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Molecule
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DES
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oxygen
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COTES
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ammonium citrate
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carbon
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nitrogen
(1)
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water
(1)
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sucrose
(1)
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2,4-dichloro-phenoxy-acetic acid
(1)
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Gene Or Protein
(3/ 16)
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Etre
(13)
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DANS
(2)
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Est-a
(1)
[19][_]
Physical
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1000 cm2
(3)
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de 2500 ml
(2)
[22][_]
44 cm
(1)
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25 %
(1)
[24][_]
25 mm
(1)
[25][_]
de 410 ml/minute
(1)
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de 8 mm
(1)
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14 % de
(1)
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2 x 10 6 moles
(1)
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de 4 mm
(1)
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de 30 ml
(1)
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Generic
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alkaloids
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Polymer
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Polyethylene
(2)
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Disease
(1/ 1)
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Callus
(1)
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Organism
(1/ 1)
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Claviceps purpurea
(1)
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Publication
_________________________________________________________________
Number FR2519020A1
Family ID 2604500
Probable Assignee Spofa Vereinigte Pharma Werke
Publication Year 1983
Title
_________________________________________________________________
EN Title The invention relates to a method and to a device for the
culturing of cells of higher organisms, for example in a...........
FR Title PROCEDE POUR LA CULTURE DE CELLULES D'ORGANISMES SUPERIEURS
ET DISPOSITIF POUR REALISER CE PROCEDE
Abstract
_________________________________________________________________
The invention relates to a method and to a device for the culturing of
cells of higher organisms, for example in a suspension in a liquid
nutrient medium, in vessels, in particular with resilient and/or
elastic walls, preferably in the form of a bag, with a supply of
aerating gas and nutrients. The principle of the method consists in
the culturing being carried out with continuous or periodic thorough
mixing of the nutrient medium by means of a wave movement, which is
produced by continuously or periodically changing the position of at
least one side of the culturing vessel. The device according to the
invention comprises essentially a base (1) and a movement arrangement
(3), which continuously or periodically changes the position of at
least one side of the base (1).
A.LE PROCEDE EST DESTINE A LA CULTURE DE CELLULES D'ORGANISMES
SUPERIEURS, PAR EXEMPLE EN SUSPENSION DANS UN MILIEU DE CULTURE
LIQUIDE DANS DES RECIPIENTS EN FORME DE SACS, SOUPLES, POURVUS D'UNE
OUVERTURE POUR L'INTRODUCTION D'AIR ET DE PRODUITS NUTRITIFS.
B.IL EST CARACTERISE EN CE QU'ON ASSURE UN MELANGE, PERIODIQUE OU
CONTINU, DU MILIEU DE CULTURE ET DES ORGANISMES AU MOYEN D'UN
MOUVEMENT ONDULATOIRE PRODUIT PAR DES VARIATIONS DE LA POSITION D'AU
MOINS UN DES COTES 2 DU SAC DE CULTURE SUR UN AXE 4.
C.CE PROCEDE PERMET D'OBTENIR UNE TRES SENSIBLE AUGMENTATION DU
RENDEMENT DES CULTURES DE CE GENRE EN AMELIORANT LES CONTACTS DES
ORGANISMES AVEC LES PRODUITS NUTRITIFS ET L'oxygen.
Description
_________________________________________________________________
Procede pour la culture de cellules d'organismes supe
rieurs et dispositif pour realiser ce procede ".
L'invention concerne un procede pour la culture de cellules
d'organismes superieurs et un dispositif pour la mise en oeuvre de ce
procede.
On sait que la culture de suspensions de cellules vegetales ou
animales necessite, comparativement a la culture de microorganismes,
non seulement une duree nettement plus longue, en general, mais aussi
un dispositif particulier, concu en tenant compte des differentes
proprietes de ces cellules. Une periode prolongee de croissance de
cellules non-differenciees d'organismes superieurs va aussi de pair
avec un ralentissement de la consommation d'oxygen, ce qui fait que ce
type de culture ne necessite pas une aeration et une agitation
intenses, comme c'est le cas par exemple dans la culture en immersion
de microorganismes dans des appareils de fermentation.Au contraire, le
mouvement rapide du liquide de culture et les obstacles mecaniques
tels qu'agitateurs ou bouchons, endommagent les cellules des
organismes superieurs par des forces de cisaillement, de facon
incomparablement superieure a ce qui se produirait par exemple dans le
cas de fongi fibrilles c est essentiellement pour cette raison que des
disposi tifs courants de fermentation ne peuvent etre utilises pour
leur culture.
Jusqu'a present, il n'a ete possible de cultiver avec succes des
cellules d'organismes superieurs qu'a l'echelle de laboratoire, dans
de faibles volumes de liquide, dans des flacons ou boites de Petri ou
dans des flacons en rotation continue sur un axe horizontal, dans des
dispositifs dits a roulement.
On connait un dispositif simple et utilisable a l'echelle
industrielle, pour la culture immobile de microorganismes aerobies sur
la surface d'un milieu de culture liquide, dont on remplit, apres
inoculation, des sacs de plastique elastiques et flexibles par exemple
des sacs de polyethylene gonfles avec de l'air sterile, et que l'on
aere au cours de la culture avec de l'air que l'on envoie sur la
surface de la culture en cours de croissance. (Certificat de l'auteur
nO 172 552).
La poursuite des recherches a prouve que ce dispositif peut etre
utilise, avec de petites modifications, pour la culture de cellules en
suspension d'organismes superieurs, a l'echelle industrielle.
En consequence, l'invention a pour objet un procede de culture de
cellules d'organismes superieurs, la culture ayant lieu par exemple en
suspension dans un milieu de culture fluide, dans des recipients a
parois souples et/ou elastiques, de preference sous forme de sac, ces
recipients etant pourvus d'une entree pour le gaz d'aeration et les
elements nutritifs. Le principe du procede consiste en ce que la
culture est
effectuee sous melange continu ou periodique du milieu de culture
assure par un mouvement ondulatoire provoque par des variations
continues ou periodiques de la position d'au moins un cote du
recipient de culture.
L'invention a egalement pour objet un dispositif pour la culture de
cellules d'organismes superieurs, ce dispositif etant constitue par
une structure plane ayant des dimensions superficielles limitees, et
par un organe de mise en mouvement, qui fait varier, de facon continue
ou periodique, la position d'au moins un cote de cette structure
plane.
Cette structure plane peut etre munie en outre d'un ou de plusieurs
organes de fixation, ainsi que d'ouvertures et/ou de surface non plane
et/ou d'un dispositif pour ajuster la temperature.
Un exemple de dispositif selon l'invention est illustre
schematiquement sur les figures 1 a 4 du dessin annexe. Ces figures
representent divers modes de realisation du dispositif en section
longitudinale, a savoir
- la figure 1 represente le mode de realisation le plus simple de
l'invention.
- la figure 2 est une variante avec l'axe du mouvement au bord de la
structure.
- la figure 3 est une variante a surface faconnee.
- la figure 4 est une combinaison de surface plane et de surface
faconnee.
La figure 1 illustre le mode de realisation le plus simple du
dispositif selon l'invention, une structure plane de dimensions
superficielles limitees, designee par 1, un organe de mise en
mouvement 3 et des moyens 2 pour fixer le recipient de culture 7; la
structure plane 1 peut effectuer un mouvement sur l'axe 4 dispose soit
entre les bords (figure 1), soit sur un bord (figure 2) de la
structure plane 1. Sur la figure 3, on voit la structure 1 pourvue
d'une surface faconnee 5; la figure 4 presente une combinaison de
surface faconnee 5 et d'ouvertures 6. Par surface non plane 5, on doit
comprendre ici qu'un corps de forme appropriee est dispose sur la
structure plane.
La structure plane 1 de dimensions superficielles limitees constituant
la partie essentielle du dispositif selon l'invention et designee dans
la suite, pour simplifier, par le terme "support", peut avoir une
surface entierement unie et lisse (voir figures 1 et 2), ou inegale 5,
de formes variees, regulieres ou irregulieres, pourvue d'ouvertures 6
de forme avantageuse (figures 3 et 4), si necessaire, qui peuvent
constituer une grille ou un reseau dans le cas limite (non illustre).
Par cette modification de la surface du support 1, on peut conferer la
forme souhaitee au fond du sac 7 de culture.Un ou plusieurs corps de
forme appropriee (non representes en particulier) peuvent servir au
meme objet, ces corps etant simplement poses sur la surface unie du
support 1 en cas de besoin. I1 apparait egalement possible de combiner
les ouvertures 6 du support 1 avec une forme appropriee de la surface
5 ou avec des corps faconnes mobiles.
Le support 1 peut etre muni en outre de moyens fixes ou amovibles 2
pour fixer le sac de culture 7, par exemple des plaques laterales
fixes ou a bascule etou ajustables, d'une realisation arbitraire
appropriee (il peut s'agir par exemple simplement d'un repli des bords
du support 1), ce qui permet l'utilisation du support 1 d'une certaine
dimension de base pour des sacs de culture 7 de dimensions et de
formes variees.
Lorsque c'est necessaire, le support 1 peut etre muni d'un dispositif
ajustant la temperature qui peut constituer seul tout le support 1, y
compris les moyens 2 pour fixer le sac de culture 7 dans la case qui
le limite.
La variation continue ou periodique de la position du support 1 avec
le sac de culture 7, assurant le melange du milieu de culture par un
mouvement ondulatoire, peut etre obtenue par de nombreux procedes
connus et/ou par d'autres moyens qui neanmoins appartiennent au
domaine de l'invention. Des cames excentriques, leviers ou pistons, et
similaires, commandes pour un organe moteur approprie, comme un moteur
electrique, peuvent etre presentes simplement comme exemples, le
moteur electrique etant en fonctionnement soit continu soit
occasionnel, par exemple selon un programme determine a l'avance. Le
point sur lequel le support se deplace (crochet, axe, support et
autres) peut etre ajuste egalement, n'importe ou entre la peripherie
et le centre du support 1 de la facon la plus appropriee pour un cas
donne.
La position du support 1 peut varier, si on le souhaite, soit sur un
cote, soit sur tous les cotes les uns apres les autres. La course de
deplacement, sa vitesse et sa frequence dependent naturellement du
caractere de l'organisme cultive, de la viscosite du milieu de culture
et naturellement de tout le regime de culture, et on les definira pour
chaque cas particulier.
Si l'on se propose de cultiver un type d'organisme pendant une duree
de production prolongee, il est raisonnable, surtout du point de vue
de ltecono: mie de surveillance, que-plusieurs supports 1 avec des
sacs de culture 7 puissent etre disposes les uns audessus et/ou a cote
des autres, et puissent etre commandes par le meme organe de mise en
mouvement.
Dans le procede selon l'invention, on obtient tres simplement le
mouvement ondulatoire du milieu de culture et ceci avec l'ampleur qui
est la plus appropriee pour l'organisme en question. Le mouvement
ondulatoire du liquide permet de realiser un melange suffisant avec la
suspension de cellules en developpement, et permet d'obtenir qu'une
surface relativement grande (par rapport a son volume) du milieu de
culture, soit en contact avec un coussin d'air continuellement
renouvele, ce qui assure en meme temps un transfert suffisant de
l'oxygen dans les cellules de developpement. L'efficacite du melange
par mouvement ondulatoire peut etre encore augmentee en conferant au
support 1 la forme d'une grille, le fond du sac de culture 7 souple
rempli de milieu de culture prenant, sous l'effet de son poids, la
forme de plusieurs rainures perpendiculaires a la direction du
mouvement ondulatoire.Ceci permet d'activer non seulement le melange
de la suspension cellulaire, mais aussi l'oxydation du milieu de
culture, comme le ferait un barrage.
Le dispositif de l'invention sert avant tout a la culture de cellules
en suspension libre, dont la reproduction et le developpement sont
conditionnes par l'accrochage sur la surface de substrat solide (par
exemple de fibroblastes). Ces cellules se developpent alors sur la
paroi interieure du sac de culture 7, la surface effective
d'accrochage et de developpement des cellules pouvant etre augmentee
en plus sensiblement par addition de micro-vecteurs suspendus dans le
milieu de culture.
Dans le dispositif selon l'invention, l'amplitude et la frequence du
mouvement, l'etendue de la surface du milieu de culture, l'ecoulement
de l'air, la temperature et la duree de la culture peuvent etre
optimises de facon empirique pour un type de cellules donne et une
composition determinee du milieu de culture.
Le procede et le dispositif suivant l'invention s'appliquent aussi de
preference a la culture de microorganismes fibrilles, a la surface de
milieu de culture liquide. Si la culture est maintenue immobile, la
lenteur de la diffusion des produits nutritifs de la solution vers le
haut, c'est-a-dire vers les
microorganismes en developpement, constitue le plus sou
vent le facteur de limitation du developpement et de
la production. Par un mouvement ondulatoire temporaire,
induit par les variations de la position du support 1,
il se produit une convection des substrats dissous dans
le milieu, ce qui permet une resorption plus rapide de
ces substrats et ainsi, une acceleration de la crois
sance et une augmentation de la production.
Les exemples suivants illustrent le pro
cede selon l'invention sans en limiter la portee.
Exemple 1
Des sacs de culture 7 de dimensions
32,5 x 44 cm, ont ete prepares pour la culture, a partir
de tubes de polyethylene au moyen de soudures transver
sales. Ces sacs 7 ont ete remplis de 2500 ml de milieu 'de culture
liquide, contenant 25 % en poids de saccha
rose et 1 X en poids de ammonium citrate comme sources
de carbon et d'nitrogen. En limitant les dimensions super
ficielles en utilisant un fond plat et un cadre fixe, la
surface du milieu a ete ajustee a 1000 cm2 et la hauteur
a 25 mm. Le milieu a ete refroidi apres sterilisation a
une temperature de 240C, et inocule avec de l'inoculum,
vegetatif en immersion, prepare a partir de conidia de
la souche de production Claviceps purpurea CCM F-725.
Les sacs de culture 7 ont subi une incubation a 240C
pendant 21 jours; a partir du 5eme jour, ils ont subi
une aeration sur la surface du milieu, avec de l'air 2
sterile, a raison de 410 ml/minute/1000 cm2. Six sacs
de culture 7 ont ete prepares ainsi au total, dont trois
ont subi l'incubation pendant tout le temps au repos,
les trois autres ayant ete soumis a une oscillation
periodique, avec des oscillations de 8 mm de hauteur,
a la frequence d'une oscillation par heure, commencant
le poeme jour. L'axe 4 des oscillations a ete place a
la moitie de la longueur des sacs de culture. Apres la fin de
l'incubation, le mycelium developpe -a ete recueilli, rince a l'water,
seche, pese, et la teneur en alkaloids a ete determine.Avec
l'incubation soumise a un mouvement ondulatoire periodique du milieu
de culture, il a ete obtenu en moyenne 14 % de plus de mycelium en
poids sec, avec une teneur en alkaloids de 35 X plus elevee que dans
le cas ou l'incubation s'est effectuee tout le temps au repos.
Exemple 2
La culture a ete effectuee dans le meme dispositif que dans l'exemple
1. Une culture de cellules en suspension de l'espece Vincea rosea,
derive de callus de tige, a ete utilisee. Le remplissage s'est
effectuee comme dans l'exemple 1, la duree de culture a ete de 14
jours a la temperature de 240C, dans un milieu contenant 3 X en poids
de sucrose et 2 x 10 6 moles d'2,4-dichloro-phenoxy-acetic acid (T.
Murashige, F. Shoog, Physiol. Plant. 15, 473, 1962).
La culture s'est deroulee sous oscillations continues, avec des
hauteurs d'oscillation de 4 mm et une frequence d'oscillations de 10
secondes. Pendant toute la duree de la culture, il a ete effectue-une
aeration a raison de 30 ml d'air/minute/1000 cm2. I1 a ete insere avec
l'inoculum 3 x 105 cellules par ml dans le sac 7 de culture, rempli de
2500 ml du milieu de culture. Apres la fin de la culture, on a trouve
35 x 105 cellules/ml.
Claims
_________________________________________________________________
REVENDICATIONS
10) Procede pour la culture de cellules d'organismes superieurs, par
exemple en suspension dans un milieu de culture fluide, dans des
recipients a parois souples et/ou elastiques, de preference en forme
de sacs, ces recipients etant pourvus d'une ouverture pour
l'introduction de gaz d'aeration et de produits nutritifs, procede
caracterise en ce que la culture est effectuee avec melange periodique
ou continu du milieu de culture, sous l'effet d'un mouvement
ondulatoire induit par une variation periodique ou continue de la
position d'au moins un cote du sac de culture.
20) Dispositif pour la mise en oeuvre du procede selon la
revendication 1, caracterise en ce qu'il est constitue par une
structure plane (1), ayant des dimensions superficielles limitees, et
par un organe de mise en mouvement (3), qui fait varier, de facon
continue ou periodique, la position d'au moins un cote de la structure
plane (1).
30) Dispositif selon la revendication 2, caracterise en ce que la
structure plane (1) est pourvue d'un ou plusieurs organes (2) pour
fixer le sac de culture (7).
40) Dispositif selon l'une des revendications 2 ou 3, caracterise en
ce que la structure plane (1) est pourvue d'ouvertures (6), et/ou
d'une surface non plane (5) et/ou d'un dispositif pour ajuster la
temperature.
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