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DANS
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Fert
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Est-a
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Munir
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Molecule
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water
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nitrogen
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HORS
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DES
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Generic
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metal
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Publication
_________________________________________________________________
Number FR2516652A1
Family ID 1953109
Probable Assignee Reichert Optische Werke Ag
Publication Year 1983
Title
_________________________________________________________________
FR Title DISPOSITIF DE TRANSFERT POUR L'EXTRACTION DE COUPES
LYOPHILISEES, HORS DE LA CHAMBRE DE REFROIDISSEMENT D'UN MICROTOME
POUR COUPES CONGELEES
Abstract
_________________________________________________________________
LE DISPOSITIF COMPREND UNE TETE DE TRANSPORT 10 CREUSE POUVANT ETRE
MISE EN COMMUNICATION AVEC UNE SOURCE DE VIDE ET ETANT DIMENSIONNEE DE
MANIERE A POUVOIR ETRE INTRODUITE DANS LA CHAMBRE DE REFROIDISSEMENT 5
D'UN MICROTOME; LA TETE 10 EST POURVUE D'UNE OUVERTURE TEMPORAIREMENT
OBTURABLE PAR UNE PLAQUE SUPPORT 8 ADAPTEE A SUPPORTER DES COUPES
LYOPHILISEES, A EXTRAIRE DE LA CHAMBRE DE REFROIDISSEMENT 5.
APRES MISE SOUS PRESSION REDUITE DE LA TETE DE TRANSPORT 10, LES
COUPES LYOPHILISEES 2 PEUVENT ETRE EXTRAITES DE LA CHAMBRE DE
REFROIDISSEMENT TOUT EN ETANT PROTEGEES DE L'ATMOSPHERE AMBIANTE.
EXAMEN DE COUPES BIOLOGIQUES.
Description
_________________________________________________________________
La presente invention concerne un dispositif de trans-
fert pour l'extraction de coupes lyophilisees hors de la chambre de
refroidissement d'un microtome pour coupes
congelees en particulier d'un cryo-ultramicrotome.
Les objets biologiques destines a des fins hystochimi-
ques, en particulier pour l'execution d'une microanalyse aux rayons X
en microscopie electronique, sont souvent coupes apres une congelation
rapide, dite "cryofixation", a l'etat congele dans des chambres de
refroidissement, c'est-a-dire
tl des chambres de "cryomicrotomie" ou de "cryo-ultramicro-
tomie" Dans la mesure o de tels types de cryo-coupes hydratees ne
peuvent etre irradiees et analysees au microscope electronique qu'avec
difficulte, on a eu recours jusqu'a present au procede de
lyophilisation de maniere a augmenter la transparence des coupes dans
le faisceau Mlectronique et a simplifier le transfert des coupes entre
la chambre de refroidissement et le microscope electronique.
Pour ce faire, la coupe qui est deposee sur une grille porte-objet,
par exemple dans l'atmosphere d'nitrogen anhydre de la chambre de
refroidissement, est chauffee depuis la
temperature a laquelle elle etait congelee a des temperatu-
res de l'ordre de 8 -30 CLa plus grande partie des
molecules d'water presentes dans la coupe sont donc trans-
ferees dans le gaz de refroidissement de la chambre qui balaye
constamment les coupes et entraine ces molecules d'water vers
l'atmosphere ambiante Les brevets des Etats-Unis ne 3 328 571, 4 284
894 et 4 302 450 donnent des exemples de cryo-ultramicrotomes ayant la
structure generale a laquelle on se refere On peut se reporter au
brevet des Etats-Unis n 3 924 500 pour ce qui est de la representation
d'une grille classique 10 adaptee a supporter une coupe Il est
cependant difficile d'extraire les coupes seches de la chambre apres
la lyophilisation sans qu'il se forme de condensats ou de sublimats
d'water sur les surfaces froides de 3; la coupe lorsqu'elle penetre
dans l'atmosphere ambiante, humide De tels water sur les coupes seches
conduisent momentanement a une distribution alternee d'ions et de
petites molecules et donc ont tendance a fausser toute micro-analyse
ulterieure des coupes On s'est donc efforce jusqu'ici d'enfermer les
coupes deposees sur des grilles porte-objet dans la chambre de
refroidissement, dans des supports formant enceince, par exemple de
petites capsules de resine synthetique, avant d'extraire ces coupes de
la D chambre de refroidissement Malheureusement, cette etape demande
des capsules tres epaisses qui ne peuvent etre manipulees que tres
difficilement dans la chambre de refroidissement a des temperatures
inferieures a -1 OO O C. Cela est egalement vrai en ce qui concerne
les essais tendant a envelopper les grilles porte-objet dans *des
feuilles en metal ou en matiere plastique avant l'extraction
hors de la chambre de refroidissement.
La presente invention a pour but principal -d'apporter un dispositif
de transfert de structure relativement simple qui soit sur et fiable
dans son mode de fonctionnement et qui elimine nombre des difficultes
liees au transfert de
coupes hydratees congelees a des temperatures cryogeniques.
Le dispositif selon la presente invention est construit de telle
maniere que les grilles porte-objet peuvent etre deplacees depuis la
plaque de chauffage prevue pour la lyophilisation vers une plaque
support qui constitue le fond d'une tete de transport sous vide,
laquelle tete, apres le deplacement des grilles sur la plaque, peut
etre enlevee pour permettre l'extraction, hors de l'espace de la
chambre, de la coupe lyophilisee portee par la grille La temperature
de la tete de transport et de la plaque support, pendant l'extraction
des coupes lyophilisees; hors de la chambre de refroidissement, est
maintenue a une valeur sensiblement
superieure a celle de la chambre de refroidissement.
En outre, dans une forme d'execution preferee, le dispositif de
transfert est realise au moins partiellement en un materiau
transparent Il est prevu des moyens formant soupape pour le
retablissement de la pression a l'interieur de la tete de transport,
ce qui elimine le risque de courant de convection lie a ce
retablissement de pression dans la tete Des evidements sont egalement
prevus dans la plaque support pour la reception et l'extraction des
grilles portant les coupes et, de preference, il existe une plaque de
couverture de la grille La plaque support du receptacle
E 2 16652
peut etre chauffee au moyen d'un element de chauffage iendant le
transfert ou avant l'ouverture de la tete de transport de telle
maniere que la precipitation de l'water sur les bio-colloides des
coupes lyophilisees soit evitee A cet egard, il est prevu des moyens
de regulation thermostatique de l'element de chauffage pour commander
la temperature de la plaque support et eviter que la chaleur endommage
le specimen.
L'invention est decrite ci-apres en detail par refe-
rence aux dessins annexes dans lesquels: la figure 1 est une
representation schematique d'une chambre de refroidissement de
construction connue montrant un dispositif de transfert selon la
presente invention avant l'extraction des coupes lyophilisees hors de
la chambre de refroidissement; la figure 2 est une representation
schematique du dispositif de transfert ferme, sous pression reduite,
apres l'extraction de la chambre de refroidissement et comprenant une
pompe a vide actionnable manuellement et un systeme a soupape; la
figure 3 a est une representation schematique, en coupe transversale,
d'une forme d'execution modifiee du dispositif de transfert selon la
presente invention avec une plaque de base formant support chauffable
thermostatiquement et comprenant des evidements pour la mise en place
et l'enlevement des grilles porte-objet ainsi qu'un couvercle pour la
protection des coupes pendant le transfert et le retablissement de la
pression; et la figure 3 b est une vue de dessus de la plaque de base
3 support de la figure 3 a montrant egalement les evidements
pour la reception des grilles porte-objet.
Si l'on se refere a la figure 1, on voit une chambre de
refroidissement classique comprenant une paroi de chambre a
multicouches 1 qui est refroidie par de l'nitrogen liquide ou gazeux a
une temperature sensiblement inferieure a 00 C, par exemple, telle que
-1700 C, et qui est maintenue depourvue de givre par un courant
continu d'nitrogen gazeux froid et sec en parcourant l'interieur Pour
la production de coupes congelees 2 a analyser, l'echantillon
biologique congele 3 _ est tranche par l-'arete d'un couteau 4 Les
coupes 2 enlevees par l'arete de couteau sont transferees, au-moyen de
dispositifs classiques convenables non representes, vers l'interieur
de la chambre 5 sur des grilles porte-objet 6 en forme de disques
circulaires couramment utilisees a cette fin Ces grilles 6 peuvent
avoir un diametre de 2,3 ou 3 zm et les grilles munies des coupes sont
amenees sur une plaque de lyophilisation 7 sur laquelle elles peuvent
etre aplaties a l'aide d'un moyen convenable non represente et sechees
a une temperature) -800 C. Selon la presente invention, les grilles 6
munies des coupes pressees et sechees sont deplacees depuis la plaque
support 7 sur une plaque 8 dont l'emplacement rend possible, de
maniere simple, un tel deplacement des grilles A cette fin, la surface
de la plaque support 8 est disposee legerement plus bas que la surface
de la plaque 7 La plaque 8 est, de preference, introduite dans la
chambre 5 immediatement avant le transfert des grilles grace a quoi la
plaque 8 est plus ou moins a la temperature ambian te On evite un
echange thermique trop rapide entre la plaque 8 et sa surface support,
par exemple, au moyen d'une couche 9 en un materiau alveole ayant des
proprietes, d'isolation thermique, laquelle couche contribue, avec la
manipulation rapide des grilles porte-objet, a empecher la
condensation 2-5 sur les coupes Apres le deplacement des grilles
porte-objet sur la plaque 8, la- tete de transport 10 qui est
egalement a la temperature ambiante, est placee sur la plaque 8 et
soumise a une pression reduite telle que la plaque 8 se trouve
momentanement collee a la tete de transport 10 par une difference de
pression qui permet l'extraction de la plaque 8 sur laquelle reposent
les grilles hors de l'espace de la chambre sans risque d'exposition a
l'atmosphere ambiante Entre la tete de transport 10 et la plaque de
base 8, est dispose un moyen d'etancheite qui, dans la forme
d'execution donnee a titre d'exemple, est une bague en O il isolant
l'espace interieur de -la tete 10 La tete 10 est pourvue d'une
tubulure d'evacuation 12 sur laquelle est
monte un tuyau 13 permettant la liaison a la pompe -
La figure 2 montre un dispositif de transfert complet selon la
presente invention, avec une simple pompe manuelle 14 munie d'un
manometre 15 et d'une soupape d'entree d'air 16 L'entree de l'air peut
se faire au travers d'un agent de deshydratation qui est prevu d'une
maniere connue en soi, dans un petit tube 17 entre la soupape 16 et le
tuyau 13 pour empecher l'introduction d'air humide dans les coupes
lyophilisees lorsqu'on laisse penetrer l'air dans l'inte-
rieur de la tete de transport 10 pour liberer la plaque support 8
Selon la presente invention, la plaque de base_ 8 1 o avec sa face
inferieure plane peut etre placee sur une plaque chauffee 18 et, de
cette maniere, etre chauffee a une temperature superieure a la
temperature ambiante telle que le risque d'introduction d'air humide
lors de l'ouverture du dispositif de transport -puisse generalement
etre evite Un -avantage supplementaire de la structure du dispositif
selon l'invention est que la tete de transport 10 a peut etre realisee
en verre ou en resine synthetique transparente, ce qui rend possible
l'observation continuelle de la position
des grilles porte-objet 6.
La figure 3 montre une representation schematique d'une autre forme
d'execution du dispositif de transfert selon la presente invention La
plaque de base 8 a comporte, dans ce cas, trois pieds 19 pourvus
d'extremites pointues et dont deux seulement sont visibles, ces pieds
reduisant au minimum le contact entre la plaque 8 a et une surface de
support donnee et, de cette maniere, l'echange thermique entre
elles De meme, selon cette forme d'execution de linven-
tion, l'echange thermique entre la plaque Sa et le gaz ambiant de la
chambre peut etre reduit au moyen d'une couche isolante 9 a Des moyens
de chauffage thermostatiques, constitues d'un chauffage de type a
cartouches 20 et d'une sonde de temperature 21, qui sont reunis par un
cable multiconducteur 22 a un dispositif de commande non represente,
sont disposes dans la plaque 8 a Le cable multi-conducteur 22 est
pourvu d'une poignee 23 d'isolation
thermique qui se projette depuis la chambre de refroidis-
sement Un autre avantage peut resider dans le fait d'avoir des grilles
6 dimensionnees de maniere a pouvoir etre recues dans des evidements 8
b de taille complementaire qui sont
reunis au moyen d'une gorge de facon a faciliter l'extrac-
tion des grilles au moyen d'une pince Un autre avantage reside dans le
fait de munir les evidements individuels d'indices, par exemple de
chiffres et/ou de lettres pour les differentes grilles qui y sont
recues De preference, il est prevu une plaque de couverture de grilles
24 de telle sorte que les troubles lies au transfert ou aux courants
de convection se produisant lors de la circulation de l'air dans la
tete 10 ne modifie par la position des coupes -ou 1.0 celles des
grilles De cette maniere, la position spaciale du couvercle 24 sur la
plaque de base 8 a-, telle que representee a la figure 3 a, peut etre
determinee et
localisee au moyen de gougeons non representes.
Les formes d'execution representees et decrites aux figures 1 a 3 ne
font que montrer quelques unes des variantes preferees de mise en
pratique du concept de l'invention D'autres formes d'execution sont
bien entendu possibles Ainsi, par exemple, l'etancheite entre la tete
10 et la plaque support 8 peut etre obtenue en donnant a leurs
surfaces opposees un fini de precision au lieu d'utiliser une bague en
O Le type, l'installation et le mode de fixation du systeme de mise
sous vide de l'equipement et de retablissement de la pression, ainsi
que le type et la disposition des moyens de chauffage ou d'isolation
de la plaque support peuvent etre modifies en ayant recours a des
variantes techniquement equivalentes connues sans affecter le mode de
fonctionnement selon l'invention De meme, on
peut faire varier les materiaux employes pour la construc-
tion de ce dispositif ainsi que les gammes de temperature.
La pompe, les Mpoyens de chauffage, la tete de transport, la plaque
support, etc comprennent des elements appartenant a l'invention mais
peuvent etre realises de toute maniere appropriee En tout etat de
-cause, les formes d'execution
decrites et representees ne l'ont ete qu'a titre d'exemples.
Claims
_________________________________________________________________
REVENDICATIONS
1 Dispositif de transfert pour l'extraction de coupes lyophilisees
hors de la chambre de refroidissement d'un microtome pour coupes
congelees, caracterise en ce qu'il comprend une tete de transport (
10) generalement creuse et fermee adaptee a etre mise en communication
avec une source
de vide ( 14), ladite tete de transport ( 10) etant dimension-
nee de maniere a pouvoir etre introduite-dans la chambre de
refroidissement ( 5) et etant pourvue d'une ouverture et d'une surface
d'etancheite entourant ladite ouverture, une plaque support ( 8) etant
adaptee a supporter des coupes lyophilisees a extraire -de la chambre
de refroidissement ( 5), ladite plaque support ( 8) etant dimensionnee
de maniere
a pouvoir fermer, de maniere etanche aux fluides, l'ouver-
ture de la tete de transport ( 10) pour proteger les coupes ( 2) de
l'atmosphere ambiante, grace a quoi, apres mise sous pression reduite
de la tete de transport ( 10) generalement creuse par la source de
vide, les coupes lyophilisees ( 2) peuvent etre extraites de la
chambre de refroidissement tout
en etant protegees de l'atmosphere ambiante.
2 Dispositif de transfert selon la revendication 1, caracterise en ce
que la tete de transport ( 10) est en forme de cloche et en ce que la
plaque de support ( 8) forme une plaque de fond fermant l'ouverture de
ladite tete de
transport ( 10).
3 Dispositif de transfert selon la revendication 1, combine a une
chambre de refroidissement ( 5) comprenant une plaque de pression et
de chauffage ( 7), caracterise en ce qu'il comporte une base d'appui
juxtaposee pour la plaque support ( 8), ladite plaque de pression et
de chauffage ( 7) etant disposee de telle maniere qu'une surface
superieure de la plaque de support ( 8) soit generalement a la meme
hauteur qu'une surface superieure de la plaque de pression et de
chauffage ( 7).
4 Dispositif de transfert selon la revendication 1, caracterise en ce
qu'il comprend des moyens formant pompe a vide ( 14) reunis
operativement a l'interieur generalement creux de la tete de transport
( 10) et des moyens formant conduit ( 13) pour la mise en
communication de la pompe a vide ( 14) et de-la tete de transport (
10) qui comporte une
poignee ( 23) pour la plaque support ( 8).
Dispositif de transfert selon la revendication 1, caracterise en ce
qu'il est prevu des moyens ( 16) pour retablir la pression dans
l'interieur creux de la tete de
transport ( 10).
6 Dispositif de transfert selon la revendication 5, caracterise en -ce
qu'il est prevu des moyens ( 17) pour secher -le fluide utilise pour
retablir la pression dans la
tete de transport ( 10).
7 Dispositif de transfert selon la revendication 1, caracterise en ce
que la tete de transport ( 10) est
construite, au moins partiellement, en un materiau transpa-
rent.
8 Dispositif de transfert selon la revendication 1, caracterise en ce
que la surface superieure de la plaque de support ( 8) est pourvue
d'au moins un evidement ( 8 b) recepteur de grilles ( 6) de support de
coupes lyophilisees et en ce qu'elle presente des indices ( 1-2-3-4)
pour
l'identification de la coupe supportee par la grille.
9 Dispositif de transfert selon la revendication 8, caracterise en ce
que l'un au moins des evidements ( 8 b) est dimensionne de maniere
complementaire a la taille de la grille porte-objet ( 6) et en ce
qu'il comprend au moins une rainure laterale pour faciliter la saisie
de la grille
porte-objet ( 6) au moyen d'une pince.
Dispositif de transfert selon la revendication 8, caracterise en ce
qu'il comporte un couvercle ( 24) pour l'un au moins des evidements (
8 b), ledit couvercle ( 24) etant dimensionne de maniere a pouvoir
penetrer dans la tete de transport ( 10) sans pouvoir etre -deplace
pendant le
mouvement de ladite tete de transport ( 10).
11 Dispositif de transfert selon la revendication 1, caracterise en ce
que la plaque de support ( 8) est isolee
sur sa face inferieure.
-12 Dispositif de transfert -selon la revendication 3, caracterise en
ce que la base-d'appui pou la plaque support ( 8) prevue dans la
chambre de refroidissement ( 5) est isolee thermiquement. 13
Dispositif de transfert selon la revendication 1, caracterise en ce
que la plaque support ( 8) comprend des
moyens de chauffage ( 20) commandes thermostatiquement.
14 Dispositif de transfert selon la revendication 1, caracterise en ce
que la plaque support ( 8) comprend une poignee isolante ( 23) ayant
une portion pouvant etre saisie
manuellement depuis l'exterieur de la chambre de refroidis-
sement ( 5).
I
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