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[5][_]
Molecule
(167/ 423)
[6][_]
HOH
(31)
[7][_]
D-glucose
(19)
[8][_]
ethyl acetate
(16)
[9][_]
hexane
(16)
[10][_]
methylene chloride
(15)
[11][_]
methanol
(10)
[12][_]
carbon
(9)
[13][_]
chloroform
(9)
[14][_]
glycerol
(9)
[15][_]
calcium Carbonate
(9)
[16][_]
tetramethyl-silane
(8)
[17][_]
sodium chloride
(8)
[18][_]
sucrose
(7)
[19][_]
Me
(6)
[20][_]
chloride
(6)
[21][_]
Cl
(5)
[22][_]
L-tyrosine
(5)
[23][_]
OH
(4)
[24][_]
heptane
(4)
[25][_]
iron
(4)
[26][_]
trehalose
(4)
[27][_]
maltose
(4)
[28][_]
nitrogen
(4)
[29][_]
ethyl ether
(4)
[30][_]
potassium
(3)
[31][_]
calcium
(3)
[32][_]
acetone
(3)
[33][_]
asparagine
(3)
[34][_]
fructose
(3)
[35][_]
mannose
(3)
[36][_]
melezitose
(3)
[37][_]
adonitol
(3)
[38][_]
dulcitol
(3)
[39][_]
lactose
(3)
[40][_]
mannitol
(3)
[41][_]
salicine
(3)
[42][_]
xylose
(3)
[43][_]
malate
(3)
[44][_]
citrate
(3)
[45][_]
Acetate
(3)
[46][_]
thylene
(3)
[47][_]
ethanol
(3)
[48][_]
sodium
(2)
[49][_]
benzene
(2)
[50][_]
Riboflavine
(2)
[51][_]
niacin
(2)
[52][_]
diaminopimelic acid
(2)
[53][_]
calcium malate
(2)
[54][_]
guanine
(2)
[55][_]
xanthine
(2)
[56][_]
esculine
(2)
[57][_]
urea
(2)
[58][_]
galactose
(2)
[59][_]
inositol
(2)
[60][_]
propionate
(2)
[61][_]
pyruvate
(2)
[62][_]
succinate
(2)
[63][_]
tartrate
(2)
[64][_]
benzoate
(2)
[65][_]
lactate
(2)
[66][_]
oxalate
(2)
[67][_]
1-arabinose
(2)
[68][_]
d-melibiose
(2)
[69][_]
1-rhamnose
(2)
[70][_]
Sorbitol
(2)
[71][_]
sodium hydroxide
(2)
[72][_]
ammonium Sulfate
(2)
[73][_]
hydroxide
(2)
[74][_]
sodium sulfate
(2)
[75][_]
Br
(2)
[76][_]
DES
(1)
[77][_]
COOH
(1)
[78][_]
hydrogen
(1)
[79][_]
methylsilane
(1)
[80][_]
magnesium
(1)
[81][_]
triethylamine
(1)
[82][_]
triethanolamine
(1)
[83][_]
procaine
(1)
[84][_]
Phosphate dicalcium
(1)
[85][_]
Hydroxy-toluene
(1)
[86][_]
dl-methionine
(1)
[87][_]
vitamin D 3
(1)
[88][_]
pantothenic acid
(1)
[89][_]
choline chloride
(1)
[90][_]
folic acid
(1)
[91][_]
Bisulfate sodium
(1)
[92][_]
vitamin B 12
(1)
[93][_]
KOH
(1)
[94][_]
Zn
(1)
[95][_]
N-acetylglucosamine
(1)
[96][_]
cytidine
(1)
[97][_]
Glutathione
(1)
[98][_]
Guanosine
(1)
[99][_]
magnesium Citrate
(1)
[100][_]
potassium Citrate
(1)
[101][_]
dl-thioctic acid
(1)
[102][_]
3,75-Thymine
(1)
[103][_]
uridine
(1)
[104][_]
L-alanine
(1)
[105][_]
L-arginine
(1)
[106][_]
L-aspartic acid
(1)
[107][_]
L-cysteine HCl
(1)
[108][_]
L-glutamate
(1)
[109][_]
L-glutamine
(1)
[110][_]
Glycine
(1)
[111][_]
L-histidine
(1)
[112][_]
L-isoleucine
(1)
[113][_]
L-leucine
(1)
[114][_]
L-lysine HCl
(1)
[115][_]
L-methionine
(1)
[116][_]
L-phenylalanine
(1)
[117][_]
L-proline
(1)
[118][_]
L-serine
(1)
[119][_]
L-threonine
(1)
[120][_]
L-tryptophane
(1)
[121][_]
L-valine
(1)
[122][_]
p-aminobenzoic acid
(1)
[123][_]
7,50-Biotine
(1)
[124][_]
choline
(1)
[125][_]
cyanocobalamine
(1)
[126][_]
Folinate
(1)
[127][_]
3,75-Myo-inositol
(1)
[128][_]
7,50-Niacinamide
(1)
[129][_]
Pantethine
(1)
[130][_]
3,75-Citrate
(1)
[131][_]
Pantothenate
(1)
[132][_]
pyridoxal Phosphate
(1)
[133][_]
Pyridoxamine
(1)
[134][_]
Pyridoxine
(1)
[135][_]
7,50-Thiainine HCl
(1)
[136][_]
madurose
(1)
[137][_]
3-o-methyl-D-galactose
(1)
[138][_]
P-I
(1)
[139][_]
phosphatidyl glycerol
(1)
[140][_]
ISO7
(1)
[141][_]
hypoxanthine
(1)
[142][_]
arabinose
(1)
[143][_]
raffinose
(1)
[144][_]
rhamnose
(1)
[145][_]
mucate
(1)
[146][_]
Nitrate
(1)
[147][_]
Adenine
(1)
[148][_]
d-galactose-d
(1)
[149][_]
d-mannose-d
(1)
[150][_]
l-inositol
(1)
[151][_]
d-raffinose
(1)
[152][_]
mucic acid
(1)
[153][_]
ammonium
(1)
[154][_]
sulfate
(1)
[155][_]
carbonate
(1)
[156][_]
phosphate
(1)
[157][_]
boron
(1)
[158][_]
molybdenum
(1)
[159][_]
copper
(1)
[160][_]
silicate
(1)
[161][_]
aluminium
(1)
[162][_]
ethylene chloride
(1)
[163][_]
acetonitrile
(1)
[164][_]
dioxan
(1)
[165][_]
methyl chloride
(1)
[166][_]
t-butanol
(1)
[167][_]
tetra-1e-methylene chloride
(1)
[168][_]
heptaneOn
(1)
[169][_]
Darco
(1)
[170][_]
hydrochloric acid
(1)
[171][_]
a-726
(1)
[172][_]
quide
(1)
[173][_]
Physical
(103/ 218)
[174][_]
100 ml
(20)
[175][_]
de 500 ml
(12)
[176][_]
0,1 %
(9)
[177][_]
100 %
(9)
[178][_]
1,5 %
(9)
[179][_]
0,5 %
(8)
[180][_]
0,3 %
(8)
[181][_]
20 M
(4)
[182][_]
80 M
(4)
[183][_]
500 ppm
(4)
[184][_]
1,0 %
(4)
[185][_]
3,0 %
(4)
[186][_]
5 % de
(4)
[187][_]
10 ml
(4)
[188][_]
2,0 %
(3)
[189][_]
25 ml
(3)
[190][_]
0,2 %
(3)
[191][_]
de 300 litres
(3)
[192][_]
6 N
(3)
[193][_]
2 litres
(3)
[194][_]
23024 l
(2)
[195][_]
5,0 %
(2)
[196][_]
500,0 mg
(2)
[197][_]
250 ppm
(2)
[198][_]
25 pl
(2)
[199][_]
4000 ppm
(2)
[200][_]
10 %
(2)
[201][_]
15 %
(2)
[202][_]
1,5 % de
(2)
[203][_]
de 30 litres
(2)
[204][_]
de 600 ml
(2)
[205][_]
500 ml
(2)
[206][_]
1 N
(2)
[207][_]
400 ml
(2)
[208][_]
50110-ppm
(1)
[209][_]
de 20 M
(1)
[210][_]
de 256 pg/ml
(1)
[211][_]
1,2 %
(1)
[212][_]
4,0 %
(1)
[213][_]
17 % de
(1)
[214][_]
41 % de
(1)
[215][_]
60 % de
(1)
[216][_]
30,0 %
(1)
[217][_]
125,0 mg
(1)
[218][_]
4,4 mg
(1)
[219][_]
27,5 mg
(1)
[220][_]
8,8 mg
(1)
[221][_]
1,43 mg
(1)
[222][_]
1,1 mg
(1)
[223][_]
100 % de
(1)
[224][_]
10 ppm
(1)
[225][_]
62,5 ppm
(1)
[226][_]
31,25 ppm
(1)
[227][_]
de 31,25 ppm
(1)
[228][_]
1,4 micron
(1)
[229][_]
1 l
(1)
[230][_]
2,5 %
(1)
[231][_]
1 %
(1)
[232][_]
2,0 litres
(1)
[233][_]
20 d
(1)
[234][_]
10-40 %
(1)
[235][_]
de 20 litres
(1)
[236][_]
12 litres
(1)
[237][_]
288 litres
(1)
[238][_]
300 litres
(1)
[239][_]
de 1500 litres
(1)
[240][_]
de 2 litres
(1)
[241][_]
250 litres
(1)
[242][_]
0 %
(1)
[243][_]
3 %
(1)
[244][_]
3000 litres
(1)
[245][_]
de 7 cm
(1)
[246][_]
de 91 cm
(1)
[247][_]
3 litres
(1)
[248][_]
de 80 ml
(1)
[249][_]
90,4 g
(1)
[250][_]
33,1 g
(1)
[251][_]
12,4 g
(1)
[252][_]
6,7 g
(1)
[253][_]
8 litres
(1)
[254][_]
4 litres
(1)
[255][_]
de 5 cm
(1)
[256][_]
de 86 cm
(1)
[257][_]
3 g
(1)
[258][_]
1 ml
(1)
[259][_]
de 17 ml
(1)
[260][_]
1269 mg
(1)
[261][_]
2,4 g
(1)
[262][_]
160 ml
(1)
[263][_]
300 ml
(1)
[264][_]
5 N
(1)
[265][_]
de 150 ml
(1)
[266][_]
402 mg
(1)
[267][_]
5,0 g
(1)
[268][_]
50 ml
(1)
[269][_]
de 200 ml/minute
(1)
[270][_]
de 200 ml
(1)
[271][_]
280 mg
(1)
[272][_]
de 90 mg
(1)
[273][_]
0,1 N
(1)
[274][_]
0,495 %
(1)
[275][_]
0,440 %
(1)
[276][_]
0,06 %
(1)
[277][_]
Organism
(27/ 103)
[278][_]
ACTINOMADURA
(40)
[279][_]
nematode
(10)
[280][_]
soja
(9)
[281][_]
actinomycetes
(6)
[282][_]
Staphylococcus aureus
(4)
[283][_]
C elegans
(4)
[284][_]
Enterococcus
(3)
[285][_]
Eimeria tenella
(3)
[286][_]
Bacillus subtilis
(3)
[287][_]
Streptococcus
(2)
[288][_]
Eimeria acervulina
(2)
[289][_]
Turbatrix aceti
(2)
[290][_]
Micrococcus
(1)
[291][_]
Caenorhabditis
(1)
[292][_]
C briggsae
(1)
[293][_]
Ostertagia circumcincta
(1)
[294][_]
T Colubriformis
(1)
[295][_]
T Axei
(1)
[296][_]
N dubius
(1)
[297][_]
Streptomyces
(1)
[298][_]
Nocardia coeliaca
(1)
[299][_]
Nocardia autotrophica
(1)
[300][_]
Actinomadura macra
(1)
[301][_]
Actinomycetes and Related Organisms
(1)
[302][_]
Actinomadura pelletieri
(1)
[303][_]
Staphylococcus
(1)
[304][_]
Caenorhabditis elegans
(1)
[305][_]
Generic
(21/ 80)
[306][_]
acid
(16)
[307][_]
salts
(15)
[308][_]
cations
(8)
[309][_]
ether
(8)
[310][_]
amine
(7)
[311][_]
carbons
(4)
[312][_]
amino acids
(4)
[313][_]
carbohydrates
(3)
[314][_]
organic acids
(2)
[315][_]
addition salt
(2)
[316][_]
sugar
(1)
[317][_]
carboxylic acids
(1)
[318][_]
alkyl
(1)
[319][_]
vitamin A
(1)
[320][_]
phospholipid
(1)
[321][_]
nitrates
(1)
[322][_]
polypeptides
(1)
[323][_]
anions
(1)
[324][_]
alcohol
(1)
[325][_]
mineral acid
(1)
[326][_]
hydrocarbon
(1)
[327][_]
Chemical Role
(7/ 72)
[328][_]
antibiotic
(46)
[329][_]
Pigments
(11)
[330][_]
nematocide
(9)
[331][_]
vitamins
(3)
[332][_]
antiseptic
(1)
[333][_]
antagonistic
(1)
[334][_]
anthelmintic
(1)
[335][_]
Gene Or Protein
(22/ 43)
[336][_]
Etre
(10)
[337][_]
Proteins
(6)
[338][_]
Acti
(3)
[339][_]
Frac
(3)
[340][_]
Pnm
(2)
[341][_]
Dtera
(2)
[342][_]
Tre
(2)
[343][_]
CES
(1)
[344][_]
Tir
(1)
[345][_]
Vitamin E 2
(1)
[346][_]
Est-a
(1)
[347][_]
Cl 2
(1)
[348][_]
Adenosine-3
(1)
[349][_]
Exn
(1)
[350][_]
Ris
(1)
[351][_]
Grou
(1)
[352][_]
Dpl
(1)
[353][_]
Fii
(1)
[354][_]
Vante
(1)
[355][_]
TSC
(1)
[356][_]
Est Gene
(1)
[357][_]
Npm
(1)
[358][_]
Polymer
(4/ 12)
[359][_]
Starch
(6)
[360][_]
Polyether
(4)
[361][_]
Silicone
(1)
[362][_]
Sephadex
(1)
[363][_]
Substituent
(7/ 11)
[364][_]
methylene
(5)
[365][_]
methoxy
(1)
[366][_]
carboxyl
(1)
[367][_]
chloro
(1)
[368][_]
butyl
(1)
[369][_]
nitro
(1)
[370][_]
azo
(1)
[371][_]
Disease
(3/ 6)
[372][_]
Tic
(3)
[373][_]
Infections
(2)
[374][_]
Hemolytic
(1)
[375][_]
Company Reg No.
(2/ 2)
[376][_]
CP-47,433
(1)
[377][_]
CP-47,434
(1)
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Images Mosaic View
Publication
_________________________________________________________________
Number FR2515207A1
Family ID 34604070
Probable Assignee Alpharma Inc
Publication Year 1983
Title
_________________________________________________________________
FR Title AGENTS ANTIBACTERIENS LL-C23024 B ET IOTA, LEUR PROCEDE DE
PREPARATION ET MICROORGANISME ACTINOMADURA YUMAENSE NRRL 12515
Abstract
_________________________________________________________________
L'INVENTION CONCERNE DES AGENTS ANTIBACTERIENS ET ANTICOCCIDIENS
APPELES LL-C23024A, LL-C23024B ET LL-C23024 IOTA, UN NOUVEAU
MICROORGANISME ACTINOMADURA YUMAENSE SP. NOV. ET SES MUTANTS, ET UN
NOUVEAU PROCEDE POUR LA PREPARATION DE CES AGENTS.
Description
_________________________________________________________________
L'invention concerne des agents antibacteriens et anticoccidiens
appeles
LL-C 23024 a, $ et iota, un nouveau
microorganisme Actinomadura yumaense sp nov ou ses mu-
tants. L'invention concerne en outre un nouveau procede pour la
production des antibiotic LL-C 23024 (, 3 et iota, par fermentation
dans des conditions determinees du nouveau
microorganisme Actinomadura yumaense sp nov.
L'antibiotic LL-C 23024 a repond a la structure suivante: o Me Me
"&#x003E;/&#x003E;; i Me OH Me \ Oe O Me 4 %O M e Me O H v KH 'oOI 4 e
H H H OR COOH Mle
L'antibiotic LL-C 23024 $ de l'invention se dis-
tingue des composes de la technique anterieure par ses ca-
racteristiques physiques et chimiques, comprenant, mais de
maniere non exhaustive, sa microanalyse, son pouvoir rota-
toire, son spectre infrarouge, son spectre de resonance magnetique
nucleaire de 13 C et son spectre de resonance magnetique nucleaire de
H.
L'antibiotic LL-C 23024 f a la structure presu-
mee suivante: 0 o H 3 OH H 3 C %",,,s XCH 3 H 3 c 3 O? O Rc H CH HOH H
3 C OH, or HC H
0 H 3
CCQH CH 3
dans laquelle R 1 et R 2 sont differents et sont choisis par-
mi l'hydrogen et CH 3.
La structure presumee ci-dessus est basee sur
l'analyse elementaire, le pouvoir rotatoire, la masse mole-
culaire calculee par spectroscopie de masse, par desorption du champ,
le point de fusion, le spectre infrarouge (IR), le spectre de
resonance magnetique nucleaire de 13 C (RMN de 13 C) et la resonance
magnetique du proton (RMN de 1 H), tel que detaille dans les exemples
et represente sur les figures des dessins annexes representant
respectivement:
Figure 1: le spectre IR du LL-C 23024 B dans K Br.
Figure 2: le spectre RMN de 13 C du LL-C 23024 S 20 M Hz
dans CDC 13, etalon de reference interne tetra-
methylsilane (tetramethyl-silane).
Figure 3: le spectre RMN de 1 H du LL-C 23024 S 80 M Hz
dans CD Cl 3, etalon de reference interne tetramethyl-silane.
TABLEAU I
Spectre RIN de 13 C de LL-C 23024 B (opm oar rapport a
tetramethyl-silane) Deplacement chimique (ppm) Nombre d'atomes de
carbon
,5 1
11,O 1
12,2 1
17,0 1
17,7 1
17,9 1
22, 3 26, i 26, 8 27, 6, 2 32, O 33, 3 33, 7 33, 8 36, 5 36, 8 39,0
39, 9, 5 57, 1 59, 1, 7 66, 9 67, 6, 2 71, 3 72, 9 74, 9, 1 79, 9, 8
82, 1 84, 5 84, 7, 6 86, 9, 8 96, 9 97, 7
107, 5
179, 2
carbons tiotauxl i i i i Le LL-C 23024 iota est un nouvel antibiotic a
base de polyether ayant une tres puissante activite anticoc-
cidienne Il est au moins dix fois plus puissant que la plu-
part des autres polyethers connus Les donnees du spectre de masse par
desorption du champ indiquent qu'il a une masse
moleculaire de 930, qui avec son spectre de resonance magne-
tic nucleaire de 13 C permet de proposer une formule mole-
culaire possible de C 48 H 82017 Le LL-C 23024 iota semble pos-
seder quatre groupes methoxy, le meme sugar que celui obser-
ve dans l'antibiotic de polyether X-14868 A (brevet US
4 278 663) et un groupe carboxyl Le seul autre antibioti-
que de polyether dont la masse moleculaire est de 930 est l'antibiotic
A 28595 B (hydroxyseptamycine) T Antibiotics 33 ( 2): 252 ( 1980)l
dont la structure et les proprietes
biologiques sont tres differentes Les observations ci-des-
sus sont basees sur l'analyse elementaire, le pouvoir rota-
toire, la masse moleculaire calculee par spectroscopie de masse par
desorption du champ, le spectre IR, le spectre de RMN de 13 C et le
spectre de resonance magnetique nucleaire du proton (RMN de 1 H), tel
que detaille-dans les exemples et dans les figures des dessins annexes
qui representent respectivement:
Figure 4: le spectre IR du LL-C 23024 iota dans K Br.
Figure 5: le spectre RMN de 1 H du LL-C 23024 iota 80 M Hz
dans CD C 13, etalon de reference interne tetramethyl-silane.
Figure 6: le spectre RMN de 13 C du LL-C 23024 iota.
Figure 7: le spectre RMN de 13 C du LL-C 23024 iota (echelle agrandie:
50110-ppm) 20 M Hz dans CDC 13,
etalon de reference interne tetramethyl-silane.
Figure 8: le spectre RMN de 13 C du LL-C 23024 iota (echelle agrandie:
50110 pnm) 20 M Hz dans CD C 13,
etalon de reference interne tetramethyl-silane.
On a obtenu les spectres de RMN de 13 C du LL-
C 23024 iota dans le chloroform deuterie (CDC 13) a une in-
tensite de champ de 20 M Hz Les pics avec leurs deplace-
ments chimiques respectifs en parties par million par rap-
port au tetramethyl-silane (tetramethyl-silane) et le nombre evalue de
carbons oar chloroform, Dic sont rapportes dans le tableau II Pour le
on a observe des pics a 75,4, 77,0 et 78,6.
TABLEAU II
Deplacement Nombre de Deplacement Nombre de chimique carbons chimique
carbons,6,9 11,7 16,4 17,6 18,0 21,7 22,9 24,1 28,2 31,2 32,2 33,4 33,
8 34,2 36,7 37,2 39,4, 3 44,5,5 47,6 56, 8 59, 9, 8 68,5 68,8 71,3 72,
2 76,1 76,9 78,5 81,0 81,3 81,8 84,8,3,6 86,8 88,5,9 97, 9 99,6
107, 2
173,0 Total Les antibiotic LL-C 23024 a, e et iota sont des carboxylic
acids organiques et sont donc capables de
former des salts avec des cations non-toxiques, pharmaceuti-
quement acceptables C'est ainsi que des salts obtenus en melangeant
l'antibiotic libre avec des quantites
stoechiometriques de cations, avantageusement dans un sol-
vant neutre, peuvent etre formes avec des cations tels que
les cations sodium, potassium, calcium, magnesium et ammo-
nium, ainsi qu'avec des cations amine organique tels qu'une tri-(alkyl
inferieur)amine (par exemple la triethylamine, la triethanolamine), la
procaine et similaires Les salts catio- niques de l'antibiotic LL-C
23024 e sont generalement des solides cristallins, relativement
insolubles dans l'water et solubles dans la plupart des solvants
organiques usuels tels
que le methanol, l'ethyl acetate, l'acetone, le chloro-
forme, l'heptane, l'etheret le benzene Pour les buts de l'invention,
l'antibiotic libre est equivalent a
ses salts non toxiques pharmaceutiquement acceptables.
Les antibiotic LL-C 23024 l et iota sont actifs in vitro contre les
bacteries gram-positives selon le test de dilution sur gelose,
standard Les resultats sont donnes en concentrations inhibitrices
minimales (CIM) en pg/ml dans les tableaux III et IV Les antibiotic
LL-C 23024 $ et iota ne sont pas actifs contre les organismes
gram-negatifs
a des concentrations de 256 pg/ml ou moins.
TABLEAU III
Activite antibacterienne in vitro du LL-C 23024 e
Organisme Concentration inhibi-
trice minimale(pg/ml) Staphylococcu il Streptococcus il Enterococcus
ll is aureus Smith
SSC 80-11
" SSC 80-32
" SSC 80-38
" LL-14
" LL-45
LL-27
" ATCC 25923
pyogenes C 203 B-hemolytic Keller T 623 pneumoniae 78-1
SSC-80-62
SSC-80-63
TABLEAU IV
Activite antibacterienne in vitro du LL-C 23024 iota
Organisme Concentration inhibi-
trice minimale(pg/ml) LL-C 23024 iota Enterococcus OSU 75-1 1
Enterococcus SM 77-15 1 Staphylococcus aureus SSC 79-18 1
Staphylococcus aureus FU 79-19-2 2 Micrococcus lutea PCI 1001 1
Staphylococcus aureus Smith 0,5 Staphylococcus aureus ATCC 25923 0,5
Comme demontre par les donnees ci-dessus, les
antibiotic LL-C 23024 a, B et iota inhibent la multipli-
cation de certaines bacteries gram-positives et sont donc utilisables
comme antiseptic topiques et de surface dans des solutions de lavage
pour la peau, les appareils, les murs, les sols, etc.
On a egalement trouve que les agents antibacte-
riens LL-C 23024 a, 1 et iota sont actifs in vivo comme a-
gents anticoccidiens chez les volailles, comme demontre
par les tests suivants.
Deux jours avant l'inoculation, on a donne a dif-
ferents groupes de poussins ages d'un jour un aliment conte-
nant differents taux de medicament L'aliment pour volailles utilise
dans le test est prepare comme suit: Premelange de vitamins et d'amino
acids 0,5 % Mineraux a l'etat de traces 0,1 % sodium chloride 0,3 %
Phosphate dicalcium 1,2 % Calcaire broye 0,5 % Graisse stabilisee 4,0
% Luzerne deshydratee, a 17 % de proteins 2,0 % Farine de gluten de
mais a 41 % de proteins 5,0 % Farine de poisson de menhaden a 60 % de
proteins 5,0 % Farine de soja a 44 X de proteins 30,0 % Mais jaune
broye, fin complement a 100 % Le pre-melange de vitamins et d'
amino acids
dans la composition d'aliment ci-dessus est prepare a par-
tir de la formulation suivante Les quantites sont expri-
mees en unites par kg de la composition d'aliment complete.
Hydroxy-toluene butyl 125,0 mg dl-methionine 500,0 mg vitamin A 3300,0
U I. vitamin D 3 1100,0 UCI Riboflavine 4,4 mg vitamin E 2,2 U I.
niacin 27,5 mg pantothenic acid 8,8 mg
15207
choline chloride 500,0 mg folic acid 1,43 mg Bisulfate sodium de
medianone 1,1 mg vitamin B 12,O; ig Mais jaune broye, fin complement a
SO g
On a inocule les poussins experimentaux par inocu-
lation directe dans le jabot de chaque poussin avec un ino-
culum mixte de 5000 oocystes sporules de Eimeria acervulina et d'un
nombre suffisant d'oocystes de Eimeria tenella de
maniere a produire de 85 a 100 % de mortalite chez les te-
moins non traites Les poussins pouvaient se nourrir et
boire de l'water a volonte pendant toute la periode d'essai.
Sept jours apres l'inoculation, on a arrete les essais et pese les
poussins, nuis on les a autopsies et examine leur
tractus intestinal quant a des lesions possibles Les re-
sultats sont reportes dans les tableaux V et VI ci-dessous et montrent
qu'une survie amelioree des poussins infectes est obtenue lorsqu'on
administre dans le regime 10 ppm ou
moins d'antibiotic LL-C 23024 B ou iota Les resultats mon-
trent egalement une suppression significative des lesions
intestinales dues a Eimeria tenella et Eimeria acervulina.
TABLEAU V
Evaluation de l'antibiotic LL-C 23024 8 comme agent anticoccidien chez
les poussins Compose Concentration Nombre de % de % de Doussins avec
des lesions reduites dans le regime poussins survie E E. ppm au depart
tenella acervulina
LL-C 23024 B 15 3 100 100 100
LL-C 23024 B 10 5 100 60 100
LL-C 23024 B 5 5 80 O 100
NNC* O 15 46,6 O o
LL-C 23024 B 120 15 100 100 100
15 100 100 100
15 100 100 100
O 15 20 O o
NNC 15 100
LL-C 23024 B 20 15 100 87 100
15 100 60 100
15 60 O o
15 47 7 O
vi
O 15 27 O O
NNC 15 100
NNC = temoin non traite, non infecte.
TABLEAU VI
Evaluation de l'antibioticque LL-C 23024 iota comme aqent
anticoccidien chez les poussins Concentration Nombre de % de % de
Doussins avec des lesions reduites dans le regime poussins survie E E.
ppm tenella acervulina
5 100 100 100
5 100 100 100
5 60 20 60
O 15 20 O O
10 100 100 100
7,5 10 100 70 100
PO Ln 1
Les tests suivants demontrent l'activite nemato-
cide. Exemn Dle A.
Evaluation des compositions d'essai quant a l'activite nema-
tocide en utilisant le nematode microbivore hermaphrodite
independant Caenorhabditis eleqans II.
Dans les tests suivants, on utilise C elegans
pour determiner l'activite nematocide du bouillon de iron-
mentation et de la bouillie recoltee preparee par le proce-
de de l'invention Cet organisme est egalement utilise pour evaluer les
LLC 23024 a et LL-C 23024 e pour determiner leur
activite nematocide.
Dans ces tests, le bouillon de fermentation est constitue du melange
de liquide et de matieres solides de fermentation avant que les
matieres solides, c'est-a-dire la bouillie recoltee, ne soient
separees du liquide La bouillie recoltee est constituee des matieres
solides apres
la separation.
Pour evaluer la bouillie recoltee, on disperse les matieres solides de
la bouillie recoltee dans de l'water distillee, 1:1 Le bouillon de
fermentation est utilise tel
quel et contient un liquide et des matieres solides.
Dans les evaluations presentes, C elegans est
maintenu dans un milieu d'entretien de C briggsae Le mi-
lieu d'entretien est commercialise par la firme Grant Island
Biological Company, Grant Island, New-York, et a la composition
suivante: Milieu d'entretien de C briciaqsae( 1) Constituant mq C/l
salts MINERAUX
Ca Cl 2 2 H 20 220,50 Cu C 12 2 H 20 6,50 Fe(NH 4)2 ( 504)2 6 H 20
58,80
KH 2 PO 4 1225,50
KOH (a) Mn C 12 4 H 20 22,20 Zn C 12 _ 10,20
AUTRES CONSTITUANTS
N-acetylglucosamine 15,00 acidadenosine-3 '-( 2 ')-phosnhorique H 20
365,00 acidcytidine-3 '-( 2 ')-phosphorique 323,00 D-glucose 1315,00
Glutathione, reduit 204,00 Guanosine-3 '-( 2 ')-PO 4 Na 2H 20 363,00
magnesium Citrate 5 H 20 (dibasique) 915,00 potassium Citrate H 20
486,00 dl-thioctic acid 3,75-Thymine 126,00 aciduridine-3 '-( 2
')phosohorique 324,00
amino acids
L-alanine 1395,00 L-arginine 975,00 L-aspartic acid 1620,00 L-cysteine
HCl H 20 28,00 L-glutamate (Na) H 20 550,00 L-glutamine 1463,00
Glycine 722,00 L-histidine 283,00 L-isoleucine 861,00 L-leucine
1439,00 L-lysine HCl 1283,00 L-methionine 389,00 L-phenylalanine
803,00 L-proline 653,00 L-serine 788,00 L-threonine 717,00
L-tryptophane 184,00 L-tyrosine 272,00 L-valine 1020,00
vitaminS
p-aminobenzoic acid 7,50-Biotine 3,75 acidde choline 88,50
cyanocobalamine (B 12) 3,75 Folinate (Ca) 3,75-Myo-inositol 64,50
niacin 7,50-Niacinamide 7,50 Pantethine
3,75-Citrate
Pantothenate (Ca) 7,50-
Acide pterolyglutamiquacid 7,50 pyridoxal Phosphate 3,75 Pyridoxamine
2 H Cl 3,75 Pyridoxine H Cl 7,50 Riboflavine-5 '-P 04 (Na)2 H 20
7,50-Thiainine HCl 7,50 References: ( 1) Hansen E L, Proc Soc Exn Bio
and Med 121: 30-393
( 1966).
Remarques:
(a) Quantite necessaire pour regler le p H a 5,9 + 0,1.
Pour les evaluations, on utilise une plaque a puits comportant une
serie de petits puits Dans chacun des puits, on depose aseptiquement
25 ml de bouillon de
fermentation, d'une suspension 1:1 dans l'water de la bouil-
lie recoltee, ou d'une solution aqueuse acetonique de LL-C 23024 a ou
de LL-C 23024 f contenant de 31,25 A 500 ppm du compose d'essai On
depose alors dans chaque puits 25 ml du milieu d'entretien C elegans
contenant de 10 a 20 vers
adultes, plus des larves de differents ages, plus des oeufs.
On Dlace les plaques sous une hotte et on les examine 48 heures apres
l'inoculation pour evaluer la vitesse et le degre d'activite
nematocide des compositions d'essai Les
donnees obtenues sont reportees ci-dessous Lorsqu'on ob-
serve l'activite du bouillon de fermentation, on dilue le bouillon de
maniere a avoir un rapport bouillon/C elegans
de 1:4.
TABLEAU VII
Composition Concentration Activite ppm ou nematocide dilution apres 48
heures Bouillon de fermentation D= 1:1 8 (pas de motilite)
D= 1:4
Bouillie recoltee LL-C 23024 a 500 ppm 7 250 ppm 7 pnm 7 62,5 ppm 6
31,25 ppm O LL-C 23024 B 500 ppm 7 250 ppm O Les chiffres utilises
nour evaluer l'activite dans ce tableau ont les significations
suivantes: Valeur d'activite: 8 = pas de motilite (mort apparente) 7 =
motilite nettement reduite 6 = motilite reduite O = motilite normale
pour l'espece Exem Dle B. Evaluation du LL-C 23024 a comme agent
nematocide contre des
larves infectieuses++ de nematodes de ruminants.
L'evaluation de LL-C 23024 a comme agent nematoci-
de contre les larves infectieuses de nematodes de ruminants:
Haemonhmus contortus, Ostertagia circumcincta, Trichostron-
gylus axei, T Colubriformis; et contre l'anguillule du
vinaigre, Turbatrix aceti, est faite en remplacant C ele-
gans par les especes de nematodes mentionnees ci-dessus.
Les donnees obtenues sont reportees dans le ta-
bleau ci-dessous.
+ Larves enrobees au troisieme stade.
Concentration in vitroa de LL-C 23024 a, Dom
TABLEAU VIII
Activite contre (apres 48 heures)
H Contort.
0 Circum.
T Axei T Colub T Aceti 500 8 8 b 8 b 8 6 250 7 8 b 8 b 7 6
7 7 7 6 6
625 7 6 7 6 6
31,25 6 6 O 6 6
0 (temoin) 0 O O O O
a Sur des plaques de culture de tissu a 96 puits, X 14868 A, preparees
dans de l'water bidistil-
lee: 25 pl de solution de LL-C 23024 a et 25 pl de culture de nematode
ajoutes par puits.
Valeur d'activite: 8 = aucune motilite (mort apparente) 7 = motilite
nettement reduite 6 = motilite reduite 0 = motilite normale pour
l'espece
bdans les 24 heures.
a'1 ru Ln VI -:x r%&#x003E; o,-a
15207
Exemole C. Evaluation de l'activite nematocide de l'antibiotic LL-C
23024 a contre Nematosniroides dubius et Aspicularis
tetra Dtera chez les souris.
Dans les tests suivants, on a infecte des souris blanches femelles,
SwissWebstern avec Nematospiroides
dubius et Aspicularis tetraptera et on a attendu trois se-
maines pour permettre la maturation des infections.
Apres la periode d'attente, on repartit les sou-
ris au hasard en groupes de 4 animaux et on place les grou-
pes dans des cages separees On donne alors a volonte aux
souris pendant une semaine des aliments medicamentes conte-
nant environ de 31,25 ppm a 4000 ppm du compose d'essai.
Pendant la periode d'essai, de l'water est egalement fournie a volonte
Pendant la periode de traitement, on examine les excrements des souris
pour verifier si des vers ont ete rejetes Dans tous les groupes
traites, on a observe le rejet de vers, indiquant ainsi l'activite
nematocide a
toutes les concentrations du compose contre les deux nema-
todes A la fin du traitement d'une semaine avec un aliment
medicamente, on autopsie les souris et on examine les te-
neurs en vers dans les voies intestinales Les donnees ob-
tenues sont reportees ci-dessous en % de reduction des vers
par rapport a des temoins non medicamentes, infectes.
Dans ces tests, on a evalue les bouillons de iron-
mentation bruts obtenus avec la recolte de la bouillie et
contenant de 1000 A 4000 ppm de l'antibiotic nematocide.
On a evalue egalement une souris nourrie avec un aliment contenant de
31, 25 A 500 ppm de LL-C 23024 a dissous dans
un melange acetone/water 1:1.
Composition Concentration Activite d'essai dietetique (% de reduction)
(opm) contre N dubius A tetra Dtera Bouillon de
*fermentation+ 4 000 73 -
avec LL-C 23024 a 2 000 44 53 LL-C 23024 a 1 000 65 33
500 70 SA
250 63 SA
61 SA
62,5 29 SA
31,25 32 SA
+ = quantite de LL-C 23024 a non determinee, ++ = legere
activite:nombre accru de vers pinworms recuperes dans l'examen fecal,
= comparee avec des temoins non medicamentes, infectes.
Les nouveaux agents antibacteriens et anticocci-
diens de l'invention sont formes pendant la culture
d'Actinomadura yumaense so nov dans des conditions deter-
minees. Une souche representative de ce microorganisme a ete isolee a
partir d'un echantillon de sol recueilli dans Yuma County, Arizona et
est conservee dans la collection de cultures de la Lederle
Laboratories Division, American Cyanamid Company, Pearl River,
New-York, sous le numero de
culture LL-C 23024 Une culture viable de cette souche re-
presentative a ete deposee au Culture Collection Laborato-
ry, Northern Regional Center, U S Department of Agricul-
ture, Peoria, Illinois 61604 et a ete ajoutee a sa collec-
tion permanente sous le numero d'admission NRRL 12515.
Caracterisation taxonomique de NRRL 12515.
La souche NRRL 12515 a ete taxonomiquement ca-
racterisee et identifiee comme la souche type d'une nou-
velle espece du genre Actinomadura, sous l'appellation
"Actinomadura Yumaense sp nov ".
Les caracteristiques de culture, physiologiques et morphologiques de
la souche representative 12515 ont ete observees en utilisant les
procedes decrits en detail
par E B Shirling et D Gottlieb dans "Methods for charac-
terization of Streptomyces species", Internat J 5 y Sto Bacteriol 16:
313340 ( 1966) et R E Gordon et al, "Nocardia coeliaca, Nocardia
autotrophica and the nocardin
strain", Internat J Syst Bacteriol 24: 54-63 ( 1974).
Les milieux utilises dans cette etude ont ete choisis parmi ceux
recommandes Par T G Pridham et al, "A selection of
media for maintenance and taxonomic study of Streptomyce-
tes", Antibiotics Ann, pp 947-953 ( 1956/1957); G F Gauze
et al, "Problems in the classification of antagonistic ac-
tinomycetes", State Publishing House for Medical Litterature, Medgiz,
Moscou ( 1957); et R E Gordon et al voir ci-dessus, pour l'etude
taxonomique des actinomycetes et des bacteries du sol La composition
chimique des parois cellulaires du microorganisme a ete determinee en
utilisant la methode de H.A Lechevalier et al,"Chemical composition as
a criterion
in the classification of actinomycetes", Adv Ap Dpl Micro-
biol 14: 47-72 ( 1971) Les modeles de phospholipides ont ete
determines par la methode de M P Lechevalier et al. "Chemotaxonomy of
aerobic actinomycetes: phospholipid composition", Biochem Syst Ecol 5:
249-260 ( 1977) Les details sont reportes dans les tableaux IX a XIV,
et une
description generale de la culture est donnee ci-dessous.
Les couleurs descriptives soulignees sont prelevees dans K.L Kelly et
D B Judd, "Color, Universal Language and Dictionary of Names", U S Nat
Bur Stand Spec Publ. 440, Washington D C ( 1976) et l'Inter-Society
Color
Council, Natl Bur Stand Centroid Color Charts associe.
Les donnees observees pour cette nouvelle espece representee par la
souche NRRL 12515 ont ete comparees avec
les donnees oubliees pour l'espece connue du genre Actino-
madura ti Goodfellow et al, "Numerical Taxonomy of Acti-
nomadura and related actinomycetes", J Gen Microbiol.
122: 95-111 ( 1979); L H Huang, "Actinomadura macra sp.
nov, the producer of antibiotic CP-47,433 and CP-47,434 ", Internat J
Syst Bacteriol 30: 565-568 _( 1980); J Meyer,
"New snecies of the genus Actinomadura", Z Allgem Mikro-
biol 19: 37-44 ( 1979); H Nomura et Y Ohara, "Distribu-
tion of actinomycetes in soil XI "Some new species of the qenus
Actinomadura' Lechevalieret al, "J Ferment Technol. 49: 904-912 (
1971); et T P Preobrazhenskaya et al "Key for identification of the
snecies-of the genus Actinomadura", The Biology of Actinomycetes and
Related Organisms 12:
-38 ( 1977)1 La culture NRRL 12515 offre une legere res-
semblance avec Actinomadura pelletieri, mais ne ressemble a aucune
autre espece decrite et differe de A pelletieri car Plusieurs
caracteristiques La souche NRRL 12515 a donc ete designee comme la
souche type d'une nouvelle espece sous l'appellation Actinomadura
yumaense sp nov en raison
du site de collection de l'echantillon de sol dont on a iso-
le la souche type.
Micromormhologie. Les spores ont la forme de courtes chaines en
spirale (longueur maximale environ 20 spores par chaine) fixees sur
des sporophores ramifies, aeriens, presque tous verticilles Les spores
sont ovoides, et ont de 0,6 a 0,8
micron sur 1,0 a 1,4 micron, avec une surface unie.
Comnosition des parois cellulaires.
Les hydrolysats de la cellule entiere de cette culture contiennent du
madurose ( 3-o-methyl-D-galactose) et le meso-isomere de
l'diaminopimelic acid (diaminopimelic acid) La culture a egalement un
modele de mhospholipides de type P-I et pas d'autres phospholipides
diagnostiques qu'un peu de phosphatidyl glycerol Ces caracteristiques
sont toutes
tres typiques des membres du genre Actinomadura.
Ouantite de croissance.
Une croissance satisfaisante est observee sur de
la gelose de Bennett, de la-gaze no 2 gelose; de la NZ-
amine-amidon-glucose gelose (ATCC milieu 172), de la pate
de tomate-farine d'avoine gelose, et de l'extrait de levu-
re-extrait de malt gelose; une croissance moderee est ob-
servee sur de la gelose de Benedict, du sucrose de Czapek gelose, du
glycerol-asparagine gelose, de la gelose de Hickey-Tresner et de la
farine d'avoine gelose; une croissance mediocre est observee sur du
calcium malate gelose, de la gaze n 1 gelose, et des salts
mineraux-amidon gelose.
Mvcelium vegetatif.
Sur des milieux favorisant une croissance satis-
faisante, on a observe que le mycelium vegetatif s'elevait
et s'enroulait et avait generalement des teintes gris-jau-
natre.
Mycelium aerien et couleur des spores.
Les mycelia aeriens et/ou les masses de spores avaient une couleur
allant du blanc au gris clair 264 La production de mycelia aeriens
etait legere sur la plupart
des milieux.
Pigments solubles.
On a fait les observations suivantes: absence sur de nombreux milieux;
pigment jaune sur les geloses de Benedict et glycerol-asparagine;
pigment jaune-vert sur le calcium malate gelose; pigment brun-verdatre
sur le NZ-amine-amidon-glucose gelose; pigment orange sur les geloses
de Bennett et extrait de levure-extrait
de malt.
Reactions Dhysiologiques.
Aucun pigment de melanine sur peptone-fer gelose et tyrosine gelose
(ISO7); forte peptonisation du lait de tournesol; forte proteolyse de
la gelatine nutritive;
reduction moderee des nitrates; pas d'hydrolyse de l'ade-
nine ou de la guanine; forte hydrolyse de l'hypoxanthine, de la
tyrosine et de la xanthine; faible hydrolyse de l'starch; hydrolyse de
l'esculine; hydrolyse variable
de l'urea Aucune croissance a 4 C, 10 C, ou 55 C; crois-
sance moderee a 25 C et 45 C; croissance satisfaisante a 320 C et 37 C
Utilisation des carbohydrates selon la methode de T G Pridahm et D
Gottlieb "The utilization of
carbon compounds by some actinomycetes as an aid for spe-
cies determination", J Bacteriol, 56: 107-114 ( 1948): bonne
utilisation du glucose, du glycerol et du trehalose; utilisation
moderee du maltose et du sucrose; mauvaise utilisation du fructose, du
galactose, de l'inositol, du mannose, et du melezitose; pas
d'utilisation de l'adonitol, de l'arabinose, du dulcitol, du lactose,
du mannitol, du me-
libiose, du raffinose, du rhamnose, de la salicine, du sor-
bitol et du xylose Production d'acida partir d'carbohydrates par la
methode de Gordon et al, voir ci-dessus: bonne production d'acida
partir du glucose, du glycerol,
du maltose, du sucrose et du trehalose; faible produc-
tion d'acida partir du galactose, de l'inositol et du mannose
Utilisation des organic acids par la methode
de Gordon et ai, voir ci-dessus: utilisation de l'aceta-
te, du malate, du propionate, du pyruvate, du succinate et du
tartrate; pas d'utilisation du benzoate, du citrate,
du lactate, du mucate et de l'oxalate.
TABLEAU IX
Caracteristiques de culture de Actinomadura yumaense NRRL 12515
Incubation: 14 jours Temperature 28 a C Milieu Quantite de Mycelium
aerien et/ou spores Pigment Couleur inverse developnement soluble
Gelose de Moderee a Colonies plates, pulverulentes; jaunatre jaune
pale 89 Benedict faible mycelia aeriens blanc a gris clair Gelose de
Bonne Pas de mycelia aeriens; mycelium orange brun grisatre Bennett
vegetatif enroule grisjaunatre 93 jaunatre fonce 81 a brun jaunatre
grisatre 80 Malate de FaiblMalate Developpement plat; mycelia aeriens
vert jaune verdatre 90 calcium blancs epars jaune gelose sucrose
Faible a Developpement plat; mycelia aeriens nul jaune pale 89 de
Czapek moderee moderes, developpement vegetatif gelose jaune grisatre
o TABLEAU IX (suite) Milieu Quantite de Mycelium aerien et/ou spores
Pigment Couleur inverse develo Dnnement soluble Gaze n 1 Faible
Developpement plat incolore; my nul incolore gelose celia aeriens
blancs epars Gaze n 2 Bonne Colonies elevees enroulees; myce nul jaune
orange gelose lia vegetatifs gris jaunatre 93; fonce 72 mycelia
aeriens moderes blanc jaunatre 92 Glycerol Faible a Colonies nlates,
pulverulentes; jaune jaune pale 89 asparagine moderee mycelia aeriens
blancs gelose Gelose de Moderee Colonies plates cireuses, Mycelia nul
jaune grisatre 90 Hickey aeriens epars, jaune grisatre 90, Tresner
blanc a gris Dapale 264 salts mineraux Faible Colonies plates,
incolores, pulve nul incolore starch rulentes; mycelia aeriens blancs
gelose TABLEAU IX (suite) Milieu Quantite de Mycelium aerien et/ou
spores Pigment Couleur inverse developpement soluble NZ-amine Bonne
Developnement epais, enroule, brun brun brun jaunatre starch jaunatre
grisatre 61 a noir bruna verdatre fonce 78 glucose tre; mycelia
aeriens moderes, gelose blanc a gris pale 264 Farine Moderee
Developpement plat cireux, jaune nul jaune grisatre 90 d'avoine
grisatre 90; mycelia aeriens gelose moderes, blancs Pate de to Bonne
Developpement plat cireux, jaune nul mate farine grisatre fonce 91;
trace de d'avoine mycelia aeriens blancs gelose Extrait de Bonne
Colonies elevees, cireuses, enrou orange brun jaunatre levure lees,
gris jaunatre 93 a brun fonce 78 r L-n Extrait de grisatre jaunatre
80; pas de % malt gelose mycelia aeriens o "
TABLEAU X
Micromor Dhologie de Actinomadura vumaense NRRL 12515 Milieu Mycelium
aerien et/ou structures Forme des Dimension des Surface des s
Doriferes spores spores spores sucrose S Dorophores aeriens; ramifies,
ovoide 0, 6-0,8 im unie M Gelose de presque verticilles; portant des
par Czapek chaines en spirale relativement 1,0-1,4 pm courtes de
spores matures O-
TABLEAU XI
Reaction Dhvsiologique de Actinomadura Yumaense NRRL 12515.
Milieu Periode Quantite Reaction physiologique
d'incubation de deve-
lonpement Peotone 7 jours bonne leger brunissement iron 14 jours bonne
leger brunissement gelose Tyrosine 7 jours moderee pas de pigment
gelose 14 jours bonne pigment jaunatre Lait de 14 jours bonne bonne
peptonisation Litmus 28 jours bonne forte peptonisation Gelatine 14
jours bonne legere proteolyse nutritive 28 jours bonne proteolyse
totale Nitrate 14 jours bonne tres faible reduction Bouillon 28 jours
bonne reduction moderee Adenine 14 jours bonne pas d'hydrolyse gelose
21 jours bonne pas d'hydrolyse Guanine 14 jours bonne pas d'hydrolyse
gelose 21 jours bonne pas d'hydrolyse Hypoxan 14 jours bonne hydrolyse
totale thine 21 jours bonne hydrolyse gelose Tyrosine 14 jours bonne
forte hydrolyse gelose 21 jours bonne forte hydrolyse
15207
TABLEAU XI (suite) Milieu Periode Ouantite Reaction physiologique
d'incubation de deve-
loppement Xanthine 14 jours bonne hydrolyse moderee gelose 21 jours
bonne forte hydrolyse NZ-amine 5 jours Developpement faible ou nul a
40 C, avec ami 10 C et 55 C; modere a 25 C, 28 O C
don solu et 45 C; bon a 320 C et 37 C.
ble et glucose gelose (ATCC Med. n 172) Bouillon 28 jours bonne
decomposition variable urea Esculine 14 jours bonne hydrolyse Bouillon
28 jours bonne hydrolyse starch 5 jours bonne pas d'hydrolyse Gelose
10 jours bonne pas d'hydrolyse
TABLEAU XII
Utilisation de sources de carbon par Actinomadura vumaense MODT 1)t i
Ul, i 1, ui, il-Fii m 'ii 7 r 1 r-+e 1 l(-rhonn
ISP-9.
Incubation: 28 jours Temperature: 28 C Source de carbon Utilisation
Adonitol 1-arabinose Dulcitol Fructose d-galactose-d-glucose Glycerol
iinositol Lactose Maltose d-mannitol d-mannose-d-melezitose
d-melibiose draffinose 1-rhamnose Salicine Sorbitol Sucrose
d-trehalose d-xylose Temoin negatif mauvaise mauvaise bonne bonne
mauvaise passable mauvaise mauvaise passable bonne -
TABLEAU XIII
Production d'acida partir de divers carbohydrates par Actinomadura
vumaense NRRL 12515 sur un milieu d'
nitrogen
mineral basal de Gordon.
Incubation: 28 jours Temperature: 28 C Source de carbon Production
d'acid* 7 jours 28 jours Adonitol 1-arabinose Dulcitol Fructose
dgalactose + d-glucose +++ +++ Glycerol ++ +++ l-inositol + Lactose
Maltose +++ d-mannitol d-mannose + d-melezitose d-melibiose
d-raffinose 1-rhamnose Salicine Sorbitol Sucrose +++ d-trehalose +++
d-xylose Temoin negatif *+++ = forte reponse positive ++ = reponse
positive moderee + = legere reponse positive = reponse negative
TABLEAU XIV
Utilisation d'acides oraaniqueacids oar Actinomadura Vumaense NRRL
12515 sur une modification de Gordon du milieu basal de caelose de
Koser (gelose citrate I - Incubation: 28 jours
de Koser).
Temperature: 28 C + = reponse oositive = reponse negative Il est
evident que le terme Actinomadura yumaense n'est oas limite a la
souche Actinomadura yumaense NRRL
12515 ou a des souches repondant totalement aux caracteris-
tic de developpement et microscopiques ci-dessus, qui
sont donnees uniquement a titre d'illustration Actinomadu-
ra yumaense decrit ici comprend toutes les souches de Acti-
nomadura yumaense qui oroduisent les antibiotic LL-C 23024 a, 8 et
iota et qui ne peuvent oas etre differenciees de facon definie de
Actinomadura yumaense NRRL 12515 et de
ses sous-cultures, comprenant des mutants et leurs varian-
tes Le terme "mutants" englobe les mutants naturels (spon-
tanes) de cet organisme aussi bien que les mutants induits,-
produits a partir de cet organisme Dar differents moyens mutagenes
bien connus des specialistes de la technique,
tels qu'une exposition aux rayons X, aux rayons ultravio-
lets, de la moutarde d'nitrogen, des actinonhages, des nitro-
Source de carbon Utilisation * Acetate +
Benzoate -
Citrate -
Lactate -
Malate +
mucic acid -
Oxalate -
Propionate + Pyruvate + Succinate + Tartrate +
15207
samines et similaires Il est egalement souhaite et voulu
d'inclure les recombinants genetiques inter et intra-spe-
cifiques produits par des techniques genetiques connues des
snecialistes de la technique, telles que par exemple des techniques de
conjugaison, de transduction et de genie ge- netique. La culture de
Actinomadura yumaense peut se faire avec une grande variete de milieux
de culture solides ou
liquides Les milieux qui sont utilisables pour la produc-
tion des antibiotic LL-C 23024 a, e et iota comprennent une source
d'nitrogen assimilable telle que des proteins, un hydrolysat de
protein, des polypeptides, des amino acids,
un siro D de maceration de mais, etc, et des anions et ca-
tions mineraux tels que le potassium, sodium, ammonium, calcium,
sulfate, carbonate, phosphate, chloride, etc Des traces d'elements
tels que le boron, le molybdenum, le copper, etc, sont apportees comme
impuretes d'autres constituants des milieux L'aeration dans les cuves
et les flacons est assuree par un courant d'air sterile force dans le
milieu ou a la surface du milieu de fermentation Une agitation
supplementaire dans les cuves est fournie par une turbine mecanique Un
agent antimousse tel que de l'huile de lard
ou un agent antimousse de silicone peut etre ajoute si ne-
cessaire. L'Actinomadura yumaense est developpe et maintenu
sur des cultures inclinees de gelose, par exemple de la ge-
lose de Bennett, du malt de levure gelose, ou le milieu ATCC N O 172
On prefere le milieu ATCC N O 172 La culture inclinee est inoculee
avec une culture de Actinomadura yumaense et incubee a 28-370 C, de
Dreference vers 321 C, pendant environ 7 jours Ces cultures meres
peuvent etre maintenues Dar des transferts en serie sur des cultures
inclinees de gelose fraiche ou un tampon de la gelose con-
tenant des mycelia provenant de la culture inclinee de ge-
lose bien developpee peut etre utilise pour inoculer les
milieux liquides.
Des inoculations de Actinomadura yumaense en
15207
flacons a secousses sont preparees en inoculant 100 ml de milieu
liquide sterile dans des flacons de 500 ml avec des raclures ou des
water de lavage de spores provenant d'une culture inclinee de gelose
de la culture Des exemples de milieux d'ensemencement appropries sont
donnes ci-dessous. Milieu A Extrait de boeuf 0,3 % Bact A tryptone 1
0,5 % Glucose 1,0 % Extrait de levure 0,5 % water quantite suffisante
pour 100 Peptone, marque deposee de Difco Laboratories Detroit,
Michigan. On ajuste le p H a 6,8 7, 2 avec une base diluee,
par exemple l'sodium hydroxide.
Milieu B Glucose 1,0 % starch 2,0 % Extrait de levure 0,5 % NZ-amine A
2 0,5 % calcium Carbonate 0,1 % water quantite suffisante pour 100 % 2
produit de digestion de la caseine, marque deposee de Sheffield
Chemical Co, Div Nat'l Dairy Products Corp. Norwich, N Y. On prefere
le milieu B. On incube les flacons a une temperature de 25 a C, de
preference a 32 C, et on agite vigoureusement sur un appareil a
secousses rotatif pendant de 1 a 4 jours On utilise alors cet inoculum
d'ensemencement pour inoculer
une culture de fermentation, ou on peut congeler cette cul-
ture et la conserver pour fournir un inoculum pour des cul-
tures d'ensemencement ulterieures.
Les milieux suivants sont des exemples de milieux appropries pour la
fermentation de Actinomadura yumaense
pour produire les antibiotic LL-C 23024 a, $ et iota.
Milieu C Glucose 1,5 % Glycerol 1,5 % Farine de soja 1,5 % calcium
Carbonate 0,1 % sodium chloride 0,3 % water quantite suffisante pour
100 % 3 Peut etre remplacee par une farine de graine de coton ou
des Produits solubles de viande avec un effet egal.
Milieu D Glucose 3,0 % Farine de soja 1,5 % calcium Carbonate 0,1 %
sodium chloride 0,3 % water quantite suffisante pour 100 % Milieu E
starch 1,0 % Melasses 2,0 % Farine de soja 1,5 % calcium Carbonate 0,1
% water quantite suffisante pour 100 X Milieu F Glucose 3,0 % Produits
solubles de viande 2,5 % sodium chloride 0,2 % calcium Carbonate 0, 1
% water quantite suffisante pour 100 % Milieu G Glucose 3,0 % Farine
de soja 0,5 % ammonium Sulfate 0,3 % sodium chloride 0,2 % calcium
Carbonate 0,1 % water quantite suffisante pour 100 % Milieu H Glucose
3,0 % ammonium Sulfate 0,3 % Phos potassium dibasique 0,1 % calcium
Carbonate 0,2 % sodium chloride 0,1 % water Quantite suffisante Dour
100 On prefere le milieu D. La fermentation peut etre effectuee dans
100 ml de milieu dans un flacon de 500 ml inocule avec de 3 a IO %
(volume/volume) d'une culture d'ensemencement preparee comme decrit
ci-dessus et incubee a 25-350 C, de preference vers
32 C, pendant de 24 a 72 heures avec aeration Des echantil-
lons de la culture de fermentation peuvent etre congeles et conserves
pour une utilisation ulterieure comme inoculum
pour des cultures d'ensemencement.
En variante, la fermentation peut etre effectuee dans de plus grandes
cuves de fermentation equipees de moyens d'aeration et d'agitation
Chaque cuve est inoculee avec de 3 a 10 % (volume/volume) d'un
inoculum prepare comme decrit ci-dessus L'aeration est fournie a une
vitesse de 0,5 a 2,0 litres d'air sterile par litre de bouillon par
minute et le milieu de fermentation est agite par une roue
entrainee a 200-400 tours/minute La temperature est mainte-
nue a 25-350 C, de preference a 32 C La fermentation est continuee
jusqu'a ce que l'antibiotic s'accumule dans le milieu de fermentation,
normalement apres 100 a 150 heures,
puis on recolte l'antibiotic.
L'antibiotic peut etre recolte et purifie selon
les procedes decrits dans le brevet US 4 278 663, voir ci-
dessus, ou selon le procede suivant:
On melange le bouillon de fermentation brut conte-
nant la totalite des cellules, prepare comme decrit ci-des-
sus, avec un egal volume d'un solvant organique non hydro-
carbon, immiscible a l'water On prefere le chlorure de mchloride-
thylene ou l'ethyl acetate On separe la phase organique
et on concentre sous vide jusqu'a obtention d'un sirop hui-
leux.
On dissout le sirop huileux dans le methylene chloride et on verse sur
une colonne de gel de silice,
d'alumine, de Sephadex LH-20 d (Pharmacia Fine Chemicals Div.
of Pharmacia, Inc, Piscataway, N J) ou de silicate de msilicate-
gnesium et d'aluminium Comme exemnles de solvants appro-
ories pour le developpement de la colonne, on citera l'ether
diithyliquether, l'ethyl acetate, un melange 1:1 a 1:7 (vo-
lume/volume) de ethylene chloride et d'ethyl ether, l'acetone a 10-40
% dans le methylene chloride, un
alcohol
inferieur a 2 a 10 % (on prefere le methanol) dans le chlo-
rure de methylene, l'acetonitrile a 2 a 15 x dans le chlo-
rure de methylene, ou le dioxan a 2 a 15 % dans le chlo-
rure de methylene On Drefere le melange methyl chloride-
lene/acetate d'ethvlacetate 1:1 (volume/volume) On recueille les
fractions et on verifie la presence d'une activite antibac-
terienne par un dosage biologique contre un organisme sen-
sible, par exemple Bacillus subtilis On combine les frac-
tions actives et on concentre sous vide jusqu'a obtention d'un residu
On dissout ce residu dans un solvant organique,
par exemple le t-butanol (prefere), le benzene ou le p-dio-
xanne et on lyophilise.
On dissout le solide lyophilise dans un solvant organique approprie,
par exemple le methylene chloride,
l'hexane, le methylene chloride/ethyl acetate, l'e-
ther diethylique, l'hexane acetate/ethyl acetate, l'hexane/chlo-
roforme ou l'hexane/etherOn Drefere l'diethyl ether.
On agite cette solution avec de l'water et on ajuste le p H a 1,5-4,0,
de preference vers 2,5 avec un mineral acid dilue quelconque On separe
la phase organique, on lave a l'water pour eliminer tout exces
d'acide, on seche sur un agent dessechant approprie, on filtre et on
concentre sous vide
jusqu'a obtention d'un residu.
On dissout le residu dans un solvant approprie
et on laisse la solution s'evaoorer lentement, de preferen-
ce vers 4 C Comme exemples de solvants an Dropries, on ci-
tetra-1e-methylene chloride, l'hexane, le chlorure de mchloride-
thylene/ethyl acetate, l'diethyl ether, l'hexane/
ethyl acetate, l'hexane/chloroform, ou l'hexane/ether.
On mrefere l'hexane/ether5:2 (volume/volume) On recueille les cristaux
resultants et on lave, de preference vers 40 C avec tout hydrocarbon a
point d'ebullition modere tel que par exemple l'hexane ou l'heptane,
et on seche a l'air pour obtenir comme produit final l'antibiotic
X-14868 A sous forme de l'acidlibre. Si on desire obtenir le produit
sous la forme d'un salt, on peut convertir l'acidlibre par traitement
avec le
cation approprie, de preference sous la forme d'une base mi-
nerale diluee, selon les procedes bien connus des specialis-
tes de la technique.
Les exemples suivants sont donnes a titre d'illus-
tration de l'invention Les milieux A, B, C, etc sont ceux
definis ci-dessus Sauf mention contraire, tous les proce-
des sont effectues a la temperature ambiante (vers 22 C) et
a pression normale ( 101 k Pa).
Exemple 1.
On utilise des spores lavees provenant d'une cul-
ture inclinee sur gelose de Actinomadura yumaense NRRL 12515
pour inoculer un flacon de 500 ml contenant 100 ml d'un mi-
lieu sterile B On incube le flacon sur un appareil a se-
cousses rotatif a 28 C pendant 2 jours.
On transfere ensuite un inoculum a 5 % de cette culture dans 100 ml du
milieu sterile C dans un flacon de 500 ml et on incube a 28 C pendant
5 jours sur un appareil
a secousses rotatif.
On verifie chaque jour la presence d'une activite antibiotic par un
dosage biologique contre Staphylococcus
aureus ATCC 6538 P Bacillus subtilis et Streptococcus fae-
calis, et on verifie l'activite anthelmintic par un dosa-
ge biologique contre le nematode vivant a l'etat libre (in-
dependant) Caenorhabditis elegans.
Exem Dle 2.
On prepare plusieurs flacons de 500 ml, contenant chacun 100 ml d'un
des milieux steriles suivants: Flacon 1: 100 ml du milieu C
Flacon 2: 100 ml du milieu C avec 1,5 % de farine de grai-
ne de coton remplacant la farine de soja
Flacon 3: 100 ml du milieu C avec 1,5 % de produits solu-
bles de viande remplacant la farine de soja Flacon 4: 100 ml de milieu
D Flacon 5:100 ml du milieu E Flacon 6:100 ml du milieu F Flacon 7:100
ml du milieu G On inocule chacun de ces flacons avec un inoculum a 5 %
de Actinomadura yumaense NRRL 12515 developpe dans le
milieu B On incube alors les flacons sur un appareil a se-
cousses rotatif a 28 C pendant 4 a 6 jours.
On trouve que chaque culture a une activite anti-
biotique selon l'essai de l'exemple 1 et une activite anti-
coccidienne contre Eimeria tenella dans des cultures de tis-
su de rein de poussin.
Exemple 3.
* On utilise des cultures de fermentation congelees
de cellules de Actinomadura yumaense NRRL 12515 pour inocu-
ler un flacon de 500 ml contenant 100 ml de milieu sterile B On incube
alors le flacon a 32 C pendant 4 jours sur un
appareil a secousses rotatif.
On transfere alors un inoculum a S e de cette cul-
ture dans 100 ml d'un milieu sterile H dans un flacon de 500 ml et on
incube a 28 C pendant 5 jours sur un appareil
a secousses rotatif.
On confirme l'activite antibacterienne comme dans
l'exemple 1 et l'activite anticoccidienne comme dans l'exem-
ple 2.
On verifie egalement la presence d'une activite antibiotic par
chromatographie en couche mince sur des
plaques de gel de silice developpees dans l'ethyl acetate-
le/chloroform 70:30 (volume/volume).
Exemple 4.
On inocule 100 ml de milieu sterile A dans un fla-
con de 500 ml avec des spores lavees provenant d'une culture inclinee
sur gelose d'Actinomadura yumaense NRRL 12515 On incube le flacon a 32
C pendant 2 jours sur un appareil a
secousses rotatif.
On transfere alors un inoculum a 5 % de cette culture dans 100 ml de
milieu sterile H dans un flacon de 500 ml et on incube sur un appareil
a secousses rotatif a
32 C pendant 2 jours.
On transfere ensuite un inoculum a 5 % de cette culture dans un flacon
de 500 ml contenant 100 ml du milieu sterile H frais et on incube a 28
C pendant 6 jours sur un
appareil a secousses rotatif.
On confirme l'activite antibacterienne comme dans
l'exemple 1.
Exemole 5.
On inocule deux flacons de 500 ml contenant cha-
cun 100 ml de milieu sterile A avec une culture d'ensemen-
cement congelee de Actinomadura yumaense NRRL 12515 et on incube a 32
C pendant 2 jours sur un appareil a secousses rotatif. On combine
alors les contenus des deux flacons et
dans un flacon de 20 litres, on ajoute a 12 litres de mi-
lieu sterile A frais On incube cette culture pendant 2
jours a 28 C en aerant.
On transfere alors le contenu de ce flacon dans une cuve
d'ensemencement de 300 litres contenant 288 litres de milieu sterile
A-et on aere cette culture en agitant
pendant 25 heures a 32 C.
A la fin de la periode d'incubation de 25 heures, on transfere les 300
litres de culture d'ensemencement dans
une cuve de fermentation de 1500 litres contenant 1200 li-
tres de milieu sterile C On incube cette culture en aerant
et en agitant pendant 115 heures a 28 C.
On verifie l'activite antibiotic du bouillon de fermentation par
chromatographie en couche mince sur des
plaques de gel de silice developpees par l'ethyl acetate-
le/chloroform 70:30 (volume/volume) Ou bien, on soumet plusieurs
plaques ainsi developpees a un dosage biologique
contre Bacillus subtilis qui montre la presence d'une acti-
vite antibiotic.
Exemnle 6.
On prepare un milieu typique utilise pour le de-
veloppement d'un inoculum primaire, selon la formule sui-
vante: Extrait de boeuf 0,3 % Bacto -trvotone 0,5 % Glucose 1,0 %
Extrait de levure 0,5 Bactoa gelose 0, 15 % water quantite suffisante
pour 100 % On utilise des spores lavees ou raclees et des mycelia
provenant d'une culture inclinee sur gelose de Actinomadura yumaense
NRRL 12515 pour inoculer un flacon
de 500 ml contenant 100 ml du milieu sterilise ci-dessus.
On place le flacon sur un appareil a secousses rotatif et
on agite vigoureusement pendant 48 heures a 32 C On uti-
lise l'inoculum du flacon resultant ( 100 ml) pour inoculer
un litre du meme milieu sterile dans un flacon de 2 litres.
On aere cet inoculum avec de l'air sterile, pendant que le
developpement est continue pendant 48 heures a 28 C On utilise alors
cette culture d'un litre Dour inoculer une cuve de fermentation de 30
litres contenant le meme milieu sterile et on aere cette cuve avec de
l'air sterile et on
incube a 28 C pendant 42 heures.
Exemple 7.
On prepare un milieu de fermentation selon la formule suivante:
Dextrose 1,5 % Glycerol 1,5 % Farine de soja 1,5 % calcium Carbonate
0,1 % sodium chloride 0,3 % water quantite suffisante pour 100 %
On ajuste le p H a 7,0 avec de l'hydroxyde de shydroxide-
dium 6 N et on sterilise le milieu On utilise une portion de 30 litres
de l'inoculum prepare tel que decrit dans l'exemple 1 pour inoculer
250 litres du milieu ci-dessus
15207
dans une cuve de fermentation de 300 litres On assure une aeration
sterile a la bouillie et on agite la bouillie par
une roue entrainee a 220 tours/minute On effectue la iron-
mentation a 320 C mendant 97 heures et on recolte la bouil-
lie.
Exemnle 8.
On prepare un milieu de fermentation selon la formule suivante
Dextrose 3, 0 % Farine de soja 1,5 % calcium Carbonate 0,1 %O sodium
chloride 0, 3 % water quantite suffisante pour 100 %
On ajuste le p H a 7,0 avec de l'hydroxyde de shydroxide-
dium 6 N et on sterilise le milieu On utilise une portion
de 300 litres de l'inoculum prepare comme decrit dans l'e-
xemole 1 Dour inoculer 3000 litres du milieu ci-dessus dans une cuve
de fermentation On assure une aeration sterile
dans la masse On agite la masse par une turbine fonction-
nant a 10 tours/minute On effectue la fermentation a 320 C
mendant 115 heures apres quoi on recueille la bouillie.
Exemple 9.
1 On ajuste la bouillie de fermentation ( 100 1) a m H 4,0 en
utilisant H Cl 6 N On agite alors la bouillie acidDendant 1 a 2 heures
avec un volume egal de chlorure de methylene On filtre le melange de
la bouillie et de
chloridemethylene chloride sur une terre de diatomee comme adju-
vant de filtration On soutire l'extrait au chlorure de mchloride-
thylene et on concentre sous vide jusqu'a environ 2 litres
d'antibiotic partiellement purifies.
2 Chromatographie sur gel de silice des antibio-
tic partiellement purifies.
On garnit une colonne de verre d'un diametre de 7 cm d'une hauteur de
91 cm de gel de silice Woelm TSC On laisse le concentre brut (voir 1
cidessus) d'un volume de
2 litres environ suinter dans la colonne de gel de silice.
On developpe la colonne d'abord avec 3 litres de
chloride
15207
de methylene, puis avec du methylene chloride/acetate
d'ethvle ( 1:1 en volume) pour obtenir un total de 126 frac-
tions, ayant chacune un volume de 80 ml On developpe encore
en utilisant de l'ethyl acetate/ethanol ( 7:3) pour obte-
nir encore 87 fractions. On reunit les fractions 58 a 87, riches en C
23024 a
et on concentre sous vide jusqu'a un residu pesant 90,4 g.
On dissout ce residu dans un melange de 600 ml d'etherdi-
ethylique et de 600 ml d'hexane On filtre la suspension resultante
pour obtenir un filtrat limpide On concentre le
filtrat limpide sous vide jusqu'a ce que des cristaux commen-
cent a se former On laisse cette suspension vieillir pendant une nuit
On recueille le C 23024 a sur un entonnoir, on lave avec de
l'etherfroid et on seche a l'air pour obtenir 33,1 g de C 23024 a
cristallin On obtient encore 12,4 g de C 23024 a par reduction
ulterieure du volume du lavage et du filtrat reunis. On reunit les
fractions 177 a 203 provenant de l'elution avec de l'ethyl
acetate/ethanol et enrichies en C 23024 l et on concentre sous vide
pour obtenir 6,7 g de
C 23024 e partiellement purifie et on traite comme ci-dessus.
On reunit les fractions 204 a 213 provenant de l'elution avec de
l'ethyl acetate/ethanol et enrichies en C 23024 iota et on concentre
sous vide pour obtenir une pate qu'on extrait de nouveau avec du
methanol On extrait l'extrait methanolique avec du methylene chloride
charge sur une colonne de gel de silice Woelm On lave la colonne avec
du methylene chloride et on elue avec du methylene chloride/ethyl
acetate ( 2:3) On verifie les coupes
par chromatographie en couche mince et on reunit les frac-
tions actives, on traite sur charbon, on concentre et on
extrait plusieurs fois avec de l'heptaneOn refroidit l'ex-
trait a l'heptane final a O C pendant 48 heures et on se-
pare les cristaux de la liqueur mere par filtration.
On dissout cette liqueur mere dans du methylene chloride et on laisse
suinter dans une colonne de verre garnie de gel de silice Woelm On
elue alors successivement la colonne avec 2 litres de methylene
chloride, 8 litres de methylene chloride/ethyl acetate ( 1:1) et 4
litres d'ethyl acetate/methanol ( 9:1) On recueille l'eluat par
fractions et on evalue leur composition antibiotic On reunit les
fractions actives et on concentre sous vide pour
obtenir un residu contenant du LL-C 23024 iota.
Exemple 10.
Autre nurification du C 23024 8 par chromatoqranhie sur gel
de silice.
On laisse du Senhade LH 20 gonfler dans un me-
lange d'hexane chloride/methylene chloride/methanol ( 10:5:1) On
garnit une colonne de verre de 5 cm de diametre avec le gel sur une
hauteur de 86 cm On dissout la charge, 3 g de LL-C 23024 S purifie,
dans 10 ml de methylene chloride, 1 ml de methanol et 10 ml d'hexane
et on laisse suinter dans la colonne de gel On developpe alors la
colonne 3 avec un solvant de la meme composition que celui utilise
pour transferer l'antibiotic sur la colonne On recueille les fractions
au moyen d'un collecteur de fractions Les 23 premieres fractions ont
un volume de 17 ml chacune Les fractions 17 a 26 contiennent du C
23024 8, selon la chromatographie en couche mince On reunit ces
fractions
et on concentre sous vide pour obtenir du LL-C 23024 D amor-
phe, pur, pesant 1269 mg.
Exem Dle 11.
Cristallisation du LL-C 23024 B sous la forme du sel de ssalt-
dium. On dissout 2,4 g de LL-C 23024 8 purifie, prepare comme decrit
dans les sections B et C, dans un melange d'e-
ther diethylique ( 500 ml), d'hexane ( 160 ml) et de methylene
chloride ( 25 ml) On transfere la solution resultante
dans une ampoule a decantation contenant 300 ml d'water dis-
tillee On ajoute goutte a goutte H Cl dilue ( 1 N) jusqu'a
ce que le p H atteigne 2,0 a 2,5, apres avoir agite et lais-
se reposer On rejette la phase acide aqueuse et on lave successivement
la phase organic acid, traitee a l'acide, avec 3 fois 400 ml d'water
On agite la couche organique lavee avec une cuillere a the de Darco
G-60 en poudre pendant 15
minutes et on filtre sur celite On place la couche orga-
nique decoloree sur 500 ml d'water distillee et on ajoute goutte a
goutte Na OH 5 N jusqu'a ce que le p H atteigne 11,0 A 11,5 apres
avoir agite et laisse reposer On rejette la phase aqueuse alcaline et
on lave la couche organique restante avec deux fois 400 ml d'water On
seche la couche organique lavee sur du sodium sulfate et on concentre
sous vide jusqu'a un volume de 150 ml On laisse ce concen-
tre reposer sous une hotte pendant plusieurs heures On re-
cueille le LL-C 23024 8 cristallin sur un entonnoir, on lave avec de l
Fhexane froid et on seche a l'air pour obtenir 402 mg du salt
cristallin de LL-C 23024 8 La composition
d'un echantillon est determinee par microanalyse et carac-
teristiques spectrales.
Analyse pour C 46 H 77017 Na: Calculee: C 59,70; H 8,33; O 29,46;
cendres 2,49 Trouvee: C 61,55; H 8,79; cendres 3,31; N O
Point de fusion (appareil Fisher-Johns) = 174 C.
Spectre de masse par desorption de champ = 924.
26 = + 3,2 (dans le methanol).
Exemnle 12.
Purification du LL-C 23024 iota.
Sur un appareil pour chromatographie liquide de
haute performance Waters Prep 500 A, on adapte une cartou-
che de gel de silice sous une pression de 3790 k Pa On dis sout 5,0 g
de la charge, le materiau brut de l'exemple 3, dans 50 ml d'heptane
acetate/ethyl acetate ( 45:55) et on injecte
dans la colonne de gel de silice On developpe alors la co-
lonne avec le meme solvant a un debit de 200 ml/minute en recueillant
40 fractions de 200 ml On reunit les fractions 21 a 32, on concentre
jusqu'a obtention d'un residu, on triture avec de l'hexane et on
evapore pour obtenir du LL-C 23024 iota pur On repete 4 fois le
procede ci-dessus
et on recueille au total 280 mg de LL-C 23024 iota amorphe.
On dissout une portion de 90 mg de LL-C 23024 iota amorphe dans 10 ml
d'diethyl ether, melange avec 10 ml d'water, et on ajuste a p H 2,5
avec de l'hydrochloric acid 0,1 N On lave la couche etheree avec de
l'water, on ajuste vers p H 11 avec de l'sodium hydroxide O,1 N, on
separe
et on lave de nouveau avec de l'water On seche la phase ethe-
ree sur du sodium sulfate, on filtre, et on concentre jusqu'a
obtention d'un residu On laisse une solution de ce residu dans
l'ether/hexane s'evaporer lentement pour donner
un solide blanc amorphe.
Ce solide blanc amorphe a les proprietes suivan-
tes:
Analyse elementaire: C 61,79; H 8,84; cendres 0,32.
a-726 = + 270 (C 0, 724, methanol).
D +
Spectrometrie de masse par desorption de champ = (M+Na)+ -
m/e 953, soit une masse moleculaire calculee de 930.
Claims
_________________________________________________________________
REVENDICATIONS
1 Culture biologiquement pure de Actinomadura yumaense sp nov, ladite
culture etant capable de produire les antibiotic LL-C 23024 a, B et
iota en des quantites recuperables par fermentation dans un milieu
nutritif li-
quide contenant des sources assimilables de carbon, d'azo-
te et de salts mineraux.
2 Culture biologiquement pure selon la revendi-
cation 1, caracterisee en ce que Actinomadura yumaense sp.
nov est Actinomadura yumaense NRRL 12515.
3 Culture biologiquement pure du microorganisme Actinomadura yumaense
sp nov selon la revendication 1 ou
2, caracterisee en ce que le microorganisme subit une muta-
tion spontanee de telle sorte que le microorganisme est ge-
netiquement altere, mais conserve encore la faculte de syn-
thetiser les antibiotic -a, B et iota.
4 Culture biologiquement pure du microorganisme Actinomadura yumaense
sp nov selon la revendication 1 ou 2, caracterisee en ce que le
microorganisme est soumis a
une action mutagene telle que le microorganisme est gene-
tiquement altere, mais conserve encore la faculte de syn-
thetiser les antibiotic LL-C 23024 a, B et iota.
Antibiotic LL-C 23024 B, caracterise en ce que la forme
substantiellement pure presente:
32 2
(a) un pouvoir rotatoire de lj 5 = + 320 + 2
( 0,495 %, methanol) et de A 25 = + 46 + 2 ( 0,440 %, chlo-
roforme}; (b) une analyse elementaire (%) d'environ C 61,55;
H 8,79;
(c) un point de fusion d'environ 171-173 C;
(d) une masse moleculaire calculee par spectro-
scopie de masse par desorption de champ de 902; (e) un spectre RMN de
13 C dans le chloroform deuterie a 80 M Hz substantiellement tel que
represente sur la figure 2;
(f) un spectre d'absorption IR dans K Br substan-
tiellement tel que represente sur la figure 1; et (g) un spectre RMN
du proton dans le chloroform deuterie a 20 MHZ substantiellement tel
que represente sur
la fiqure 3.
6 addition salt avec un acidDharmaceutiquement accentable de
l'antibiotic LL-C 23024 B selon la revendica-
tion 5.
7 Antibiotic LL-C 23024 iota, caracterise en ce que la forme
substantiellement pure presente: (a) un pouvoir rotatoire de a 6 = +
270 (C: 0,724, methanol); (b) une analyse elementaire % d'environ: C
61,79;
H 8,84;
(c) une masse moleculaire calculee par spectro-
scopie de desorption de champ de 930; (d) un spectre RMN de 13 C dans
le chloroform deuterie a 80 M Hz substantiellement tel que represente
sur les figures 6, 7 et 8;
(e) un spectre d'absorption IR dans K Br substan-
tiellement tel que represente sur la figure 4; et (f) un spectre RMN
du proton dans le chloroform deuterie a 20 M Hz substantiellement tel
que represente sur
la figure 5.
8 addition salt avec un acidpharmaceutiquement
acceptable de l'antibiotic LL-C 23024 iota selon la reven-
dication 7.
9 Procede pour la preparation des antibiotic LL-C 23024 a, e et iota,
caracterise en ce qu'il consiste a
faire fermenter aerobiquement Actinomadura yumaense sp.
nov ou un de ses mutants dans un milieu liquide contenant des sources
assimilables de carbon, d'nitrogen et de
salts
mineraux, jusqu'a ce qu'une activite antibiotic substan-
tielle soit conferee au bouillon de fermentation, puis a
recueillir l'antibiotic a partir de ce bouillon.
Procede selon la revendication 9, caracterise en ce que la temperature
de la culture de fermentation est
maintenue a 25-35 C pendant une periode de 24 a 150 heures.
11 Procede selon la revendication 9 ou 10, ca-
racterise en ce que Actinomadura yumaense sp nov est
Actinomadura yamuense NRRL 12515.
12 Medicament pour lutter contre les infections de coccidiose chez les
volailles, caracterise en ce qu'il comprend un vehicule comestible et
d'environ 0,000025 A 0,06 % en poids du compose LL-C 23024 a ou LL-C
23024 iota
ou d'un de leurs salts pharmaceutiquement acceptables.
13 Medicament selon la revendication 12, carac-
terise en ce que le vehicule comestible est l'water de bois-
son et contient de 2,5 a 120 npm de l'agent anticoccidien.
14 Procede de lutte contre les nematodes presents dans un sol
contenant des nematodes, caracterise en ce qu'il consiste a appliquer
sur le sol infeste de nematodes une quantite efficace pour tuer les
nematodes d'un compose LL-C 23024 a, LL-C 23024 B ou des salts
pharmaceutiquement acceptables de ces composes, des melanges des
composes ou des salts, ou des bouillons de fermentation ou encore des
solides recoltes a partir des bouillies, a partir desquels
on obtient les antibiotic nematocides.
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