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[5][_]
Molecule
(39/ 188)
[6][_]
nebramycin
(49)
[7][_]
nebramycin-5'
(41)
[8][_]
nebramycin-4
(18)
[9][_]
water
(8)
[10][_]
nitrogen
(5)
[11][_]
kanamycin B
(4)
[12][_]
carbon
(4)
[13][_]
glucose
(4)
[14][_]
ammonium chloride
(4)
[15][_]
glutamic acid
(3)
[16][_]
ammonium nitrate
(3)
[17][_]
calcium carbonate
(3)
[18][_]
hydroxyde de sodium
(3)
[19][_]
magnesium sulfate heptahydrate
(3)
[20][_]
ammonium hydroxide
(3)
[21][_]
-O
(2)
[22][_]
bromide
(2)
[23][_]
2,7-diamino-10-ethyl-phenyl-phenanthridinium bromide
(2)
[24][_]
ethidium bromide
(2)
[25][_]
glycerol
(2)
[26][_]
fructose
(2)
[27][_]
hydroxide
(2)
[28][_]
cobalt dinitrate hexahydrate
(2)
[29][_]
sulfuric acid
(2)
[30][_]
apramycin
(1)
[31][_]
cipe
(1)
[32][_]
ammonium sulfate
(1)
[33][_]
magnesium sulfate
(1)
[34][_]
zinc sulfate
(1)
[35][_]
cobalt nitrate
(1)
[36][_]
oxygen
(1)
[37][_]
ammonium ethanol
(1)
[38][_]
methylethylketone
(1)
[39][_]
2,5-glucose
(1)
[40][_]
oxalic acid
(1)
[41][_]
calcium
(1)
[42][_]
phosphorus pentoxide
(1)
[43][_]
ethanol
(1)
[44][_]
OOK
(1)
[45][_]
Physical
(78/ 119)
[46][_]
10 percent
(5)
[47][_]
0,5 percent
(5)
[48][_]
50 percent
(5)
[49][_]
0,1 percent
(4)
[50][_]
de 100 ml
(4)
[51][_]
2000 ml
(4)
[52][_]
2,0 percent
(3)
[53][_]
0,001 percent
(3)
[54][_]
3,0 percent
(3)
[55][_]
100 ml
(3)
[56][_]
9 l
(3)
[57][_]
1,0 percent
(2)
[58][_]
20 minutes
(2)
[59][_]
de 500 ml
(2)
[60][_]
0,3 percent
(2)
[61][_]
de 10 litres
(2)
[62][_]
1000 litres
(2)
[63][_]
1000 ml
(2)
[64][_]
0,05 N
(2)
[65][_]
0,1 N
(2)
[66][_]
0,15 N
(2)
[67][_]
180 pg/ml
(1)
[68][_]
2600 pg/ ml
(1)
[69][_]
60 minutes
(1)
[70][_]
0,5 pg/ml
(1)
[71][_]
25 percent
(1)
[72][_]
2,5 percent
(1)
[73][_]
2,4 cm
(1)
[74][_]
20 ml
(1)
[75][_]
45 minutes
(1)
[76][_]
5,0 percent
(1)
[77][_]
0,8 percent
(1)
[78][_]
4,2 percent
(1)
[79][_]
de 3 litres/minute
(1)
[80][_]
260 mg
(1)
[81][_]
9 mg
(1)
[82][_]
3,3 percent
(1)
[83][_]
0,6 percent
(1)
[84][_]
0,7 percent
(1)
[85][_]
2,1 percent
(1)
[86][_]
4 percent
(1)
[87][_]
3 mg
(1)
[88][_]
180 mg
(1)
[89][_]
100 litres
(1)
[90][_]
de 100 litres/minutes
(1)
[91][_]
50 litres
(1)
[92][_]
22 g
(1)
[93][_]
2600 kg/ml
(1)
[94][_]
90 pg/ml
(1)
[95][_]
25 minutes
(1)
[96][_]
de 6 g
(1)
[97][_]
30 minutes
(1)
[98][_]
600 ml
(1)
[99][_]
de 200 ml
(1)
[100][_]
400 ml
(1)
[101][_]
3000 ml
(1)
[102][_]
de 250 ml
(1)
[103][_]
120 ml
(1)
[104][_]
200 ml
(1)
[105][_]
0,2 N
(1)
[106][_]
de 60 ml
(1)
[107][_]
7 g
(1)
[108][_]
70 percent
(1)
[109][_]
12 percent de
(1)
[110][_]
8 percent de
(1)
[111][_]
0,2 g
(1)
[112][_]
60 percent
(1)
[113][_]
de 40 percent de
(1)
[114][_]
0,2 percent de
(1)
[115][_]
5,7 g
(1)
[116][_]
0,15 percent de
(1)
[117][_]
96 percent
(1)
[118][_]
4,2 g
(1)
[119][_]
de 5 litres
(1)
[120][_]
6 M
(1)
[121][_]
9 J
(1)
[122][_]
6 l
(1)
[123][_]
0 L
(1)
[124][_]
Organism
(7/ 33)
[125][_]
STREPTOMYCES TENEBRARIUS
(21)
[126][_]
soja
(5)
[127][_]
Streptomyces
(3)
[128][_]
Streptoalloteichus
(1)
[129][_]
thera
(1)
[130][_]
Bacillus
(1)
[131][_]
inconnu
(1)
[132][_]
Gene Or Protein
(13/ 32)
[133][_]
Etre
(17)
[134][_]
Est A
(4)
[135][_]
CES
(1)
[136][_]
Vege
(1)
[137][_]
Tif
(1)
[138][_]
Perd
(1)
[139][_]
Frac
(1)
[140][_]
GLI
(1)
[141][_]
OC-1
(1)
[142][_]
Ap A
(1)
[143][_]
TEU
(1)
[144][_]
Oli
(1)
[145][_]
Oim
(1)
[146][_]
Chemical Role
(2/ 23)
[147][_]
antibiotic
(22)
[148][_]
Antimicrobial
(1)
[149][_]
Generic
(4/ 6)
[150][_]
salts
(3)
[151][_]
sugar
(1)
[152][_]
dichloride hexahydrate
(1)
[153][_]
acid
(1)
[154][_]
Substituent
(3/ 4)
[155][_]
6-O-CARBAMOYL
(2)
[156][_]
carbamoyl
(1)
[157][_]
amino
(1)
[158][_]
Disease
(2/ 3)
[159][_]
Tic
(2)
[160][_]
Infection
(1)
[161][_]
Polymer
(1/ 2)
[162][_]
Starch
(2)
Export to file:
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Images Mosaic View
Publication
_________________________________________________________________
Number FR2519023A1
Family ID 1897300
Probable Assignee Gyogyszerkutato Intezet
Publication Year 1983
Title
_________________________________________________________________
FR Title PROCEDE MICROBIOLOGIQUE POUR PREPARER DE LA NEBRAMYCINE-2, DE
LA NEBRAMYCINE-5' ET DE LA NEBRAMYCINE-4
Abstract
_________________________________________________________________
L'INVENTION EST RELATIVE A UN PROCEDE DE PRODUCTION DE BOUILLONS DE
FERMENTATION CONTENANT SOIT PRATIQUEMENT UNIQUEMENT DE LA
NEBRAMYCINE-5 (6-O-CARBAMOYL-TOBRAMYCINE, SOIT UN MELANGE DE
NEBRAMYCINE-2 (APRAMYCINE) ET DE NEBRAMYCINE-5 SELON UN QUELCONQUE
RAPPORT DESIRE PRE-ETABLI ET DE LA NEBRAMYCINE-4
(6-O-CARBAMOYL-KANAMYCINE B), CES BOUILLONS DE FERMENTATION ETANT
PRODUITS A PARTIR DE LA SOUCHE MNG 204 DE STREPTOMYCES TENEBRARIUS,
EVENTUELLEMENT EN ASSOCIATION AVEC LA SOUCHE MNG 169 DE STREPTOMYCES
TENEBRARIUS.
APPLICATION A LA PREPARATION DE BOUILLONS DE CULTURE CONTENANT SOIT
PRATIQUEMENT UNIQUEMENT DE LA NEBRAMYCINE-5, SOIT UN MELANGE DE
NEBRAMYCINE-2 ET DE NEBRAMYCINE-5.
Description
_________________________________________________________________
La presente invention est relative a un procede microbiologique pour
preparer des bouillons de fermentation qui contiennent soit
pratiquement uniquement de la nebramycin-5', soit un melange de
nebramycin-2 et de nebramycin-
5 ' selon un rapport quelconque desire preetabli et de la
nebramycin-4.
I 1 est connu que la nebramycin, un melange comple- xe de plusieurs
antibiotic, est un metabolite biosynthe- tic de Streptomyces
tenebrarius (Stark, Hoehn and Knox, Antimicrobial, Agents and
Chemotherapy, 1967, p 314; brevet britannique N 1 178 489 et brevet U
S N 3 691 279).
Le melange antibiotic est compose, a cote de plusieurs facteurs
mineurs, des principaux composants suivants: nebramycin-2 (apramycin);
nebramycin-4 (6 "-O-carbamoyl- kanamycin B), et nebramycin-5' (6
"-O-carbamoyltobramycin) (Koch, Davis and Rhoades, J Antibiotics 26,
745,
1973) Dans le brevet U S N 3 853 709 on decrit un micro- organisme
produisant de la nebramycin-7 en plus de la nebramycin-2 Les auteurs
japonais dans le brevet US.
N 4 032 404, coproduisent de la nebramycin-2 et de la nebramycin-5' en
cultivant du Streptoalloteichus hindus- tanus Selon le brevet hongrois
N 176 103, les Streptomyces tenebrarius MNG 169 et 170, cultives dans
des conditions submergees et aerees, produisent des bouillons de
fermenta- tion contenant soit de la nebramycin-2; de la nebramycin-5'
et de la nebramycin-4, soit de la nebramycin-2 et de la nebramycin-5',
respectivement; Ces antibiotic sont isoles selon la technique decrite
dans le brevet hongrois
N 174 315.
La nebramycin-2 inhibe la croissance de micro- organismes
phytopatogenes et zoopathogenes (brevets U S. N 3 691 279, 3 853 709
et 3 876 763, tandis que la kanamycin B, obtenue par hydrolyse de la
nebramycin-4 et la tobramycin (Brulamycin), obtenue par l'hydrolyse de
la nebramycin-5', sont toutes deux des antibiotic industriels a large
spectre, jouant un grand role en thera- pie humaine pour le traitement
d'infection provoquee par des bacteries polyresistantes (par exemple
Prestonand Wick,
Ar.timicrobial Agents and Chemotherapy 1970, p 322).
En appliquant le procede decrit dans le brevet hongrois N 176 106, on
obtient un melange antibiotic ayant la composition suivante tableau
I):
Tableau 1
Souche Nebramycin-2 Nebramycin-4 Nebramycin-5'
MNG 169 77 2 21
MNG 170 91 traces 9 # Deposee le 28 DECEIBRE 1977 a la National
Collection of Microorganisms, National Institute for Public Health,
Budapest et accessible au public depuis le 28 Fevrier 1980.
{* Deposee le 5 avril 1978 dans la meme collection; accessi- ble au
public depuis le 28 Fevrier 1980.
Il est apparent que la nebramycin-2 constitue le principal produit de
la biosynthese dans les deux souches, tandis que la nebramycin-5' doit
etre separee des autres composants predominants au prix d'une
procedure hautement sophistiquee et couteuse.
La composition d'un complexe antibiotic, biosyn- thetise par un
microorganisme est determinee principalement par l'ensemble des
informations genetiques cellulaires et seulement en une mesure
beaucoup plus faible, par les condi- tions de fermentation.
Dans les procedes connus jusqu'a maintenant, le rapport des composants
dans le bouillon de fermentation ne peut pas etre modifie conformement
aux necessites industriel- les reelles De plus, si la production de
nebramycin-5' est requise, celle-ci doit etre separee de la
nebramycin-2 predominante par des procedures extremement coateuses
Avec de tels svstemes a multicom Dosants, l'avaluation des expe-
riences de selection des souches qui tendent a accroitre la
productivite de la souche, demande plutot beaucoup de travail et de
temps Apres separation chromatographique sur couche mince, chaque
composant est determine en quantite, separement par un titrage
biologique Il serait avantageux d'effectuer ces selections de souches
avec un systeme a un comnosant permettant des procedures de titrage
simples De plus, l'augmentation de productivite dans une souche bio-
svnthetisant un antibiotic unique, est plus prometteuse, muisaue dans
ce cas, les cellules peuvent utiliser leur capacite biosynthetique
entiere pour former un seul compose.
La presente invention a pour but de developper un procede de
fermentation simple et nouveau, pour preparer des bouillons de
fermentation qui contiennent, soit uniquement de la nebramycin-5',
soit un melange de nebramycin-2 et de nebramycin-5' selon un rapport
quelconque desire preetabli.
La Demanderesse a constate avec surprise que le
Streptomyces tenebrarius MNG 169, traite avec du bromure d'ethbromide-
2,7-diamino-10-ethyl-phenyl-phenanthridinium bromide (bromure de
2,7-diamino-10-ethyl-phenyl-phenanthridinium bromide) fournit une
souche mutante qui ne produit pas de nebramycin-
2, mais donne de la nebramycin-5' a titre de principal composant a
cote de traces de nebramycin-4 Ce phenomene est plutot inattendu et
surprenant dans la mesure o, jusqu'a maintenant, le ethidium bromide
n'avait pas du tout ete applique a titre d'agent mutagene.
Pour realiser l'isolation d'une souche mutante bio- synthetisant un
complexe antibiotic presentant un rapport de composants modifie, on
cultive les spores du Streptomyces tenebrarius MNG 169 dans un milieu
nutritif liquide La culture developpee est divisee en cinq parties et
des quantites de O; 0,05; 0,5; 5,0 et 50,0 pq/lk de bromure
d'ethediubromide sont resnectivement ajoutees La culture est
poursuivie pendant 24 heures, puis une portion de la culture est
etalee sur de l'agar en botte apres dilution, tandis que l'autre
portion sert a inoculer des milieux liquides contenant des quantites
egales de ethidium bromide et leur culture est poursuivie pendant 24
heures supplementaires Ensuite, la procedure ci-dessus de depot sur de
l'agar en boite et d'inoculation est repetee Les nouvelles cultures
liquides obtenues sont remises sur de l'agar a nouveau apres 24
heures, les bottes d'agar sont incubees, certaines colonies distinctes
sont isolees et leur productivite est evaluee selon une procedure
decrite dans les exemples.
A partir de plusieurs centaines d'isolats prove- nant du Streptomyces
tenebrarius MNG 169, deux souches mutantes ne reussissent pas a
produire de la nebramycin-2, mais produisent des quantites
relativement petites de nebramy- cine-5 ' et des traces de
nebramycin-4 Pour ameliorer la productivite de ces deux souches
mutantes produisant de la nebramycin-5', on effectue des experiences
de selection de souches et d'optimisation du milieu Au cours de
celles-ci, une mutante est perdue, tandis que la capacite de
production de la seconde augmente d'un facteur cinq et peut etre main-
tenue a ce niveau Cette souche a ete deposee le 2 septembre 1981 a la
National Collection of Microorganisms (National Institute for Public
Health, Budapest, Hongrie), o le numero matricule MNG 204 lui a ete
attribue De plus, la presente invention est relative a un procede pour
preparer des bouillons de fermentation contenant un melange de
nebramycin-2 et de nebramycin-5 selon un rapport quelconque desire
preetabli, par melange des spores ou de myceliums vegetatifs de la
souc In Streptomyces tene- brarius MNG 169 d'origine et de ceux de la
souche Streptomyces tenebrarium 204 ne produisant pas de nebramycin-2,
selon un rapport requis, puis culture de ceux-ci dans une culture
mixte On a constate avec surprise, qu'au cours de cette fermentation
effectuee avec une culture mixte, les deux souches produisent de plus
fortes antibiotic que dans des fermentations dans lesquelles chaque
souche est cultivee separement.
A partir de ces donnees, l'invention est relative a un procede pour
preparer des bouillons de fermentation qui contiennent, soit
pratiquement uniquement de la nebramycin-5', soit un melange de
nebramycin-2 et de nebramycin-5', selon un rapport quelconque desire
Dreetabli et de nebramycin-4 Conformement au procede de la nresente
invention: a) pour preparer des bouillons de fermentation contenant
pratiquement uniquement de la nebramycin-5', on utilise la souche MNG
204 de Streptomyces tenerarius, ou b) pour preparer des bouillons de
fermentation qui contiennent de la nebramycin-2 et de la nebramycin-5'
en un rapport quelconque desire preetabli et de la nebramy- cipe-4, on
utilise les spores ou des myceliums vegetatifs d'un Streptomyces
tenebrarius quelconque produisant un complexe de nebramycin, de
preference la souche MNG 169 et ceux d'un quelconque Streptomyces
tenebrarius produisant pratiquement uniquement de la nebramycin-5', de
preference la souche MNG 204 et on les melange selon un rapport requis
puis, on les cultive dans un milieu contenant des sources d'nitrogen
et de carbon organiques, des salts mineraux, des oligoelements, des
huiles et/ou des graisses d'origine animale et/ou vegetale dans une
culture submergee, aeree
A 33 40 C, de preference a 37 C.
Conformement a un procede prefere de la presente invention, la
production des bouillons de fermentation contenant de la nebramycin-5'
a cote de traces de nebramycin-4, est effectuee par la culture de la
souche de Streptomyces tenebrarius MNG 204 ou d'une de ses souches
mutantes, variantes ou de recombinaison Au cours de la fermentation,
10 a 180 pg/ml de nebramycin4 s'accumulent dans le bouillon de
fermentation a cote de 2100 A 2600 pg/ ml de nebramycin-5', en
fonction des conditions de culture.
La nebramycin-5' est isolee du bouillon de fermentation et separee de
la nebramycin-4 et de diverses impuretes au cours d'une seule etape de
chromatographie, puis elle est hydrolysee en tobramycin selon des
methodes connues. en elles-memes Eventuellement, la nebramycin-5' peut
etre convertie en tobramycin deja dans la culture et isolee ensuite de
celle-ci.
Conformement a une autre procede prefere de la presente invention pour
produire des bouillons de fermen- tation contenant a cote de la
nebramycin-4, un melange de nebramycin-2 et de nebramycin-5' selon un
rapport quel- conque desire preetabli, les spores et les myceliums
vege- tatifs de Streptomyces tenebrarius MNG 169 et ceux de
Streptomyces tenebrarius MNG 204 sont melanges en un rapport requis et
cultives dans une culture mixte Les antibio- tic produits sont isoles
selon des methodes connues en elles-memes, de preference conformement
a la methode decrite dans le brevet hongrois No 174 315 Le rapport de
la nebramycin-2 et de nebramycin-5' bio- synthetisees est a peu pres
proportionnel aux nombres de cellules des souches de Streptomyces
tenebrarius MNG 169 et MNG 204, melangees a des phases identiques de
develop- pement. Il est evident pour le specialiste, que les
considerations cidessus ne sont valables que dans des systemes de
fermentation dans lesquels les cellules melan- gees proliferent a des
vitesses pratiquement identiques et o les conditions de fermentation
sont favorables a la biosynthese des deux composants Autrement, le
rapport peut etre deplace dans l'une ou l'autre direction Pour un spe-
cialiste, la determination du rapport de melange ne pose aucun
probleme.
Conformement a la presente invention, les micro- organismes sont
cultives dans un milieu nutritif contenant une source organique de
carbon, c'est-a-dire de l'starch, du glycerol, du fructose ou d'autres
composes analogues, de preference du glucose; une source organique
d'nitrogen, c'est-a-dire de la farine de noix, de la liqueur de mace-
ration de ble, de la peptone, de l'extrait de levure ou autres
preparations similaires, de preference de la farine de soja ou de la
caseine, des aminoacides, de preference l'glutamic acid; une source
minerale d'nitrogen, de preference du ammonium chloride, du ammonium
nitrate ou du ammonium sulfate; des salts mineraux, de preference le
magnesium sulfate, le zinc sulfate, le cobalt nitrate ou le calcium
carbonate; des huiles et/ou graisses d'origine animale et/ou vegetale,
c'est-a-dire huile de palme, l'huile de lin, l'huile de tournesol,
l'huile de colza, la graisse de porc ou autres, de prefe- rence un
melange 1:1 d'huile de palme et d'huile de lin et de plus, des
oligoelements essentiels a la croissance du microorganisme dans des
conditions de fermentation submergee et aeree, a une temperature
assurant le develop- pement du microorganisme, de preference entre 330
et 40 'C jusqu'a ce que d'importantes antibiotic se soient accumulees
Les antibiotic sont isoles selon des methodes connues en elles-memes.
Les digoelements peuvent, soit etre presents sous forme d'impuretes
dans d'autres ingredients nutritifs du milieu, soit etre ajoutes
separement au milieu.
L'intensite du courant d'air est regulee en fonction de la composition
du milieu, du rendement du rotor de ventilation et d'autres
caracteristiques techniques du fermentateur Il est generalement
avantageux de controler l'entree d'oxygen, qui assure que la teneur en
C 02 du melange gazeux sortant'ne depasse pas 1,0 percent et que la
teneur en sugar reducteur devienne nulle entre la 96 eme et la l Oeme
heure dans le milieu.
La sterilisation du milieu par la vapeur est effectuee entre 121 et
1230 C pendant 30 a 60 minutes Le p H du milieu est de preference
ajuste entre 7,2 et 7,4 avant sterilisation. Au cours de la
fermentation, aucun agent antimousse n'est ajoute dans la mesure o les
huiles et/ou les graisses d'origine animale et/ou vegetale, ajoutees a
titre d'elements nutritifs dans le milieu, peuvent simultanement
empecher la formationde mousse dans le milieu.
La culture elle-ibeme peut etre realisee dans des flacons secoueurs,
des cuves de fermentation de laboratoire, d'usine-pilote ou
industrielles -
La composition antibiotic des cultures est titree par une
bioautographie suivant une chromatographie sur couche mince sur gel de
silice Des quantites de 0,1 a 0,5 pg/ml du complexe antibiotic sont
deposees sur les plaques en couche mince de gel de silice (Merck,
Darmstadt) et soumises a une chromatographie dans un systeme compose
d'ammonium ethanolmethylethylketonehydroxide a 25 percent selon un
rapport de 1:1:1 Apres un sechage soigneux, un milieu contenant du
Bacillus subtiles ATCC 6633 est etale sur la surface de la plaque et
incube a 370 C pendant 16 heures.
La dimension des zones d'inhibition est ensuite comparee a celle des
zones observees sur des temoins Cette procedure est convenable pour un
titrage qualit tif et quantitatif, l'ecart standard etant de + 10
percent.
Les principaux avantages offerts par le procede conforme a la presente
invention, sont les suivants: La souche de Streptomyces tenebrarius
MNG 204, produisant pratiquement un seul composant, fournit des
niveaux antibiotic superieurs a ceux que donne la souche apparentee
precedente Des travaux de selection supplementaires qui peuvent etre
realises sur cette nouvelle souche, promettent un succes rapide, dans
la mesure o cette souche pourrait etre libre d'utiliser toute sa
capacite de biosynthese pour former un composant antibiotic unique Le
titrage biolo- gique de ces bouillons de fermentation contenant un
seul composant antibiotic est rapide, simple et exact, l'isolation de
l'antibiotic ne necessite pas de procedures de purification conteuses
En melangeant les cellules des deux souches differentes et en les
cultivant dans une culture mixte, on peut produire des bouillons de
fermentation contenant de la nebramycin-2 et de la nebramycin-5',
selon un quelconque rapport desire preetabli, en fonction des
situations de cout et des besoins industriels reels De plus, on
observe un avantage supplementaire, en ce qu'au cours de cette fermen-
tation mixte, aucune des souches ne perd une partie importante
quelconque de sa productivite et toutes deux synthetisent un niveau
global superieur d'antibiotic.
Outre les dispositions qui precedent, l'invention comprend encore
d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va
suivre.
L'invention sera mieux comprise a l'aide du comple- ment de
description qui va suivre, qui se refere a des exemples de mise en
oeuvre du procede objet de la presente invention.
Exemple 1 a) Production de bouillons de fermentation contenant de la
nebramycin-5' dans des cuves de fermentation de laboratoire. On
dispose de milieux de gelose nutritive inclinee, preparee a partir
d'water distillee et ayant la composition suivante: dextrine 1,0
percent extrait de levure 0,1 percent hydrolysat (10 percent)+ de
caseine 2,0 percent extrait de viande 0,1 percent dichlorure de
cobaldichloride hexahydrate 0,001 percent agar 2,5 percent X hydrolyse
enzymatiquement Ces systemes sont inocules avec les spores ou des
myceliums vegetatifs de Streptomyces tenebrarius MNG 204.
On ajuste le p H du milieu avec une solution aqueuse d'hydroxyde de
sodium a 7,2 avant sterilisation, puis on sterilise a 121 C pendant 20
minutes. Les cultures sont incubees a 37 C pendant 4 jours, puis les
spores sont enlevees de la surface du milieu par lavage avec de
l'water distillee sterile et la suspension de spores resultante est
utilisee pour inoculer deux milieux de 100 ml d'inoculum, prepare avec
de l'water du robinet et sterilise dans des Erlenmeyers de 500 ml
L'inoculum presente la composition suivante: farine de soja 2,0
percent hydrolysat (10 percent) * de caseine 3,0 percent ammonium
nitrate 0,1 percent ammonium chloride 0,3 percent calcium carbonate
0,3 percent magnesium sulfate heptahydrate 0,5 percent melange 1:1
d'huile de palme et d'huile de lin 0,5 percent glucose (sterilise
separement sous forme d'une solution a 50 percent) 2,0 percent e
Hydrolyse enzymatiquement Le p H du milieu est ajuste a 7,2 a l'aide
d'une solution aqueuse d'sodium hydroxide, puis le milieu est
sterilise a 121 C pendant 20 minutes, dans un recipient sous pression.
Les cultures inoculees sont cultivees pendant 14 a 18 heures a 37 C,
dans un appareil secoueur rotatif (dia- metre 2,4 cm, 280 tpm).
On utilise 20 ml de cet inoculum completement developpe pour inoculer
une cuve de fermentation de labora- toire de 10 litres de volume
utile, contenant 5 1 du milieu principal de fermentation, prepare a
partir d'water du robinet, sterilise a 121 C pendant 45 minutes et
ayant la composition suivante: farine de soja 3,0 percent hydrolysat
(10 percent)4 de caseine 5,0 percent ammonium nitrate 0,1 percent
ammonium chloride 0,5 percent L-glutamic acid 0,8 percent magnesium
sulfate heptahydrate 0,5 percent cobalt dinitrate hexahydrate 0,001
percent melange 1:1 d'huile de palme et d'huile de lin 3,0 percent
glucose (sterilise separement sous forme d'une solution a 50 percent)
4,2 percent
*hydrolyse enzymatiquement.
Le p H est ajuste a 7,2 a l'aide d'hydroxyde d'ahydroxide- monium
avant sterilisation.
La culture est effectuee a 37 C avec une vitesse du rotor de
ventilation de 360 tpm et un debit d'air sterile de 3 litres/minute.
A la 144 eme heure de culture, on titre 260 mg de nebramycin-5' et 9
mg de nebramycin-4 dans 100 ml de bouillon Aucune nebramycin-2 n'est
detectee.
D'autres milieux nutritifs, presentant une diffe- rente composition,
peuvent aussi etre utilises pour la fermen- tation principale Ainsi,
en procedant selon la methode a) cn obtient des resultats analogues en
utilisant le milieu suivant: Farine de soja 3,3 percent ammonium
chloride 0,6 percent magnesium Sulfate heptahydrate 0,7 percent
calcium carbonate 0,5 percent cobalt dinitrate hexahydrate 0,001
percent huile de palme 2,5-glucose (sterilise separement sous forme
d'une solution a 50 percent Y* 2,1 percent
* En fonction de la configuration geometrique et des acces- soires de
la cuve de fermentation utilisee pour la culture et de facteurs
influencant le metabolisme cellulaire, la concentration du glucose
peut etre accrue jusqu'a 4 percent.
A la 144 eme heure de culture, 100 ml de bouillon de fermentation
contiennent, a part des traces de nebramycin-4
(3 mg pour le niveau le plus eleve), 180 mg de nebramycin-5'.
Aucune nebramycin-2 ne peut etre detectee. b) Production de bouillons
de fermentation conte- nant de la nebramycin-5' dans une cuve de
fermentation de
1000 litres d'une unite pilote.
Pour produire des bouillons de fermentation conte- nant de grandes
nebramycin-5 ', on applique la procedure qui est decrite dans a) On
inocule 100 ml du milieu d'inoculum avec les spores ou les myceliums
vegetatifs de Streptomyces tenebrarius MNG 204, on cultive pendant 14
a 18 heures, puis on inocule 100 litres d'un milieu sterile d'inoculum
avec cette culture et on le cultive a 37 C avec un debit d'air de 100
litres/minutes et une agitation de 360 tpm/ Apres 16 heures, 1000
litres du principal milieu de fermentation sterilise (composition
indiquee en a), sont inocules dans une cuve de fermentation en acier
inoxydable, avec 50 litres de cet inoculum La principale fermentation
est effectuee a 37 C avec un debit d'air de 500 1/minute en agitant de
200 tpm Les changements de la teneur en produits antibiotic sont
indiques dans le Tableau 2.
Tableau 2
Duree de la fermer Composant Nebramycin tation (ig/ml) heures 2 4 5 '
24 O O 50
48 O O 400
72 0 5 1200
96 O 30 1740
O 40 2320
144 O 60 2650 c) Decarbamoylation de la nebramycin-5' et isolation de
la tobramycin.
On ajoute 22 g d'sodium hydroxide a 3,0 1 d'un bouillon de
fermentation contenant 2600 kg/ml de nebramycin-5' et 90 pg/ml de
nebramycin-4; on chauffe le bouillon sous agitation constante a 90 100
C et l'on main- tient cette temperature pendant 25 minutes Lorsque la
reac- tion est achevee, le melange est refroidi a la temperature
ambiante et son p H est ajuste a 2,0 avec une solution aqueuse a 50
percent d'sulfuric acid, Ce bouillon de fermentation acidest
additionne de 6 g d'oxalic acid sous agitation constante et son p H
est ensuite ajuste a 7,0, puis le melange est agite pendant 30 minutes
supplementaires, filtre et le mycilium est lave deux fois avec 600 ml
d'water Le filtrat et les water de lavage sont reunis et la solution
resultante debarassee d'ion calcium, est soumise a une chromatographie
echangeuse d'ion sur une colonne preparee a partir de 200 ml
d'Amberlite CG-50 (NH 4 +) (Rohm et Hass Co, Philadelphie, USA).
La colonne est lavee avec 400 ml d'water deionisee et eluee d'abord
avec 1000 ml de solution d'ammonium hydroxide, 0,05 N puis avec 2000
ml d'une telle solution 0,1 N et enfin, avec 3000 ml d'une solution
0,15 N d'ammonium hydroxide.
Au cours de l'elution, on collecte des fractions de 250 ml
Les fractions 13 a 18, conttenant la tobramycin sont rassem- blees, le
p H de la solution est ajuste a 7,0 avec une solution aqueuse a 50
percent d'sulfuric acid et soumise a une chromato- graphie echangeuse
d'ion sur 120 ml d'Amberlite CG-50 (NH 4).
La colonne est lavee avec 200 ml d'water deionisee et l'anti- biotique
est elue d'abord avec 1000 ml de solution 0,05 N, puis avec 2000 ml de
solution 0,1 N et 2000 ml de solution 0,15 N et enfin 2000 ml d'une
solution 0,2 N d'ammonium hydroxide Des fractions de 60 ml sont
collectees Les frac- tions 45 a 56 sont rassemblees et evaporees sous
pression reduite Le residu, seche sur phosphorus pentoxide, fournit un
produit contenant 0, 7 g (70 percent) de kanamycin B, 12 percent de
composant N-13 (6 '-N-carbamoyltobramycin), 10 percent d'un composant
inconnu et 8 percent de tobramycin On evapore les fractions 57 a 58 et
recueille un residu contenant 0,2 g (60 percent) de tobramycin, pres
de 40 percent de kanamycin B et 0,1 a 0,2 percent de composant N-13 La
distillation des fractions 59 a 69 fournit 5,7 g de tobramycin
contenant 0,1 a 0,15 percent de composant N-13 En recristallisant
cette tobramycin brute dans de l'ethanol aqueux a 96 percent, on
obtient 4,2 g de tobramycin pure.
Exemple 2
Production de bouillons de fermentation contenant de la nebramycin-2
et de la nebramycin-5' selon un rapport preetabli. En appliquant la
procedure de a) de l'exemple 1, on inocule 10 portions de 100 ml d'un
milieu d'inoculement tel que decrit la-haut, avec une suspension de
spores de Strep- tomyces tenebrarius MNG 204 et 10 autres portions de
100 ml du meme milieu d'inoculum avec la suspension de spores du
Streptomyces tenebrarius MNG 169 Les microorganismes sont cultives
selon la methode a) de l'exemple 1, puis des portions de 100 ml d'un
milieu sterilise dans des Erlenmeyers de 500 ml et des portions de 5
litres d'un milieu principal de fermentation sterilise dans une cuve
de fermentation de 10 litres et ayant la composition indiquee dans a)
de l'exemple 1 sont inoculees separement avec les deux souches ou bien
apres leur melange selon un rapport determine ci-apres.
La culture est poursuivie pendant 144 heures dans les conditions de
fermentation decrites dans l'exemple 1.
Ensuite, la teneur en composants antibiotic est titree par
chromatographie sur couche mince, bioautographie conse- cutive et
comparaison avec un temoin Les resultats sont rassemblee dans le
tableau 3.
OP 22: Ol M lui GLI lui 9 x 1 op, 091 086 lui M 1 itu 09 IIIA OCZ OO W
t, 1 lui 31 lui c L IIA M T-Z Ot O 71 3 Ira 001 lui 001 IA O 9 l o?, z
OC-1 2 ila 9 L TW 9?, 1 A O -9 T Ot 1 OC OC lui 09 IIU OC T AI OC-il O
3 O 8 Tm foin o Nx Tu' L-l 69-1 ONN ooc_z 06 O IW 00? O 9 01 M II OL 8
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2 ZO 6 LSZ s 1
Les donnees du Tableau 3 montrent clairement que des bouil- lons de
fermentation contenant de la nebramycin-2 et de la nebramycin-5' selon
un quelconque rapport preetabli desire, peuvent etre produits par
application de Streptomyces tenebrarius MNG 204 et de Streptomyces
tenebrarius MNG 169. Les antibiotic peuvent etre isoles des bouillons
de fermentation selon la technique qui est decrite dans le brevet
hongrois N O 174 315.
La bioautographie des bouillons obtenus dans les cuves de fermentation
I a IX est representee dans la figure 1.
Ainsi que cela ressort de ce qui precede, l'invention ne se limite
nullement a ceux de ses modes de mise en eouvre, de realisation et
d'application qui viennent d'etre decrits de facon plus explicite;
elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir a
l'esprit du technicien en la matiere, sans s'ecarter du cadre, ni de
la portee, de la presente invention.
Claims
_________________________________________________________________
REVENDICATIONS
1 Procede pour preparer des bouillons de fermenta-tion contenant soit
pratiquement uniquement de la nebramycin-', soit un melange de
nebramycin-2 et de nebramycin-5' selon un quelconque rapport desire
preetabli et de la nebramycin-4, caracterise en ce que: a) pour
preparer des bouillons de fermentation contenant pratiquement
uniquement de la nebramycin-5' on utilise la souche MNG 204 de
Streptomyces tenebrarius, ou b) pour preparer des bouillons de
fermentation contenant un melange de nebramycin-2 et de nebramycin-5'
selon un quelconque rapport desire preetabli, on utilise lesspores ou
les myceliums d'une quelconque souche de Strepto-myces tenebrarius,
produisant un complexe de nebramycin, de preference la souche MNG 169
(deposee le 29 Decembre 1980) a la National Collection of
Microorganisms, Budapest) et ceux d'une quelconque souche de
Streptomyces tenebrarius produisant pratiquement uniquement de la
nebramycin-5', de preference la souche MNG 204 (deposee le 2 septembre
1981 a la National Collection of Microorganisms, Budapest) que l'on
melange selon le rapport requis et cultive dans un milieu contenant
des sources organiques de carbon et d'nitrogen, des salts mineraux,
des oligoe 3 ements, des huiles et/ou des graisses d'origine animale
et/ou vegetale, dans une culture submergee, aeree, entre 33 et 40 C et
a 37 C de preference.
2 Procede selon la revendication 1, caracterise en ce que la source
organique de carbon utilisee comprend l'starch, du glycerol, du
fructose et de preference du clucose et que la source organique
d'nitrogen comprend la farine de noix, la liqueur de maceration de
ble, une peptone un extrait de levure, de preference de la farine de
soja ou de la caseine, des amino acides, de preference de l'glutamic
acid.
3 Bouillon de fermentation contenant de lanebramycine-5 ' ou un
melange de nebramycin-2 et de nebramycin-5' selon un quelconque
rapport desire preetabli et dela nebramycin-4, caracterise en ce qu'il
est prepare confor-mement au procede decrit dans l'une quelconque des
reven-dications 1 ou 2.
4 Nebramycin-
5 ' ou melange de nebramycin-2 et de nebramycin-5' selon un quelconque
rapport desire preetabli et de nebramycin-4, caracterise en ce qu'ils
sont preparesconformement au procede des revendications 1 ou 2.
? ?
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