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[5][_]
Molecule
(123/ 328)
[6][_]
AMINOfluorescein
(23)
[7][_]
OH
(19)
[8][_]
carbamazepine
(12)
[9][_]
HX
(10)
[10][_]
lidocaine
(10)
[11][_]
phenobarbital
(10)
[12][_]
chloroform
(10)
[13][_]
fluorescein
(9)
[14][_]
procainamide
(7)
[15][_]
primidone
(7)
[16][_]
chlorosulfonic acid
(7)
[17][_]
carbon
(6)
[18][_]
nitrogen
(6)
[19][_]
nortriptyline
(6)
[20][_]
water
(6)
[21][_]
oxygen
(5)
[22][_]
quinidine
(5)
[23][_]
phenytoin
(5)
[24][_]
ethosuximide
(4)
[25][_]
disopyramide
(4)
[26][_]
chloramphenicol
(4)
[27][_]
R-S
(4)
[28][_]
pyridine
(4)
[29][_]
4-aminofluorescein
(4)
[30][_]
methanol
(4)
[31][_]
-CO-CO-
(3)
[32][_]
digoxin
(3)
[33][_]
thyroxine
(3)
[34][_]
theophylline
(3)
[35][_]
amitriptyline
(3)
[36][_]
desipramine
(3)
[37][_]
sodium
(3)
[38][_]
barbital
(3)
[39][_]
acetone
(3)
[40][_]
sodium sulfate
(3)
[41][_]
-CO-NH-SO-
(2)
[42][_]
valproic acid
(2)
[43][_]
-S-
(2)
[44][_]
acetaminophene
(2)
[45][_]
desimpramine
(2)
[46][_]
H-
(2)
[47][_]
methoxyoxalyl chloride
(2)
[48][_]
triethylamine
(2)
[49][_]
phosphate
(2)
[50][_]
sodium hydroxide
(2)
[51][_]
methylsuccinimide
(2)
[52][_]
iminostilbene
(2)
[53][_]
Cl
(2)
[54][_]
propranolol
(2)
[55][_]
C-H
(2)
[56][_]
azide
(2)
[57][_]
sodium cholate
(2)
[58][_]
Propanolol
(2)
[59][_]
Imipramine
(2)
[60][_]
-SO2-
(1)
[61][_]
-CONHSO2-
(1)
[62][_]
CF
(1)
[63][_]
-SO-
(1)
[64][_]
-SO-NH-
(1)
[65][_]
DES
(1)
[66][_]
oestrone
(1)
[67][_]
oestradiol
(1)
[68][_]
cortisol
(1)
[69][_]
testosterone
(1)
[70][_]
chenodesoxycholic acid
(1)
[71][_]
cholic acid
(1)
[72][_]
digitoxin
(1)
[73][_]
desoxycholic acid
(1)
[74][_]
folic acid
(1)
[75][_]
triiodothyronine
(1)
[76][_]
histamine
(1)
[77][_]
serotonin
(1)
[78][_]
doxorubicin
(1)
[79][_]
methotrexate
(1)
[80][_]
erythromycin
(1)
[81][_]
vancomycine
(1)
[82][_]
gentamicin
(1)
[83][_]
amikacin
(1)
[84][_]
streptomycin
(1)
[85][_]
tobramycin
(1)
[86][_]
pramine
(1)
[87][_]
morphine
(1)
[88][_]
codeine
(1)
[89][_]
hydrocodone
(1)
[90][_]
dihydrocodeine
(1)
[91][_]
dihydrohydroxycodeinone
(1)
[92][_]
pholcodine
(1)
[93][_]
dextromethorphan
(1)
[94][_]
phenazocine
(1)
[95][_]
potassium
(1)
[96][_]
ammonium
(1)
[97][_]
sodium phosphate
(1)
[98][_]
R-S-Cl
(1)
[99][_]
benzoic acid
(1)
[100][_]
C-OH
(1)
[101][_]
1-ethyl-3-hydrochloride
(1)
[102][_]
carbodiimide
(1)
[103][_]
OOH
(1)
[104][_]
chlorosulfonyl isocyanate
(1)
[105][_]
N-SCl
(1)
[106][_]
borate
(1)
[107][_]
minee
(1)
[108][_]
chloride
(1)
[109][_]
methylene chloride
(1)
[110][_]
CHI
(1)
[111][_]
2-CN
(1)
[112][_]
precipite blanc
(1)
[113][_]
?-phenethyl-?-methylsuccinimide
(1)
[114][_]
toluene
(1)
[115][_]
n-methylsuccinimide
(1)
[116][_]
hydrochloric acid
(1)
[117][_]
N-hydroxyoxalyl-iminostilbene
(1)
[118][_]
pyridineOn
(1)
[119][_]
sulfonylpyrimidone
(1)
[120][_]
para-methyl-meta-sulfonylpyrimidone
(1)
[121][_]
5-sulfonylphenyl-5-ethylhydantoin
(1)
[122][_]
tris hydrochloride
(1)
[123][_]
sodium dodecylsulfate
(1)
[124][_]
N-acetylprocainamide
(1)
[125][_]
OR-S
(1)
[126][_]
NCH
(1)
[127][_]
S-NI
(1)
[128][_]
XOOH
(1)
[129][_]
Physical
(44/ 75)
[130][_]
5 mg
(8)
[131][_]
50 ml
(5)
[132][_]
1 h
(4)
[133][_]
0,5 ml
(4)
[134][_]
0,01 %
(4)
[135][_]
10 min
(3)
[136][_]
40 ml
(3)
[137][_]
1000 ml
(3)
[138][_]
15 min
(3)
[139][_]
de 10 ml
(2)
[140][_]
2 g
(2)
[141][_]
10-9 M
(2)
[142][_]
113 M
(1)
[143][_]
0,71 g
(1)
[144][_]
2,8 g
(1)
[145][_]
100 mg
(1)
[146][_]
1,2 g
(1)
[147][_]
4,5 g
(1)
[148][_]
0,8 g
(1)
[149][_]
2,5 g
(1)
[150][_]
0,29 g
(1)
[151][_]
2 ml
(1)
[152][_]
1,5 g
(1)
[153][_]
2 N
(1)
[154][_]
30 min
(1)
[155][_]
100 ml
(1)
[156][_]
16 h
(1)
[157][_]
2,4 g
(1)
[158][_]
2 h
(1)
[159][_]
0 N
(1)
[160][_]
3 L
(1)
[161][_]
1 M
(1)
[162][_]
10-7 M
(1)
[163][_]
0,1 %
(1)
[164][_]
10 M
(1)
[165][_]
10-8 M
(1)
[166][_]
5,75 %
(1)
[167][_]
1 ul
(1)
[168][_]
40,1 l
(1)
[169][_]
1 l
(1)
[170][_]
0,2 %
(1)
[171][_]
1 ml
(1)
[172][_]
1,0 ml
(1)
[173][_]
0 l
(1)
[174][_]
Gene Or Protein
(20/ 69)
[175][_]
ETRE
(24)
[176][_]
GGB
(16)
[177][_]
Est-a
(7)
[178][_]
DANS
(4)
[179][_]
FAFl
(2)
[180][_]
CHCH
(2)
[181][_]
Sans Protein
(1)
[182][_]
R-Z
(1)
[183][_]
OXII
(1)
[184][_]
Chl
(1)
[185][_]
Pyri
(1)
[186][_]
Tre
(1)
[187][_]
Chro
(1)
[188][_]
Ine
(1)
[189][_]
Ily
(1)
[190][_]
EAF-1
(1)
[191][_]
Hil
(1)
[192][_]
Ilil
(1)
[193][_]
Proca
(1)
[194][_]
Acet
(1)
[195][_]
Substituent
(29/ 60)
[196][_]
amino
(7)
[197][_]
HYDROXY
(5)
[198][_]
oxalyl
(5)
[199][_]
phenyl
(4)
[200][_]
imino
(4)
[201][_]
sulfonyl
(3)
[202][_]
oxalylamino
(3)
[203][_]
carbamidosulfonyl
(2)
[204][_]
carbamidosulfonylamino
(2)
[205][_]
chlorosulfonyl
(2)
[206][_]
hydroxyoxalyl
(2)
[207][_]
chlorosulfonamidocarbonyl
(2)
[208][_]
N-oxalyl
(2)
[209][_]
o-sulfonamidocarbonyl
(2)
[210][_]
N-acetyl
(1)
[211][_]
oxy
(1)
[212][_]
methoxyoxalyl
(1)
[213][_]
methylaminopropyl
(1)
[214][_]
4-amino
(1)
[215][_]
para-chlorosulfo
(1)
[216][_]
para-chlorosulfonylphenethyl
(1)
[217][_]
?-chlorosulfonylphenethyl
(1)
[218][_]
sulfonylphenethyl
(1)
[219][_]
N-hydroxyoxalyl
(1)
[220][_]
para-methyl
(1)
[221][_]
N-sulfonamidocarbonyl
(1)
[222][_]
N-oxalyl-iminodibenzyl
(1)
[223][_]
para-methyl-meta-sulfonyl
(1)
[224][_]
sulfonamido
(1)
[225][_]
Generic
(16/ 55)
[226][_]
salt
(19)
[227][_]
AMINE
(6)
[228][_]
glucosides
(6)
[229][_]
acids
(5)
[230][_]
salicylates
(3)
[231][_]
primary amine
(3)
[232][_]
tricyclics
(2)
[233][_]
cation
(2)
[234][_]
ether
(2)
[235][_]
esters
(1)
[236][_]
amides
(1)
[237][_]
sodium salts
(1)
[238][_]
radical
(1)
[239][_]
methylsuccinimides
(1)
[240][_]
chloroforms
(1)
[241][_]
alkyl
(1)
[242][_]
Chemical Role
(9/ 31)
[243][_]
antibiotic
(8)
[244][_]
antiasthmatic
(7)
[245][_]
antiarthritic
(6)
[246][_]
hormones
(4)
[247][_]
reagents
(2)
[248][_]
tracer compounds
(1)
[249][_]
fluorophore
(1)
[250][_]
vitamins
(1)
[251][_]
antineoplastic
(1)
[252][_]
Organism
(2/ 7)
[253][_]
inconnu
(5)
[254][_]
animal
(2)
[255][_]
Disease
(3/ 5)
[256][_]
Tic
(3)
[257][_]
Medi
(1)
[258][_]
Corns
(1)
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Publication
_________________________________________________________________
Number FR2518096A1
Family ID 29415408
Probable Assignee Abbott Laboratories
Publication Year 1983
Title
_________________________________________________________________
FR Title PROCEDE ET REACTIFS DE DETERMINATION IMMUNOLOGIQUE PAR
POLARISATION DE FLUORESCENCE
Abstract
_________________________________________________________________
This disclosure relates to a method and reagents for determining
ligands in biological fluids such as serum, plasma, spinal fluid,
amnionic fluid and urine. In particular, this disclosure relates to a
fluorescence polarization immunoassay procedure and to a novel class
of tracer compounds employed as reagents in such procedures and having
the formula wherein X is -CO-CO-, -SO2- or -CONHSO2-, and R is a
ligand-analog wherein said ligand-analog has at least one common
epitope with said ligand so as to be specifically recognizable by a
common antibody.
<P>L'INVENTION CONCERNE DE NOUVEAUX DERIVES D'AMINOfluorescein DE
FORMULE:
(CF DESSIN DANS BOPI)
DANS LAQUELLE X EST UN GROUPE -SO-, -CO-NH-SO- OU -CO-CO- ET R EST UN
ANALOGUE DE LIGAND AYANT UN POIDS MOLECULAIRE DANS LA GAMME DE 100 A
2000, LEDIT ANALOGUE DE LIGAND AYANT AU MOINS UN EPITOPE COMMUN AVEC
LEDIT LIGAND DE MANIERE A ETRE SPECIFIQUEMENT RECONNAISSABLE PAR UN
ANTICORPS COMMUN ET LEDIT ANALOGUE DE LIGAND ETANT LIE AU RESTE
-SO-NH- PAR UN carbon AROMATIQUE, AU RESTE -CONHSO- PAR UN oxygen
D'HYDROXY OU UNE AMINE REACTIVE, OU AU RESTE -CO-CO- PAR UN nitrogen
REACTIF.</P><P>APPLICATIONS: RECHERCHE ET DOSAGE DE LIGANDS DANS DES
ECHANTILLONS DE LIQUIDES BIOLOGIQUES PAR POLARISATION DE
FLUORESCENCE.</P>
Description
_________________________________________________________________
La presente invention concerna un procede et des reactifs pour
determiner
des ligands dans les liquides biologiques
tels que le serum, le plasma, le liquide spinal, le liquide amnio-
tic et l'urine En particulier, l'invention concerne un procede de
determination immunologique par polarisation de fluorescence et
des marqueurs utilises comme reactifs dans ces modes operatoires.
Le mode operatoire de determination immunologique par polarisation de
fluorescence selon l'invention combine la specificite d'une
determination immunologique avec la rapidite et la commodite des
techniques de polarisation de fluorescence pour fournir un moyen de
determination de la quantite d'un ligand specifique present
dans un echantillon.
Les determinations immunologiques par fixation competitive pour la
mesure de ligands reposent sur la competition entre un ligand dans un
echantillon d'essai et un reactif marque, denomme marqueur, pour un
nombre limite de sites de fixation du
recepteur sur des anticorps specifiques du ligand et du marqueur.
La concentration du ligand dans l'echantillon determine la quantite de
marqueur qui se fixe de maniere specifique sur un anticorps La
quantite de conjugue marqueur-anticorps produite peut ttre mesuree
quantitativement et elle est inversement proportionnelle a la quan-
tite de ligand dans l'echantillon d'essai.
En general, les techniques de polarisation de fluores-
cence reposent sur le principe d'apres lequel un marqueur fluorescent,
excite par de la lumiere a polarisation lineaire, emet de la lumiere
de fluorescence ayant un degre de polarisation qui est en relation
inverse de son taux de rotation Donc, lorsqu'une molecule telle qu'un
conjugue marqueur-anticorps ayant un marqueur fluorescent est excitee
avec de la lumiere a polarisation lineaire, la lumiere emise reste
fortement polarisee parce que la rotation du fluorophore est limitee
entre l'instant d'absorption de la lumiere et l'instant d'emission
Lorsqu'un marqueur "libre" (c'est-a-dire non fixe sur un anticorps)
est excite par de la lumiere a polarisation lineaire,
sa rotation est beaucoup plus rapide que le conjugue marqueur-anti-
corps correspondant et les molecules sont davantage orientees statis-
tiquement, donc la lumiere emise est depolarisee Donc, la polarisation
de fluorescence fournit un moyen quantitatif pour la mesure de la
quantite de conjugue marqueur-anticorps produite dans une deterii-
nation immunologique par fixation competitive.
La presente invention concerne un procede pour la determination de
ligands dans un echantillon consistant a melanger avec ledit
echantillon un salt biologiquement acceptable d'un marqueur de formule
generale OH
R-HX N
1-X) (I) dans laquelle X represente un groupe oxalyl de formule Il Il
-CC- un groupe sulfonyl de,formule 0 o -S - Il ou un groupe
carbamidosulfonyl de formule O HO il l Il
-C-N-S-
ll et R est un analogue du ligand ayant au moins un epitope commun
avec ledit ligand de maniere a etre specifiquement reconnaissable par
un anticorps commun; et un anticorps capable de reconnaltre
specifiquement ledit ligand et ledit marqueur; et a determiner ensuite
la quantite de conjugue marqueur-anticorps par des techniques de
polarisation de fluorescence
comme mesure de la concentration dudit ligand dans l'echantillon.
L'invention concerne en outre une nouvelle classe de marqueurs de
formule (I) et leurs salts biologiquement acceptables,
qui sont interessants comme reactifs dans le procede decrit ci-dessus.
Les procedes et marqueurs selon l'invention sont particulierement
interessants pour le controle quantitatif de concentrations de medi-
caments therapeutiques dans le serum et le plasma.
Le terme "ligand" s'entend dans la presente descrip-
tion pour designer une molecule, en particulier un haptene de bas
poids moleculaire auquel on peut obtenir ou former un recepteur,
normalement un anticorps Les haptenes sont des corps sans protein,
generalement de bas poids moleculaire, qui ne provoquent pas de
formation d'anticorps lorsqu'on les injecte a un animal, mais sont
reactifs vis-a-vis des anticorps Les anticorps ou haptenes sont
generalement formes en conjuguant d'abord les haptenes a une pro-
teine et en injectant le produit conjugue a un animal Les anticorps
resultants sont isoles par des techniques classiques d'isolement des
anticorps.
Les ligands determinables par le procede de l'inven-
tion varient dans une large gamme de poids moleculaires Bien que l'on
puisse determiner des ligands de haut poids moleculaire, il est
generalement preferable,pour de meilleurs resultats,d'utiliser les
procedes de l'invention pour determiner les ligands de bas poids
moleculaire, generalement dans un intervalle de 50 a 4 000 On pre-
fere encore determiner des ligands ayant un poids moleculaire dans
la gamme de 100 a 2 000.
Les nouveaux marqueurs selon l'invention comprennent
des composes de formule (I) dans laquelle l'analogue du ligand re-
presente par R comprend des radicaux ayant un poids moleculaire
dans la gamme de 50 a 4 000 Les nouveaux marqueurs preferes compren-
nent des composes de formule (I) dans laquelle les analogues du ligand
representes par R comprennent des radicaux ayant un poids
moleculaire dans la gamme de 100 a 2 000.
Des exemples representatifs de ligands pouvant etre determines par les
procedes de la presente invention comprennent les
sterotdes tels qu'oestrone, oestradiol, cortisol, testosterone, pro-
gesterone, chenodesoxycholic acid, digoxin, cholic acid, digitoxin,
desoxycholic acid, acides lithocholiqueacids et leurs esters et
amides; les vitamins telles que B-12, folic acid,
thyroxine, triiodothyronine, histamine, serotonin; les prosta-
glandines telles que PGE, PGF, PGA; les medicaments antiasthmatic tels
que la theophylline; les medicaments antineoplasiques tels
que doxorubicin et methotrexate, les antiarythmiques tels quediso-
pyramide, lidocaine, procainamide, propranlol, quinidine, N-acetyl-
procainamide; les anticonvulsivants tels que phenobarbital, pheny-
toine, primidone, valproic acid, carbamazepine et ethosuximide; les
antibiotic tels que les penicillines, les cephalosporines,
l'erythromycin, la vancomycine,-la gentamicin, l'amikacin, le
chloramph 6 nicol, la streptomycin et la tobramycin; les antiarthri-
tic tels que les salicylates; les antidepresseurs, y compris les
composes tricyclics tels que nortriptyline, amitriptyline, imi-
pramine et desipramine; et les analogues, ainsi que leurs metabolites.
En outre, les medicaments donnant lieu a l'accoutumance tels que
morphine, herolne, hydromorphoneoxymorphone, metapon, codeine,
hydrocodone, dihydrocodeine, dihydrohydroxycodeinone, pholcodine,
dextromethorphan, phenazocine et deonine et leurs metabolites,
peuvent etre determines selon les procedes de l'invention.
Les marqueurs selon l'invention existent generalement en equilibre
entre leurs formes acidet ionisee et, a l'etat Lonise,
ils sont efficaces dans le procede de l'invention La presente inven-
tion comprend donc les marqueurs soit sous la forme acide, soit la
forme ionisee et, pour la commodite, les marqueurs de l'invention
sont representes structurellement dans la presente description sous
leur forme acidLorsque les marqueurs de l'invention sont presents
a l'etat ionise, les marqueurs existent sous la forme de salts biolo-
giquement acceptables L'expression "salts biologiquement acceptables"
designe des salts tels que les sodium salts, potassium, ammonium, etc,
qui permettent aux marqueurs de l'invention d'exister a l'etat
ionise lorsqu'on les utilise dans le procede de l'invention Gene-
ralement, les marqueurs selon l'invention existent en solution a
l'etat de salts, le salt specifique resulte du tampon utilise,
c'est-a-
dire que, en presence d'un tampon au sodium phosphate, les marqueurs
de l'invention existent generalement a l'etat ionise sous forme d'un
sodiumsalt.
Le terme "analogue du ligand" s'entend dans la pre-
sente description pour designer un radical mono ou polyvalent dont
une proportion notable a la meme organisation spatiale et polaire que
le ligand pour definir un ou plusieurs sites determinants ou epitopes
capables d'entrer en competition avec le ligand pour les sites de
fixation d'un recepteur Une caracteristique d'un tel analogue du
ligand est qu'il possede une ressemblance structurale
suffisante avec le ligand interessant pour etre reconnu par l'anti-
corps pour le iigand Pour la plupart, l'analogue du ligand a une
structure etuir distribution de charges identique ou sensiblement
identique (organisation spatiale et polaire) a celles du ligand
interessant pour une portion significative de la surface moleculaire.
Comme le site de fixation pour un haptene est frequemment le meme dans
la preparation de l'antigene pour la production d'anticorps, que celui
utilise pour la fixation du ligand, la meme portion de l'analogue du
ligand qui fournit le modele de l'anticorps est
exposee par l'analogue du ligand dans le marqueur.
Lorsque X est un groupe sulfonyl o
-S-
ll o
les analogues du ligand representes par R sont derives du ligand cor-
respondant par elimination d'un hy rogene aromatique, c'est-a-d re un
hydrogen fixe a un carbon aromatique, de preference un
carbon
de phenyl, ou par la formation d'un derive phenyl ou phenyl subs-
titue du ligand En outre, un ligand peut etre structurellement modifie
par l'addition ou l'enlevement d'un ou plusieurs groupes fonctionnels
pour former un analogue du ligand tout en conservant
les sites epitopes necessaires pour la fixation a un anticorps.
Cependant, on prefere que ces analogues du ligand modifies soient
fixes au reste sulfonylaminofluoresceine par un carbon aromatique.
Lorsque X est un groupe oxalyl -C-C-
les analogues du ligand representes par R derivent du ligand corres-
pondant par enlevement d'un atome d'hydrogen lie a une amine reac-
tive, c'est-a-dire un atome d'hyerogene lie a une primary amine ou
18096
secondaire ou par la formation d'un derive amino du ligand dans lequel
un groupe -Nl I remplace un ou plusieurs atomes initialement presents
dans le ligand, au site de fixation a un reste d'oxalylaminofluores-
ceine Des exemples de ligands qui, par enlevement d'un hydrogen lie a
une amine reactive, forment un analogue du ligand represente par R
comprennent, par exempie, la procainamide, la thyroxine, la quinidine
et les antibiotic du type aminoglucoside Des exemples de ligands dont
les derives amino sont interessants comme analogues
du ligand comprennent la theophylline, l'valproic acid, le pheno-
barbital, la phenytoin, la primidone, la disopyramide, la digoxin,
le chloramphenicol,, les salicylates, l'acetaminophene, la carbamaze-
pine, la desimpramine et la nortriptyline En outre, un ligand peut
etre structurellement modifie par l'addition ou l'enlevement d'un ou
plusieurs groupes fonctionnels pour former un analogue du ligand, tout
en conservant les sites epitopes necessaires pour la fixation a un
anticorps Cependant, on prefere que ces analogues du ligand
soient lies au reste d'oxalylaminofluoresceine par un groupe imino.
Lorsque X est un groupe carbamidosulfonylamino 0 H 0
-C-N-S-
o les analogues du ligand representes par R sont derives du ligand
correspondant par elimination d'un atome d'hydrogen reactif, c'est-a-
dire d'un atome d'hydrogen lie a un oxygen d'hydroxy ou une amine
reactive (primaire ou secondaire) ou par la formation d'un derive
amino du ligand dans lequel un groupe imino H -N- remplace un ou
plusieurs atomes initialement presents dans le ligand,
sur le site de fixation a un reste de carbamidosulfonylaminofluores-
ceine Des exemples de ligands qui, par enlevement d'un hydrogen
reactif, peuvent former un analogue du ligand represente par R
comprennent, par exemple, la procainamide, la thyroxine, la quinidine
et les antibiotic de la classe des aminoglucosides Des exemples de
ligands dont les derives amino sont utiles comme analogues du
ligand comprennent la theophylline, l'acidvalpro Yque, le pheno-
barbital, la phenytoin, la primidone, le disopyramide, la digoxin,
le chloramphenicol, les salicylates, l'acetaminophene, la carbamaze-
pine, la desimpramine et la nortriptyline En outre, un ligand peut
etre structurellement modifie par l'addition ou l'enlevement d'un ou
plusieurs groupes fonctionnels pour former un analogue du ligand tout
en conservant les sites epitopes necessaires pour la fixation a un
anticorps Cependant, on prefere que ces analogues du ligand
modifies soient lies a un reste de carbamidosulfonylaminofluores-
ceine par un groupe imino ou oxy.
Les marqueurs de l'invention peuvent etre prepares selon des
techniques connues Lorsque X est un groupe sulfonyl o O -S- o les
marqueurs de l'invention sont prepares par reaction d'un compose de
formule
R-Y (II)
dans laquelle R est tel que defini ci-dessus et Y est un hydrogen
aromatique, de preference lie a un noyau phenyl, avec l'acide
chlorosulfonique pour produire un derive chlorosulfonyl de l'ana-
logue du ligand de formule o R-S-Cl (III)
On fait reagir le derive chlorosulfonyl de l'ana-
logue du ligand avec une aminofluorescein de formule OH H- H-N \ p
(IV) dans laquelle le groupe amino est lie a la position (IV) ou (V)
du noyau benzoic acid, en presence d'un solvant inerte, pour donner un
marqueur de l'invention de formule generale O-H Il 1
R-S-N,
O O (v) Lorsque X est un groupe oxalyl OO Il Il -C-c- on prepare les
marqueurs de l'invention par reaction d'un compose de formule R-Z (vi)
dans laquelle R est tel que defini ci-dessus et Z est un hydrogen lie
a un nitrogen reactif (primary amine ou secondaire), avec le
methoxyoxalyl chloride pour donner un derive methoxyoxalyl d'analogue
du ligand qui est hydrolyse en presence d'une base pour donner un
derive hydroxyoxalyl d'analogue du ligand de formule 0 O I il
R-C-C-OH (VII).
On fait reagir le derive hydroxyoxalyl d'analogue du ligand avec une
aminofluorescein de formule (IV) en presence d'un
agent de condensation,tel que le 1-ethyl-3-hydrochloride( 3 '-di-
methylaminopropyl)-carbodiimide,dans un solvant inerte pour donner un
marqueur de l'invention de formule OOH il il t
R-C-C-N,
(VIII)
Lorsque X est un groupe carbamidosulfonyl, O H O il y Il
-C-N-S
Il les marqueurs de l'invention sont prepares par reaction d'un
compose de formule
R-W (IX)
dans laquelle R est tel que defini ci-dessus et W est un hydrogen iie
a un nitrogen reactif (primary amine ou secondaire) ou a un oxygen
hydroxy, avec l'chlorosulfonyl isocyanate pour donner un derive
chlorosulfonamidocarbonyl d'analogue de ligand de formule O H O
R-C-N-SCl (X) t' o On fait reagir le derive chlorosulfonamidocarbonyl
d'analogue de ligand avec une aminofluorescein de formule (IV) pour
donner les marqueurs de l'invention de formule generale OH
0 H OH O
R-C-N-S-N
o (xi) o La temperature a laquelle se deroule la reaction pour la
preparation des marqueurs de l'invention n'est pas essentielle La
temperature doit etre suffisante pour amorcer et maintenir la reaction
En general, pour la commodite et l'economie, la temperature ambiante
est suffisante Dans la preparation des marqueurs selon l'invention, le
rapport des reactifs n'est pas strictement essentiel Par exemple, on
doit utiliser deux moles d'chlorosulfonic acid par mole de compose de
formule (II) pour
obtenir un rendement raisonnable On preefere utiliser un exces -
d'chlorosulfonic acid pour la facilite de la reaction et de la
recuperation des produits de reaction.
Les composes de formule (IV, utilises comme matieres premieres dans la
production des marqueurs selon l'invention sont soit disponibles dans
le commerce, soit prepares selon des
techniques connues.
Pour la facilite de la manipulation et de la recuperation du produit,
la preparation des marqueurs de l'invention est effectuee en presence
d'un solvant inerte Des solvants inertes
appropries comprennent les solvants qui ne reagissent pas notable-
ment avec les matieres premieres et sont suffisants pour dissoudre les
matieres premieres Ils comprennentpar exemplel'acetone,
le chloroform, la pyridine, etc Pour obtenir des rendements maxi-
maux e N produit, la reaction se deroule de preference en condi-
tions neutres ou basiques Des bases appropriees comprennentpar
exemple,la triethylamine, la pyridine, etc Les produits de reaction
sont generalement purifies par chromatographie,soit en couche mince,
soit sur colonne,avant l'application dansles procedes de l'invention.
Selon le procede de l'invention, on melange
un echantillon contenant le ligand a determiner avec un salt biolo-
giquement acceptable d'un marqueur de formule (I) et un anticorps
specifique du ligand et du marqueur Le ligand present dans l'echan-
tillon et le marqueur sont en competition pour un nombre limite de
sites de l'anticorps conduisant a la formation de complexes ligand-
anticorps et marqueur-anticorps En maintenant constante la concentra-
tion de marqueur et d'anticorps, le rapport du complexe ligand-anti-
corps au complexe marqueur-anticorps qui est forme est directement
proportionnel a la quantite de ligand present dans l'echantillon.
Donc, par excitation du melange en lumiere fluorescente et mesure de
la polarisation de la lumiere de fluorescence emise par un marqueur et
par un complexe marqueur-anticorps, on est capable de determiner
quantitativement la quantite de ligand dans l'echantillon.
En theorie, la polarisation de fluorescence d'un
marqueur non complexe par un anticorps est faible et voisine de zero.
Par formation de complexe avec un anticorps specifique, le complexe
marqueur-anticorps ainsi forme subi t la rotation de la molecule
d'anticorps qui est plus faible que celle de la molecule de marqueur
relativement petite, augmentant ainsi la polarisation observee Donc,
11. lorsqu'un ligand est en competition avec le marqueur pour les
sites
de l'anticorps, la polarisation de fluorescence du complexe marqueur-
anticorps observee prend une valeur comprise entre celle du mar-
queur et du complexe marqueur-anticorps Si un echantillon contient une
concentration elevee d'un ligand, la valeur de la polarisation
observee est plus proche de celle du ligand libre, c'est-a-dire
faible.
Si l'echantillon d'essai contient une faible concentration en ligand,
la valeur de polarisation est plus proche de celle du ligand lie,
c'est-adire elevee En excitant successivement le melange de reaction
d'une determination immunologique avec de la lumiere polarisee ver-
ticalement et ensuite horizontalement et en n'analysant que la
composante verticale de la lumiere emise, on peut determiner avec
precision la polarisation de fluorescence du melange de reaction.
La relation precise entre la polarisation et la concentration du
ligand a determiner est etablie par mesure des valeurs de polari-
sation de substances etalons a des concentrations connues La concen-
tration du ligand peut etre extrapolee a partir d'une courbe d'eta-
lonnage preparee de cette maniere.
Le pl auquel on met en oeuvre le procede de l'invention doit etre
suffisant pour que les marqueurs de formule (I)
puissent exister a l'etat ionise Le p H peut etre compris entre envi-
ron 3 et 12, plus couramment dans la gamme de 5 a 10, de preference
d'environ 6 a 9 On peut utiliser divers tampons pour obtenir et
maintenir le p H pendant la determination Des tampons caracteris-
tic comprennent les tampons au borate, au phosphate, au carbo-
nate, au tris, au barbital, etc Le tampon particulier utilise n'est
pas essentiel pour l'invention, mais, dans une determination indivi-
duelle, on peut preferer un tampon specifique pour l'anticorps utilise
et le ligand a determiner La portion cation du tampon
determine generalement le cation du salt du marqueur en solution.
Les techniques de l'invention sont mises en oeuvre a des temperatures
moyennes et, de preference, a temperature constante La temperature
varie normalement entre O et 500 C, plus couramment entre environ 15
et 400 C.
La concentration du ligand qui peut etre deter-
minee varie generalement d'environ 10-2 A 10 113 M, plus couramment
d'environ 104 a 10 1 OM Des concentrations plus elevees de ligand
peuvent etre determinees par dilution de l'echantillon initial.
Outre la gamme de concentrations du ligand interessant, d'autres
considerations determinent normalement la concentration des marqueurs
et de l'anticorps a utiliser, par exemple selon que la determination
est qualitative, semi-quantitative ou quantitative, l'appareillage u t
ilise et les caracteristiques du marqueur et de l'anticorps Bien que
la concentration du ligand dans l'echantillon determine la gamme de
concentrations des autres reactifs, c'est-a-dire marqueur et
anticorps, les concentrations individuelles des reactifs sont
normalement determinees de maniere empirique pour optimiser la
sensibilite de la determination Les
concentrations du marqueur et de l'anticorps sont facilement de-
terminees par l'homme de l'art d'une habilite courante.
Comme on l'a mentionne precedemment, les marqueurs prefEres de
l'invention sont prepares a partir de la -aminofluorescein ou de la
4-aminofluorescein et existent de preference sous forme d'i oomeres de
formules
OH
H
R-;X 4 \ N OXII)
O OH
l et H H
-N (XIII)
il " C\
O OH
dans lesquelles R et X sont tels que definis ci-dessus.
Les exemples non limitatifs suivants servent a illustrer encore pour
l'homme de l'art la preparation de marqueurs specifiques entrant dans
le cadre de l'invention Le symbole lAFl, apparaissant dans les
formules developpeesillustrant les composes prepares dans les exemples
suivants, represente un reste de formule OH H -N t / \ (XIV)
0 OH 9
dans laquelle l'nitrogen du reste imino est lie a la position 4 ou 5
dans la formule ci-dessus,selon l'isomere specifique d'aminofluores-
ceine utilise comme matiere premiere.
EXEMPLE 1
A 0,71 g de lidocaine, on ajoute 2,8 g d'chlorosulfonic acid et on
chauffe le melange resultant a 60 C pendant 1 h On refroidit le
melange de reaction et on ajoute au melange de la glace pilee et de
l'water pour eliminer l'chlorosulfonic acid n'ayant pas reagi On
neutralise la solution aqueuse resultante a p H 7 en utilisant
l'sodium hydroxide On extrait le produit resultant par deux portions
de 10 ml de chlorure de methylenechloride On reunit les extraits de
methylene chloride, on seche sur sodium sulfate et on filtre On
evapore a siccite pour obtenir 100 mg d'un melange de meta et
parachlorosulfonyllidocainessous forme
d'une huile gommeuse A une solution contenant 5 mg de 4-amino-
fluorescein dans 0,5 ml de pyridine, on ajoute 5 mg du melange de
chlorosulfonyllidocanes ci-dessus Apres 10 min, il se forme un produit
brut On purifie le produit brut par chromatographie sur couche mince
en utilisant le gel de silice et le chloroform, puis
un melange chloroform-acetone ( 1:1) et enfin un melange chloroform-
methanol ( 1:1) comme solvants de developpement,pour obtenir un
melange de conjugues sulfonyllidocaine-aminofluorescein de formule
generale
CH O
3 a N-CHI 2-CN d O
H 5 C 2 1 '
Cii 3
EXEMPLE 2
A 1,2 g de phenobarbital, on ajoute lentement 4,5 g d'chlorosulfonic
acid et on chauffe le melange resultant a 60 C pendant 1 h On
refroidit le melange de reaction et on ajoute au melange de la glace
pilee et de l'water pour eliminer l'chl 3 rosulfoniquacid n'ayant
eventuellement pas reagi On filtre ensuite le melange de reaction pour
obtenir un precipite blanc que l'on rince a l'water et on seche dans
un dessiccateur a
vide pour obtenir 0,8 g d'un melange de meta et para-chlorosulfo-
nylphenobarbitals ayant un point de fusion de 190-195 C A une
solution contenant 5 mg de 5-aminofluorescein dans 0,5 ml de pyri-
dine, on ajoute 5 mg du melange ci-dessus de chlorosulfonylpheno-
barbitals Apres 10 min, il s'est forme un produit brut et on le
purifie deux fois par des techniques de chromatogr phie sur couche
mince en utilisant le gal de silice et un melange chloroform-
methanol 2:1 comme solvant de developpement pour obtenir un conjugue
sulfonylphenobarbital-aminofluorescein de formule
H O
CH H 5 O
O=C C 2 -l-AF N Cv
H O
EXEMPLE 3
A 2 g d'?-phenethyl-?-methylsuccinimide, on ajoute goutte a goutte 2,5
g d'chlorosulfonic acid et l'on agite le m-lange resultant a 26 C
pendant 1 h On ajoute aumelange de la glace pilee et de l'water pour
eliminer l'chlorosulfonic acid n'ayant pas reagi eventuel On extrait
le produit de reaction-forme par deux portions de 10 ml de chloroform
On reunit les extraits chloroformiques, on seche sur sodium sulfate et
on evapore pour obtenir une huile visqueuse On cristallise l'huile
dans un melange
18096
de toluene et d'ether de petrolether pour obtenir 0,29 g d'un melange
d'a(meta et para-chlorosulfonylphenethyl)-n-methylsuccinimide ayant un
point de fusion de 145-150 C A une solution contenant 5 mg de
4-aminofluorescein dans 0,5 ml de pyridine, on ajoute 5 mg du melange
cidessus d'?-chlorosulfonylphenethyl)-u-methylsuccinimides. Apres 10
min, il s'est forme un produit brut que l'on purifie deux fois par des
techniques de chromatographie sur couche mince en utilisant le gel de
silice et un melange chloroform-methanol ( 2:1) comme solvant de
developpement pour obtenir un melange de conjugues
a-(sulfonylphenethyl)ac-methylsuccinimide-aminofluorescein de formule
O=C CH 2 CH 3
I \^C/
H-N C CH CH / O
O A S -FAFl
EXEMPLE 4
A une solution contenant 2 g d'iminostilbene et 2 ml de triethylamine
dans 50 ml de chloroforms on ajoute 1,5 g de methoxyoxalyl chloride On
chauffe le melange resultant au reflux pendant 1 h et ensuite on
l'evapore a siccite On reprend le residu dans 50 ml de chloroform et
on extrait ensuite par 50 ml d'water On evap're a siccite la couche
chloroformique On ajoute au residu ml d'sodium hydroxide 2 N et on
chauffe le melange resultant au reflux pendant 30 min On refroidit le
melange a la temperature ambiante et ensuite on l'extrait par 50 ml de
chloroform On acidifie
la couche aqueuse a pli 1 en utilisant de l'hydrochloric acid concen-
tre,et ensuite on extrait par 100 ml d'etherOn seche l'extrait
organique sur sodium sulfate et on l'evapore a siccite On reprend le
residu dans 50 ml de methanol et on triture avec de l'water pour
obtenir un jet de cristaux On filtre le melange et on refroidit les
cristaux pendant 16 h pour obtenir 2,4 g d'un N-hydroxyoxalyl-
iminostilbene (point de fusion 162-163 C).
A 5 mg du N-hydroxyoxalyl-iminostilbene, on ajoute une solution
contenant 5 mg de 4-aminofluorescein dans 0,5 ml de pyridineOn laisse
la reaction se poursuivre pendant 2 h a 26 C
* pour obtenir un produit brut On purifie le produit brut par chro-
matographie sur couche mince en utilisant le gel de silice et un
solvant de developpement consistant en un melange chloroform-
acetone ( 1:1) pour obtenir un conjugue
N-oxalyl-iminostilbeneaminofluoresceine de formule
O Q
N-C-C AFl On prepare egalement les marqueurs suivants selon
les modes operatoires ci-dessus.
EXEMPLE 5
Conjugues sulfonylpyrimidone-
aminofluorescein
H "
o 2 5 O H O q Il AF
N _C O
\ 60 &#x003C; HS O\F/
EXEMPLE 6
Conjugue para-methyl-meta-sulfonylpyrimidone-
aminofluorescein
HN C __
H 2 C /
H/
O O^ il CH
EXEMPLE 8
Conjugue 5-sulfonylphenyl-5-ethylhydantoin-aminofluorescein H il c CH
CH O 2 3 il
S -+AF
C 1 1
N O
H
EXEMPLE 9
Conjugue u-(sulfon,lphenyl)-a -methylsuccinimide-aminofluorescein \ c
CH 2 le
EXEMPLE 10
Conjugue 0-sulfonaniidocarbonylpropranolol-
aminofluorescein
H O H O
1 Il yIl 0-CH 0-C-N-S EAFl 2 il
H CH 3
-11 I, -H
CH 3 H N
O=C '1
CI C 2 H 5
1 1 C '
I-
N C,
H AFl Il 0 CH Il \\C _ 3 Il -AFl H-N'
18 096
1 7
EXEMPLE 7
Conjugue para-methyl-meta-sulfonylph Cnobarbital-aminofluorescein is
EXEi LE Il e CcLlju,-,ue N-sulionami-docarb,)nyl-imi-nostilb,ie-
aminofluoresc 4-ine 0 H O
N-C -N-S-+AFI
EXEMPLE 12
Conjugue N-sulfonamidocarbonyl-procainartide-aminofluorescein H 5 C 2
Il O H O H O N-CH CH -N-C N-C-N-S EAFl C 2 2 il
H 5 2 O
EXEMPLE 13
Conjugue o-sulfonamidocarbonyl-chloramphenicol-
aminofluorescein
H H O H O
1 t ily il
0 N C-C-CH -0-C-N-S EAF-1
2 2 Il
H O
H C-CH Cl
EXEIMPLE 14
Conjugue N-sillfonamidocarbonyl-disopyramide-
aminofluorescein
H-C H 3
H O H O
CH 3 il Vit 1 fi
N-CH CH -C-C-N C-N-S E-AFI
CH / 2 2 i Il
\ 3 O
H-C i
CH 3 L)1
EXEMPLE 15
Conjugue o-sulfonamidocarbonyl-quinidine-aminofluorescein H CHCH x 2
N 0 H
H O-C-N-S-FEAFl OC Hil
EXEMPLE 16
Conijugue 0-oxalyl-propranolol-
aminofluorescein
H 0 00
I ilil \ / OC? -C-O-C-C -fr AFl
21,,CH
CH -N-C-H
2 y, -
H CH 3
EXEMPLE 17
Conjugue N-oxalyl-proca Tnamide-
aminofluorescein
H 5 C 2 H O H
N-CH CH -N-C -' " "
2 2 \ NCC AFI
H C
EXEMPLE 18
Conjugue Ni-acet yl-N'-desethivl-N'-oxaly 11-procai
Cnamideaminofluoresceine
O H H C H
C-N C N-CH CH -N
3 C-C -l-Arl i Q Oi
EXEMPLE 19
Conjugue N oxalyl-nortriptyline-aminofluorescein /A \ i / CH 3
C=CHCH 2 -CH -N
2 2 \ C-C-+AFl 0 \
EXEMPLE 20
Conjugue N-oxalyl-iminodibenzylaminofluorescein A 00 zi i A¦ N-C-C
FAFl Comme precedemment mentionne, les marqueurs selon l'invention
sont des reactifs efficaces pour l'utilisation dans les determinations
immunologiques par polarisation de fluorescence Les exemples suivants
illustrent l'interet des marqueurs selon l'invention dans les
determinations immunologiques utilisant des techniques de polarisation
de fluorescence Ces determinations sont effectuees selon le mode
operatoire general suivant: 1) On place dans un tube a essais un
volume mesure d'echantillon etalonne ou de serum d'essai et on dilue
par le tampon; 2) on ajoute ensuite dans chaque tube une concentration
connue d'un marqueur de l'invention contenant facultativement un
tensio-actif; 3) on ajoute dans les tubes une concentration connue des
antiserums;
4) on fait incuber le melange de reaction a la tempe-
rature ambiante et ) on mesure la quantite de marqueur lie a l'anti-
corns par des techniques de polarisation de fluorescence, comme
mesure de la quantite de ligand dans l'echantillon.
EXEMPLE 21 Determination de la lidocaine Produits: 1) Tampon:
phosphate 0, 1 M, p H 7,5, contenant 0,01 % 7 en poids par volume
d'azide de sodium et 0,01 % en poids par volume de y-globuline de
boeuf (ci-apres denomme "tampon GGB")
2) Marqueur: conjugue sulfonyllidocalne-amino-
fluorescein (prepare a l'exemple 1) a une concentration de 2,34 10-7 M
dans le tampon tris hydrochloride 0,IM, p H 7,8, contenant 0,1 % en
poids par volume de sodium dodecylsulfate, 0,01 % en poids par volume
de y-globuline de boeuf et 0,01 % en poids par volume d'azide de
sodium 3) Anticorps serum de lapin anti-lidocaine dilue 1 a 80 fois
dans le tampon GGB 4) Etalons et echantillons inconnus: serum humain
(ou autre liquide biologique) contenant de la lidocaine dans une gamme
de concentrationsde O a 10 P g/ml ) polarimetre de fluorescence:
instrument capable
de mesurer la polarisation de fluorescence d'une solution de fluores-
_g
ceine 10 M A + 0,001 unite de polarisation.
Mode operatoire: 1) A 20 /ul d'etalons ou d'echantillons inconnus,
ajouter 200 p 1 de tampon GGB 2) A 20 /ul de chaque etalon ou
echantillon inconnu dilue dans un tube de culture, ajouter 200 u 1 de
tampon GGB 3) A chaque tube de culture contenant l'etalon ou
l'echantillon inconnu dilue, ajouter 40 ml de marqueur et 1000 ml de
tampon GGB 4) Ajouter ensuite 40 ml d'anticorps et 1000 ml de tampon
GGB a chaque tube de culture 5) Melanger les reactifs et faire incuber
les tubes de culture contenant les etalons et les echantillons
inconnus pendant environ 15 min a 23 C 6) Mesurer la polarisation de
fluorescence de tous les tubes Des resultats caracteristiques des
echantillons etalons
sont representes dans le tableau I ci-apres.
TABLEAU I
Concentration de lidocaine (,u/ml) Polarisation
0 0,224
0,5 0,186
1,0 0,162
2,5 0,124
,0 0,094
,0 0,071
Les valeursde polarisation diminuent a mesure que la concentration de
lidocaine augmente, ce qui permet de tracer une courbe d'etalonnage
Des Echantillons inconnus traites de maniere
identique peuvent etre quantifies par reference a la courbe d'eta-
lonnage. EXEMPLE 22 Determination du phenobarbital Produits: 1) Tampon
GGB
2) Marqueur: conjugue (para-methyl-meta-sulfonyl)-
phenobarbital-aminofluorescein (prepare a l'exemple 7) a une concen-
tration de 5,75 10-8 M dans le sodium cholate a 5,75 % 3) Anticorps:
serum de lapin anti-phenobarbital dilue 1 a 78,3 fois dans le tampon
GGB 4) Etalons ou echantillons inconnus: serum humain (ou autre
liquide biologique)contenant du phenobarbital dans une gamme de
concentrationsde O a 80 /ug/ml 5) Polarimetre de fluorescence:
instrument capable
de mesurer la polarisation de fluorescence d'une solution de fluores-
ceine 10-9 M A + 0,001 unite de polarisation.
Mode operatoire 1) A 20 Pl d'etalons ou d'echantillons inconnus,
ajouter 200 1 ul de tampon GGB 2) A 20 /ul de chaque etalon ou
echantillon inconnu dilue dans un tube de culture, ajouter 200 /ul de
tampon GGB 3) Chaque tube de culture contenant un etalon ou un
echantillon inconnu dilue, ajouter 40 ml de marqueur et 1000 ml de
tampon GGB 4) Ajouter ensuite 40,1 l d'anticorps et 1000 /u 1 l de
tampon GGB a chaque tube de culture ) Melanger les reactifs et faire
incuber les tubes de culture contenant les etalons et les echantillons
inconnus pendant environ 15 min a 23 C 6) Mesurer la polarisation de
fluorescence de tous les tubes Des resultats caracteristiques pour des
echantillons
etalons sont representes dans le tableau II ci-apres.
TABLEAU II
Concentration de phenobarbital (ug/ml) Polarisation
O 0,155
10 0,108
0,092
0,074
0,060
Les valeurs de polarisation diminuent a mesure que la concentration de
phenobarbital augmente, ce qui permet de tracer une courbe
d'etalonnage Les echantillons inconnus traites de maniere identique
peuvent etre quantifies par reference a la
courbe d'etalonnage.
EXEMPLE 23 Determination de la carbamazepine Produits: 1) Tampon GGB
2) Marqueur: conjugue N-oxaliminostilbene-amino-
fluorescein (prepare a l'exemple 4) a une concentration de 2 n M dans
le tampon BGG contenant 0,2 % en poids par volume de sodium cholate 3)
Anticorps: serum de lapin anti-carbamazepine diluee 1 a 3040 fois dans
le tampon GGB 4 j Etalons ou echantillons inconnus: serum humain (ou
autre liquide blologique)contenant de la carbamazepine dans une gamme
de concentrationsde O a 20 /ug/ml 5) Polariraetre de fluorescence:
instrument capable de mesurer la polarisation de fluorescence d'une
solution
de fluorescein 109 M A + 0,001 unite de polarisation.
Mode operatoire 1) A 10 /ul d'etalons ou d'echantillons inconnus,
ajouter 300 /ul de tampon GGB 2) A 10 /11 de chaque etalon ou
dchantillon inconnu dilue dans un tube de culture, ajouter 300 X 1 de
tampon GGB 3) Ajouter 1 ml de marqueur a chaque tube de culture 4)
Ajouter ensuite a chaque tube de culture 1,0 ml d'anticorps 5)
Melanger lesreactifs et faire incuber les tubes de culture contenant
les etalons et les echantillons inconnus pendant environ 15 min a 23 D
O C. 6) Mesurer la polarisation de fluorescence
de tous les tubes Des resultats caracteristiques pour les echan-
tillons etalons sont representes dans le tableau III ci-apres.
TABLEAU III
Concentration de carbamazepine (/ug/ml) Polarisation
0 0,224
2 0,108
4 0,135
8 0,105
12 0,088
0,077
Les valeurs de polarisation diminuent a mesure que la concentration de
carbamazepine augmente, ce qui permet de tracer une courbe
d'etalonnage Les echantillons inconnus traites de maniere identique
peuvent etre quantifies par reference a la
courbe d'etalonnage.
Le tableau suivant resume les diverses deter-
minations immunologiques par polarisation de fluorescence qui ont ete
effectuees selon les modes operatoires decrits ci-dessus en
utilisant des marqueurs prepares dans les exemples precedents.
Les marqueurs utilises sont identifies par le numero d'exemple et
le o les ligands specifiques determines sont indiques.
Marqueur (exemple de preparation) Ligand(s) determine(s) Lidocaine
Phenobarbital Ethosuximide Carbamazepine Primidone Primidone Marqueur
(Exempie de preparation) Ligand(s) determine(s) 7 Phenobarbital 8
Phenytoin 9 Ethoxysuximide Propanolol 11 Carbamazepine 12 Procainamide
13 Chloramphenicol 14 Disopyramide Quinidine 16 Propanolol 17
Procainamide 18 N-acetylprocainamide 19 Desipramine, Imipramine
Nortriptyline, Amitriptyline Comme il est evident d'apres les
resultats ci-dessus, les marqueurs selon l'invention sont des reactifs
efficaces dans
les determinations immunologiques par polarisation de fluorescence.
Outre les proprietes mentionnees ci-dessus, les marqueurs de l'inven-
tion possedent une stabilite thermique elevee, un degre eleve de
polarisation a l'etat fixe, des rendements quantiques eleves et
sont faciles a produire et a purifier.
Il est entendu que l'invention n'est pas limitee aux
modes de realisation preferes decrits ci-dessus a titre d'illustra-
tion et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modications et
divers changements sans toutefois s'ecarter du cadre et de
l'esprit de l'invention.
Claims
_________________________________________________________________
R E V E N D I C A T I O N S1 Nouveaux derives de
sulfonylaminofluoresceine, caracte-rises en ce qu'ils repondent a la
formule generale __,OH / 0, R-S \ vE = \lo o H dans laquelle R est un
analogue de ligand ayant un poids moleculaire dans la gamme de 100 a
2000, ledit analogue de ligand ayant au moins un epitope commun avec
ledit ligand de maniere a etre specifiquement reconnaissable par un
anticorps commun et ledit analogue de ligand ayant un carbon
aromatique par lequel il est fixe au reste de
sulfonamidofluoresceine;et leurs salts biologiquement acceptables.2
Composes selon la revendication 1 caracterises en ce-qu'ils repondent
a la formule generaleOHOH R-S-NO -/ \OU 0 v BH A_ ou OH OR-S-N, / / '0
l Oet leurs salts biologiquement acceptables.3 Composes selon la
revendication 2, caracterises en ce que R est derive d'un ligand
choisi parmi les steroides, les hormones, les antiasthmatic, les
antineoplasiques, les antiarythmiques, les anticonvulsivants, les
antibiotic, les antiarthritic, les antidepresseurs et les glucosides
cardiaques. 4 Compose selon la revendication 3, caracterise en ceque R
est derive d'un antiarythmique.Compose selon la revendication 4,
caracterise en ceque R est derive de la lidocaine.6 Compose selon la
revendication 5, caracterise en ce que R est un groupe de formule CH 0
H CH CH 3 t N-CH 2-C-NCH.CE 2CH 3 Compose selon la revendicationderive
d'un anticonvulsivant.Compose selon la revendicationderive de la
phenytoin.Compose selon la revendication un groupe de formule 3,
caracterise en ce que 7, caracteriseen ce que 8, caracterise en ce que
H% Il N C -1 C ci CH 3I' / 2 31 1 /Compose selon la revendication
7,caracterise en ce queR est derive de la primidone.11 Compose selon
la revendication 7, caracterise en ce que R est un groupe de formule
LI r%LN _C' CH2 N CHl N O Vdans laquelle R' est un groupe alkyl en
Cl-C 4-7. R est
8. Rest
9. R est 12 Compose selon la revendication 7, caracterise en ceque R
est derive de l'ethosuccinimide.13 Compose selon la revendication 12,
caracterise en ce que R est un groupe de formule a? CH 3- H-NC-C -'CH
2dans laquelle N est un entier de O a 3.14 Nouveaux derives de
carbamidosulfonylaminofluoresceine, caracterises en ce qu'ils
repondent a la formule generale OHOH OH /tg I Il yR-C-N-S-NI O HOdans
laquelle R est un analogue de ligand ayant un poids moleculaire dans
la gamme de 100 a 2000, ledit analogue de ligand ayant au moins un
epitope commun avec ledit ligand de maniere a etre specifiquement
reconnaissable par un anticorps commun et ledit analogue de ligand
etant fixe au reste carbamidosulfonylaminofluoresceine par un oxygen
de groupe hydroxy ou une amine reactive;et leurs salts biologiquement
acceptables.Composes selon la revendication 14, caracterises en ce
qu'ils repondent a la formule generaleOHO HO HIl I '1 IR-C-N-S-NouO HO
O11 l IlR-C-N-S-Oet leurs salts biologiquement acceptables.16 Composes
selon la revendication 15, caracterises en ce que R est derive d'un
ligand choisi parmi les steroides, leshormones, les antiasthmatic, les
antineoplastic, les anti-arythmiques, les anticonvulsivants, les
antibiotic, les anti-arthritic, les antidepresseurs et les glucosides
cardiaques.17 Compose selon la revendication 16, caracterise ence que
R est derive d'un anticonvulsivant.18 Compose selon la revendication
17, caracterise ence que R est derive de la carbamazepine.19 Compose
selon la revendication 18, caracterise en ce que R est un groupe de
formule\ -\ &#x003C; Compose selon la revendication 16, caracterise
ence que R est derive d'un antiarythmique.21 Compose selon la
revendication 20, caracterise ence que R est derive de la
procainamide.22 Compose selon la revendication 20, caracterise ence
que R est derive du propranolol.23 Nouveaux derives
d'oxalylaminofluoresceine, carac-terises en ce qu ils repondent a la
formule generale OH O O H 'dR-C-C-No' OH if Y/i dans laquelle R est un
analogue deligand ayant un poids moleculaire dans la gamme de 100 a
2000, ledit analogue de ligand ayant au moins un epitope commun avec
ledit ligand de maniere a etre specifiquement reconnaissable par un
anticorps commun et ledit analogue de 'ligandayant un nitrogen reactif
par lequel il est fixe au reste oxalylamino-fluorescein,et leurs salts
biologiquement acceptables.24 Composes selon la revendication 23,
caracterises en ce qu'ils repondent a la formule generale OH O O Hv il
Il IR-C-C-N&#x003C;OH\XOOH \Co ou OHO O HIl Il IR-C-C-N0 ' OH \Oet
leurs salts biologiquement acceptables.2 518096Composes selon la
revendication 24, caracterises en ce que R est derive d'un ligand
choisi parmi les steroides, leshormones, les antiasthmatic, les
antineoplasiques, les anti-arythmiques, les anticonvulsivants, les
antibiotic, les anti-arthritic, les antidepresseurs et les glucosides
cardiaques. 26 Compose selon la revendication 25, caracterise en ceque
R est derive d'un antidepresseur.27 Compose selon la revendication 26,
caracterise en ceque R est derive d'un medicament tricyclic.28 Compose
selon la revendication 27, caracterise en ceque R est derive de la
nortriptyline, de l'amitriptyline, de l'imipramine ou de la
desipramine.29 Compose selon la revendication 28, caracterise en ceque
R est derive d'un anticonvulsivant.30 Compose selon la revendication
29, caracterise en ceque R est derive de la carbamazepine.31 Compose
selon la revendication 30, caracterise en ce qu R est un groupe de
formule e32 Procede pour la determination de ligands dans un
echan-tillon, caracterise en ce que l'on melange avec ledit
echantillon un salt biologiquement acceptable d'un marqueur de formule
generale OHOH /R-S-Nol18096dans laquelle R est un analogue de ligand
ayant un poids moleculaire dans la gamme de 100 a 2000, ledit analogue
de ligand ayant au moins un epitope commun avec ledit ligand de
maniere a etre specifiquement reconnaissable par un anticorps commun
et ledit analogue de ligand ayant un carbon aromatique par lequel il
est fixe au reste de sulfonamidofluoresceine; et un anticorps capable
de reconnaitre specifiquement ledit ligand et ledit marqueur et on
determine ensuite la quantite de marqueurfixee a l'anticorps par des
techniques de polarisation de fluores-cence comme mesure de la
quantite de ligand dans l'echantillon.33 Procede selon la
revendication 32, caracterise en ce que le groupe sulfonamido lie au
groupe R est egalement lie a laposition 4 ou 5 du reste fluorescein.34
Procede selon la revendication 33, caracterise en ce que ledit ligand
est choisi parmi les steroides, les hormones, les antiasthmatic, les
antineoplasiques, les antiarythmiques, les anticonvulsivants, les
antibiotic, les antiarthritic, lesantidepresseurs, les glucosides
cardiaques et leurs metabolites.Procede selon la revendication 34,
caracterise en ceque R a un poids moleculaire dans la gamme de 50 a
4000.36 Procede selon la revendication 35, caracterise en ceque R a un
poids moleculaire dans la gamme de 100 a 2000.37 Procede selon la
revendication 36, caracterise en ceque ledit ligand est un
antiarythmique.38 Procede selon la revendication 37, caracterise en
ceque ledit antiarythmique est la lidocaine.39 Procede selon la
revendication 38, caracterise en ceque ledit ligand est un
anticonvulsivant.Procede selon la revendication 39, caracterise en
ceque ledit anticonvulsivant est la phenytoin.41 Procede selon la
revendication 39, caracterise en ceque ledit anticonvulsivant est la
primidone.42 Procede selon la revendication 39, caracterise en ceque
ledit anticonvulsivant est l'ethosuccimide.43 Procede pour la
determination de ligands dans un echan-tillon, caracterise en ce que
l'on melange avec ledit echantillon un salt biologiquement acceptable
d'un marqueur de formule generale OHO H O /R-C-N-S-N \_o "O dans
laquelle R est un analogue de ligand ayant un poids moleculaire dans
la gamme de 100 a 2000, ledit analogue de ligand ayant au moins un
epitope commun avec ledit ligand de maniere a etre specifiquement
reconnaissable par un anticorps commun et ledit analogue de ligand
etant fixe au reste carbamidosulfonylaminofluoresceine par un oxygen
de groupe hydroxy ou une amine reactive; et un anticorps capable de
reconnaitre specifiquement ledit ligand et ledit marqueur et on
determine ensuite la quantite de marqueurfixee a l'anticorps par des
techniques de polarisation de fluores-cence comme mesure de la
quantite de ligand dans l'echantillon.44 Procede selon la
revendication 43, caracterise en ce que le groupe
carbamidosulfonylamino lie au groupe R est egalement liea la position
4 ou 5 du reste fluorescein.45 Procede selon la revendication 44,
caracterise en ce que ledit ligand est choisi parm i les stero Tdes,
les hormones, les antiasthmatic, les antineoplasiques, les
antiarythmiques, lesanticonvulsivants, les antbiotiques, les
antiarthritic, les anti-depresseurs, les glucosides cardiaques et
leurs metabolites.46 Procede selon la revendication 45, caracterise en
ce queR a un poids moleculaire dans la gamme de 50 a 4000.47 Procede
selon la revendication 46, caracterise en ce queR a un poids
moleculaire dans la gamme de 100 a 2000.48 Procede selon la
revendication 47, caracterise en ce queledit ligand est un
anticonvulsivant.49 Procede selon la revendication 48, caracterise en
ce queledit anticonvulsivant est la carbamazepine.Procede pour la
determination de ligands dans un echan-tillon, caracterise en ce que
l'on melange avec ledit echantillon un salt biologiquement acceptable
d'un marqueur de formule generale OH 0 0 H il il 1R-C-C-N /o dans
laquelle R est un analogue de ligand ayant un poids moleculaire dans
la gamme de 100 a 2000, ledit analogue de ligand ayant au moins un
epitope commun avec ledit ligand de maniere a etre specifiquement
reconnaissable par un anticorps commun et ledit analogue de
ligandayant un nitrogen reactif par lequel il est fixe au reste
oxalylamino-fluorescein; et un anticorps capable de reconnaitre
specifiquement ledit ligand et ledit marqueur et on determine ensuite
la quantite de marqueurfixee a l'anticorps par des techniques de
polarisation de fluores-cence comme mesure de la quantite de ligand
dans l'echantillon.51 Procede selon la revendication 50, caracterise
en ce que le groupe oxalylamino lie au groupe R est egalement lie a la
position4 ou 5 du reste fluorescein.52 Procede selon la revendication
51, caracterise en ce queledit ligand est choisi parmi les steroldes,
les hormones, les anti-asthmatic, les antineoplasiques, les
antiarythmiques, les anti-convulsivants, les antibiotic, les
antiarthritic, les anti-depresseurs, les glucosides cardiaques et
leurs metabolites.53 Procede selon la revendication 52, caracterise en
ce queR a un poids moleculaire dans la gamme de 50 a 4000.54 Procede
selon la revendication 53, caracterise en ce queR a un poids
moleculaire dans la gamme de 100 a 2000.Procede selon la revendication
54, caracterise ence que ledit ligand est un anticonvulsivant.56
Procede selon la revendication 55, caracterise en ceque ledit
anticonvulsivant est la carbamazepine.
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