise en ce que les
bacteries sont choisies parmi Vibrio Cholerae,Escherichia coli,
Salmonella.
10. Procede selon la revendication 8, caracterise en ce que les
particules virales sont des particules du virus de la poliomyelite ou
du virus de l'enc8phalo-myocardite.
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